Top Banner
Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot Dr. Gaye Güler Tezel Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı
87

Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

Jan 01, 2020

Download

Documents

dariahiddleston
Welcome message from author
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
Page 1: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot

Dr. Gaye Güler TezelHacettepe Üniversitesi Tıp FakültesiPatoloji Anabilim Dalı

Page 2: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

Elektroforez

DNA, RNA ve protein moleküllerini büyüklük, şekil ve topolojik özelliklerine göre ayıran bir yöntem

Page 3: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

Elektroforez Çözünmüş durumdaki moleküllerin elektrik

yüklerinin kitlelerine oranıyla belirlenen hızlarda elektriksel alanda göç etmeleri prensibine dayanır.

Nükleik asit ya da protein karışımlarını saflaştırmakta ve analiz yapmakta geniş çapta kullanılır.

Page 4: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

Elektroforez Analiz yapılacak örnek destek ortamına

uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi

düşük molekül ağırlıklı olan moleküller için, Jeller ise nükleik asit ve proteinler gibi büyük

moleküller için destek ortamı olarak kullanılır.

Page 5: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

Jel matriksi jelöz kıvamlı, makromoleküller için elek görevi yapan porlu bir materyal

Agaroz ve akrilamid olarak iki tip matriks

Page 6: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

Horizontal Agaroz Jel Elektroforezi Vertikal poliakrilamid Jel Elektroforezi

DNA/RNA DNA/RNA/Protein

Page 7: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı
Page 8: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

Jelin sahip olduğu porların çapı; jelin kimyasal özelliklerine bağlıdır.

Dokudan hazırlanan makromolekülün (DNA, RNA, protein) ekstreleri tank içinde jel üzerinde elektroforetik olarak koşturulur.

Page 9: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

Jel elektroforezi ile DNA ayırımı

büyük orta küçükElektroforez sonrası

Page 10: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

Büyük moleküller porlardan küçük moleküllere göre daha yavaş geçerler.

Bu boyuta göre ayrılmayı sağlar, buna göre büyük moleküller kuyucuklara yakın kalırken, küçükler daha uzakta yerleşir.

Page 11: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

Jel içerisindeki agarozun miktarı

(%, w/v)

Lineer DNA (bp) moleküllerinin etkin

ayırım aralığı

0.30.60.70.91.21.52.0

5.000 - 60.0001.000 - 20.000

800 - 10.000500 - 7.000400 - 6.000200 - 3.000100 - 2.000

Farklı miktarlarda agaroz içeren jellerin ayırım gücü

Page 12: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

Agarozkonsantrasyonu

(%)

Ksilen Siyanol

Bromofenol Mavisi

0.5-1,52.0-3.04.0-5.0

4-5 kb750 bp125 bp

400-500 bp100 bp25 bp

Örnek yükleme boyaları ile DNA migrasyonu

Page 13: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

Etidyum bromid ile boyanmış agaroz jelin UV-transilluminator’daki görüntüsü

Page 14: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı
Page 15: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

Proteinlerin jelde ayrımı sadece moleküler ağırlıklarına göre değil hacimlerine göre olur.

Page 16: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı
Page 17: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

Aynı molekül ağırlığa sahip molekülden biri sekonder yapıda ise primere göre daha küçük ve dolayısıyla daha hızlı olacaktır.

Bu nedenle jelde ayrım sekonder/tersiyer yapılar uzaklaştırıldıktan sonra primer yapı içerenler arasında yapılır.

Elektroforez için DNA, RNA ve protein örnekleri hazırlanırken farklı teknikler bu amaçla kullanılır.

