ELVÁLASZTÁS TECHNIKA Labor beszámoló M2 csoport Bartus Zsuzsanna Fodor Melinda Mahunka Marietta Marosi Dóra Németh Viktória Szabados Ádám Szabó Dávid Takács Mónika Troczkis Fruzsina
Mar 20, 2016
ELVÁLASZTÁS TECHNIKALabor beszámolóM2 csoport
Bartus ZsuzsannaFodor MelindaMahunka MariettaMarosi DóraNémeth ViktóriaSzabados ÁdámSzabó DávidTakács MónikaTroczkis Fruzsina
HS-GC-MS
HS-GC-MS
Gőztéranalizátor (headspace) – mintaadagolás Gázkromatográf – elválasztás Tömegspektrométer - detektálás
PerkinElmer HS-GC-MS
GŐZTÉRANALIZÁTOR (HS) - MINTATARTÓ
•Minta (folyadék, szilárd)- és Gázfázis közt egyensúly alakul ki
•Az egyensúly eltolódását a gőztér hőmérséklet változtatásával (termosztálás) tudjuk befolyásolni
•Egyensúly beállta után véges térfogatot bocsájtunk a gázkromatográfba
KIEGYENSÚLYOZOTT NYOMÁSÚ MINTAADAGOLÁS (BALANCED PRESSURE)
• d=0,2-0,3 mm, kicsi holttértfogat, elhanyagolható zónaszélesítő hatás
• Minta térfogat nagysága a ∆p-től és adagolási időtől függ• Zárt, minden részében jól termosztált rendszer• Paraméterek könnyen kontrolálhatók, jól reprodukálható mérések
GŐZTÉRANALIZÁTOR – BEÁLLÍTANDÓ PARAMÉTEREK ÉS FŐBB HATÁSAIK Gőztér hőmérséklete (max 400°C):
megoszlási hányados Termosztálási idő: megoszlási hányados Tű hőmérséklet: kondenzálás Átvezető cső hőmérséklete: kondenzálás Nyomás alá helyezés ideje: mintatérfogat,
kapilláris Injektálási idő: mintatérfogat
GÁZKROMATOGRÁFIA Kromatográfia: fizika-kémiai elválasztási módszer,
ahol az elválasztandó alkotók 2 fázis közt – álló és mozgó – oszlanak meg a különböző mértékű kötődéseik szerint
Gázkromatográfia: gáz halmazállapotú mozgófázis Kolonna töltete/belső bevonata lehet az állófázis Gázok és gőz halmazállapotúra hozható
folyadékok vizsgálatára alkalmas Az elválasztás nagyszámú szorpciós-deszorpciós
lépésen keresztül történik Az elválasztás függ a vivő gáztól (Hidrogén,
Nitrogén, Hélium) MS-nél Héliumot alkalmaznak a nagy ionizációs
energiája miatt
GÁZKROMATOGRÁFIA• Két kolonna típus:
– töltött kolonna: töltet lehet szilikagél, aktív szén, diatómaföld…stb., 2-4 mm belső átmérő, 0,3-3 m hossz
– kapilláris kolonna: belső folyadék film bevonat lehet metil-szilikon olaj, fenil-metil-szilikon olaj…stb., 0,10-0,53 mm belső átmérő, 15-75 m hossz
• Elválasztás befolyásolása:– Termosztáló hőmérséklet– Hőmérséklet egyenletes, lineáris változtatása– Állófázis változtatása
TÖMEGSPEKTROSZKÓP• Mérés elve: ionos részecskéket választunk el
fajlagos tömegük (töltésegységre eső tömegük: m/z) szerint csökkentett nyomáson elektromos vagy mágneses mezők segítségével
• Mérjük az elválasztott ionok intenzitását• Tömegspektrum (ujjlenyomat)• Minőségi információ: legintenzívebb ion
intenzitásra normált karakterisztikus tömegspektrum
