Ektomykorhizní symbiózaregent.jcu.cz/roots/ektometody.pdf · •Houba kolonizuje úsek laterálního kořínku tak, že hyfami proniká do primární kůry kořene a v mezibuněčných

EktomykorhizníEktomykorhizní symbiózasymbióza

Co to je ektomykorhiza?

•Symbiotické spojení mezi houbou a rostlinou

•Formuje se na fyziologicky aktivních laterálních kořínkách dřevin

•Ektomykorhiza je morfologická formace, na jejímž vzhledu se podílí jak rostlina tak houba

Kolonizace laterálních kořínků

Hartigova síť

Houbový plášťStřední válec kořene

kortex

endodermis

•Houba kolonizuje úsek laterálního kořínku tak, že hyfami proniká do primární kůry kořene a v mezibuněčných prostorách tvoří myceliární sít nazývanou „Hartigovasíť“.

•Hartigova síť: u gymnospermních rostlin se formuje kolem a mezi buňkamikortexu (ale nepenetrují), angiospermních rostlin i u epidermálních buněk.

Na povrchu kořene se z hyf utvoří kompaktní povlak – hyfový plášť, který změní morfologii, anatomii a celkový vzhled kolonizovaného kořínku.

•Ostatní struktury: extramatrikální hyfy, sklerocia, rhizomorfy, laktifery, cystidia…

•Vyskytuje se, až na vyjímky, výhradně u dřevin

Je známo:

cca: 2.000 druhů rostlin, které tvoří ektomykorhizu

(Betulaceae, Dipterocarpaceae, Fagaceae , Myrtaceae, Pinaceae, Salicaceae)

Cca 5.000 druhů hub, které tvoří ektomykorhizuOdd: Basidiomycota příklad:Agaricales: Amanita sp.Russulales: Russula sp, Lactarius sp.Boletales: Boletus sp., Paxillus sp.Gomphales: Ramaria sp.Cantharellales: Cantharellus sp.Polyporoid: Polyporus sp, , Sistotrema sp.,Hymenochaetales: Coltricia sp.Thelephorales: Thelephora sp.

Odd: AscomycotaTuberales: Tuber sp, Terfezia sp.

Pezizales: Morchella sp., Genea sp., Helvella sp, Gyromitra sp.

Elaphomycetales: Elaphomycetales sp.

Deuteromycetes: Mycelia sterila: Coenococcum sp.

Proč?Rostlina poskytuje houbě:• sacharidy: udává se, že rostliny investují až 10% fotosyntetických produktůdo svého mykobionta• glukóza je enzymaticky houbou přeměněna na trehalozu, manitol a glykogen

• pro houby jsou to zásobní látky a látky nezbytné ke klíčení spór

Houba poskytuje rostlině:• fosfor, vápník, draslík, mikroprvky• vodu• ochrana proti půdním patogenům•Zvyšuje aktivní povrch kořenů•Produkuje auxiny a gibereliny (rostlinné hormony)

Jak se ektomykorhiza utvoří ?

•Vztah mezi houbou a rostlinou je dán geneticky, podílely se na něm evoluční procesy

• vztah je založen na synchronizovaném růstu kořenů a houby tj. narůstu a diferenciaci hyfy

Rhizopogon sp.

•Ze spór vyklíčí monokaryotické mycelium (Basidiomycety), které se mění (fúze a přezky) na dikaryotické (morfogeneze) aktivní mycelium, které aktivně (růstové tropismy)vyhledává hostitele, čerstvé aktivní kořínky.

•Hyfa kontaktuje povrch, enzymaticky a mechanicky rozrušuje povrchové buňky a tvoří hyfální plášť. Tento proces je doprovázen řadou biochemických reakcí, jak ze strany houby tak ze strany rostliny.

•Z hyfálního pláště se pak pojí množství externích hyf s půdním okolím kořínku vytváří tzv. aktivní zónu(několik mmm kolem kořínku)

•Hyfa penetruje a kolonizuje prostor kortexu (jehličnany) a epidermálních buněk (listnáče) a formuje Hartigovu síť

•Rostliny po dobu formace ektomykorhizního spojení produkují polyfenoly a sekundární metabolity, jenž zvyšují jejich rezistenci proti půdním patogenům – houbám, bakteriím i hmyzu.