Page 18: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

PAGE

Page 19: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

Akrilamid (% [w/v])

Etkin ayırım aralığı (bp)

Ksilen siyanol Bromofenol mavisi

3.55.08.012.015.020.0

1.000-2.000 80-500

60-40040-20025-1506-100

460260160706045

1006545201512

Poliakrilamid jelde DNA ayırımının etkin aralığı

Page 20: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

Poliakrilamid jelde protein ayırımının etkin aralığı

Jel (%)Protein büyüklüğü

(kDa)

5-155-208-158-2010-20

20-20010-20010-1008-1506-150

Page 21: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

Örnek 1: tek bir sınıf makromolekül (plazmid, pür mRNA, pürifiye proteinÖrnek 2: restriksiyon enzimi ile kesilmiş total DNA, total RNA veya total protein)

Page 22: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

Kullanım Alanları Nükleik Asit analizi PCR ürünlerinin görüntülenmesi Mutasyon analizi ( RFLP, SSCP) Dizileme Southern, Northern blot

Protein Analizi Western blot

Nükleik asit ve proteinlerin saflaştırılması

Page 23: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

Moleküler Ağırlık DNA: Baz çifti ya da bp, sıklıkla kilobaz-

çifti(1000bp), ya da kbp RNA: Nükleotid olarak ya da nt, sıklıkla

kilonükleotid (1000nt), ya da knt [Bazen, baz, ya da b veya kb]

Protein: Dalton ya da Da, veya sıklıkla kiloDalton (1000Da), ya da kDa olarak ifade edilirler.

Page 24: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

Genellikle bir kuyucuk molekül ağırlığı bilinen bir DNA, RNA veya protein marker (belirleyici) ile yüklenir. Bu markerlar aynı zamanda kalibrasyonu sağlar.

Page 25: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

Daha sonra jel belli sınıf makromolekül için spesifik ancak sequence spesifik olmayan bir boya ile boyanır (Problar sequence-bağımlıdır).

Page 26: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

DNA----Southern blot

RNA----Northern blot

Protein—Western blot

Page 27: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

Southern Blot 1975 Edward Southern

Hedef DNA’ya nükleik asit hibridizasyonu

DNA restriksiyon enzimleriyle kesilir veya PCR

DNA parçaları agaroz jelde ayrılır

Prob ile hedef gen/DNA dizisi hibridize edilir

Görüntüleme

Page 28: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

DNA

İlk zincir GGGTTTAAACCC İkinci zincir CCCAAATTTGGG

Page 29: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

Baz çiftlerinin Chargaff kuralı

•A ile T: Bir pürin olan adenin (A) her zaman bir pirimidin olan timin (T) ile eşleşir

•C ile G: Bir pirimidin olan sitozin (C) her zaman bir pürin olan guanin (G) ile eşleşir

Page 30: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

Southern Blot

Restriksiyonenzimi

DNA fragmanları

Elektroforez

Jel

Denatürasyon - transfer

blot

Page 31: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

Görüntüleme

blot

Probe ile hibridizasyon

Page 32: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

Southern blotting

DNA fragmanları agaroz jel elektroforezi ile ayrılır

Ayrılan DNA fragmanları membran üzerine aktarılır

Ayrılan DNA fragmanları ile işaretli DNA probu hibridize edilir

İşaretli DNA probu ile bağlanan DNA bantları görünür hale getirilir

Page 33: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı
Page 34: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

Sourthern Blot Uygulaması1. DNA’nın kesimi/PCR

2. Agaroz jelde ayırım

3. DNA’nın denatürasyonu ;

0.5M NaOH ile dsDNAssDNA

sadece ssDNA transfer olabilir

4. Opsiyonel olarak (>15 kb) 0.2M HCl ile depürinasyon yapılır.

5. Yüksek tuz konsantrasyonunda (3M NaCl) nötralizasyon

re-hibridizasyonu önlemek

6. Kapiller transfer

7. Fikzasyon (UV 254 nm veya 80˚C 1-2 saat)

8. Hibridizasyon

9. Görüntüleme (Biotin/streptovidin)

Page 35: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

Southern blottingDNA fragmanlarını agaroz jele yükle

Elektroforez uygula

DNA fragmanlarını agaroz jelden membranatransfer et

DNA bantlarını mebranafikse et

Membrana işaretli bir probe ekle(Buffer içinde)

Hedef diziye bağlanan probun yerini görüntüleme yöntemi ile açığa çıkar

Page 36: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

Farklı sınıf makromoleküller için farklı boyalar ve boyama prosedürleri DNA boyanması

Nükleik asitlere bağlanan ethidium bromide (EtBr) kullanılır, DNA-EtBr kompleksi UV ışık altında fluoresan verir.