LEGFONTOSABB KÉSZÜLÉKELEMEK Mintabeviteli rendszerek (GC-MS) Ionforrás Analizátor Detektor Számítógép Vákuumrendszer Energiaellátó elektromos egységek
MS DETEKTOR
IM
minta
R
TMSz
++-
-V (egyenfeszültség)o
TMSzIM
:: ionsokszorozó detektor
turbomolekuláris szivattyúR : olajrotációs (elõvákuum) szivattyú
I A
I: elektronütközéses ionforrás10-6 -810- kPa
A: analizátor
=Vo oV+ sin toVV +
U
V: váltófeszültség
,vagy diffúziós szivattyú
kvadrupól rudak
ELŐNYÖK összetett elegyek minőségi és mennyiségi
elemzése rövid idő alatt (20-30 perc) elvégezhető, s igen kis mennyiségű alkotók (10-15-10-21 g) meghatározása lehetséges
Minőségi,szerkezeti információ (hogyan?): Referencia anyagot kell használni a mérés során kapott tömegspektrum és
ismert vegyületek, ismert tömegspektrumainak az összehasonlítása,
a mérés során kapott tömegspektrum "megfejtése", ismert szabályok alapján történő értelmezése
SCANFUNKCIÓK• Pásztázó:
– az egész m/z tartományra történő ionintenzitás mérés– A különböző m/z pontoknál mért intenzitások
egymáshoz való arányát is lehet látni → minőségi információ
– Dinamikus üzemmód,pillanatnyi ionáramot mér,nagyobb hibával jár
• SID:– Különböző, kevés m/z pontokban történő ionintenzitás
mérés– Legalább 2 pontban kell mérni– Az adott mérések csak pár m/z pontra korlátozódnak,
így a kérdéses ionokról sokkal pontosabb mérési eredményeket kapunk → mennyiségi információ
– Kimutatási határ 1 nagyságrenddel jobb
FID (LÁNGIONIZÁCIÓS DETEKTOR)
kb. 2000-2500 K hőmérsékletű hidrogén-levegő láng
A lángban a C-H kötéseket tartalmazó molekulák, azaz a szerves vegyületek (pl szerves savak) fragmentálódnak és egy részük ionizálódik
Láng fölé helyezett elektródpár között gyenge áram folyik ionok képződésének hatására jel (feszültséget mér)(mintakomponens koncentrációjával arányos)
Standardek használata
HS-GC MÉRÉSGYAKORLAT Mérés célja:
Melaszban lévő karbonsavak vizsgálata. Vizsgált minták:
C2, V2 Felhasznált vegyszerek:
85%-os foszforsav, NaCl (Merck, Darmstadt), több komponensű kereskedelmi standard (minden komponens 10 mmol/l)
GŐZTÉRANALIZÁTOR (HS) PARAMÉTEREI Minta hőmérséklete: 60 °C Tű hőmérséklete: 100 °C Átvezető cső hőmérséklete: 150 °C Termosztálási idő: 10 perc Nyomás alá helyezés ideje: 2 perc Injektálási idő: 0,05 perc Tű visszahúzás ideje: 0,5 min
GÁZKROMATOGRÁFIÁS KÉSZÜLÉK ADATAI Készülék: Perkin Elmer AutoSystem XL Detektor: FID Vivőgáz: N2, 110 kPa Adagoló: Perkin Elmer Headspace
Sampler HS 40 Kolonna: VOCOL 60m x 0,53 mm x 3
μm Hőmérsékletprogram: 50 °C – ról 200 °C – ig 7 °C/perc sebességgel
A STANDARDEK ÉS A MINTÁK ELŐKÉSZÍTÉSE Légmentesen záródó 20 ml-es üvegedénybe bemértünk 2g NaCl-ot (kisózás), majd 1 ml
foszforsavat adtunk hozzá. Erre mértük rá automata pipettával a
standard/minta 1 ml-es részletét. Közvetlenül ezután az edényt gyorsan légmentesen lezártuk.
