EKSTRAKSI DAN BIOAKTIVITAS SENYAWA ANTIMIKROB … · Banyak metabolit sekunder yang dihasilkan oleh bakteri yang berasosiasi dengan spons yang diindikasi sebagai senyawa bioaktif

EKSTRAKSI DAN BIOAKTIVITAS SENYAWA ANTIMIKROB DARI

BAKTERI YANG BERASOSIASI DENGAN SPONS Jaspis sp.

ISSANTO PUTRA

DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR

2012

ABSTRAK

ISSANTO PUTRA. EKSTRAKSI DAN BIOAKTIVITAS SENYAWA ANTIMIKROB DARI

BAKTERI YANG BERASOSIASI DENGAN SPONS Jaspis sp. Di bawah bimbingan ARIS TRI WAHYUDI dan DUDI TOHIR

Banyak bakteri yang berasosiasi dengan spons mampu memproduksi senyawa metabolit

sekunder atau senyawa bioaktif baru yang diidentifikasi sebagai senyawa antimikrob, antifungi,

dan antibakteri. Penelitian ini bertujuan untuk mengekstrak senyawa antimikrob yang dihasilkan

oleh bakteri yang berasosiasi dengan spons Jaspis sp. dan menguji toksisitasnya terhadap larva

udang Artemia salina. Enam isolat bakteri potensial yang diisolasi dari spons Jaspis sp. dengan kode SAB E-8, SAB E-33, SAB E-35, SAB E-38, SAB E-40, dan SAB S-43 diekstraksi

menggunakan pelarut etil asetat. Ekstrak kasar bakteri diuji aktivitas senyawa antimikrobnya

terhadap mikrob patogen dan non-patogen. Hasilnya menyatakan ekstrak kasar mampu

menghambat pertumbuhan bakteri Escherichia coli, Bacillus subtilis, Enteropathogenic

Escherichia coli (EPEC) K1-1, Stapylococus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans,

dan Candida tropicalis. Konsentrasi hambatan minimum (KHM) dari supernatan menunjukkan

penghambatan sebesar 12.5-100%. Tiga isolat terbaik ditunjukkan oleh SAB E-35, SAB E-38, dan

SAB S-43, selanjutnya difraksinasi menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT). Hasil KLT di

bawah sinar UV 365 nm dan UV 254 nm menunjukkan setiap ekstrak memiliki fraksi aktif yang

dapat menghambat pertumbuhan P. aeruginosa dan EPEC K1-1 melalui uji bioautografi. Enam

ekstrak kasar bakteri kemudian diuji brine shrimp letality test (BSLT) menggunakan Artemia salina sebagai organisme uji untuk mengetahui konsentrasi ekstrak yang bersifat toksik. Hasilnya

menunjukkan setiap ekstrak memiliki tingkat toksisitas yang berbeda diukur menggunakan LC50.

SAB E-38 menghasilkan nilai LC50 terendah, yaitu sebesar 81 mg/L.

Kata kunci : bioaktivitas, senyawa antimikrob, ekstraksi, BSLT, KLT

ABSTRACT

ISSANTO PUTRA. EXTRACTION AND BIOACTIVITY OF ANTIMICROBIAL

COMPOUNDS FROM BACTERIA ASSOCIATED WITH SPONGES Jaspis sp. Under

supervised of ARIS TRI WAHYUDI and DUDI TOHIR

Many bacteria associated with sponges produced secondary metabolite or bioactive

compounds that has been identified as antimicrobial, anti-cancer, anti-fungi, and anti-bacteria. This study aims to extract antimicrobial compound produced by bacteria associated with sponge Jaspis

sp and to test its toxicity toward Artemia salina prawn. Six potential isolates of bacteria isolated

from sponge Jaspis sp., coded as SAB E-8, SAB E-33, SAB E-35, SAB E-38, SAB E-40, and

SAB S-43, were extracted by using ethyl acetate solvent. Bacterial crude extracts of antimicrobial

compounds were tested its activity toward pathogenic and non-pathogenic microbes. The results

revealed that the crude extracts of bacteria inhibited the growth of E. coli, B. subtilis, EPEC K1-1,

Stapylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, and Candida tropicalis. The

minimum inhibitory concentration (MIC) from bacterial supernatants range from 12.5% to 100%.

Three best isolate i.e. SAB E-35, SAB E-38, and SAB S-43 were fractionated by using thin layer

chromatography (TLC). Results of TLC under UV 365 nm and UV 254 nm showed that each

extract had active fraction that inhibited P. aeruginsa and EPEC K1-1 through bioautography test.

