-
1
Semmelweis Egyetem Doktori Iskola – Elméleti Orvostudományok
Program: I/3. Ionizáló és nem ionizáló sugárzások biológiai
hatásai
DNS alapú biológiai dozimetria kiterjesztése széles spektrumú UV
hatásra
Készítette: dr. Hegedüs Márton
Témavezető: Dr. Fekete Andrea, egyetemi docens Programvezető:
Dr. Rontó Györgyi, professor emeritus Hivatalos bírálók: Dr.
Sasvári Mária, egyetemi docens
Dr. Török Szabina, tudományos főmunkatárs Szigorlati bizottság
elnöke: Dr. Monos Emil, professor emeritus Szigorlati bizottság
tagjai: Dr. Csík Gabriella, egyetemi docens
Dr. Török Szabina, tudományos főmunkatárs
Budapest 2006
-
2
Tartalomjegyzék 0. Rövidítések
jegyzéke.........................................................................................
6 1. Bevezetés
...............................................................................................................
7 2. Irodalmi áttekintés
............................................................................................
9
2.1. AZ ULTRAIBOLYA SUGÁRZÁS
.................................................................
9
2.1.1. Fizikai jellemzők
......................................................................................
9 2.1.2. A spektrum
felosztása...............................................................................
9
2.2. TERMÉSZETES ÉS MESTERSÉGES UV
FORRÁSOK............................. 10
2.2.1.
Napsugárzás............................................................................................
10 2.2.2. Az ózon
szerepe......................................................................................
11 2.2.3. Az
ózonlyuk............................................................................................
12 2.2.4. Légköri tényezők hatása az UV dózisra
................................................. 13 2.2.5.
Mesterséges UV források
.......................................................................
15
2.3. AZ UV SUGÁRZÁS BIOLÓGIAI
HATÁSAI.............................................. 16
2.3.1. Az UV sugárzás és a földi élet
kialakulása............................................. 16 2.3.2.
Exobiológiai vonatkozások
....................................................................
18 2.3.3. A jelen ökoszisztémát érintő változások
................................................ 19 2.3.4. Az
egészség és a napfény
.......................................................................
20 2.3.5. Immunszuppresszió
................................................................................
21 2.3.6. Hóvakság,
szürkehályog.........................................................................
23 2.3.7. Az UV sugárzás bőrre gyakorolt általános
hatásai................................. 23 2.3.8. A bőrrákok
epidemiológiája
...................................................................
25 2.3.9. A bőrrákok tumorbiológiája
...................................................................
27
2.4. MOLEKULÁRIS HATÁSOK, A DNS KÁROSODÁSA
............................. 29
2.4.1. Molekuláris fotobiológia
........................................................................
29 2.4.2. Lipidek és fehérjék UV
sérülései............................................................
30 2.4.3. A fehérjék szerepe a DNS
sérülésében................................................... 31
2.4.4. A DNS UV
elnyelése..............................................................................
32 2.4.5. A DNS
gerjesztése..................................................................................
34 2.4.6. Ciklobután-pirimidin-dimerek (CPD)
.................................................... 36 2.4.7.
Pirimidin-(6-4)-pirimidon fotoproduktumok (6-4 PD)
.......................... 37 2.4.8. Pirimidinek egyéb
sérülései....................................................................
38 2.4.9. Oxidatív léziók
.......................................................................................
39 2.4.10.
Lánctörések.............................................................................................
40
2.5. AZ UV SUGÁRZÁS
DOZIMETRIÁJA........................................................
41
2.5.1. Fizikai UV
dózis.....................................................................................
41 2.5.2. A biológiai hatékonyság
becslése...........................................................
43 2.5.3. Biológiai
doziméterek.............................................................................
45
3.
Célkitűzések.......................................................................................................
46
-
3
4. Anyagok és
módszerek...................................................................................
48
4.1. T7 BAKTERIOFÁG
......................................................................................
48
4.1.1. A fágok tudományos
jelentősége............................................................
48 4.1.2. A fág életciklusa
.....................................................................................
49 4.1.3. A T7 fág
tenyésztése...............................................................................
49 4.1.4. A T7 fág szerkezete
................................................................................
50 4.1.5. „Fűtött fág” állapot
................................................................................
51 4.1.6. T7
DNS...................................................................................................
52 4.1.7. T7 biológiai dózis és mérése
..................................................................
52
4.2.
MINTAKÉSZÍTÉS.........................................................................................
53
4.2.1. Fág
szuszpenzió......................................................................................
53 4.2.2. DNS oldat
...............................................................................................
54 4.2.3. DNS és fág vékonyrétegek
.....................................................................
54 4.2.4. A DNS konformáció befolyásolása
........................................................ 56
4.3. A MINTÁK
KEZELÉSE................................................................................
57
4.3.1. Oldatok besugárzása
...............................................................................
57 4.3.2. Vékonyrétegek űrszimulációs kezelése
.................................................. 58
4.4. A KIÉRTÉKELÉS
MÓDSZEREI..................................................................
60
4.4.1. Spektrofotometria
...................................................................................
60 4.4.2. Gélelektroforézis
....................................................................................
61 4.4.3. Specifikus enzimatikus
emésztés............................................................
63 4.4.4. DNS–fehérje keresztkötések
meghatározása.......................................... 63 4.4.5. A
DNS sérülése T7 fágok túlélése alapján
............................................. 64
4.5. POLIMERÁZ
LÁNCREAKCIÓ....................................................................
65
4.5.1. A PCR működése
...................................................................................
65 4.5.2. A
primerek..............................................................................................
67 4.5.3. A QPCR paraméterei
..............................................................................
69 4.5.4. Kvantitatív
kiértékelés............................................................................
70
5.
Eredmények.......................................................................................................
71
5.1. POLIMERÁZ LÁNCREAKCIÓ
OPTIMALIZÁLÁSA................................ 71
5.1.1. A kiindulási DNS
...................................................................................
71 5.1.2. Az exponenciális amplifikáció tartománya
............................................ 72 5.1.3.
DNS-koncentrációval arányos
amplifikáció........................................... 73
-
4
5.2. UV DÓZIS HATÁSA A PCR TERMÉK MENNYISÉGÉRE
...................... 74
5.2.1. A cél fragmens
szerepe...........................................................................
74 5.2.2. Öt különböző spektrumú UV sugárforrás
hatása.................................... 77
5.3. A FÁG-FEHÉRJÉK JELENLÉTÉNEK HATÁSA
....................................... 78
5.3.1. T7 fág, „fűtött fág”, izolált DNS
............................................................ 78
5.3.2. UV fotosérülés különböző DNS
konformációkban................................ 79
5.4. VÉKONYRÉTEGEK ÉS VÁKUUMKEZELÉS
........................................... 80
5.4.1. A fág és DNS vékonyrétegek
szerkezete................................................ 80
5.4.2. Vákuum hatása a vékonyrétegekre
......................................................... 81 5.4.3.
Hőmérséklet-ingadozás következményei
............................................... 83
5.5. VÉKONYRÉTEGEK ULTRAIBOLYA BESUGÁRZÁSA
......................... 84
5.5.1. UVC sugárzás hatása a
vékonyrétegekre................................................ 84
5.5.2. A többszörös rétegek árnyékoló hatása
.................................................. 87 5.5.3.
Különböző fotoproduktumok keletkezése napszimulátor hatására
........ 88 5.5.4. Kombinált kezelések: vákuum és UV sugárzás
együttes hatása ............ 89
6.
Megbeszélés........................................................................................................
91
6.1. T7 FÁG BIOLÓGIAI DOZIMÉTER
KIÉRTÉKELÉSE............................... 91
6.1.1. PCR beállítása
........................................................................................
91 6.1.2. T7 fág biológiai dózismérő hitelesítése
.................................................. 92 6.1.3. A
proteinek szenzibilizáló hatása
........................................................... 94
6.2. SZIMULÁLT VILÁGŰR HATÁSA
.............................................................
96
6.2.1. A minták minőségének ellenőrzése
........................................................ 96 6.2.2.
A vákuum által okozott
dehidráció.........................................................
98 6.2.3. Vákuum által okozott
sérülések............................................................
100 6.2.4. Az UVC fotoproduktumok DNS szerkezetét módosító hatása
............ 102 6.2.5. Telítődés az UVC sérülések
mennyiségében........................................ 103 6.2.6. A
rétegvastagság védő hatása
............................................................... 105
6.2.7. Különböző sérülés típusok megoszlása
................................................ 106 6.2.8. A
vákuum és az UVC sugárzás szinergisztikus
hatása......................... 108
7.
Következtetések..............................................................................................
110 8. Összefoglalás
...................................................................................................
117 9. Summary
..........................................................................................................
118
-
5
10. Irodalomjegyzék
........................................................................................
119 10.1. FELHASZNÁLT IRODALOM
............................................................... 119
10.2. FELHASZNÁLT INTERNETES FORRÁSOK
...................................... 132
11. Saját publikációk
jegyzéke.....................................................................
133
11.1. CIKKEK
...................................................................................................
133
11.2. ELŐADÁSOK ÉS POSZTEREK
............................................................ 134
11.3. ISMERETTERJESZTŐ
TEVÉKENYSÉG.............................................. 137
12. Köszönetnyilvánítás
..................................................................................
138
-
6
0. Rövidítések jegyzéke
Az értekezésben többször előforduló rövidítések és
magyarázatuk:
6-4 PD 6-4 fotodimer A adenin AP apurinezett/apirimidinezett
lézió bp bázispár BED biologically effective dose C citozin CFC
klór-fluoro-karbon CPD ciklobután-pirimidin-dimer DLR Deutsches
Zentrum für Luft- und Raumfahrt DNS dezoxiribonukleinsav dNTP
dezoxinukleozid-trifoszfát DU Dobson unit EDTA
etilén-diamin-tetra-acetát ESA European Space Agency EVT Experiment
Verification Test G guanin HT7 T7 egyenérték dózis ISS
International Space Station MED minimal erythema dose m / RNS
messenger / ribo-nukleinsav NASA National Astronautics and Space
Administration NMSC non-melanoma skin cancer OD optikai denzitás
PUVA pszoralén + UVA Q / PCR quantitative / polymerase chain
reaction r.h. relative humidity RPM rotation per minute SDS
sodium-dodecyl-sulfate T timin UV ultraibolya UVA 315–400 nm UVB
280–315 nm UVC 100–280 nm
-
7
1. Bevezetés
Az élőlényeket érő ultraibolya sugárzás legfontosabb forrása a
Nap. Az ózonréteg
vékonyodása, a napozási szokások változása és a mesterséges
források elterjedése
(pl.: szolárium, ipari és orvosi célú alkalmazások) miatt az
emberi szervezetet érő
ultraibolya sugárterhelés összességében növekszik. Emellett
olyan nagy energiájú, az
UV tartományba eső sugárzás hatásaival is fokozottan számolnunk
kell, ami a légkör
szűrő hatása miatt korábban nem képezte részét az élőlények
természetes
környezetének, és amely biológiai szempontból más
hullámhosszaknál veszélyesebb. A
változó UV sugárzás élővilágra kifejtett hatásainak felmérése és
előrejelzése bonyolult
feladat, ami biológiai doziméterek használatát teszi
szükségessé.