RNA boyanması Nükleik asitlere bağlanan ethidium bromide (EtBr)

kullanılır, RNA-EtBr kompleksi UV ışık altında fluoresan verir.

Protein boyanması Protein Coomassie Blue (CB) ile boyanır. Protein-CB

kompleksi koyu mavidir ve normal ışıkda görülebilir.

Page 37: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

DNA,RNA ve Proteinin membrana bağlanmasında başlıca iki yol vardır:

Page 38: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

1) Negatif yüklü moleküller için avantaj olan elektroforez

Page 39: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

2) Islak filtre kağıdından kuruya doğru buffer akımı olan kapiller blotting

Page 40: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

Western Blot (Immunoblotting)

1979 yılında Towbin tarafından tanımlanmış protein analiz yöntemi

Jelde ayırımı yapılmış proteinlerin membrana emdirilerek ilgilenilen proteinin radyoaktif izotopla ya da başka şekilde işaretlenmiş özel antikor yardımıyla membran üzerinde belirlenmesidir.

Page 41: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

Antikor spesifik antijenini tanıdığından immunoblotting olarak da isimlendirilir

Western blotting kompleks karışım içinden spesifik proteinin tanınması ve bu protein hakkında kalitatif ve semikantitatif veri elde edilmesinde kullanılır

Page 42: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

Yöntem Jel elektroforezi ile proteinlerin ayrılması Jelde ayrılmış proteinlerin membrana transferi-

blotlama Nonspesifik bağlanma bölgelerinin blokajı-bloklama Primer ve sekonder antikor aşamaları İşaretleyiciye uygun substrat ile reaksiyon Görüntüleme

Page 43: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı
Page 44: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

Birinci basamak

Jel elektroforezi kullanılarak makromoleküllerin ayrılmasıdır

(Çözünmüş durumdaki moleküllerin elektrik yüklerinin kitlelerine oranıyla belirlenen hızlarda elektriksel alanda göç etmeleri prensibine dayanır)

Page 45: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı
Page 46: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı
Page 47: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

Örnek yükleme kılavuzuPipet ucu

Page 48: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı
Page 49: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı
Page 50: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

İkinci basamak

Ayrılmış moleküllerin ikinci bir matrikse (genelde nitroselüloz ya da polivinilidin difluorid-PVDF membrana) transferi ya da blotlanmasıdır

Page 51: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

Proteinin Membrana Transferi Jelden matrikse elektroforetik transfer

(blotting) protein içeren poliakrilamid jel ile nitroselüloz ya da protein bağlayıcı başka bir desteğe direkt teması ve sandwich modeli şeklinde gerçekleşir

DNA, RNA, veya protein membrana sequence-bağımsız olarak yapışır.

Page 52: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

Membran filtreler Çok küçük gözenekleri olan polimer

yapıdaki filtrelerdir.

1. Eylemsiz (inert)2. Saf selüloz esterleri

Page 53: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı
Page 54: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

Ultrafiltrasyon Moleküller boyut, biçim ve yüklerine göre

ayrılabilir. Por çapları 1-20nm arasındadır. Kullanılacak zarın por çapı çalışılan

molekülün geçmesine izin vermeyecek şekilde olmalıdır.

NMWC (Nominal Molecular Weight Cut Off) değeri zardan geçemeyen molekülün ağırlığına eşdeğerdir.

Page 55: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

Bu amaçla kullanılan filtreler genelde iki tabakalıdır. Birinci tabaka selüloz asetat, naylon veya polivinilidinden yapılmış zar, ikinci tabaka daha kalın inert destek tabanıdır.

Selüloz nitrat ve polivinilidin fluorid filtreleri özellikle protein ve nükleik asit bağlama kapasitesine sahiptir.