The six bacterial crude extracts were also tested using brine shrimp lethality test (BSLT) with Artemia salina as test organism to find out the toxicity concentration of the extract. Results

showed that each extract had different toxicity measured with LC50 provision. SAB E-38 produced

the lowest LC50 value which was 81 mg/L.

Keyword : bioactivity, antimicrobial compound, extraction, BSLT, TLC

EKSTRAKSI DAN BIOAKTIVITAS SENYAWA ANTIMIKROB DARI

BAKTERI YANG BERASOSIASI DENGAN SPONS Jaspis sp.

ISSANTO PUTRA

Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Sains pada Departemen Biologi

DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR

2012

Judul Skripsi : Ekstraksi dan Bioaktivitas Senyawa Antimikrob dari Bakteri yang

Berasosiasi dengan Spons Jaspis sp. Nama : Issanto Putra NIM : G34080103

Menyetujui

Pembimbing I Pembimbing II

Dr. Aris Tri Wahyudi, M.Si. Drs. Dudi Tohir, M.S.

NIP. 19630705 199103 1 005 NIP. 19571104 198903 1 001

Mengetahui

Ketua Departemen Biologi

Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.S.

NIP. 19641002 198903 1 002

Tanggal Lulus :

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karuniaNya, sehingga

karya ilmiah ini dapat diselesaikan. Penelitian dengan judul “Ekstraksi dan Bioaktivitas Senyawa

Antimikrob dari Bakteri yang Berasosiasi dengan Spons Jaspis sp.” ini dilakukan pada bulan

Desember 2011-Mei 2012 di laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi dan laboratorium

Kimia Organik, Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut

Pertanian Bogor. Pada kesempatan ini penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada Dr. Aris Tri

Wahyudi, M.Si. dan Drs. Dudi Tohir, M.S. atas bimbingan dan pengarahan yang diberikan serta

Ir. Agustin Wydia Gunawan, M.S. selaku komisi penguji atas masukan, kritik, dan saran yang

membangun dalam perbaikan karya ilmiah ini. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada Yonatan Banoet, M.Si., Rika Indri Astuti, M.Si., Efendi S.Si., Meli S.Si., Ai Karwati, Dita,

Ita, Bapak Jaka dan Ibu Heni di laboratorium Mikrobiologi, serta Pak Sobur dari laboratorium Kimia

Organik atas bantuan dan saran selama penulis melakukan penelitian ini. Terima kasih juga untuk

keluarga tercinta dan Esa Ayu Pratama yang senantiasa memberi cinta, doa dan dukungan, serta

teman-teman Biologi angkatan 45, teman-teman Kimia angkatan 45, kakak S2 dan S3 di

laboratorium Mikrobiologi dan wisma Suhandas yang selalu memberikan bantuan, doa, semangat dan

kasih sayang. Penulis berharap semoga karya tulis ini dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu

pengetahuan.

Bogor, Juli 2012

Issanto Putra

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 25 Agustus 1990 dari pasangan Turasno dan

Mukarti. Penulis merupakan anak pertama dari dua bersaudara. Penulis lulus dari SMP Negeri 256

Jakarta pada tahun 2005, kemudian melanjutkan pendidikan di SMA Negeri 89 Jakarta dan lulus

tahun 2008. Setelah itu, penulis lulus seleksi masuk jurusan Biologi di Institut Pertanian Bogor

melalui jalur SNMPTN. Penulis mempunyai pengalaman sebagai asisten praktikum pada mata

kuliah Mikrobiologi Dasar dan Genetika Dasar. Penulis pernah aktif berorganisasi di BEM TPB

IPB pada tahun 2008, BEM FMIPA pada tahun 2009, Himpunan Mahasiswa Biologi

(HIMABIO) sebagai Ketua pada tahun kepengurusan 2010-2011, Ikatan Himpunan Mahasiswa

Biologi Indonesia (IKAHIMBI) pada tahun 2010-2011, serta menjadi panitia di berbagai kegiatan antara lain Bakti Sosial Kampus 2008, Pekan Ilmiah FMIPA (PIPA) 2009, dan Pesta

Sains 2010. Penulis juga mendapatkan prestasi seperti pendanaan dari Dinas Pendidikan Tinggi

(DIKTI) pada tahun 2009 untuk Program Kreativitas Mahasiswa (PKM) di bidang kemasyarakatan,

pendanaan untuk program Lembaga Pengabdian kepada Masyarakat (LPPM) IPB 2009, pendanaan

untuk Program Mahasiswa Wirausaha (PMW) tahun 2010, juara pertama lomba karya tulis tingkat

FMIPA IPB 2010 dan pada tanggal 6-8 Juni 2012 penulis mempresentasikan hasil penelitian ini pada

forum International Seminar on Advances in Molecular Genetics and Biotechnology for Public

Education di Universitas Atmajaya, Jakarta.

