ELEKTRONINIO MIKROSKOPO VEIKIMO … TEM.pdfmanoma, kad pirmąjį mikroskopą galėjo sukurti jo tėvas Hansas. Šis pirmasis Jansenų sukurtas sudėtinis mikroskopas buvo paprastas

ELEKTRONINIO MIKROSKOPO VEIKIMO PRINCIPAI IR PRINCIPINĖ PREPARATŲ PARUOŠIMO SCHEMA

Šioje santraukoje pateikiama bendra mikroskopo charakteristika, elektroninio mikroskopo sandaros

schema, teikiamos galimybės, preparatų paruošimo eiga ir vaizdų interpretavimo problemos. Tiriant

mažus objektus, tokius kaip bakterijos ir virusai, tenka ieškoti papildomų tyrimo būdų, kurie

remiasi šiame referate aprašytais.

MIKROSKOPAS (iš graikų mikrós: mažas; skopein: stebėti) yra optinis prietaisas skirtas stipriai

padidintam, plika akim neįžiūrimų objektų (arba jų struktūros detalių), vaizdui gauti. Mažų objektų

tyrimo mokslas vadinamas mikroskopija.

Žmogaus akis sudaro tam tikrą optinę sistemą, kuri turi atitinkamą skiriamąją gebą, t.y. mažiausią

atstumą tarp stebimo objekto elementų, kur tie elementai dar gali būti atskiriami vienas nuo kito.

Normali akis per optimaliausią atstumą atitraukta nuo objekto turi apie 0,08 mm skiriamąją gebą (o

daugelio žmonių - apie 0,20 mm). Mikroorganizmų, daugelio augalų ir gyvūnų ląstelių, smulkių

kristalų, metalų ir lydinių mikrostruktūros detalės ir kt. yra žymiai mažesnio dydžio. Tokių objektų

stebėjimui ir tyrimui pritaikyti įvairių tipų mikroskopai. Mikroskopo pagalba nustatoma forma,

dydis, sandara ir daugelis kitų mikroobjektų charakteristikų. Mikroskopas leidžia skirti struktūras su

atstumais tarp jų elementų iki 0,20 mkm.

Mikroskopai skirstomi į tokias grupes:

• optiniai mikroskopai • stereoskopiniai mikroskopai • lazeriniai (lazeriu apšviečiami) mikroskopai • elektroniniai mikroskopai (apšviečiami elektronų srautu)

Istorija

Pirmojo mikroskopo išradimas paprastai priskiriamas Zacharijui Jansenui, kuris pirmąjį mikroskopą

sukonstravo apie 1595 metus Nyderlanduose. Kadangi Zacharijus tuo metu buvo labai jaunas

manoma, kad pirmąjį mikroskopą galėjo sukurti jo tėvas Hansas. Šis pirmasis Jansenų sukurtas

sudėtinis mikroskopas buvo paprastas vamzdelis su lęšiais abiejuose galuose. Prie pirmųjų

mikroskopų tobulinimo prisidėjo ir anglų išradėjas Robertas Hukas (Robert Hooke, 1635-1703).

Tokie pirmieji mikroskopai didino nuo 3 iki 9 kartų. Šiuolaikiniai tokio tipo mikroskopai didina virš

1000 kartų. Optinio mikroskopo didinimo galimybes riboja difrakcijos fenomenas.

Šviesinio mikroskopo veikimo schema

MIKROSKOPŲ RŪŠYS A. Optinis mikroskopas.B. Elektroninis mikroskopas.

1. Apšvietimo linzė. 2. Stalelis su

preparatu. 3. Objektyvas. 4. Okuliaras.

ŠVIESINIO IR ELEKTRONINIO MIKROSKOPŲ SKIRIAMOSIOS GEBOS PALYGINIMAS

Skiriamoji geba

TRANSMISINIS ELEKTRONINIS MIKROSKOPAS

Figure 1–8. Photograph of the JEM-1230 transmission electron microscope. (Courtesy of JEOL USA, Inc., Peabody, MA.)

Figure 1–9. Schematic view of a transmission electron microscope with its lenses and the pathway of the electrons. CCD, charged coupled device.