•Houba sama o sobě má ještě tzv. bakteriální pomocníky (helper bacteria), které usnadňují kolonizaci kořene

•Ektomykorhizní spojení na 1 laterálním kořínku je časově i prostorově omezené. Závisí na stáří a fyziologii laterálního kořínku. Hartigova sít postupně odumírá a hyfální plášť mění na základě metabolitů barvu a postupně odumírá (jedná se ale o jeden jediný morfotyp a současně se vždy tvoří mnoho nových současně s růstem dalších laterálních kořínků).

Výsledkem je:•že na kořeni 1 stromu se tvoří , je a odumírá množství ektomykorhiz, tvořené rozmanitými druhy hub

•Kořínek může houbu přerůst a často bývá kolonizován více druhy ECMf

•Na základě toho, jak jsou ECM houby dominantní v prostoru a čase rozlišujeme

•Ranně sukcesní druhy, pozdně sukcesní druhy a multisukcesní (early, late, & multi-stage)

•Tvorba plodnic nesouvisí s tvorbou ECM, nemusí ovlivňovat dominanci druhu na kořenech dané dřeviny

•Na základě biologické specifičnosti druhu (metabolity, biochemické aktivity, morfologie) je ektomykorhiza formovaná každým konkrétním rodem morfologicky odlišná –pozměňuje tvar a barvu kořínku – ektomykorhizní morfotypy

Na čem závisí druhové spektrum ektomykorhizních hub?

1. Rostlina- druh, věk, fyziologický stav

2. Houba – druh, specifická vazba na hostitele, nutriční požadavky

3. Prostředí- typ půdy (moder - ektomykorhizní, mor – ekto, ektendo-, erikoidní), okolní vlivy – hnojení, sešlap, spady.. Etc. Počasí – období vegetačního klidu pro dřeviny – omezená tvorba ektomykorhizních špiček, tenčí hyfální plášť apod.

čas

R

H prostředí

Jak určím o kterou ektomykorhizní houbu se jedná?

•Plodnice

•Morfologické charakteristiky

•Anatomické charakteristiky

•Molekulární metody

Hebeloma crustuliniforme

•Plodnice mohou být resupinátní až pileátní•Hymenofór – hladký, zubaté, porovité•Monomitický systém•Hyfy jsou tmavé, pigmentované•Zástupci jsou lignikolní druhy nebo mykorhizní

Řád: Theleophorales(plesňákotvaré)

Metody identifikace ektomykorhiz

a. Binolupa + mikroskop

• Kvalitativní určení – rod (druh) houby

• Kvantitativní určení –procentické zastoupení druhu na celkové mykorhizaci, frekvence 1 druhu na definovanou délku kořene

Morfologie ECM špiček – morfotypy:určujeme pod binolupou, propláchnuté kořínky jsou zcela ponořené ve vodě v Petrihomisce!

1. Větvení, délka, abundance, průměr mykorhizních špiček

Nevětvené solitérní špičky (Coenococcum sp.)

Monopodiálně pinátní (Russula nigricans)

Nepravidelně větvené (Thelephora sp.)

Koraloidní (Rhizopogon sp.)

2. Zakončení nevětvených částí morfotypů:

rovné

ohnuté

vlnité

kroucené

smáčknuté mezi mladší a starší částí

3. Povrch houbového pláště + barva

Hustě zrnatý nebo bradavičnatý

Silně vlnatý

ochmýřený

Hladký lesklý

Tomentella sp.

4. Přítomnost ostatních struktur – rhizomorfy, extramatrikální hyfy (morfologie), cystidia, sklerocia, laktifery.

Amphinema byssoides: Thelephorales

5. Anatomie morfotypu: Hartigova síť a uspořádání buněk hyfálního pláště. – mikroskop

Paxillus involutus - Hartigova síť

Anatomie pláště a Hartigovy sítě

1. Celková anatomie mykorhizy

2. Anatomie laktifer, hyf (přítomnost přezek, anatomóz, napojení hyf etc.)

3. Jednotlivých vrstev houbového pláště

4. Tvar a uspořádání buněk

(parenchymatické,pseudoparenchymatické)