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR TABEL ............................................................................................................... viii

DAFTAR GAMBAR ........................................................................................................... viii

DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................................................ viii

PENDAHULUAN ............................................................................................................... 1

BAHAN DAN METODE

Bahan dan Alat ......................................................................................................................... 2

Metode .................................................................................................................................... 2

Penentuan Konsentrasi Hambatan Minimum Antimikrob ................................................. 2

Ekstraksi Senyawa Bioaktif ............................................................................................... 2

Bioasai Ekstrak Kasar ......................................................................................................... 2

Fraksinasi Ekstrak Kasar .................................................................................................... 2

Aktivitas Antimikrob Senyawa Hasil Fraksinasi (Bioautografi) ....................................... 2

Uji Toksisitas Ekstrak Kasar Menggunakan Brine Shrimp Letality Test (BSLT) ............. 3

HASIL DAN PEMBAHASAN

Konsentrasi Hambatan Minimum .......................................................................................... 3

Bioasai Ekstrak Kasar ............................................................................................................ 3

Fraksinasi Ekstrak Kasar ........................................................................................................ 4

Aktivitas Antimikrob Senyawa Hasil Fraksinasi ................................................................... 6

Toksisitas Ekstrak Kasar Terhadap Larva Udang A. salina dengan Metode BSLT .............. 7

SIMPULAN ........................................................................................................................... 8

SARAN ................................................................................................................................ 8

DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................................... 8

LAMPIRAN ......................................................................................................................... 10

DAFTAR TABEL

Halaman

1 Konsentrasi hambatan minimum (KHM) dari supernatan bakteri asal spons Jaspis sp.

terhadap bakteri dan cendawan patogen ................................................................................... 3

2 Aktivitas antimikrob ekstrak etil asetat dari bakteri asal spons Jaspis sp. terhadap

bakteri dan cendawan patogen .................................................................................................. 4

3 Fraksinasi dan uji aktivitas ekstrak kasar terhadap EPEC K1-1 dan P. aeruginosa ............... 6

4 Nilai toksisitas/LC50 senyawa ekstrak kasar bakteri asal spons Jaspis sp. .............................. 8

DAFTAR GAMBAR

Halaman

1 Aktivitas antimikrob ekstrak etil asetat dari bakteri asal spons Jaspis sp. terhadap

S. aureus .................................................................................................................................... 5

2 Kromatogram dan uji bioautografi ........................................................................................... 7

DAFTAR LAMPIRAN Halaman

1 Komposisi medium sea water complete (SWC) ........................................................... 11

2 Penetasan larva A. salina ............................................................................................. 12

3 Peralatan medium penetasan A. salina ......................................................................... 13

4 Perhitungan LC50 pada metode BSLT .......................................................................... 14

5 Tabel perhitungan LC50 SAB E-38 .............................................................................. 15

6 Grafik probit LC50 isolat SAB E-38 ............................................................................. 16

PENDAHULUAN

Spons merupakan organisme laut yang

saat ini menjadi perhatian banyak peneliti di dunia karena manfaat yang dikandungnya dan

peranannya sebagai hewan simbion dari

berbagai macam mikroorganisme yang ada di

lautan. Keunikan dari sistem sirkulasi kanal

tubuhnya, spons merupakan habitat hidup bagi

beragam jenis mikroorganisme yang ada di

lautan khususnya bakteri. Menurut Wang

(2006) spons menjadi inang dari berbagai

jenis mikrob secara umum yang dapat

mencapai 50-60% dari tubuhnya. Ada peranan

penting dari mikrob yang hidup pada tubuh spons, antara lain sebagai sumber makanan

hingga penghasil senyawa bioaktif yang

berguna bagi spons itu sendiri (Kennedy et al.

2009). Spons berperan sebagai habitat hidup

mikrob yang aman, untuk mendapatkan akses

ke sinar matahari bagi mikrob yang

berfotosintesis, dan penyuplai nutrisi.

Salah satu manfaat penting yang

dihasilkan spons yaitu kemampuannya dalam

menghasilkan senyawa metabolit sekunder

yang bersifat senyawa bioaktif. Kemampuan

tersebut diduga merupakan hasil hubungan mutualisme antara spons dan mikrob yang

hidup bersimbiosis pada tubuh spons tersebut.