Az élő szervezetek sugárkárosodásában a fehérjékkel
kölcsönhatásban álló
nukleinsav kitüntetett szerepet játszik. A biológiai hatások
közé tartozik többek között a
sejthalál és a bőrrákok kialakulásában szerepet játszó mutációk
megjelenése. Az
ultraibolya sugárzás következményeinek jelentős része az
örökítőanyagban kialakuló
változatos sérülésekre vezethető vissza, ezért célszerű magát a
DNS-t használni
biológiai doziméterként.
A DNS sérülések tanulmányozásához a T7 bakteriofág ideális
modell rendszer,
mert a fág izolált DNS-e mellett a kromoszóma modelljének
tekintett intakt fágban a
fehérjékkel való kölcsönhatás következményei is vizsgálhatóak. A
T7 bakteriofág
szerkezete ismert, laboratóriumi felhasználásának módszerei
letisztultak és a
Semmelweis Egyetem Biofizikai és Sugárbiológiai Intézetében több
évtizedes
tapasztalat áll rendelkezésre a fágok felhasználásával
kapcsolatban. A molekuláris
biológiai technikák fejlődésével a DNS UV fotosérüléseinek
detektálásában emellett új
utak is megnyíltak. Ezért a jelen dolgozat témája a DNS alapú
biológiai dozimetria
kiterjesztése széles spektrumú UV hatásra T7 bakteriofág és
molekuláris biológiai
technikák felhasználásával.
-
8
Munkám természetéből következik, hogy az részben új módszerek
kifejlesztésére,
megbízhatóságuk ellenőrzésére, részben ezek gyakorlati
felhasználására irányult.
Kísérleteim során a kvantitatív polimeráz láncreakció
segítségével meghatározott DNS
sérülések és a biológiai dózis között kerestem kapcsolatot.
Vizsgálataimat
kiterjesztettem a széles biológiailag releváns dózistartományra,
és egyes, az UV
sérülések kialakulását befolyásoló tényezők hatásainak
elemzésére.
A DNS és egyszerűbb mikroorganizmusok világűrbeli sorsa fontos
kérdés az élet
kialakulásával és bolygók közti átvitelének lehetőségével
kapcsolatban. Az élet
szempontjából a világűrben uralkodó vákuum és a nagy energiájú
UV sugárzás a
legfontosabb limitáló tényezők, amik hozzátartoznak a Nemzetközi
Űrállomásra
küldendő fág és DNS vékonyrétegek űrszimulációs kezeléséhez is.
A DNS sérülések
detektálására szolgáló új eljárást – más módszerekkel
kiegészítve – a gyakorlatban
alkalmaztam a szimulált világűrbeli körülmények vékonyrétegekre
kifejtett hatásainak
tanulmányozásában.
-
9
2. Irodalmi áttekintés
2.1. AZ ULTRAIBOLYA SUGÁRZÁS 2.1.1. Fizikai jellemzők
„Kezdetkor teremtette Isten az eget és a földet. ... és Isten
szólt: „Legyen
világosság”, és világos lett” (Genesis I, 1.1.). A Teremtés első
mozzanatai között
szükség volt a fényre, hiszen a földi élet a Nap nélkül
elképzelhetetlen.
A fény fizikailag elektromágneses sugárzás, a terjedési irányra
és egymásra
merőlegesen, szinkron oszcilláló elektromos és mágneses erőtér.
Az energia adott
mennyiségeit fotonokba csomagolva közvetíti. A fény
természetének megértését sokáig
nehezítette a fotonok kettős viselkedése. Az általuk szállított
energiával fordítottan
arányos, rövidebb hullámhosszakon a részecskékre jellemző
tulajdonságokat mutatják,
míg az alacsonyabb frekvenciájú sugárzás hullámtermészettel
rendelkezik
(Rontó és Tarján 1997).
E = h ν = h (c/λ), ahol:
h : 6,626 · 10-34 Js, Planck-állandó;
ν : frekvencia [Hz];
c : fénysebesség [m/s];
λ : hullámhossz [m].
2.1.2. A spektrum felosztása
Az optikai tartományt az elektromágneses spektrum 100 nm és 1 mm
közé eső
szakasza jelenti. Ide tartozik a nagyobb energiájú ultraibolya
(UV), a 400–800 nm-es
látható fény (VIS) és az infravörös (IR) sugárzás, ahogy azt az
1. ábra mutatja. Az
élőlények megtanulták hasznosítani a Napból érkező energiát. A
hősugárzásnak szerepe
van az éghajlat meghatározásában. Az energia legnagyobb részét
közvetítő látható fényt
használják a növények a fotoszintézishez, ebben a
hullámhossz-tartományban szemünk
csapjai és pálcikái a frekvenciakülönbségeket színbeli
eltérésként érzékelik. Egyes
-
10
állatok (pl.: méhek) a közeli ultraibolya tartományban is
látnak, az embereknek azonban
erre nincsen érzékszervük (Nilsson 1996). Az UV sugárzás káros
hatásai ellen ezért
csak akkor tudunk védekezni, ha a minket érő dózist méréssel meg
tudjuk határozni.
1. ábra. Az elektromágneses spektrum tartományai (Nilsson 1996
nyomán)
2.2. TERMÉSZETES ÉS MESTERSÉGES UV FORRÁSOK
2.2.1. Napsugárzás
A Wien-féle eltolódási törvény (λmax T = Wien-állandó)
értelmében magasabb
hőmérsékletű testek emissziós színképe a nagyobb energiák felé
tolódik. Életünkben a
legjelentősebb feketetest sugárzó 6000 K körüli felszíni
hőmérsékletével a Nap. Ezen a
hőmérsékleten már jelentős ultraibolya kisugárzással is számolni
kell. Távoli galaxisok
megfigyelésénél ezért a csillagászok UV felvételeket is
készítenek. A Föld légkörének
határára érkező teljes energiát a szolár konstans adja meg,
átlagos értéke 1,37 kW/m2. A
napfénynek mintegy 7%-a esik az ultraibolya tartományba
(Nicholson és mtsai 2005),
ennek azonban csak töredéke éri el a Föld felszínét.
Az atmoszférában való elnyelődés szerint a nagy energiájú
optikai sugárzás
további felosztása lehetséges hullámhossza alapján. A 100 és 280
nm közötti UVC-t a
légkör nitrogén és oxigén molekulái teljes mértékben elnyelik és
szétszórják. A
-
11
280–315 nm-es UVB jelentős részét az UVC által generált ózon
hivatott elnyelni. Az
ennél nagyobb hullámhosszú UVA a látható fényhez hasonlóan
gyakorlatilag akadály
nélkül jut le a felszínre.
2.2.2. Az ózon szerepe
A légkör molekuláinak a sugárzással való kölcsönhatása nem csak
szűrőként
fontos. 240 nm-nél rövidebb hullámhosszú fotonoknak oxigénnel
való ütközésekor a
molekula atomjaira hasad. A kialakuló, páratlan elektronnal
rendelkező gyökök igen
reakcióképesek és a kétatomos oxigénhez kapcsolódva exotherm
folyamat során ózon
(O3) alakul ki. A keletkezés helye szerint így jött létre a
sztratoszférában, a Föld felszíne
felett mintegy 25–40 km-rel az ózonréteg. Mára az ózon
mennyisége átlagosan 0,5 pars
pro million (ppm), a felszíni nyomáson mintegy 3 mm vastag
réteget alkotna, ezt
tekintik 300 Dobson-egységnek (DU).
Az ózon kötései a 320 nm körüli fotonok energiáját elnyelve
felszakadnak és a
molekula kiindulási elemeire bomlik, ahogy az a 2. ábrán
látható. Az ózonréteg
magasságában a felszabaduló hőnek megfelelően ezért a
sztratoszféra környező
rétegeihez képest magasabb hőmérséklet uralkodik. Az O3 bomlása
oxigén, hidrogén,
nitrogén és klór szabad gyökök által közvetített láncreakcióban
is létrejöhet. Az 1995-ös
kémiai Nobel-díjat a nitrogén-oxidok és a klór-fluoro-karbonok
(CFC) e folyamatban
játszott szerepének tisztázásáért ítélték oda P.J. Crutzennek és
munkatársainak.
2. ábra. Az UV sugárzás útja a Föld felszínére (Nilsson 1996
nyomán):
Az oszlopok a Föld felszínét elérő sugárzás relatív intenzitását
érzékeltetik
-
12
2.2.3. Az ózonlyuk
A Nap által kibocsátott spektrum emberöltőnyi léptéken mérve nem
változik. A
felszínt elérő dózist meghatározó ózon megoszlásáért,
keletkezéséért és bomlásáért
felelős folyamatok azonban érzékeny egyensúly elemei.
Az 1970-es évek óta nem fér kétség a sztratoszféra
ózonrétegének
vékonyodásához. A jelenséget rövid távon és helyileg elősegítik
természetes éghajlati
változások és vulkánkitörések is (pl.: Mount Pinatubo, 1992)
(Madronich és mtsai
1998), de a globális folyamatokra ezek nem adnak
magyarázatot.
Mára a magas légkörben közvetlenül kimutatott köztitermékek
alapján
bebizonyosodott a mesterséges kibocsátásból származó anyagok
elsődleges szerepe. A
többek között hűtőgépekben és dezodorok hajtógázaként használt
klór-fluoro-karbonok
(CFC), a tűzoltásban fontos halonok és a bromidok a magas
légkörben UVC sugárzás
hatására olyan aktivációs reakción eshetnek át, aminek termékei
katalizálják az ózon
bomlását eredményező láncreakciót. A vegyületek egy része hosszú
életidejű, több mint
100 évig maradhat a légkörben. Az UV sugárzás hatására a CFC-ről
leszakadó klór
gyök megtámadja az O3-t és az abból lehasított egyik atommal a
3. ábrán mutatott
módon kötésre lép. A klór-monoxiddal szabad oxigén reagál és O2
keletkezik. A
folyamatot elindító klór változatlanul visszamarad, és újabb
reakciót kezdeményez
(Nilsson 1996).
3. ábra. Az ózon bomlása klór gyök katalizátorral (Nilsson 1996
nyomán)
Az ózonréteg vastagságát a Föld felszínéről
Dobson-spektrofotométerekkel,
magas légköri ballonos mérésekkel és a Total Ozone Mapping
Spectroradiometer
(TOMS) segítségével, műholdról folyamatosan követik. A
vékonyodás évszaktól és
földrajzi szélességtől való függést mutat. A legnépesebb
mérsékelt égövben
-
13
évtizedenkénti 5%-os, gyorsuló tendenciájú fogyást mutattak ki.
A trópusokat a jelenség
alig érinti. Az Antarktisz, Új-Zéland és Ausztrália térségében
azonban 20%-os
kumulatív vékonyodás lépett fel. Ha az ózonréteg vastagsága 100
Dobson-egység alá
csökken, ózonlyuk alakul ki.