STANDARD KROMATOGRAMJA
C2-ES MINTA KROMATOGRAMJA
V2-ES MINTA KROMATOGRAMJA
MÉRÉSI EREDMÉNYEK
A C2-es mintában azonosított komponensek:propionsav, izovajsav, izovaleriánsav, izokapronsav, kapronsav
A V2-es mintában azonosított komponensek:propionsav, izovajsav, vajsav, izovaleriánsav
GYORSLC
KROMATOGRÁFIA ÁLTALÁNOSAN Többfokozatú, nagyhatékonyságú, dinamikus
elválasztási módszerek gyűjtőneve.
Közös elem: az elválasztandó komponensek az egymással érintkező két fázis között oszlanak meg, ezek közül az egyik áll, a másik pedig meghatározott irányba halad.
UHPLC (UPLC) HPLC
8x, 10x gyorsabb p›1200-1300 bar Dp‹2-3 µm; héjszerű
szemcse L= 3-10 cm; 2-3 mm 0,1-0,5 µl minta térf. UV-VIS
p<400 bar Dp= 3-10 µm, porózus,
nem porózus L= 15-25 cm; 3-8mm 5-200 µl UV-VIS
ALAPÖSSZEFÜGGÉSEK A KOLONNÁN KÍVÜLI ZÓNASZÉLESEDÉSRE OPTIMÁLT GYORS LC ÉS HPLC MÓDSZEREKNÉL
Kis szemcseátmérő
Kis térfogat (kisebb holttérfogat, kisebb komponens hígulás)
Elemzési idő csökk.: L csökk., u növelése (k nem- interferencia veszély) meg kell növelni p-t (Darcy)
Szemcse sérülése (UHPLC nagyobb nyomás) Kis η mozgófázis acetonitril tartalmú (gradiens
elúció, maximumos görbe) H csak kis mértében nőjön u-val (függ η) Készülék max nyomás sebességnövelés határa Nagy nyomáshőhossz-, keresztirányú hőm.-
grad. széles torzult csúcs (belső átmérő csökk.) belső átmérő csökk.Vr csökk. külső
zónaszélesítő hatások
KROMATOGRÁFIA KINETIKUS ELMÉLETE:
van Deemter egyenlet: H- elméleti tányérszámmal ekvivalens
oszlopmagasság, u-mozgófázis lineáris áramlási sebessége
A: az oszlop geometriájának hatása (szemcsék közti tér nem teljesen rendezett)
B: longitudinális diffúzió (molekula áramlik a szemcsék között)
C: anyagátadással szembeni ellenállás
KROMATOGRÁFIA KINETIKUS ELMÉLETE:
Szemcseátmérő csökkentése: élesebb csúcs, rövidebb, kisebb átmérő
KROMATOGRÁFIA KINETIKUS ELMÉLETE:
Hőmérséklet növelésével:csökken a kölcsönható erők viszkozitása (mozgófázis), nő a mérendő komponens diffúziós állandója. B≈DM (molekuláris diffúziós állandó); C≈ (póruson belüli diffúziós állandó)
Kis szemcsén belüli átmérő, a mozgófázis áll, csak a részecske diffúzióját vizsgáljuk.
KROMATOGRÁFIA KINETIKUS ELMÉLETE: Nyomás növelése: a szemcseátmérő csökkentés velejárója,
lamináris tartomány Héjszerkezetű állófázis: a diffúziós úthossz rövidebb, mint
egy teljesen porózus szemcsénél. Kolonna ellenállását csökkenteni, mozgófázis gyorsabb, nem
töltetes, hanem monolit kolonna esetén. Egy nagyságrenddel kisebb nyomás, mint a porózus töltet esetén. Könnyebben alakul ki nagyobb sebesség.
Nyomástartomány és az oszlopon kívüli térfogat nagyon fontos.