Page 56: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı
Page 57: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

Nitroselüloz membran Protein blottingi için en popüler matrikslerden

biridir Çoğu protein 0.45 µm pore büyüklüğüne

sahip membran kullanılarak başarıyla blotlanabilir

Düşük molekül ağırlıklı proteinler ya da peptidler için 0.2 µm pore büyüklüğü tavsiye edilir

Page 58: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

PVDF Membran

PVDF membranların por büyüklükleri 0.2 ya da 0.45 µm

Bu membranlar proteinler ve nükleik asitler için yüksek bağlanma afinitesine sahiptir ve Western, Southern, Northern ve dot blotçalışmaları için uygundur

Page 59: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı
Page 60: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

Filtre kağıdı

Elektroforez jelinden membrana proteinlerin hızlı ve etkili transferi için kullanılır

Protein içeren poliakrilamid jel membran ile filtre kağıdı arasında direkt temasta olacak şekilde yerleştirilir ve en dışta sünger destekler kalır.

Page 61: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

Blotting Ünitesi

Page 62: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

Buffer tankı

Soğutma ünitesiElektrot modülü

Jel tutucu kaset

kapak

Page 63: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

süngerfiltre kağıdımembranjelfiltre kağıdısünger

Page 64: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı
Page 65: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı
Page 66: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı
Page 67: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

Elektrik uygulandığında proteinler poliakrilamid jelden sıkıca bağlandıkları membran yüzeyine hareket ederler

Membranda jeldeki protein paterninin aynen kopyası olur

Page 68: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı
Page 69: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

Transfer etkinliği proteinin jelden migrasyon yeteneği, membrana bağlanma özelliği, jel ve membranın komplet teması, elektrotların pozisyonu, transfer süresi, proteinlerin büyüklüğü, alan direnci ve deterjanların varlığına bağlıdır

Optimal transfer düşük-iyon dirençli bufferlar ve düşük elektrik direncinde olur

Page 70: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

Üçüncü basamak-Bloklama Membran üzerindeki nonspesifik bağlanma

bölgelerinin bloke edilmesi gerekmektedir Bu amaçla süt veya normal serum

kullanılabilir Hangi bloklama ajanının kullanılacağı

antijen ve enzim konjugata bağlıdır Alkalen fosfataz kullanıldığında buffer

olarak tris-buffered salin seçilmelidir

Page 71: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

Bloklama Süt değişen oranlarda biotin içerdiğinden

avidin-biotin sisteminde bloklama amaçlı süt kullanılmaz

Her sistem için optimal tek bir bloklama ajanı yok.

Page 72: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

Dördüncü basamak

Primer ve sekonder antikor ile reaksiyon

Transfer edilmiş protein enzim-işaretli antikor ile kompleks oluşturur

Enzim için uygun substrat eklenir, böylece membran üzerinde kromojenik ya da fluorojenik presipitat oluşur

Page 73: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

Primer ve Sekonder Antikorlar Primer antikor seçimi tanınacak antijene

bağlıdır Poliklonal antikorlar daha ucuz, üretimi kolay,

antijen için yüksek afiniteye sahiptir Monoklonal antikorlar yüksek spesifite ve

saflığa sahiptir

Page 74: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

Membranın yıkanması Bağlanmamış ajanların elimine edilmesi için

gerekli bir basamakdır Yetersiz yıkama yüksek zemin etkisine, çok

yıkama ise antikor veya antijenin blottan kaybına neden olabilir

Yıkama için TBS ya da PBS bufferları, sıklıkla %0.05 Tween 20 gibi bir deterjan eklenerek kullanılır

Page 75: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

Sekonder antikorun seçimi primer antikorun geliştirildiği canlıya bağlıdır

Optimal dilüsyon denenerek saptanır

Page 76: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

Biotin, fluoresan, rodamin, horseradish peroksidaz, alkalen fosfataz işaretleyicileri kullanılabilir

Page 77: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

Kromojenik Substratlar Seçilecek olan substrat istenen sensitivite,

tanıma metodu, sinyalin şekline ve kullanılan enzim işaretleyicisine göre değişiklik gösterir

Basit ve etkili bir yol Bu substratlar uygun enzim ile biraraya

geldiğinde membran üzerinde çözünmeyen renkli presipitatlar oluşturur ve ek görüntülemeye ihtiyaç duymazlar