A magyarázat egy egyedülálló meteorológiai jelenségben rejlik. A
telente
kialakuló sarki légörvény elszigeteli az Antarktisz légterét. A
sötétségben lehűlő
levegőben jégkristályok csapódnak ki. Ezek felszíne felfogja a
tavasz első napsugarait,
így a gyöngyházfelhőkben fokozott a jégkristályokra
adszorbeálódott CFC-k UVC
okozta aktivációja. A légörvény felszakadásával a hőmérséklet
emelkedik és a
keletkezett ózonszegény levegő észak felé sodródik. Az ózonlyuk
középpontjában a tél
végén 75%-os hiány jön létre. 1995-ben európányi terület felett
gyakorlatilag megszűnt
a védő réteg (4. ábra). Az Arktiszon eddig ez a jelenség nem
öltött ilyen mértéket, mert
a levegő – környezetével keveredve – nem hűl le eléggé (Nilsson
1996).
4. ábra. Az Antarktisz feletti ózonlyuk alakulása 1979-től
1999-ig (NASA–TOMS):
Megfigyelhető a sötétkék színkóddal jelölt ózonlyuk (
-
14
A felhők vízcseppeket, jégkristályokat, részben ipari eredetű
port és – többek
között égés nyomán keletkező – kénsav-aeroszolt tartalmazhatnak.
A fedettség
vastagságát, optikai tulajdonságait, térbeli és időbeli
megoszlását is figyelembe kell
venni az UV-protektív hatás becsléséhez, ami igen jelentős is
lehet (Bornman és van der
Leun 1998). Ráadásul az emberi tevékenység nyomán a levegőbe
kerülő aeroszolok és a
troposzférikus ózon szintjében is erős ingadozások
mutatkoznak.
A gázmolekulák és részecskék hosszabb úton többet nyelnek el az
egyes
fotonokból. Következésképpen délben fokozott a nagy energiájú
sugárzás. Nyáron a
napi UVB dózis 75%-a reggel 9 és délután 3 óra között érkezik a
Földre, a leégésnek
ekkor legnagyobb a veszélye (Nilsson 1996). A jelenség szerepet
játszik a dózis
földrajzi szélességtől való függésében is. Ugyanakkor az
Egyenlítőtől távolodva a
napsugárzás beesési szöge egyre jelentősebb évszaki ingadozást
mutat, a sarkokon
szélsőséges viszonyokkal. Ez azonos intenzitás mellett a
felszíni fluxus csökkenésében
jelentkezik. A nyári napforduló tájékán így nem csak a nappalok
hossza miatt könnyű
barnulni, hanem azért is, mert a Nap magasan áll a horizont
felett. A fényszórás a
rövidebb hullámhosszú komponenseket érinti elsősorban, ami a
felszínt érő UV
spektrum minőségét is befolyásolja és azt az egyenlítő környékén
a veszélyes, nagyobb
energiájú tartomány felé tolja (Bérces és mtsai 1999).
A tengerszint feletti magasság sem elhanyagolható tényező. Ha a
hegycsúcsok
kiemelkedését az atmoszféra teljes vastagságához viszonyítjuk,
az arány csekélynek
tűnhet, de számításba kell venni, hogy a gravitációnak és a
gázok
összenyomhatóságának köszönhetően a légkör anyagának túlnyomó
része az alsó
10 km-ben összpontosul. 300 méter emelkedés 4%-kal fokozza a
napsugárzás leégést
kiváltó hatását (Nilsson 1996). Egyes felületek, mint a hó, a
víz, a homok ráadásul a
sugárzás jelentős részét visszaverik, albedojuk közel 1 (Bornman
és van der Leun
1998). A napozási szokások változását a sugárzás–légkör
kölcsönhatás figyelembe
vételével értékelve összességében egyre nagyobb dózisú és egyre
rövidebb
hullámhosszú UV sugárzás elszenvedésével lehet számolni.
-
15
2.2.5. Mesterséges UV források
Ma használt mesterséges fényforrásaink egy része
nemkívánatos
melléktermékként a látható mellett az UV tartományban is
emittál. A fénycsövek
mellett ilyenek a magas üzemi hőmérsékleten működő és ezért
UV-ben is sugárzó
kvarc-halogén izzók. Ez a dózis azonban a Nap fényéhez képest
elhanyagolható.
Kivételt egyes speciális alkalmazási területek képeznek, amiknek
az elszenvedett UV
dózis és a szükséges védekezés (pl.: hegesztő pajzs)
szempontjából nagy jelentősége
lehet.
Széles körben elterjedt az UV fény alkalmazása az egészségügyben
és a
kozmetikai iparban. A szoláriumok kvarclámpáiban az UVA
tartomány barnító hatását
igyekeznek kihasználni. A bőrgyógyászatban használt PUVA kezelés
során az UVA
hatását fényérzékenyítő 8-metoxi-pszoralénnel potencírozzák.
UVC-t kibocsátó
germicid lámpákkal légterek és felületek csíramentesítése érhető
el. Ez a hatás ívóvíz és
szennyvíz tisztítására és élelmiszerek tartósítására is
felhasználható.
Egyes ragasztóanyagok polimerizációjának gyorsítására UV fényt
használnak az
ipar számos területén, a fogászatban, az ortopéd sebészetben, de
még lovak patkolásánál
is. A hegesztés során keletkező ívfény UVC-t is tartalmaz. Egyes
nyomdai, lakkozó és
gyorsszárító eljárások során szintén ultraibolya sugarakat
használnak (Tenkate 1999).
Széleskörűen elterjedt az ultraibolya sugárzás által keltett
fluoreszcencia
felhasználása. Biológiai minták szerves molekulái és egyes
kristályok is mutathatják a
jelenséget, így vér, vizelet nyomok és ásványok azonosíthatók.
Láthatatlan festékekkel
bankjegyek, műtárgyak jelölhetők meg. Terjedőben van az UV
keltette fluoreszcencia
szórakoztató ipari és művészeti felhasználása is, ami a
szórakozóhelyek „fekete
fényétől” a fluoreszkáló festékkel készített festményekig és
látvány elemekig terjed.
A mindennapi élet során ezért nem csak a napozási szokások
változása és az
ózonréteg vékonyodása, hanem a mesterséges források miatt is
egyre többet találkozunk
az ultraibolya sugárzással.
-
16
2.3. AZ UV SUGÁRZÁS BIOLÓGIAI HATÁSAI
2.3.1. Az UV sugárzás és a földi élet kialakulása
Az UV sugárzás Janus-arcú jelenség. A sejtek örökítőanyagát
roncsolja, így nem
csoda, hogy az élet a részleges védelmet jelentő tengerekben
fejlődött ki. Az ózonréteg
megjelenését 2 milliárd évvel ezelőttre teszik, amikor a
kékeszöld algák által termelt
oxigén megfelelő szintet ért el. Feltételezhető, hogy az élet
kialakulásának idején még
számottevő UVB sugárzás érte a Föld felszínét. A biomolekulákban
elnyelődő
fotonoknak szerepe lehetett az élet kialakulásában és a korai
evolúcióban. A vékonyodó
ózonréteg alatt napjainkban ismét előtérbe kerül az UVB sugárzás
immunszuppressziót,
szürkehályogot, leégést és bőrrákot okozó hatása.
Máig sem tisztázott kérdés, hogy hogyan kerültek az első
biomolekulák a Földre.
Ígéretes elképzelések szerint külső forrás is feltételezhető. A
híres Miller-Urey kísérlet
óta több sikeres próbálkozás történt szerves vegyületek, cukrok,
amino- és nukleinsavak
„őslevesből” történő előállítására. A kiindulási anyagok, H2O,
CO, CO2, CH3OH, NH3
és szükséges energiaforrásként az elektromágneses sugárzás a
bolygóközi térben
megtalálhatóak (Munoz Caro és mtsai 2002). A mai tudományos
vélemény szerint a
fiatal Földön a légköri körülmények nem igazán kedveztek a
szerves molekulák
véletlenszerű szintézisének (Chyba 2005). A bolygóközi tér
anyagát besűrítő
porszemcsék, meteoritok és üstökösök azonban lehetséges
helyszínei ilyen reakcióknak.
A bolygóközi tér szerves anyagának egy része ma is eljut a Föld
felszínére. A
meteoritok egyik fajtájának, a szenes kondritok anyagának akár 5
súlyszázalékát is
szerves vegyületek teszik ki. A Murchison meteoritból
nukleinsav-analógokat,
aminosavakat és cukrokat tudtak izolálni (Cooper és mtsai 2001,
Epstein és mtsai 1987,
Stoks és Schwartz 1982). A 4,5–3,8 milliárd évvel ezelőtt
zajlott késői erős meteorit
bombázás idején a jóval sűrűbb légkör (10 bar CO2) erősen
lefékezte a belépő
meteoritokat. 10 km/sec becsapódási sebesség alatt a szerves
vegyületek sem
szenvedtek teljes hőbomlást (Chyba és mtsai 1990). Az Antarktisz
jegéből izolált 50–
100 µm átmérőjű mikrometeoritok jelentős tömeget képviselnek,
nagy részük erősebb
felhevülés nélkül érte el a Föld felszínét. A késői erős
bombázás időszakában, ami
-
17
egybeesik az élet kialakulásának feltételezett időpontjával, így
106–107 kg/év szerves
anyag érkezett a bolygóközi térből a Földre, ami bőven
fedezhette a mai 1014 kg-os
biomassza széntartalmát (Clancy és mtsai 2005).
A Földre való megérkezés előtt a szerves anyagot a világűrben
folyamatos
ultraibolya sugárzás és vákuum hatás érte. A világűrbeli
paraméterek biológiai mintákra
kifejtett hatását számos tudományos kísérletben vizsgálták.
Baktérium spórákkal
folytatott kísérletek szerint a spórák egy része képes
ellenállni a világűrben uralkodó
szélsőséges körülményeknek (Rettberg és mtsai 2002). Az
információt tároló DNS és
RNS makromolekulák is elég stabilak, ha por vagy agyag
szemcsékhez adszorbeálódva
bizonyos védelmet kapnak (Scappini és mtsai 2004).
A pánspermia elmélet az élet bolygók közti átvitelének
lehetőségével foglalkozik.
A meteorit becsapódások által a felszínből kilökött porszemcsék
és kőzetdarabok más
égitestekre is eljuthatnak. Modellszámítások alapján 109
nagyságrendbe teszik az elmúlt
4 milliárd év alatt a Marsról a Földre érkezett meteoritok
számát (Mileikowsky és mtsai
2000). Ezeknek felszínén és repedéseiben a mikroorganizmusok kis
százaléka képes
lehet túlélni a kilőkődés, az utazás és a becsapódás
viszontagságait. Az út során az élet
szempontjából az egyik legkritikusabb tényező a világűrben
uralkodó nagy energiájú
UV sugárzás és az extrém vákuum (Horneck és Baumstark-Khan
2001).
A világűrben a Nap UV sugárzása mellett a Napból származó
részecske
sugárzással is számolni kell. A napszél és a napkitörések anyaga
90–95%-ban
protonokból, 5–10%-ban α-részecskékből és viszonylag kevés nehéz
ionból áll. A
Naprendszert elérő galaktikus kozmikus sugárzás protonokat
(85%), elektronokat, α-
részecskéket (14%) és 1% körüli arányban nehéz ionokat, ún. HZE
– nagy (High)
töltésű (Z>2) és energiájú (E) – részecskéket tartalmaz
(Horneck 1998).