1. Přítomnost chlamydospór, haustorií

Hyfa s přezkou

Scleroderma citrinum(Basidiomycota: Sclerodermatales)

rhizomorfa

Laccaria sp.Basidiomycota: Agaricales

(Quercus robur)

Rhizomorfy

Paxillus involutusBoletales: Homobasidiomycetes:Basidiomycota(Quercus robur)

Coenococcum geophillum:

Ř: Mycelia sterila:

č: Deuteromycetes:

Kmen: Ascomycota

(melanizovaný povrch, R-strategové)

6. Využití autofluorescence v určité vlnové délce (UV filtr)

7. Chemické reakce (Fuchsin, anilin, síran železitý,Melzerovo reagens, sulfovanilin etc.)

c. Molekulární metody používané k identifikaci ECM hub a jejich populací

Něco málo o DNA hub….U většiny ECM hub je DNA vysoce polymorfní… výhodné a strategické

•Polymorfní úseky s neznámou funkcí - anonymní loci

•Polymorfní úseky se vyskytují v určité frekvenci…ITS (interspecific transcribed spacer) repetitivní úseky)

Pro ECM:

ITS1

ITS2

ITS 1F

ITS 4 (reverse)

1. PCR-rITS- RFLP – metoda analýzy restrikčních fragmentů

genetickégenetické markerymarkery = značky, ukazatele se silnou = značky, ukazatele se silnou genetickou kontrolou, neovlivněnou prostředímgenetickou kontrolou, neovlivněnou prostředím•• morfologickémorfologické markerymarkery (barva HO)(barva HO)

•• biochemickébiochemické markerymarkery (přítomnost určitých látek v HO (přítomnost určitých látek v HO podmiňují geny podmiňují geny --> přítomnost látky dokazuje přítomnost genu)> přítomnost látky dokazuje přítomnost genu)

•• molekulárnímolekulární markerymarkery (analýzy DNA )(analýzy DNA )DNA DNA markerymarkery….molekulární ….molekulární markerymarkery

2.2. Metoda přímé Metoda přímé sekvenacesekvenace3. Metoda hybridizace PCR produktu, klonování a 3. Metoda hybridizace PCR produktu, klonování a

sekvenacesekvenace4. Metoda 4. Metoda mikrosatelitních markerůmikrosatelitních markerů, , ssrssr-- markery markery

(single (single sequence repeat markerssequence repeat markers) ) (velmi krátké motivy (velmi krátké motivy ––22--6 6 bpbp, opakující se v DNA s určitou pravidelností v rámci rodu, druhu, opakující se v DNA s určitou pravidelností v rámci rodu, druhu))

5. DGGE 5. DGGE ((denaturating denaturating gradient gelgradient gel electrophoresiselectrophoresis))

Molekulární markery:umožňují identifikaci organizmuumožňují identifikaci organizmustanoví příbuzenské vztahystanoví příbuzenské vztahy

Výhoda Výhoda DNADNA markerůmarkerů::rychlá a spolehlivá determinacerychlá a spolehlivá determinace

základní princip metody PCR ITS RFLPzákladní princip metody PCR ITS RFLPI.I. štěpení celkové DNA (s štěpení celkové DNA (s amplifikovanýmiamplifikovanými ITS ITS

úseky) na fragmenty pomocí restrikčníchúseky) na fragmenty pomocí restrikčníchendonukleázendonukleáz

II.II. elektroforetické rozdělení fragmentů dle délkyelektroforetické rozdělení fragmentů dle délky

III.III. přenos fragmentů na membránupřenos fragmentů na membránu

IV.IV. hybridizace DNA hybridizace DNA

Zdrojem DNA v případě ECM bude:

•Kořenová špička - očištěná

•In vitro kultura (y) – získaná (é) z kořenové špičky

PCRPolymerase Chain Reaction(polymerázová řetězová reakce)

- vyvinuto v 80. letech 20. století- jedna z nejpoužívanějších metod molekulárně genetické

diagnostiky

základní princip metody• in vitro syntéza vybraného úseku DNA, která probíhá v

mnoha opakujících se cyklech • fragmenty nasyntetizované během reakce lze

pozorovat na agarózovém gelu• možno analyzovat i velmi malé množství DNA

PCR - teplotní fáze

1. teplotní fáze 95 °C - denaturacezvýšením teploty dojde k oddělení obou řetězců dvoušroubovice od sebe (řetězce jsou k sobě poutány vodíkovými můstky, dodání energie zapříčiní zánik těchto vazebných interakcí)