Penelitian Thakur dan Műller (2004) juga

mengungkapkan bahwa metabolit sekunder ini

tidak hanya berperan dalam metabolisme

organisme tersebut tetapi berperan juga dalam

strategi adaptasi organisme terhadap ling-

kungannya. Banyak metabolit sekunder yang

dihasilkan oleh bakteri yang berasosiasi

dengan spons yang diindikasi sebagai

senyawa bioaktif baru. Senyawa bioaktif tersebut memiliki aktivitas sebagai anti-

mikrob, antikanker, antitumor, antiviral,

antiangiogenik, hemolitik, dan sitotoksik

(Hentschel et al. 2002; Thakur & Műller

2004; Thakur et al. 2006; Taylor et al. 2007).

Senyawa bioaktif tersebut umumnya me-

rupakan turunan dari asam amino dan

nukleosida, makrolid, porfirin, terpenoid,

peroksida alifatik, dan sterol (Thakur &

Műller 2004).

Perkembangan penemuan dan identi-fikasi

senyawa bioaktif baru saat ini semakin maju seiring dengan perkembangan dalam bidang

biologi molekuler dan biokimia. Contoh di

bidang biokimia sendiri misalnya, isolasi dan

identifikasi komponen-komponen senyawa

organik yang berpotensi sebagai senyawa

bioaktif dapat dilakukan dengan beberapa

cara, salah satunya dengan kromatografi lapis

tipis (KLT). Kromatografi lapis tipis

merupakan teknik pemisahan senyawa ber-

dasarkan distribusi komponen yang berbeda

dari suatu campuran antara fase gerak dan fase

diam (Khopkar 1990). Uji untuk melihat ada

tidaknya aktivitas komponen (fraksi) yang

dihasilkan, dapat menggunakan uji lanjutan

yaitu uji bioautografi.

Metode untuk menganalisis suatu

senyawa bioaktif baru yang berpotensi se-

bagai senyawa sitotoksik terhadap sel hidup

ataupun sel kanker dapat menggunakan metode brine shrimp lethality test (BSLT).

Metode BSLT ini menggunakan larva udang

Artemia salina sebagai hewan uji dalam

menentukan nilai kematian 50% atau disebut

LC50 sebagai kadar minimum sito-toksik suatu

zat.

Pada penelitian sebelumnya, Abubakar

(2009) melaporkan bahwa bakteri yang ber-

asosiasi dengan spons Jaspis sp. dapat meng-

hasilkan senyawa antimikrob. Enam isolat

terbaik, SAB E-8, SAB E-33, SAB E-35, SAB E-38, SAB E-40, dan SAB S-43 mampu

menghambat Staphylococcus aureus non

patogen, Staphylococcus aureus patogen,

Escherichia coli, Enteropathogenic Esche-

richia coli (EPEC) K1-1, Pseudomonas

aeruginosa, Candida albicans, Candida

tropicalis, dan Bacillus subtilis. Aktivitas

antimikrob dapat ditunjukkan oleh konsentrasi

hambatan minimum (KHM) tertentu atau

minimum inhibitory concentration (MIC).

Berdasarkan penelitian lanjutan oleh Rizqoh (2011), semua isolat SAB diduga memiliki

gen poliketida synthase (PKS) dan non-

ribosomal peptide synthase (NRPS). Deteksi

gen PKS dan NRPS merupakan salah satu

metode metagenomik yang dapat digunakan

untuk menganalisis gen yang menyandikan

pembentukkan senyawa bioaktif (Lee et al.

2005; Scheirmer et al. 2005; Taylor et al.

2007).

Meskipun aktivitas antimikrob pada isolat-

isolat tersebut dan gen penyandi PKS dan

NRPS telah diketahui, namun pengujian akti-vitas ekstrak dari senyawa antimikrob serta uji

toksisitasnya terhadap sel hidup belum

diketahui. Konsentrasi minimum penghambat-

an senyawa antimikrob, pemisahan senyawa

bioaktif, bioasai, bioautografi, dan uji tok-

sisitasnya terhadap larva udang Artemia salina

juga perlu dikaji lebih lanjut. Penelitian ini

bertujuan menganalisis senyawa bioaktif

antimikrob dari bakteri yang berasosiasi

dengan spons Jaspis sp. dan menguji

toksisitasnya terhadap larva udang A. salina.

10

BAHAN DAN METODE

Bahan dan Alat

Bahan yang digunakan adalah isolat-isolat

terbaik dari bakteri yang berasosiasi dengan

spons Jaspis sp., yaitu SAB E-8, SAB E-33,

SAB E-35, SAB E-38, SAB E-40, dan SAB S-

43 (Abubakar 2009) dan larva udang A.

salina. Mikrob indikator yang digunakan

untuk uji antagonis adalah E. coli, B. subtilis,

EPEC K1-1, S. aureus, P. aeruginosa, C.

albicans, dan C. tropicalis. Medium yang

digunakan yaitu sea water complete (SWC),

nutrient broth (NB), nutrient agar (NA),

potato dextrose broth (PDB), potato dextrose agar (PDA) dan air laut. Pelarut yang

digunakan untuk ekstraksi adalah etil asetat.