Biológiai szempontból a HZE részecskék a legveszélyesebbek. Az
elnyelő
anyagban (kőzetdarabban) másodlagos sugárzást keltenek, ezért az
általuk leadott
energia nem a felszínen a legnagyobb, hanem hozzávetőleg 10
cm-es mélységben
(Mileikowsky és mtsai 2000). A HZE részecskék fluxusa viszonylag
alacsony
(a kozmikus sugárzás ≈1%-át adják) és a Bacillus subtilis
spórákkal folytatott
kísérletekben elsősorban azokat a spórákat inaktiválták, amik az
útjukba estek (vagy
0,2 µm távolságon belül voltak), de még a telibe talált spórák
27%-a is életképes maradt
-
18
(Horneck és mtsai 2001a). A számítások szerint olyan apró
célpontok, mint a spórák
(0,2 µm2) vagy bakteriofágok (0,004 µm2) sok egyedet tartalmazó
populációiban több
százezer év után is számottevő lehet a túlélők száma (Horneck
1998).
Az élet a világűrön keresztül el is hagyhatja a Földet. Régóta
ismert, hogy az
űrjárművek nem sterilezhetők tökéletesen. Mikroorganizmusok
millióit viszik magukkal
a világűrbe és arra az égitestre, ahova leszállnak. Korábban
feltételezték, hogy a világűr
extrém körülményeit a potyautasok úgysem képesek túlélni.
Alaposabb vizsgálat
azonban rámutatott, hogy különösen a járművek rejtett zugaiban
van esély
biomolekulák ilyetén átvitelére (Nicholson és mtsai 2005). A
kontamináció
értékelhetetlenné teszi az élet nyomai után való kutatást. Ezért
felvetődött a Marson
nemzeti parkokhoz hasonló bolygóvédelmi övezetek kijelölése
(Horneck és
Cockell 2004).
2.3.2. Exobiológiai vonatkozások
Az exobiológia az élet Földön kívüli lehetőségével foglalkozó
tudományág.
Közvetlen bizonyítékokra mind a mai napig nem támaszkodhat.
Lehetőség nyílik
viszont az élet világűrbeli sorsának tanulmányozására, az ehhez
kapcsolódó elméletek
mérésekkel történő alátámasztására. Az űrkutatás más
területeihez hasonlóan az itt
született eredmények nem csak elméleti jelentőséggel bírnak,
hanem fontos
következményekkel számolhatunk a földi élet sorsára vonatkozóan
is.
Ilyen jellegű kísérletekre a múltban többször sor került (pl.:
Biopan, Perseus,
LDEF – Long Duration Exposure Facility). A legújabb lehetőséget
a Nemzetközi
Űrállomás (International Space Station – ISS) jelenti. Az ISS
felépítése 1998-ban
kezdődött, elkészültével a legnagyobb űrbeli létesítménynek fog
számítani. A 45 tonnás
építmény 350–400 km magasságban, 90 perc alatt kerüli meg a
Földet. 6 laborató-
riumában 6–7 asztronauta állandó munkáját tervezik.
Az Európai Űrügynökség (ESA) kifejlesztett egy asztrobiológiai
kísérletek
végzésére alkalmas berendezést, amit az űrállomás
tartószerkezetére fognak rögzíteni.
Az EXPOSE egység fő célja az űrbeli körülményeknek a
mikroorganizmusokra és a
biológiailag fontos makromolekulákra kifejtett hatásainak
vizsgálata. A berendezés
fedélzetére tervezett kísérletek segítségével további értékes
adatokhoz juthatunk az
örökítőanyag világűrbeli sorsát illetőleg (5. ábra).
-
19
5. ábra. A Nemzetközi Űrállomás és az EXPOSE egység
(NASA–ESA)
Az ESA által támogatott első 8 exobiológiai kísérlet közül 6 a
ROSE (Response of
Organisms to the Space Environment) nemzetközi konzorcium
tudományos kísérlete.
Ezek egyike a magyar PUR (Phage and Uracil Response), melynek
célja az űrbeli
körülmények hatásainak vizsgálata nukleinsavakon és
modelljeiken. Az adatok
kiértékelése közelebb vihet számos alapvető kérdés
megválaszolásához:
– Lehetséges-e biológiailag releváns molekulák, vagy ezek
darabjainak átvitele a
világűrben egyik égitestről a másikra – esetleg meteoritokhoz
kötődően?
– Miként alakulhatott ki az élet a maitól eltérő összetételű ősi
légkörben?
– Fennmaradhat-e az élet akkor, ha az ózonpajzs tovább
vékonyodik?
2.3.3. A jelen ökoszisztémát érintő változások
A felszínt érő UV sugárzás nem csak az élet múltja és jövője
szempontjából
érdekes, hanem jelenét is befolyásolja. Az ózonréteg vékonyodása
által okozott
változások már ma is komoly hatással vannak a földi
ökoszisztémára.
Az élelmezési szempontból fontos gabona, kukorica terméshozamát
az UVB
terhelés csökkenti, jóllehet a jelenség csak igen súlyos ózon
fogyásnál válna
számottevővé. A besugárzás növekedésével a növények beporzási
időszaka korábbra
tolódik, az ezt végző ízeltlábúak fejlődési ciklusa azonban csak
hosszabb idő alatt tud
alkalmazkodni a megváltozott körülményekhez. A házi- és
haszonállatoknál azonban
már most leírták a szürkehályog és a szőrtelen testtájak
daganatainak gyakoribb
megjelenését, ami gazdasági károkat okoz. Elsősorban egyes
fejlődő országokban a
-
20
tenger az élelem fő forrása. Az ultraibolya sugárzás
megtizedelheti a tápláléklánc alapját
képező planktonok állományát. Másfelől a csekély alkalmazkodó
képesség miatt a
tengeri állatok ikráinak és lárváinak jelentős részét is
elpusztítja (Nilsson 1996), így
éppen a legszegényebb területek juthatnak a nyugat
CFC-kibocsátása miatt az éhínség
szélére.
Az ipari méretű égetés nyomán felszaporodó szén-dioxid felelős
az
üvegházhatásért. Az UVB sugárzás emelkedésével az erdők
biomasszája megcsappan,
és a tengeri algák fotoszintézise is jelentősen csökken, így a
szárazföldi és a vízi
élővilág is kevesebb CO2-t tud megkötni. Az óceánok vizében
felhalmozódó
humuszsavak vagy a fában lévő lignin kevéssé vesznek részt a
biológiai körforgásban.
UV sugárzás hatására azonban bomlanak, a termékekből pedig a
mikroorganizmusok
már fel tudják szabadítani a szén-dioxidot (Nilsson 1996).
Az ózon fogyatkozásának következményeit tehát nem elég a humán
populáció
szintjén és más jelenségektől (pl.: az üvegházhatástól)
izoláltan felgöngyölíteni, hiszen a
bolygó valamennyi élőlénye egymásra van utalva.
2.3.4. Az egészség és a napfény
Az élet ma ismert formáinak többségét a napfény tartja fenn. Az
ember
létezéséhez szükséges éghajlat kialakításán kívül fontos, hogy a
táplálék fotoszintézis
útján keletkezik. Látásunk a földfelszínt legnagyobb mértékben
elérő hullámhosszakra
(400–800 nm) érzékeny csapokra és pálcikákra épül. A
7-dehidrokoleszterin B-gyűrűje
a bőrben UV sugárzás hatására hasad, a keletkezett
kolekalciferolból két további
hidroxilációs lépés nyomán keletkezik a kalcium- és
foszfor-anyagcserét irányító
D-vitamin, aminek újabban rákellenes hatását is feltételezik
(Ainsleigh 1993). Az UV
sugárzás féken tartja a bőrfelületen és a környezetben élősködő
mikroorganizmusokat
(nyáron kevesebb az acne). A fény gyógyító hatását a dán Finsen
felismerése óta a
fototerápiában is alkalmazzák (Roelandts 2002). Az
alvás-ébrenlét és a szteroid
hormonok cirkadián ritmusa a napszakok váltakozásához kötött
(Fonyó 1999). A téli
depressziókért részben a napfény hiányát teszik felelőssé. A
napfényre tehát előnyös
hatásai miatt mindenképpen szükségünk van. Az 1. táblázat
emellett azonban
összefoglalja azokat a káros hatásokat is, amelyekkel az
ultraibolya sugárzás kapcsán
számolnunk kell.
-
21
1. táblázat. Az ultraibolya sugárzás hatásai egészségünkre
Előnyös hatások: Káros hatások: Molekuláris hatások: D-vitamin
szintézis immunszuppresszió oxidatív stressz
csíraszám csökkentés hóvakság, cataracta fehérje/lipid
peroxidáció fototerápia leégés, bőrrákok DNS károsodás
2.3.5. Immunszuppresszió
Az immunrendszer UV okozta károsodása bőrtípustól függetlenül
lép fel. Az
addig sajátként felismert sejtfelszíni molekulák besugárzást
követő megváltozása, a
sejtek fotolízisével felszabaduló, addig elzárt antigének (pl.:
DNS, hisztonok) és a
membrán bomlásakor keletkező arachidonsav metabolit
prosztaglandinok gyulladásos
választ (napallergia, fotodermatitis) indítanak meg. A leégést
követő
immunszuppresszió feladata ennek kivédése lehet.
A sugárzás elsődleges célpontja az epidermisben elhelyezkedő,
vagy azon
átvándorló antigént prezentáló Langerhans-sejt. Feladata a
szervezet első védelmi
vonalán áttört ágensek felkutatása és bemutatása a
nyirokcsomókban. UV sugárzás
hatására a sejtek eltűnnek a bőrből és dendritikus morfológiájuk
is megváltozik. A
jellegzetességüknek számító MHC-II, ICAM és ATP-áz expressziója
csökken. Helyüket
mononukleáris makrofágok veszik át (Vink és Roza 2001).
Az urokaninsav izomerizációja és a DNS károsodása folytán
megváltozhat a
gyulladásban szereplő gének expressziója. A besugárzás hatásait
utánozni képes
radiomimetikum a stratum corneumban a hisztidin deaminációjával
keletkezett
izomerből UV sugárzás hatására kialakuló cisz-urokaninsav, ami
TNF-α-t szabadít fel
(Nilsson 1996).
Végeredményképpen a drenáló nyirokcsomókban a T-sejtek
aktiválódása zavart
szenved, az antigén prezentáció kisiklik a T-szuppresszorok
(Th2) felé, ahogy azt a
6. ábra is mutatja. A T-helper (Th1) sejtek működését a
besugárzás hatására felszaba-
duló TNF-α és IL-10 gátolja. Mindkét sejttípus a másik
funkcióját gátló cytokineket is
termel (Th1: IL-12→ Th2↓, Th2: IL-10→ Th1↓). A celluláris
immunválasz gyengül, a
humorális immunválasz túlsúlyra jut, idegen anyagokkal szemben
nő a tolerancia, amit
a kontakt hyperszenzitivitás csökkenése jelez (Grossman és
Leffell 1997).