TRANSMISINIS IR SKENUOJANTIS ELEKTRONINIAI MIKROSKOPAI

Figure 1–10. Schematic view of a scanning electron microscope.

Figure 1–9. Schematic view of a transmission electron microscope with its lenses and the pathway of the electrons. CCD, charged coupled device.

FOTOGRAFAVIMAS SKENUOJANČIU MIKROSKOPU

PREPARATŲ ELEKTRONINEI MIKROSKOPIJAI PARUOŠIMAS

Iš pradžių laboratoriniam gyvūnui dėl širdies optimalios perfuzijos intraperitoniškai

įšvirkščiama 10000 VV heparino. Praėjus 10-20 min. po heparino injekcijos, gyvūnai eutanizuojami

intraperitonine arba intravenine natrio tiopentalio letalios dozės (50-60 mg/kg) injekcija. Po

torakotomijos, širdis sustabdoma diastolėje, įšvirkščiant į apatinę tuščiąją veną 20 ml šilto

fiziologinio tirpalo su 1 ml 3 M KCl. Į sustabdytą širdies kairiojo skilvelio ertmę transmiokardialiai

įvesdamas metalinis kateteris ir širdis perfuzuojama gazifikuotu (95% O2 ir 5% CO2) 35oC

fiziologiniu tirpalu. Vidutiniškai širdies perfuzija trunka 5-15 min. Perfuzato perteklius išleidžiamas

perkirpus apatinę tuščiąją veną.

Išplovus širdies kraujagysles bei kameras, širdis išimama iš krūtinės ląstos ir patalpinama

specialioje kameroje su atšaldytu iki 4oC fiziologiniu tirpalu. Šioje kameroje nuo širdies pamato

pašalinamos perikardo, stambių kraujagyslių ir kitų tarpuplaučio organų liekanos. Pro viršutinę

tuščiąją ir kairiąją viršutinę plautines venas į prieširdžių ertmes įvedami specialūs su išsipučiančiais

galais kateteriai. Įšvirkščiant į tokių kateterių išsipučiančius galus fiziologinį tirpalą, atstatomos

suglebusios prieširdžių sienos. Tamponuojant vata, ištiesinamos prieširdžių venos. Dėl endokardo

nervų vizualizacijos bei patogesnio jų paėmimo mikroskopiniams tyrimams, daromi įvairių širdies

vietų transmuraliniai pjūviai arba ekstirpuojamos jos dalys. Tam, kad butų geriau matomi

mikroskopiniams tyrimams paimami intrakardiniai nervai, jie vizualizuojami supravitaliniu

metileno mėlio metodu.

Supravitalinis intrakardinių nervinių struktūrų dažymas metileno mėliu. Šiuo metodu buvo

sėkmingai išryškintas eksperimentinių gyvūnų širdies nervinis aparatas. Kadangi metileno mėliu

nudažyti nervai matomi išlieka trumpai, stengiamasi juos paimti per 10-15 min. Metileno mėliu

išryškintas nervinis audinys lieka intaktiškas ir dėl to supravitalinis metileno mėlio metodas

praktiškai yra nepakeičiamas, paimant precizinius mėginius elektronomikroskopiniams tyrimams.

A. Dogelio aprobuotas supravitalinis metileno mėlio metodas (Догель, 1902) turi daug

modifikacijų. Mūsų laboratorijoje paruoštos širdys patalpinamos į 37oC termostatinę kamerą su

aukščiau paminėtos sudėties fiziologiniu tirpalu. Palaipsniui fiziologinis tirpalas pakeičiamas tokiu

pačiu gazifikuotu fiziologiniu tirpalu (pH – 7,0-7,3) su 0,01 – 0,02% metileno mėliu. Dažniausiai

metileno mėlis per 5-10 min. nudažo nervines terminales, per 10-20 min. nervinius pluoštus ir

galiausiai, po 20-60 min. – neuronų kūnus ir nervus. Išryškėjus nerviniams elementams,

mikrochirurginiais instrumentais buvo iškerpami reikiami nervai ar ganglijai ir specialiuose

kiekvienai rūšiai protokoluose pažymima tiksli jų lokalizacija širdyje. Iškirptus gabalėlius

fiksuojame atšaldytame iki 4oC 2,5% glutaraldehide 0,1 M kakodilatiniame buferyje (pH – 7,3).