UPLC KÉSZÜLÉK PARAMÉTEREI Waters Acquity, Ascentis Express Peptide ES 10 cm x 3 mm; 2,7 µm (0,5 µm tömör belső) Gradiens elúció Eluens (30 % B-ig mentünk fel):
A: víz+0,1 % TFA; B: acetonitril:víz+0,1 % TFA (= 90:10)
U=0,8 ml/min, beinj.: 2 µl, Detektálás: λ=260 nm
MÉRÉS KIÉRTÉKELÉS
Mennyi komponenst tud meghatározni? Pc=1+tg/wb (tg= 2.5 min alatt) Pc= 41
KORLÁTOK A GYORS FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁS MÓDSZEREKNÉL
KORLÁTOK A GYORS FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁS MÓDSZEREKNÉL Azt vizsgáljuk, hogy milyen követelmények
vannak műszer oldalról nézve az elemzés gyorsaságának növelésére.
A kromatogramon mért zónaszélesedés két fő részből tevődik össze:
Kolonna által okozott Kolonnán kívüli zónaszélesítő hatások
Adagoló okozta zónaszélesedés σ2A Összekötő vezeték okozta zónaszélesedés σ2Ö Detektorcella okozta zónaszélesedés σ2Dcell Detektor elektronika okozta zónaszélesedés σ2Dt
σ2E = σ2A+σ2Ö+σ2Dcell+σ2Dt ∑σ2= σ2C+ σ2E
Az adagolóban és az összekötő vezetékben azért van zónaszélesedés, mert az
áramlás lamináris és a sebességi profil parabolikus, az egyes rétegek közöttikeveredés elhanyagolható. Azok a molekulák, amelyek a cső falához
közelebbvannak kb fele sebességgel haladnak, mint a maximumban lévők => áramlási csúcsdiszperzió
Ehhez hozzájárul a detektorban az áramlási sebesség megváltozása: ha lassú
az elektronika, akkor nem lehetséges legalább 20 adatpont gyűjtése, amiből a
kromatográfiás csúcs analóg jele leképezhető =>változik a görbe alatti terület
és a zónaszélesség.
A zónaszélesedés összege nem lehet nagyobb, mint a kolonnán mért tizede.σ2
E=0,1σ2C
PéldaUPLC: 5 cm hosszú, 2,1 mm belső átmérőjű kolonna, 1,7 µm
szemcseátmérőjű töltetKolonna okozta zónaszélesedés:
σ2k=(πr2εT)2HL UPLC:
σ2k=8,14 µm
A komponens hígulása a kolonnán kicsi és a csúcskapacitás nagy, mert szűk a zóna, viszont a kolonnán kívüli zónaszélesedést meghatározza.
A 10 %-os szabályt betartva a kolonnán kívüli zónaszélesedésnek 1 µl alatt kell lennie. Ez pedig több függetlenből tevődik össze, meg kell adni az egyes tagok járulékait: - megengedett legnagyobb injektált térfogat Vinj=105 nl- Detektor okozta zónaszélesedés és detektor térfogat σ 2det=20,8 µl - összekötő vezeték okozta zónaszélesedés σ2
Ö=1,28 µl*1280 nl- detektor időállandó τRC=0,17 sec
r=2,1 cmεT=0,5Dp=1,7 µmH= 3,4 µmL=5 cm
Mintavételezési sebesség hatása a csúcskapacitásra és a felbontásra:a csúcskapacitás összefügg a kromatográfiás felbontással, így ha a csúcskapacitás csökken, csökken a felbontás is.
Mintavételi sebesség Csúcskapacitás80 Hz40 Hz20 Hz10 Hz5 Hz
6156442816
A lassú mintavétel jelentősen csökkenti a kromatogramon látható csúcsok számát
80 Hz40 Hz20 Hz10 Hz5 Hz
2,252,051,711,170,67
HPLC
UHPLC
A gyors kolonnák nagy mintavételi frekvenciát igényelnek
A kis belső átmérőjű és rövid kolonnákhoz a hagyományos HPLC rendszer nem, vagy csak nagy hatékonyság csökkenéssel alkalmazható.