-
22
6. ábra. Az immunválasz módosulása UV besugárzás hatására
(Grossman és Leffell 1997 nyomán): Az áthúzott nyilak az adott
hatás gátlását jelzik
Az autoimmun kórképek közül a humorális eredetű szisztémás
lupus
erythematodes (SLE) UV sugárzás hatására fellángol (vespertilio
a fénynek kitett
testtájakon). A celluláris immunitás hibájából kialakuló
sclerosis multiplex (SM) vagy
psoriasis remisszióba kerülhet (PUVA kezelés).
A sejtes védekezés gyengülése túlérzékenységi reakciók
csökkenésével és latens
herpes labialis aktiválódásával jól követhető. Finsen
(Nobel-díj, 1903) leírta, hogy a
napfény gyógyítólag hat a bőr tuberculosisára, később viszont
kiderült, hogy a
pulmonális TBC-t rontja. A besugárzás csökkentheti az élő,
attenuált kórokozókkal
végzett vakcinálás hatékonyságát, sőt veszélyessé teheti azt
(pl.: BCG). Az UV
irradiáció immunszuppresszív hatása folytán fokozza a legtöbb
fertőző betegségre
(pl.: HIV, TBC, herpes, candidiasis, listeriosis) való
fogékonyságot (Armstrong 1994).
A lokális és generalizált immunszuppresszió a daganatok,
bőrrákok kialakulásának is
kedvez (Longstreth és mtsai 1998).
-
23
2.3.6. Hóvakság, szürkehályog
A szembe jutó UV sugárzás nagy részét a cornea és a lencse nyeli
el, így főleg
ezek károsodása várható (Tenkate 1998). Az okulonegatív
hatásokhoz a szervezet nem
tud adaptálódni.
A fotokeratitis, fotoconjunctivitis és a retinopathia tünetei
akut sugárártalomként
24 órán belül jelentkeznek. A vörös szem, fájdalom, könnyezés,
fénykerülés jellegzetes
tünetegyüttesét hóvakságként emlegetik. Reflektáló környezetben
– homokon, vízen
vagy havon – folytatott tevékenység, védőpajzs nélküli
hegesztés, szolárium használat
kapcsán lép fel.
Közegészségügyi és gazdasági szempontból a legjelentősebb késői
szemhatás az
UV sugárzás által kiváltott szürkehályog (kortikális cataracta).
A cataracta
világviszonylatban a vakság leggyakoribb oka. A szemlencsét
felépítő hosszú kollagén
rostokat az UV sugárzás széttördeli, ami a lencse
átlátszóságának csökkenését
eredményezi. Az UV sugárzás az alkoholizmussal és a
cukorbetegséggel azonos súllyal
latba eső rizikótényező! Szürkehályog műtét vagy látásélességet
javító beavatkozás
(CLEAR – Clear Lens Extraction and Replacement) során a műlencse
(IOL – Intra-
Ocular Lens) ma már UV-abszorbenssel dúsított sziloxán-akrilát
kopolimerből készül.
A pinguecula (a cornea transzparenciáját csökkentő burjánzás) és
a pterygium
(a conjunctivális nyálkahártya ráterjedése a corneára)
vonatkozásában az UV sugárzás
szintén hajlamosító tényező lehet (Longstreth és mtsai
1998).
2.3.7. Az UV sugárzás bőrre gyakorolt általános hatásai
A bőr leggyakoribb akut léziója az UVB hatásra kialakuló
napégés, ami a
bőrpírtól a hólyagképződésig fokozódhat. Szövettani képét az
epidermisben
apoptotikus, dyskeratotikus keratinocyták (napégés-sejtek)
megjelenése, a Langerhans-
sejtek eltűnése és kereksejtes infiltráció, később
hyperproliferáció jellemzi.
Legérzékenyebbek az ismételt expozíció után is kevéssé barnuló,
világos bőrű
(kevés eumelanin), az I-es bőrtípushoz tartozó, többnyire
kaukázusi, gyakran szeplős,
vörös (sok pheomelanin) vagy szőke hajú, kék szemű egyének.
Náluk a legnagyobb a
-
24
bőrrákok kockázata is. A másik szélsőséget az V-ös bőrtípusú,
sötét bőrű afrikaiak és
afro-amerikaiak képezik (Moan és mtsai 1999). A hazai népesség
legnagyobb része a
II–III. bőrtípusba sorolható.
A napfényre való érzékenységet a testfelület pigmentációja
alapvetően
meghatározza. Az egyedfejlődés során a mélybe vándorolt
neuro-ektodermális eredetű
melanocyták az általuk termelt pigmenteket a környező
keratinocytáknak adják át
(Szende 1999). A barna eumelanin fényelnyelése révén védi a bőr
mélyebb rétegeit a
sugárzástól. A narancssárga pheomelanin viszont UVB hatására
oxigén gyököket hoz
létre, sőt feltételezik közreműködését a melanomák
kialakulásában is. A 7. ábrán a
normalizált sérülési hatásspektrum melanin jelenlétében 320 nm
felett jelentősen eltér a
DNS sérülési hatásspektrumától. Ezeken a hullámhosszakon a
melanin járulékos
kromofórként igen jelentős elnyelést mutat (lásd a 9. ábrát is)
és közvetett módon –
például szabad gyökök révén – hozzájárulhat a sérülések
kialakulásához (Setlow 1999).
7. ábra. DNS, DNS+melanin és epidermis modell elméleti sérülési
hatásspektruma
(Setlow 1999 nyomán): 20 µg/ml DNS és 12 ng/ml melanin
abszorpciós spektrumának
összegeként meghatározva, 270 nm-nél 1 értékre normálva,
valamint az epidermis
transzmissziós spektrumával súlyozva
-
25
Ma a Föld felszínére elsősorban a legkisebb energiájú UVA
sugárzás jut el. Mivel
a melanin szintézisét serkenti, ezért a szoláriumokban
felhasználják a barnulás
eléréséhez. A kellemetlen leégés kialakításában nem főszereplő,
emiatt azonban
veszélyes is, mert észrevétlenül nagy sugárterhelést okozhat, és
egyértelműen szerepet
játszik a legrosszabb indulatú bőrrákok, a melanomák
kialakulásában (Gallagher és Lee
2006). Xiphophorus halakban sokszorosára nőtt a melanoma
előfordulása UVA
besugárzás után, amiben nem a DNS, hanem közvetett módon a
melanin elnyelésének is
szerepe lehet (Setlow és mtsai 1993). Elsősorban a krónikus UVA
sugárzás
bőröregedéshez vezet. Hatásait részben reaktív oxigén gyökök
(ROS – Reactive Oxygen
Species) közvetítik. Az abnormális elasztikus és a degenerálódó
kollagén rostok miatt a
bőr elveszti rugalmasságát és ráncosodik .
Napjainkban az ózonréteg vékonyodása miatt egyre jelentősebb az
UVB
expozíció. Ezt a sugárzást a szoláriumok is felhasználják, mert
a melanin felszabadítása
révén gyorsítja a barnulást. Kellemetlen hatásai közé tartozik a
bőrpír (erythema) és a
leégés kiváltása. Közvetlen rizikófaktora a bőrrákoknak, de a
szervezet védekezésének
gyengítésével közvetetten is kedvez a tumorok kialakulásának
(Longstreth
és mtsai 1998).
2.3.8. A bőrrákok epidemiológiája
Az UV sugárzás által okozott legsúlyosabb elváltozások a
bőrtumorok. Az
idősebb korosztálynál jelentkező nem-melanomatikus bőrrákok
(NMSC) a
keratinocyták burjánzásai. Az ide tartozó laphámrák (squamous
cell carcinoma, SCC) és
a Krompecher Ödön által elsőként leírt bazálsejtes karcinoma
(BCC, ulcus rodens)
kiváltásában a p53 gén UVB okozta gátlásának tulajdonítanak
szerepet. A melanocyták
transzformációját a melanoma malignumban (cutaneous malignant
melanoma, CMM)
az UVA irradiácóhoz kötik (de Gruijl 1996).
A fehér kaukázusi embercsoport daganatos megbetegedései között a
BCC
(basalioma), SCC (laphámrák) és a CMM (melanoma) igen gyakori,
az Egyesült
Államokban például az első helyen állnak (de Gruijl 1999).
Előfordulásuk 1930 és 1990
között évi 5%-kal emelkedett! De ez csak részben köszönhető a
megváltozott napozási
szokásoknak. Incidenciájuk az Egyenlítőtől való távolság
növekedésével – az UVB
terhelés visszaesésével – csökken (Moan és mtsai 1999). Mivel a
napsugárzás a
-
26
legelterjedtebb környezeti rákkeltő ágens, a bőrtumorok a
leggyakoribb megelőzhető
daganatos betegségeknek számítanak. Leginkább a napfénynek
kitett felületeken, arcon,
nyakon, kézháton jelentkeznek, és főleg az I–II-es bőrtípusúakat
sújtják. Az egyes
bőrrák típusok kialakulásában és tulajdonságaiban fontos
különbségek mutatkoznak,
amiket a 2. táblázat foglal össze.
BCC és CMM esetében megfigyelték, hogy a korábbi
feltételezésekkel ellentétben
nem az elszenvedett összdózis, hanem annak időbeli sűrűsödései
hozhatók kapcsolatba
az átmenetileg exponált testtájak (pl.: törzs) érintettségével.
A gyermekkori leégések
hajlamosítanak a bőrrák kialakulására. A 18. életévet megelőző
időszak fontosságát
magyarázza egyrészt, hogy a gyermekek nem figyelnek magukra,
bőrük igen érzékeny,
ők szenvedik el az UV életdózis 80%-át és elég sokáig élnek
ahhoz, hogy a késői káros
hatások is manifesztálódjanak. A lökésekben érkező sugárzáshoz –
a nem rendszeresen
napoztatott testtájakon és a nem jól barnulóknál – a szervezet
nem tud hatékonyan
alkalmazkodni, így ez tovább fokozza a kockázatot (Armstrong
1994).
2. táblázat. Az egyes bőrrák típusok fontosabb tulajdonságai
Jellemző BCC (NMSC) SCC (NMSC) CMM Relatív előfordulás gyakori
(80%) közepes (15%) ritka (2%)
Incidencia kapcsolata a földrajzi szélességgel
közepes erős gyenge
Kiváltó tartomány UVB UVB UVA Kockázatos UV terhelés gyermekkori
leégés kumulatív dózis gyermekkori leégés
Prekancerózis lehet nem ismert actinicus keratosis,
papilloma
dysplasiás naevus
Elsősorban károsodik PTCH, p53 ras, p53 ras, INK4a Áttétképző
hajlam szinte nincs előfordul igen agresszív
Prognózis jó közepes rossz
-
27
2.3.9. A bőrrákok tumorbiológiája
Tumorok kialakulásakor a sejtek osztódásának és működésének
szabályozása
felborul a folyamatokat irányító szignál transzdukciós útvonalak
károsodása miatt. A
sejtek biztosítják maguknak a növekedési szignált
(proliferáció), amelyeket gátló
faktorokat a sejtek figyelmen kívül hagynak (dedifferenciáció),
kikerülik a
programozott sejthalált (az apoptosist), korlátlan osztódási
képességre tesznek szert
(immortalizáció), fenntartják az angiogenezist és szöveti
invázióra (metasztatizálás)
válnak hajlamossá (Szende 1999).