Iškirpti mėginiai fiksuoti 12 valandų. Po fiksacijos mėginiai buvo praplaunami du kartus po 1 min.

kakodilatiniame buferyje ir papildomai fiksuojami 1% osmio tetraoksidu kakodilatiniame buferyje 1

val. 4oC temperatūroje. Toliau buvo atliekama dehidratacija didėjančios koncentracijos etanolio

tirpalais ir acetonu. Po dehidratacijos mėginiai buvo įliejami į epoksidinių dervų Epon 812 (Serva)

ir Araldit 502 (Serva) mišinį. Polimerizuojama 60oC temperatūroje 48 val.

Pusiau ploni pjūviai pjaustomi ultramikrotomu Tesla BS 490A. Darant pjūvius, svarbu

parinkti tinkamo kietumo ir aštrumo peilius, kad būtų gaunami kokybiški pjūviai. Pjauti epoksidinės

dervos blokams naudojami stikliniai arba deimantiniai peiliai. Šiam tyrimui paimta medžiaga

pjaustoma stikliniais peiliais. Šie peiliai yra gaminami iš specialaus stiklo lakštų, kurie yra laužomi

tam skirtu prietaisu „Knife maker“. Atpjautas pjūvis patenka į prie peilio pritaisytą nedidelę

vandens vonelę. Baigus pjaustymą, pjūviai išimami su blakstiena ir padedami ant objektinio

stiklelio į vandens lašą ir išdžiovinami termostate. Pjūviai dažomi metileno mėliu pagal R.L.

Ridgway (1986).

Ultramikrotomas LKB,

Pusiau plonų pjūvių dažymas pagal Ridgway.

2% kalio permanganato vandenyje ir 1,3% metileno mėlio vandeninio tirpalo sumaišoma

lygiom dalim ir kaitinama 90-95oC temperatūros vandens vonelėje 30 min. Dažas atšaldomas

kambario temperatūroje ir prafiltruojamas. Dar kartą prafiltruojamas 0,22 µm miliporiniu filtru.

Dažoma 10 min. prie 70oC temperatūros. Nudažius preparatas nuplaunamas šaltu tekančiu

vandeniu. Po dažymo, užlašinus lašą epoksidinės dervos ir uždengus dengiamuoju stikleliu, pjūviai

polimerizuojami 60oC temperatūroje per naktį.

Taip paruošti preparatai naudojami šviesinės mikroskopijos analizei.

Nudažyti pusiau ploni pjūviai mikroskopuojami ir analizuojami iš pradžių apžvalginiu x50 ir

x250 didinimu, šviesiniu mikroskopu ZEISS AXIOMAT. Pjūviuose be nervų matomos įvairios

audinio struktūros (kraujagyslės, riebalinės ląstelės, purusis jungiamasis audinys. Nervai, naudojant

aliejinę imersiją, buvo padidinti padidinimu x1000 bei nufotografuoti fotoaparatu NIKON

COOLPIX 4500.

Ruošiant plonus pjūvius pirmiausia išpjaunamos piramidės. Tam reikia du mikroskopus -

peršviečiantį ir stereoskopinį mikroskopus sustatyti greta. Peršviečiančiu mikroskopus stebimas

pusiau plonas pjūvis, o stereoskopiniu – piramidė. Stebint pusiau ploną pjūvį, jame matomos

struktūros surandamos piramidėje. Tai labai subtili procedūra, kurios metu kreipiamas dėmesys į

netiesioginius požymius – rėželius, skirtingų audinių skirtingą blizgesį, tamsumą, didelių ląstelių

kontūrus, audinio gabaliuko formą. Tinkamai suorientavus piramidę, ji sumažinama iki tinkamo

ploniems pjūviams pjauti dydžio. Reikia atkreipti dėmesį į piramidės kraštinių nuožulnumo kampą,

kuris turi būti 90o. Paruoštos ploniesiems pjūviams pjauti piramidės kraštinės ilgis neturėtų būti

didesnis už skutimosi peiliuko briaunos plotį.