Page 78: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

TMB (3,3’,5,5’-tetrametilbenzidin), 4-CN (4-kloro-1-naftol) ve DAB (3,3’,-diaminobenzidintetrahidroklorid) HRP ile NBT (nitro-blue tetrazolium klorid) ve BCIP (5-bromo-4-kloro-3’indolilfosfat p-toluidin tuzu) ise AP ile kullanılabilecek kromojenik substratlardır

Page 79: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

HRP ile yapılacak kolorimetrik deteksiyon için substrata peroksid eklenmelidir

Page 80: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

Kemiluminesan Substratlar Kemiluminesan substrat kullanımı en duyarlı

saptama metodudur

Enzim ile kombine olduğunda kimyasal reaksiyon ışık verir

Film banyosu sonrası siyah renkte spotlar (bant) izlenir

Page 81: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı
Page 82: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

Avantajları

En iyi imaj yakalanana kadar film süresi denenebilir

Tüm blot “stripping” buffer ile uzaklaştırılabilir, aynı membrana başka probla reaksiyona izin verir

Herşeyden önemlisi herhangi bir deteksiyon yönteminden daha fazla sensitiviteye sahiptir

Page 83: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

Olası Aksaklıklar ve Nedenleri-1 Uniform olarak dağılmış yüksek zemin etkisi1. Yüksek antikor konsantrasyonları2. Yetersiz veya uygunsuz blokaj3. Yetersiz yıkama4. Film süresinin uzun olması5. Membranın kuruması

Page 84: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

Olası Aksaklıklar ve Nedenleri-2 Leke şeklinde yüksek zemin etkisi1. Yüksek antikor konsantrasyonları2. HRP da agregat formasyonu3. Yanlış bloklama bufferının kullanımı4. Membranın uygun olmayan ıslaklığı

Page 85: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

Olası Aksaklıklar ve Nedenleri-3 Zayıf sinyal veya sinyalin yokluğu1. Proteinlerin membrana başarısız transferi2. Membrana yetersiz bağlanma3. Yetersiz antikor miktarı4. Yetersiz antijen miktarı5. Bloklama bufferının antijeni baskılaması6. Koruyucu olarak azidin kullanıması (HRP inhibe

olur)7. İnkübasyon sürelerinin ve film süresinin kısa

olması

Page 86: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

Olası Aksaklıklar ve Nedenleri-4 Nonspesifik veya diffüz bantlar1. Yüksek antikor konsantrasyonları2. Jele çok fazla protein yüklenmesi

Siyah bölgeler1. Jelden inkomplet transfer (transfer sırasında

jel ve membran arasında hava kalmamalı)

Page 87: Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot · Analiz yapılacak örnek destek ortamına uygulanır. Selüloz aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı

Southern Blot

Western Blotting


Related Documents
Blot | October 2013

Blot | October 2013

Category: Documents
Jurnal Northern Blot

Jurnal Northern Blot

Category: Documents
Agaroz Jel Elektroforezi & İki Boyutlu Jel Elektroforez

Agaroz Jel Elektroforezi & İki Boyutlu Jel Elektroforez

Category: Technology
Blot | October 2010

Blot | October 2010

Category: Documents
Southern Blot

Southern Blot

Category: Documents
Aminoasitler Ve Protein Metobolizmasi

Aminoasitler Ve Protein Metobolizmasi

Category: Documents
Southern blot exposé1

Southern blot exposé1

Category: Documents
Blot : myc

Blot : myc

Category: Documents
Spawned naming of related techniques: Southern blot (DNA) Northern blot (RNA) Western blot (Protein) Eastern blot (???)

Spawned naming of related techniques: Southern blot (DNA)...

Category: Documents
Fluorescent Western Blot Kit: MaxTagâ„¢ for IRDYE Western Blot

Fluorescent Western Blot Kit: MaxTagâ„¢ for IRDYE...

Category: Documents
Northern blot

Northern blot

Category: Education
Northern Blot Fix

Northern Blot Fix

Category: Documents