Az ultraibolya sugárzás elsődleges célpontja a sejtekben az
örökítőanyag,
amelyben az UV fotonok különböző károsodásokat hoznak létre. A
jelátviteli utak
maradandó károsodása a fehérjéket kódoló gének sérülésére
vezethető vissza. Tumorok
kialakulásához elengedhetetlen legalább egy protoonkogén (pl.:
növekedési faktor vagy
annak receptora) aktivációja (gain of function). Ez az állapot
jellemző a malignomát
megelőző, már osztódási előnnyel rendelkező sejteket tartalmazó
prekancerózisokra
(pl.: keratinocyta burjánzás papillomában SCC-nél). A rák
kialakulásának ezen
sebesség-meghatározó lépését a differenciációs szignálokra
érzéketlen sejtek folyamatos
szelekciója uralja. A malignus transzformációhoz átlagosan
további 3–4
tumorszuppresszor gén (pl.: p53, Rb) inaktivációja (loss of
function) is szükséges
(Grossman és Leffell 1997). Genetikus prediszpozíció esetén már
az őssejtek hordoznak
egy mutációt, ami mellett egyetlen további sérülés (second hit)
is elégséges lehet a
transzformációhoz.
A rákok kialakulásában a mutációk mellett legalább ilyen fontos
szerep jut a
kijavítás elmaradásának is. Egészséges sejtekben az S-fázis
addig nem indul meg, amíg
a DNS hibái fennállnak. Xeroderma pigmentosum A–G variánsaiban a
CPD-k és 6-4
PD-k kijavításának autoszomális recesszív elégtelensége vezet a
bőrrákok 1000-szeres
incidenciájához (de Gruijl és mtsai 2001). Mindezek alapján a
liposzómába zárt
hibajavító enzimek (pl.: T4 endonukleáz V.) a fényvédő
készítmények fontos
alkotóelemeivé válhatnak (Yarosh és mtsai 2001).
A bőrrákok esetében több olyan mutációt azonosítottak, amiknek
kialakulása az
UV sugárzással közvetlenül kapcsolatba hozható. A kis
G-proteineket kódoló ras
protoonkogének károsodását már egyes bőrrákmegelőző állapotokban
is sikerült
kimutatni. Ilyen esetek többségében UVB sugárzásra specifikus
CC→TT tranzíciókat
-
28
találtak a ras génben. A mutáns ras a membrán belső oldalához
asszociáltan GTP-t
kötve aktiválódik és állandó osztódási szignálként bekapcsolva
tartja a növekedési
faktorok tirozin-kináz (TRK) kaszkádját. A PTCH gén hibáját
mutatták ki BCC
sporadikus eseteiben, de familiáris Gorlin- és Bazálsejtes
naevus-szindrómában (BCNS)
is. A mutációk nagy része itt is UVB-specifikus C→T, CC→TT
csere, amiknek
eredményeként felszaporodik az apoptosis egyik inhibitora, a
bcl-2 (Mitchell
és mtsai 1996).
Tumorszuppresszorok UV sugárzás okozta mutációja
valószínűsíthető az Rb és a
p53 jelátviteli utakat is befolyásoló INK4a gén esetében (de
Gruijl és mtsai 2001). A
p53 tumorszuppresszor fehérje kontrollálja a sejtciklust, az
apoptosist, a differenciációt
és a DNS repairt is. A p53 mutációja a humán tumorok felében
kimutatható (de Gruijl
1996). A sejtmag sérülése esetén G1-fázisban tartja a sejtet,
amíg a DNS-t az enzimek
teljesen ki nem javítják, vagy – túlzott mértékű károsodás
esetén – sor nem kerül a
programozott sejthalálra (Szende 1999). Ennek megfelelően
besugárzás után magasabb
a p53 koncentrációja. A gén működésének köszönhető a daganatok
egy részének
elkerülése és a leégést követően az apoptotikus napégés-sejtek
kialakulása. A p53
mutációi SCC-ben és BCC-ben az UVB sugárzásra jellemző jegyeket
mutatják, kisebb
csoportokba tömörülnek a gén mentén, ami a pirimidin dimerek
kijavításának helyi
nehezítettségét tükrözheti. Egy-egy tumorban valamennyi sejt
azonos típusú mutációt
hordoz, bizonyítva, hogy egyetlen sejt klonális expanzója
alakítja ki a daganatot.
Egészséges és korai rákmegelőző állapotokban a mutációk
változatosabbak, ami
szelekciós folyamatok szerepére utal (Grossman és Leffell
1997).
A 8. ábra röviden bemutatja, hogyan eredményezik a bőrrákokhoz
kapcsolható
károsodott ras, INK4a, PTCH és p53 proteinek a sejt bizonyos
jelátviteli útjainak kóros
serkentését, más utak esetében pedig azok kóros gátlását.
Végeredményképpen a
sejtciklust irányító ciklinek és ciklin-dependes-kinázok (cdk)
aktivitásában történik
változás, ami miatt a sejtosztódás és annak gátlása közötti
finom egyensúly felborul.
-
29
8. ábra. A különböző jelátviteli utak szerepe a sejtciklus
szabályozásában
(Szende 1999 kiegészítésével)
2.4. MOLEKULÁRIS HATÁSOK, A DNS KÁROSODÁSA
2.4.1. Molekuláris fotobiológia
Biológiai hatást a fotobiológia I. alaptörvénye értelmében csak
az abszorbeált
energia okoz. A sugárzás elnyelésében főszerepet játszó
molekulák a kromofórok,
amelyek rájuk jellemző abszorpcióval rendelkeznek. A sejt
összetevői a melanin
kivételével az UVA-t kölcsönhatás nélkül átengedik. Az ózon
fogyatkozásával
felszaporodó UVB-t a 9. ábrán bemutatottak szerint
abszorbeálják, ezért az jelentős
hatással van rájuk. A keletkező fotoproduktumok biokémiai
változásokhoz, azok pedig
a sejt reakciójához és az erre adott szervezeti szintű válaszhoz
vezetnek (Longstreth és
mtsai 1998) (9. ábra).
-
30
9. ábra. A sejtek kromofórjaitól indul a biológiai hatás
megjelenéséhez vezető több-
lépcsős folyamat, a fő kromofórok közé tartozik az örökítőanyag
mellett a melanin és
az urokaninsav, továbbá a fehérjékben megtalálható két aminosav:
a tirozin és a trip-
tofán; 290 nm alatti komponenseket a természetes felszíni
sugárzás nem tartalmaz
(Longstreth és mtsai 1998 nyomán)
A sugárzás oki szerepének bizonyítéka, ha egy-egy biológiai
végpontot
(pl.: erythema, karcinogenezis, sejthalál) sikerül egyetlen
molekuláris fotoproduktumra
visszavezetni (pl.: DNS sérülések). Ebben az esetben a
következmény hatásspektruma
és a keresett, sérülő vagy szenzibilizátor kromofór (pl.: DNS)
elnyelési színképe
megegyezik. Hatásspektrumon az objektum által a vizsgált hatás
szempontjából
egyetlen beeső foton felé mutatott felület
(hatáskeresztmetszet), vagy az átalakult
molekulák és az elnyelt fotonok arányának (kvantumhatásfok) a
hullámhossz
függvényében való ábrázolását értjük (Rontó és Tarján 1997).
2.4.2. Lipidek és fehérjék UV sérülései
A fehérjék egy része, a zsírszerű anyagok és egyéb sejtalkotók
nem nyelnek el
jelentős UV energiát, de károsodásuk reaktív oxigén gyökök útján
kialakulhat. Kivételt
képeznek a bőrben a fényelnyelésre specializálódott vegyületek,
mint az urokanin és
elsősorban a melanin. Az UV sugárzás arachidonsav
felszabadulásához vezet
-
31
membránlipid peroxidáció és az ezt követő foszfolipáz-hidrolízis
révén. Az
arachidonsav metabolitjai a gyulladásos mediátorként ismert
prosztaglandinok. Ez is
hozzájárul a leégés alkalmával fellépő inflammáció
kialakulásához (Grossman és
Leffell 1997). A sejtváz érintettsége része lehet a
karcinogenezisnek, mert a
mikrotubulusok szerepet játszanak a sejt növekedésében és
osztódásában.
A proteinek a sejtek szárazanyag-tartalmának több mint 50%-át
teszik ki. Az UV
sugárzás okozta sejthatások hatásspektrumának a DNS elnyeléséhez
viszonyított
vöröseltolódása a fehérjék szerepére utal. Abszorpciójuk
jelentősége egyértelmű az
izokromatid törések és a fehérjékhez kapcsolt sejtfunkciók, mint
a nátrium- és
aminosav-transzport szempontjából. Megfelelő hullámhosszon
végzett besugárzás az
enzimaktivitás csökkenését eredményezi. A fehérjék fő
kromofórjai az aromás
aminosavak, a tirozin és a triptofán – elnyelésük csak 220 nm
alatt és 300 nm felett
közelíti meg a DNS-ét.
2.4.3. A fehérjék szerepe a DNS sérülésében
A DNS–fehérje keresztkötések kialakulásának hatásspektruma a DNS
elnyelését
követi, majd egy második csúcsot mutat 400 nm-nél, amiben
járulékos kromofóroknak
lehet jelentőségük (Peak és Peak 1991). Anaerob körülmények
között a keresztkötések
száma megcsappan, ami reaktív oxigén szerepére utal (Distel és
mtsai 2006). A
hisztonokkal való keresztkötés timin–lizin és
uracil/timin–SH-csoport kapcsolatnak
tudható be. Az ilyen típusú sérülések kialakulása a besugárzást
követően is folytatódik,
amit részben a CPD-k kijavítására érkező enzimeknek a DNS-hez
való kötődésével
magyaráznak (Moan és mtsai 1999). A keresztkötések kijavítására
az élő szervezetek
igen hatékony mechanizmusokkal rendelkeznek (Peak és mtsai
1985).
Támadáspontot az UV fény számára főleg a kromatinban
elhelyezkedő DNS
jelent. A promóter szekvenciákhoz kapcsolódó transzkripciós
aktivátor és represszor
fehérjék védhetik és érzékenyíthetik is a DNS-t (Pfeifer 1997).
A DNS–fehérje kötődés
fotoproduktumok keletkezését befolyásoló hatását elsőként a lac
operon esetében
tapasztalták (Becker és Wang 1984). Valószínűleg a fehérjék
jelenléte árnyékolás révén
nem csak védheti a genomot, hanem a B-DNS geometriájának
torzításával megkönnyíti
a szomszédos nukleotid bázisok kettős kötéseinek fedésbe
kerülését is. A lánc görbítése
számos átírási faktor funkciójához elengedhetetlen, ugyanakkor a
legnagyobb sérülés
-
32
sűrűséget éppen ezeken a szakaszokon mérték. A lokálisan
kialakuló konformáció
jellege szabja meg, hogy melyik lézió milyen gyakorisággal
keletkezik. A kötődő
fehérje a hibák kijavítását is gátolhatja, így fokozva a mutagén
hatást. Másfelől a
fotoproduktumok erősen akadályozhatják a DNS-regulátor proteinek
kötődését. A
sejtciklus szabályozásának befolyásolásával ennek a tumorok
kialakulásában is szerepe
lehet (Pfeifer 1997).