Medžiagos, įlietos į epoksidinę dervą, blokai.

Stiklinis peilis, skirtas epoksidinės dervos blokams pjauti.

Piramidės pjovimo schema

Sekantis darbo etapas – plonų pjūvių pjovimas. Ploni pjūviai pjaunami aukštos kokybės

stikliniu arba deimantiniu peiliu. Mūsų laboratorijoje ploniems pjūviams pjauti naudojamas

deimantinis peilis. Pjaunama ultramikrotomu LKB. Naudojant deimantinį peilį reikia būti labai

atsargiam artinant peilį prie piramidės, nes neatsargus priartinimas gali sugadinti brangų peilį.

Ultraplonų pjūvių storis turi būti 60-70 nm ir tai atitinka pilką ir sidabrinę pjūvių spalvą. Auksinės,

geltonos ir kitų spalvų pjūviai yra netinkami stebėjimui elektroniniu mikroskopu, dėl per didelio jų

storio. Atpjauti pjūviai surenkami ant tinkliukų.

Teisingo pjovimo schema.

Sekantis darbo etapas – kontrastavimas arba dažymas. Elektroninei mikroskopijai

ultraplonus pjūvius dažome sunkiųjų metalų druskomis, nes tik sunkiųjų metalų atomai, sudarę

junginius su audinio struktūromis užtikrina gerą elektronų išsklaidymą.

DAŽNIAUSIAI NAUDOJAMŲ MEDŽIAGŲ, SKIRTŲ ULTRAPLONŲ PJŪVIŲ DAŽYMUI-KONTRASTAVIMUI LENTELĖ

OSMIS - 190 - osmio tetraoksidas - proteinus

- lipidus (fosfolipidines membranas,

lipidinius intarpus, sekretus)

URANAS - 238 - uranilacetatas - nukleinines rūgštis (chromatiną, ribosomas)

- proteinus

ŠVINAS - 207 - švino citratas - lipoproteidinės membranos

- proteinai

- glikogenas

- ribonukleoproteinai

VOLFRAMAS - 184 - fosforovolframinė

rūgštis, kai ph≥3

- polisacharidus ir glikoproteinus

- fosforovolframinė

rūgštis, kai ph≤3

- proteinus ir ypač kolageną

FOTOGRAFAVIMAS ELEKTRONINIU MIKROSKOPU

Intrakardinio neurono elektronograma

VAIZDŲ INTERPRETAVIMO PROBLEMOS

Viena iš problemų, su kuriomis susiduriama, yra skersinio nervo pjūvio gavimas. Gavus

įstrižinį nervo pjūvį, išmatuotas nervo plotas bus didesnis negu yra. Išmatavus nervą, pasvirusį 20o

kampu, paklaida bus ne didesnė kaip 6% (Karim et al., 2004). Taip pat labai sunku įvertinti, ar

matomų mielininių skaidulų pjūviai yra skirtingų mielininių skaidulų ar tai tos pačios mielininės

skaidulos kitos vietos pjūvis. Dėl šių priežasčių labai atidžiai buvo parenkami pjūviai

morfometriniams matavimas, nes nervinės skaidulos nervo viduje yra vingiuotos (Ushiki, Ide,

1990) ir pats nervas vingiuoja, todėl ne visi pjūviai buvo gauti skersiniai. Įstrižinių pjūvių

morfometrinio matavimo buvo atsisakyta dėl sunkiai įvertinamo nervo ploto ir mielininių skaidulų

skaičiaus.

Interpretuojant gautus vaizdus reikia būti labai atidiems, vertinant trimates struktūras,

elektronogramose, kurios jau yra tik dvimatis struktūros vaizdas. Iliustracijoje vaizduojama kelių

labai paprastų ir gerai žinomų objektų vaizdas pjūviuose.

Figure 1–30. How different 3-dimensional structures may appear when thin-sectioned. A: Different sections through a hollow ball and a hollow tube. B:A section through a single coiled tube may appear as sections of many separate tubes. C: Sections through a solid ball (above) and sections through a solid cylinder (below).