Rövid kolonnák alkalmazása HPLC rendszerben:- 5 µl jelenti az adagolás felső határát- a minta oldószerének gyengébbnek kell lenni, mint a mozgófázis eluenserőssége- a molekuláris formának azonosnak kell lennie a mintában és a mozgófázisban- az összekötő vezetékek hosszát a készülék által megadott minimumra kell csökkenteniAdagoláskor a kolonna elején csúcskompresszió történik => gradienselúciót alkalmazunk akkor is, amikor nem lép fel az általános elúciós probléma. A kiindulási mozgófázis összetételének olyan gyengének kell lennie, hogy a minta leggyengébben visszatartott komponensének is nagyobb kell, hogy legyen a visszatartása, mint 10.
Visszatartási tényező:K= KVs/Vm=ns/nm*Vs/Vm
Vs, Vm: álló- és mozgófázis térfogataK: megoszlási hányadosns, nm: álló- és mozgófázisban mért mólok száma
k>10A komponensek döntő részben az állófázisban tartózkodnak. Az
összes komponens vándorlási sebessége lecsökken, a mintaadagolás során a kolonna eleje koncentrálja azokat.
Vándorlási sebesség [ux=u/(1+k)] csökken.
k=10Tizenegyed részére csökken a vándorlási sebesség, így a
komponensek szűk zónában koncentrálódnak.Itt problémát okozhat az oldhatóság, ha a minta
komponenseinek nagyon eltérő az apolaritása vagy polaritása. Ekkor a jobban visszatartott komponensek a gyenge
eluenserősségűmozgófázisban kevésbé oldódnak. A közel egyforma
tulajdonságúvegyületeknél a szelektivitás csökken.
AZ ELVÁLASZTÁST BEFOLYÁSOLÓ PARAMÉTEREK HATÁSÁNAK VIZSGÁLATA
A KROMATOGRÁFIÁS FELBONTÁS ALAPÖSSZEFÜGGÉSE
Rs = N ½ (α – 1/α)(k+1/k)
N az elméleti tányérszám (kinetikai hatékonyság),
α a relatív retenció vagy szelektivitás (termodinamikai hatékonyság),
k a visszatartási tényező.
A kromatográfiás rendszerekben az elválasztás ezen három paramétertől függ.
HOGYAN BEFOLYÁSOLJA A PARAMÉTEREK MEGVÁLTOZTATÁSA AZ ELVÁLASZTÁST?
Deriváljuk az elválasztást megadó Rs = N ½ (α – 1/α)(k+1/k)
összefüggést, mindig az adott vizsgálandó paraméter (N, α, k) szerint.
1.) ELMÉLETI TÁNYÉRSZÁM HATÁSA ΔRs/ΔN = 1/8(N½)(α-1/α)(k/(k+1))
Egységnyi N változás 0,0144% elválasztás-változás.
Ha a kolonnahosszat 2x-esére növeljük (pl. N = 3000-ről 6000-re) az elválasztás értéke kb. 14%-kal nő (ha ua. a kolonna és változatlan a mozgófázis összetétele).
Ez a hatás kismértékű, tehát a kolonnahossz növelése csak mérsékelten növeli az elválasztást.
A nyomásesés a kolonnán közben kétszeresére nő.
Ezek az adatok k = 2-3, α = 1,1 és ΔR = 1 körüli értékekre igazak.
Van Deemter ha a szemcseátmérőt felére csökk. az elméleti tányérmagasság is a felére csökken (Hmin és az Nmax) N 2x-esére nő.
A H-u görbe meredeksége annál kisebb, minél kisebb a szemcseátmérő (N-ben nagyobb lesz a nyereség).
Ha 3 µm-ről 1,5 µm-re csökkentjük az állófázis szemcseátmérőjét, akkor pl. N=1000 2500-ra nő kb. 26%-os növekedés az elválasztásban (ha az egyéb paramétereket változatlanul hagyjuk). A nyomásesés 4x-esére nő!