2.4.4. A DNS UV elnyelése
A dezoxiribonukleinsav kettős spirálban egymással szemben
komplementer
nukleotid bázisok helyezkednek el, a molekula kitekert
szerkezete létrához hasonló
képet mutat (10. ábra). A sejt örökítőanyaga szerencsétlen
véletlenképpen az UV
sugárzás fő kromofórja is. Elnyelési spektruma a sejthalál, a
kromoszóma aberrációk és
a transzformáció kialakulásának hatásspektrumához nagyon közel
áll, vagyis sérülése e
folyamatok megindítója. A DNS a legnagyobb energiájú UVC
fotonokra a
legérzékenyebb, abszorpciós maximuma 260 nm körül van, így a
molekuláris hatások
vizsgálatához ez a tartomány jól használható. Biológiai
szempontból a Föld felszínén
csak a DNS által szintén hatásosan abszorbeált UVB-vel kell
számolni. A 220–300 nm-
es sávban valamennyi bázis elnyel, ellentétben a nukleinsav
cukor és foszfát
komponenseivel. UVA esetén endogén fényérzékenyítő anyagok
közvetítésével a DNS
fotooxidációja kerül előtérbe. Az UV sugárzás hatására igen
változatos léziók
keletkezhetnek, amelyek egy részét a 10. ábra mutatja be. A
különböző típusú
fotoproduktumok egymáshoz viszonyított aránya a sugárzás
színképétől és a
körülményektől függ. UVC–UVB hatására túlnyomó többségben
dimer
fotoproduktumok alakulnak ki két szomszédos pirimidin bázisból
(Mitchell
és mtsai 1996).
-
33
10. ábra. A DNS sematikus ábrája és a különböző UV
fotoproduktumok
(Mitchell és mtsai 1996 nyomán)
A fotoproduktumok mutagenitása sejttenyészeteken, bőrrákok és
szintetikus
oligonukleotidok esetében jól követhető. A DNS öröklődő
károsodásai többnyire
tranzíciók (G↔A,C↔T), transzverziók (G/A↔C/T), tandem mutációk
(két bázist érint)
és frame shiftek (3-mal nem osztható számú bázis inzerciója vagy
deléciója).
A környezet is nagymértékben befolyásolja a DNS viselkedését,
ezért erre is
tekintettel kell lenni az örökítőanyagban lejátszódó folyamatok
vizsgálatakor. Nem csak
a nukleinsav denaturációját okozó hőmérséklet-, víztartalom-,
ionerősség- vagy pH-
változások fontosak. A DNS stabilitása széles tartományban (pH
5–9; ionerősség
10-3–1; hőmérséklet: 0 °C–DNS olvadáspontja) nem mutat jelentős
változást. Az életnek
pontosan egy ilyen, szélsőségek között is megbízható
információhordozóra van
szüksége.
A környezet változásaira az örökítőanyag konformáció-változással
reagál, ami a
DNS–UV fény kölcsönhatást, az elnyelési spektrumot is
befolyásolja. A protonálódás és
töltés-átrendeződés talaján meginduló denaturációt minden
esetben hyperkrom effektus,
a nukleotid bázisok „stacking” kölcsönhatásának csökkenése
jelzi. Míg a normál
-
34
DNS-ben, 3,4 Å bázistávolság mellett a lánc elnyelési
spektrumának minősége az azt
felépítő mononukleotidokéhoz képest nem tér el (a λmax azonos),
addig az abszorpció
mértéke ≈30%-os csökkenést mutat. A helikális konfigurációban
létrejövő
kölcsönhatások nem szolgáltatnak kielégítő magyarázatot, hiszen
a hypokrom effektus
akkor is fellép, ha nincs geometriai rendezettség. A nukleozidok
elnyelése a hidrofób
erőknek köszönhetően apoláros oldószerekben is csökken. Sőt,
RNS, egyszálú DNS és
szintetikus polimerek esetében kimutatták, hogy nem is a
hidrogén-kötésektől függ. A
hypokromia mértéke a lánc hosszával hozzávetőleg a 10. tagig
növekszik.
Magyarázattal az egymás közelében lévő bázisok elektrosztatikus
kölcsönhatása és az
ezt elősegítő – poláros közegben fellépő – hidrofób erők
szolgálnak. Az alap és a
gerjesztett állapot közötti elektronátmeneteket jellemző
vektorok a fentieknek
köszönhetően az egyes bázisok esetében részleges fedésbe
kerülnek (Patrick és Rahn
1976). A bázisok egymásra rétegződésében bekövetkező változások
a spektrumban
ezért gyakran hyperkrom effektusként észlelhetők.
2.4.5. A DNS gerjesztése
A DNS-ben elnyelt UV foton a nukleotid bázis kettős kötéseinek
egyik π elektron-
ját egy addig üres π* lazító pályára juttatja, így keletkezik a
260 nm-es abszorpciós
csúcs. A σ elektronok hasonló viselkedése ritka. Átrendeződések,
különböző gerjesztett
állapotok érintettsége, kovalens kötések szakadása és
létrejötte, valamint a molekula
más részeinek való energiaátadás segítségével a végállapot három
úton érhető el. Az
alapállapotba az energiának foton (fluoreszcencia, τ
-
35
11. ábra. A gerjesztő foton energiájának sorsa
(Jablonski-diagram)
A 12. ábrán látható módon az alapállapotból nincs közvetlen
átmenet a triplett
állapotba. Az elektron gerjesztett szingulett állapotának
legalacsonyabb vibrációs
szintjéről viszont már nagyobb valószínűséggel valósul meg az
ábrán is jelölt spin–
tiltott ISC a triplett állapotba. Az átmenet a fordított
irányban is hasonlóképpen
nehézkes. A triplett állapot lecsengése ezért lassabb, így
foszforeszcenciára (τ>10-3
másodperc) képes és a gerjesztés hosszabb élettartama miatt
kémiai reakcióra is jóval
hajlamosabb! Egyes érzékenyítő molekulák (pl.: pszoralén a
PUVA-ban) képesek a
saját maguk által elnyelt energiát az alacsonyabban fekvő
triplett állapotba pumpálni,
ezzel kedveznek a DNS fotoproduktumok kialakulásának (Patrick és
Rahn 1976).
12. ábra. Az energiaállapotok közötti lehetséges átmenetek; a
szingulett állapotból
inter-system crossing révén kialakuló triplett állapot a DNS
fotoproduktumok elő-
futára lehet (Patrick és Rahn 1976 nyomán)
-
36
A kettős hélix szerkezet megváltoztatja a bázisok gerjesztett
állapotának
lecsengését és azok ilyen körülmények között egymásra is
erősebben hatnak. Már
dinukleotidokban is kialakulhatnak excimer állapotok, amiket egy
szingulett gerjesztett
és egy szomszédos, alapállapotú bázis hoz létre
(Crespo-Hernandez és mtsai 2005). A
köztük lévő távolság az energia minimumra való törekvés és a
megváltozott
körülmények miatt csökken, a gerjesztés következményein immár
osztozik a két
molekula. A kialakuló közös energiaszintek alacsonyabbak és
valamivel hosszabb
élettartamúak lesznek a szingulett állapotéinál. Így az
excimerek a fotokémiai reakciók
és a triplett állapotok előfutáraivá válhatnak.
Bár a helikális stabilitás 10 tag fölött nem növekszik tovább, a
lánc hosszával új
lehetőségek nyílnak a többlet energiától való biztonságos
megszabadulásra, így az
abszorpció is változhat. A foton elnyelése és a gerjesztett
állapot kialakulása közötti
időben az energia egy része a közeli, szomszédos kromofór
alacsonyabb
energiaszintjeire átadható. Kétszálú DNS-ben az energia a fotont
elnyelő szál gerince
mentén eloszolhat. Ha sérülés alakul ki, azt az ép komplementer
lánc segítségével a
hibajavító enzimek ki tudják javítani (Crespo-Hernandez és mtsai
2005). A jelenség
szétterjedésének a lánc teljes hossza felett még alacsony
hőmérsékleten is gátat szab,
hogy G–C bázispárokból kialakuló excimerek alacsony
energiaszintjük miatt
csapdaként működnek. Az A–T párok excimerjeiből triplett
állapotú T jöhet létre,
aminek révén a gerjesztés a szingulett energiával szemben, bár
lassabban, de akár 5
bázis távolságra is elvándorolhat, éppen a nagyobb megoszlás
miatt viszont kevesebb
hatással van a DNS tulajdonságaira (Patrick és Rahn 1976).
2.4.6. Ciklobután-pirimidin-dimerek (CPD)
Izolált pirimidinek oldatában a ciklobután-pirimidin-dimerek
(CPD) triplett
állapoton keresztül transz izomerként keletkeznek. A cisz
változat előfutára a szingulett
gerjesztés. Természetes DNS-ben a négy lehetséges diasztereomer
közül csak a cis-syn
variáns fordul elő, ami az UVC-UVB sugárzás fő fotoproduktuma
(13. ábra).
Kialakulásának leginkább a TT és a CT szekvencia kedvez, ahol a
szomszédos bázisok
C5-C6-os kettős kötései között a cikloaddíció nagyobb
valószínűséggel történik meg
(Ravanat és mtsai 2001).
-
37
13. ábra. Ciklobután-pirimidin-dimerek (CPD) (Ravanat és mtsai
2001)
A CPD-k kialakításában résztvevő fotonok a sérülések
visszafordítására is
képesek lehetnek, a folyamat a lézió létrehozásánál mintegy
tízszer nagyobb
kvantumhatásfokkal működik. A dimerek kialakulásának
kvantumhatásfoka ≈20·10-4,
míg a dimerek fotoreverziójáé ≈650·10-4 (Patrick és Rahn
1976).
UVC-vel végzett besugárzás hatására a sejtekben a nagy
molekulasúlyú DNS
szintézisének csökkenését mérték, vagyis a CPD-k a DNS-polimeráz
által végzett
elongációt felfüggesztik. Besugárzás hatására a sejtek mitotikus
indexe átmenetileg
csökkent az S-fázis elhúzódásának köszönhetően. A jelenséget
fotoreaktiváló fénnyel
(UVC) végzett besugárzással – a hosszabb hullámhosszakkal
ellentétben, ahol más
fotoproduktumok dominálnak – meg lehetett szüntetni.
Fotoreverziót okozó besugárzás után az eredeti citozin
visszaalakulása mellett a
C4-es amino-csoport hidrolítikus OH szubsztitúciójával is
számolni kell. Az uracil
megjelenése tranzíciót jelent, pirimidin bázist egy másik
pirimidin helyettesít. A
jelenség a megváltozott párosodás miatt mutagenezisre vezethet,
mert guanin helyett
adenin fog beépülni a komplementer láncba, majd az újabb
replikáció alkalmával az
adenin timinnel kapcsolódik és megtörténik a citozin
lecserélése, ami az UVB-re
jellemző elváltozás (Grossman és Leffell 1997).