2. teplotní fáze 35 - 65 °C – annealingochlazení umožní přisednutí primerů k homologním místům a vytvoření krátkých dvoušroubovic DNA

3. teplotní fáze 72 °C – polymerace upravením teploty (zvýšením) na hodnotu vhodnou pro působení DNApolymerázy dochází k prodlužování dvoušroubovice DNA (5´ 3´) až po začátek další denaturace (nového cyklu)

Průběh PCR• daný fragment DNA přibývá exponenciální rychlostí

(2n = počet fragmentů po n cyklech)• v praxi se používá cca 30 cyklů, při nichž dojde k vyčerpání reakčních

složek a růst se zastavuje

poznámka: billion je v češtině miliarda

Výsledkem je PCR produkt s amplifikovanými ITS úseky

•Nejčastěji: ITS 1, ITS2, ITS 4, ITS 1-F (nespecifické markery)

•Specifické markery: syntetizované pro daný konkrétní druh

•Vizuální efekt: elektroforetický produkt s rozdílným bp (páry bazí)…(rozdílná délka produktů vzhledem k rozdílnosti analyzovaných morfotypů)

•rozdíly zatím neříkají vůbec nic o druhovém složení

•Další krok: stěpíme!!!

Štěpení celkové DNA na fragmenty pomocí restrikčních endonukleáz

• restrikční endonukleázy - enzymy izolované z bakterií– jméno podle názvu bakterie, z které byl izolován

(např.: EcoRI - Escherischia coli, AluI - Arthrobacter luteus)– rozeznávají určitou sekvenci DNA a podle ní DNA specificky štěpí– tato sekvence DNA tvoří palindrom - je symetrická kolem centrálního bodu– sekvence sestává nejčastěji z 4 bp (base pair - pár bází) nebo 6 bp

EcoRI -

AluI -

Elektroforetické rozdělení fragmentů DNA podle jejich délky

• elektroforéza obecně metoda pomocí níž lze rozdělit makromolekuly , resp. fragmenty DNA, podle jejich délky

• princip - makromolekuly s elektrickým nábojem se v elektrickém poli pohybují k jedné z elektrod v závislosti na své relativní molekulové hmotnosti, celkovém náboji a tvaru

• stejně dlouhé fragmenty DNA se v elektrickém poli pohybují stejně rychle a vytvoří proužek

ITS/RFLP pattern obtained by using EcoRI and Hinf 1 endonucleasePCR produkt neštěpený

Eco RI Hinf I

Marker(bp)

LAK12 LAK13 LAK14

NR EcoRI HinfI NR EcoRI HinfI NR EcoRI HinfI

1,517 0,615 0,369 0,283 0,495 0,290 0,277 0,523 (0,373)* 0,277

1,200 0,277 0,271 0,241 0,247 0,290 0,245

1,000 0,105 0,237 0,020

0,900

0,100

0,615 0,646 0,614 0,495 0,531 0,524 0,523 (0,900)* 0,542

0,527

RFLP

metoda sama o sobě vykazuje variabilitu v závislosti na

a. Přístupu pracovníka a pořádku v laboratoři

b. Použitých chemikáliích a metodických přístupech

c. ECM špička může být více než jedním houbových organismem

d. ECM špička je tvořena jedním houbovým organismem vykazující variabilní polymorfismus v rámci jedné genety

e. Takže…… rozhodneme se pro…

1. přímou sekvenaci (rychlejší, ale nezaručuji kvalitní výsledek)

2. Hybridizaci, zaklonování do sekvence bakteriální klonované buňky a sekvenaci (zdlouhavější, kvalitnější, ale závisí na kvalitě práce)

Výsledkem sekvenace by měla být jasně identifikovaná DNA v rámci amplifikovaného ITS úseku, která na základě NCBI náleží konkrétnímu houbovému organismu (databáze).

Optimální je pro identifikaci mykorhiz kombinovat metodu morfologického popisu a metodu molekulární identifikace.

17B.zeller

11S.bovist

24L.quietu

18L.quietu

20T.myomy

10L.laccat

23T.sublil

3T.terrest

12T.terres