2.) SZELEKTIVITÁS HATÁSA ΔRs/Δα = ((N½)/4)(1/α2)(k/(k+1))
Egységnyi változás az α-ban közel 1000-szeres változást okoz az elválasztási tényezőben.
A szelektivitási tényező kismértékű változása nagymértékben növeli az elválasztást.
Folyadékkromatográfiában vagy az állófázis típusát változtatjuk meg (állófázis hatás), vagy a mozgófázis összetételét (mozgófázis hatás). Ahhoz, hogy a mozgófázissal a megfelelő elválasztást tudjuk elérni, szükséges, hogy az állófázison minimális elválasztás elérhető legyen. A vegyületek szerkezetének függvényében, tehát az első feladat a legnagyobb szelektivitást nyújtó állófázis kiválasztása, csak utána következhet a mozgófázissal az elválasztás „finomhangolása”.
3.) VISSZATARTÁSI TÉNYEZŐ HATÁSA ΔRs/Δk = ((N½)/4)((α-1)/α)(1/(1+k)2)
Egy egységnyi változás k-ban kb. 8% változást jelent a felbontásban.
A deriváltnak maximum helye van a 2-3 k érték körül.
Folyadékkromatográfiában a visszatartást az állófázis minőségével, a mozgófázis összetételével és a hőmérséklettel tudjuk változtatni.
HŐMÉRSÉKLET Új elválasztást befolyásoló tényező, amely a
technikai megvalósításban a legutóbbi években jelent meg.
MONOLIT KOLONNÁK
ELEMZÉSI IDŐ CSÖKKEN, HA A LINEÁRIS ÁRAMLÁSI SEBESSÉG NŐ!
tr=L/u(1+k)
Szemcsés tölteteknél a lineáris áramlási sebesség növelésével egyenes arányban nő a kolonnán a nyomásesés
Ez monolit kolonnákra is igaz, viszont ezeknek az áramlási ellenállásuk sokkal kisebb, mivel porozitása a szemcsés töltethez képest sokkal nagyobb (a kolonna térfogatának 80%-a holttérfogat)
Azaz ugyanolyan áramlási sebességhez sokkal kisebb nyomásesés tartozik (~ 1 nagyságrenddel)
MONOLIT TÖLTET ELEKTRONMIKROSZKÓPOS KÉPE
Vannak szilikagél és szerves polimer alapú monolitok.Szerves alapúnál a mikropórusosság elkerülhetetlen, ami szélesebb kromatográfiás csúcsot eredményez, valamint ezek mechanikailag kevésbé stabilak (biopolimerek elválasztására alkalmazzák).
Fehér rész: szilikagél alapváz (benne 10-20 nm-es mezopórusok; visszatartást eredményezik)Sötét rész: nagy átmérőjű pórusok (1-2 μm; mozgófázis áramlás itt)
AZ ELVÁLASZTÁSI ELLENÁLLÁS
TÉRFOGATÁRAMLÁSI SEBESSÉG ÉS NYOMÁSESÉS A KOLONNÁN
Tehát nyomásesés szempontjából a monolit előnyösebb,mint a szemcsés.Az általánosan alkalmazott 1-2 ml/min térfogatáramlási sebességek 6-9 ml/min értékre növelhetők.
ELŐNYÖK ÉS HÁTRÁNYOK Előnyök: Térfogatáramlási
sebesség növelhető Az elválasztás
hatékonysága csak kis mértékben csökken gyors elválasztáskor
Hagyományos készüléknél alkalmazható
Gyors elválasztások közül ez adja a legkisebb elválasztási ellenállást
Elemzési idő csökkenthető a térfogatáramlási seb. programozásával
Hátrányok: A kolonna felületi
kémiája korlátozott- elsődlegesen oktadecil és oktil módosított kolonnák kaphatók, és a normál fázisú kromatográfiában alkalmazott alap szilikagél
Mivel műanyag házban van a töltet, így max. 200 bar nyomás alkalmazható
KÖSZÖNJÜK A FIGYELMET!