2.4.7. Pirimidin-(6-4)-pirimidon fotoproduktumok (6-4 PD)
A 6-4 PD-k keletkezése a DNS abszorpciójának vöröseltolódását
okozza, ugyanis
az UVC-hez képest elnyelési maximumuk (310 nm) a hosszabb
hullámhosszak felé
esik. Fotolízisüket ugyanez a hullámhossz-tartomány okozza. A
párhuzamos keletkezés
és bomlás terméke lehet a Dewar valencia-izomer (10%), ami a CC
szekvenciákat
preferálja (Taylor és mtsai 1990). A kialakuló sérülések lúgos
közegben egyszálú
-
38
törésként manifesztálódhatnak. A 6-4 PD-k elsősorban a CC és TC
szekvenciákat
kedvelik (Pfeifer 1997). Szingulett gerjesztés nyomán az 5’
pirimidin C5-C6-os kettős
kötése és a 3’ bázis C4 karbonil(T)- vagy imino(C)-csoportja
között instabil oxetán
vagy azetidin intermedier érintésével cikloaddíció jön létre a
14. ábrán szemléltetett
reakcióban. A biológiai hatásokért elsősorban a szubsztituált
pirimidon-gyűrű felelős.
Az 5’ citozin itt is uracillá deaminálódhat, de a 3’ C érintett
funkciós csoportja a kötés
kialakításában vesz részt (Ravanat és mtsai 2001).
14. ábra. 6-4 PD és Dewar-izomer kialakulása (Ravanat és mtsai
2001)
Megállapították, hogy az 5’ T-t tartalmazó dipirimidinek 10-szer
fotoreaktívabbak
az 5’ C-oknál, és hogy a 3’ C a 6-4 PD-knek kedvez.
Kialakulásukhoz a CPD-kkel (7˚)
ellentétben a bázisok jelentős kitekeredése (44˚) szükséges, ami
ritkábban valósul meg
(Mitchell és mtsai 1996). Bár mennyiségük a CPD-kének csak
10–50%-a, a sejthalál, a
testvérkromatid cserék, a mutagenezis és a nukleinsav-szintézis
gátlása elsősorban a 6-4
PD-kre vezethető vissza (Ravanat és mtsai 2001).
2.4.8. Pirimidinek egyéb sérülései
Az örökítőanyag dehidrált állapotában, elsősorban
A-konformációban és
vékonyrétegeken a pirimidin dimerek egy további változata, a
spóra fotoproduktum is
kialakulhat (15. ábra). A két timin bázis között létrejövő
5,6-dihidro-5-(α-timinil)-timin
nem csak szomszédos bázisok között alakul ki számottevő
valószínűséggel, hanem a
láncon belül nagyobb távolságokat is áthidalhat, sőt különböző
láncok között is létrejön
(Douki és mtsai 2003).
-
39
A CC→TT tranzíció annak ellenére az UVB mutagenezis
főszereplője, hogy a
kérdéses szekvencia igen alacsony fotoreaktivitást mutat. Ez azt
jelenti, hogy a DNS
öröklődő megváltozását kiváltó hatása – részben a lehetséges
deaminációnak
köszönhetően – igen jelentős. A génexpresszió szabályozásában
résztvevő 5-metil-
citozin sérüléseinek a protoonkogének aktivációjában lehet
szerepe. Szingulett
gerjesztett citozinokon víz molekula nukleofil addíciójára
kerülhet sor, aminek
eredményeként citozin-fotohidrát keletkezik. Deaminációval ez a
termék uracil-
fotohidráttá is átalakulhat (Ravanat és mtsai 2001), amit a 15.
ábra mutat.
15. ábra. Fotohidrát keletkezése (Ravanat és mtsai 2001); spóra
fotoproduktum
(Douki és mtsai 2003); jellegzetes oxidatív lézió: 8-oxodGua
(Ravanat és mtsai 2001)
2.4.9. Oxidatív léziók
Az UVA tartományban, ahol a DNS molekula elnyelése már kevésbé
jelentős,
oxidatív léziók és DNS–fehérje keresztkötések jutnak főszerephez
az örökítőanyag
károsításában. Purin bázisok sérülései főleg ezen az úton
keletkeznek, de a teljes DNS
UVB okozta károsodásához csak mintegy 1%-ban járulnak hozzá.
Kivételt képez az
adeninnek szomszédos adeninnel vagy timinnel kialakított
dimerje, ami bizonyítottan
mutagén.
Az I. mechanizmusú reakciók egyelektronos oxidációt vagy
H-elvonást
jelentenek. A guanin-kationok képződése elsődleges az alacsony
ionizációs potenciál és
a máshol kialakult vándorló elektronhiány befogására való
képesség miatt. A kialakuló
produktum elsősorban 8-oxo-7,8-dihidro-2’-deoxiguanozin
(8-oxodGua, 15. ábra),
amely prolin vagy lizin peptidkötésben részt nem vevő szabad
hidroxil-, vagy amino-
csoportjával lépve kölcsönhatásba a DNS–protein keresztkötések
létrejöttében játszik
kulcsszerepet, de adeninnel is párosodhat (G→T transzverzió, UVA
jellegzetesség).
spóra fotoproduktum
-
40
A triplett gerjesztett fotoszenzibilizátorok
elektron-transzferrel az adenin
oxidációjára képesek. Levegőztetett vizes oldatban elsősorban
2’-deoxi-inozin és kisebb
részben 4,6-diamino-5-formamidopirimidin (FapyAde) keletkezik
(Ravanat
és mtsai 2001).
A purin bázisok C6-os hidratációját követően hidroperoxidok
alakulnak ki,
intramolekuláris átrendeződést követően glikolok, formamidok és
hydantoinok a
végtermékek. A képet a timinek uracillá történő demetilációja
színesíti. A cukor
komponens laktonná alakulása, és N1 deprotonálás során
felszabaduló citozin és timin a
hasonló bázisokkal biadduktumokat képezhet, másik lehetőségként
guaninnal két bázist
érintő tandem sérülés is kialakulhat.
A II. típusú, domináló oxidáció során a sejt gerjesztett
állapotú
fotoszenzibilizátorai (riboflavin, porfirin, szteroid,
benzofenon, kinonok) energia
átadásával szingulett állapotú oxigént hoznak létre, de erre az
eredményre vezet számos
kémiai reakció is. O2-, OH· és H2O2 keletkezik a NADPH-, a
xantin- és a flavin-oxidáz,
a légzési lánc citokrómjai és nukleotid–Fe2+ komplexek működése
nyomán is (Ádám
és mtsai 1996).
A DNS-ben az oxidáció legfőbb támadáspontja az elektron-gazdag
guanin. A
kettős láncban instabil endoperoxidokon keresztül főleg
8-oxodGua keletkezik. Ennek a
molekulának a jelenléte tehát utal az oxidatív stresszre.
Alacsony ionizációs potenciál-
jának köszönhetően másodlagosan is képes I-es és II-es típusú
reakciókban részt venni
(Ravanat és mtsai 2001).
2.4.10. Lánctörések
Míg az UVC és UVB régiókban nem a lánctörések a domináns
sérülések, addig az
UVA és VIS tartományban a sejtekben több keletkezik belőlük,
mint CPD-kből (Peak
és Peak 1991). Itt ugyanis már nem a DNS az egyetlen kromofór,
és az alacsony
energiájú UV sugárzás által keltett reaktív oxigén gyököknek a
száltörések
kialakulásában nagy szerepe lehet. Biológiai jelentőségük nem
szignifikáns, amíg gyors
és teljes kijavításukra lehetőség van, de lánctörésekkel
magyarázható a pontmutációk
alapján várható mértéket meghaladó inaktiváció UVA esetében
(Moan és Peak 1989).
-
41
A száltörések közvetlen kialakulásához az elnyelődött fotonnak
igen nagy
energiával kell rendelkeznie. Elméleti számítások alapján az
egyszálú törések
kialakításához szükséges energiát 20, a kettős szálú törésekhez
szükségeset 50 eV
környékén határozták meg (Nikjoo és mtsai 1999). Ilyen nagy
energiával jellemzően a
vákuum-UV / röntgen tartományba tartozó fotonok rendelkeznek.
Ezekhez képest az
UVC–UVB tartományban jóval kevesebb a száltörés.
A kettős szálú törések keletkezése összefüggést mutat a
sejthalállal. Besugárzás
hatására kialakuló hosszú életidejű protein peroxil-gyökök
kettős szálú DNS lánctörések
kialakításában is részt vesznek. A fehérjék jelenléte nem csak
védheti az
örökítőanyagot, hanem gyökös mechanizmusú reakciókban is
hozzájárulhat a sérülések
kialakulásához (Distel és mtsai 2006).
A DNS dehidrációja a száltörések kialakulásának különösen
kedvez. A DNS
kettős hélixet stabilizáló hidrátburokból vízmolekulák kivonása
olyan szerkezeti
változásokat okoz, amik a cukor–foszfát gerinc kötéseinek
felszakadásához vezethetnek.
A vízelvonás az UV sugárzás által kiváltott száltörések
kialakulását is fokozhatja. Egyes
fotoproduktumok helyén a dehidráció–rehidráció okozta stressz
következtében
alakulhatnak ki száltörések (Dose és mtsai 1996).
2.5. AZ UV SUGÁRZÁS DOZIMETRIÁJA
2.5.1. Fizikai UV dózis
A földfelszínt elérő ultraibolya dózis meghatározására két
eltérő, egymást
kiegészítő módszert dolgoztak ki. Számítógépes matematikai
számításokban a Nap
sugárzási teljesítményét, a beesési szöget, a fotonokat szóró és
elnyelő összetevők –
mint például az ózon, por, vízgőz – koncentrációit veszik
figyelembe. Eredményként
elméleti térképek születnek, amiket a várható UV dózis
előrejelzésére is fel lehet
használni. A matematikai modellel számított UV-indexhez a
W/m2-ben kapott
irradianciát az erythema hatásspektrumával súlyozzák és 40-es
szorzófaktort
alkalmaznak (International Comission on Non-Ionizing Radiation,
1995).
-
42
A hatékony védekezéshez az érintett népesség tájékoztatása
nélkülözhetetlen. Ma
már a világ számos táján a Kanadában bevezetett UV-index az
időjárás-előrejelzés
részét képezi. A nemzetközi rendszer 0-tól 15-ig terjedő skálát
használ, ahol a 8 feletti
értékek már nagyon magasnak számítanak. Az előrejelzés
segítségével a bőrtípus
figyelembevételével az egyén számára elkerülhetővé válik a
túlzott expozíció.
A másik lehetőség az UV sugárzás direkt mérése, kémiai vagy
fizikai hatásai
alapján. Megfelelő aktiválási energiával és
hatáskeresztmetszettel rendelkező
fotokémiai reakciók felhasználhatók erre a célra, például az
aceton bomlása vagy
poliszulfon rétegek sötétedése (Davis és mtsai 1976). Fizikai
dózismérésre elsősorban