Alat laboratorium yang digunakan adalah

pelat KLT (TLC alumunium sheet silica gel

60F254 produksi Merck), vorteks, laminar

(Jouan, Prancis), autoklaf, hot plate, dan

rotavapor.

Metode

Penentuan Konsentrasi Hambatan Mini-

mum Antimikrob

Isolat bakteri asal spons Jaspis sp.

dikulturkan dalam medium SWC cair lalu

diinkubasi dalam mesin penggoyang selama

tiga hari di suhu ruang. Mikrob indikator

diremajakan kembali dalam medium NB

untuk E. coli, EPEC K 1-1, S. aureus, B.

subtilis, dan P. aeruginosa atau dalam

medium PDB untuk C. albicans dan C. tropicalis. Mikrob indikator tersebut di-

inkubasi selama 24 jam pada suhu ruang.

Setelah tiga hari, isolat asal spons di-

sentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm

selama 30 menit. Supernatan dari hasil

sentrifugasi dimasukkan ke dalam 5 tabung

reaksi dengan konsentrasi 6.25%, 12.5%,

25%, 50%, dan 100%. Selain kelima

konsentrasi tersebut, dibuat juga kontrol yang

tidak diberi filtrat bakteri. Setelah itu, masing-

masing tabung diisi dengan 1 mL (OD620 0.45)

bakteri indikator. Biakan uji KHM tersebut lalu diinkubasi selama 24 jam di dalam tabung

reaksi dan diamati. KHM ditentukan ber-

dasarkan kekeruhan biakan dibandingkan

dengan kontrol.

Ekstraksi Senyawa Bioaktif

Isolat bakteri asal spons Jaspis sp.

dikulturkan dalam 500 mL medium SWC cair. Kultur diinkubasi pada mesin penggoyang

(100 rpm; 30°C) selama tiga hari, kemudian

ditambahkan 500 mL etil asetat, diaduk

selama 12 jam, kemudian lapisan etil asetat

dievaporasi. Ekstrak yang dihasilkan disimpan

pada suhu 5°C untuk pemakaian selanjutnya

(Muller et al. 2004).

Bioasai Ekstrak Kasar

Mikrob indikator dikulturkan selama 24 jam. Sebanyak 1% kultur mikrob indikator

dicampurkan ke medium NA atau PDA

semipadat lalu dituangkan di cawan. Ekstrak

kasar senyawa antimikrob yang telah

dilarutkan dengan metanol (100 mg/mL)

diteteskan ke kertas cakram masing-masing

sebanyak 100 µL dan diuapkan hingga kering.

Selanjutnya diletakkan di atas permukaan

medium agar tersebut. Cawan uji diinkubasi

selama 24 jam. Hasil uji positif ditunjukkan

dengan terbentuknya zona bening di sekitar kertas cakram.

Fraksinasi Ekstrak Kasar

Isolasi dan identifikasi senyawa bioaktif

sampel dilakukan dengan KLT terhadap

senyawa organik dari ekstrak kasar 3 isolat

terbaik hasil uji bioasai (SAB E-35, SAB E-

38, dan SAB S-43). Fraksinasi dilakukan pada pelat 25 TLC alumunium sheet silica gel

60F254. Sebanyak 30 µL ekstrak kasar

senyawa antimikrob diteteskan dengan pipa

kapiler pada pelat yang telah diberi tanda

sebagai titik awal. Kemudian pelat di-

masukkan ke dalam kotak kromatografi yang

berisi eluen n-butanol: etil asetat: akuades{

(2:3:1) & (2:5:1)} dan n-butanol: etil asetat

(3:7) dan telah dijenuhkan selama satu jam.

Setelah senyawa bergerak sampai garis batas

atas, pelat dikeluarkan dan dikeringkan.

Komponen senyawa organik yang terpisah akan berbentuk pita di sepanjang pelat,

kemudian dilihat dan ditandai di bawah sinar

UV dengan panjang gelombang 254 dan 365

nm (Zheng et al. 2005). Masing-masing fraksi

antimikrob kemudian diuji aktivitasnya

(bioautografi) untuk mengetahui fraksi

antimikrob yang dapat menghambat bakteri

patogen.

Aktivitas Antimikrob Senyawa Hasil

Fraksinasi (Bioautografi)

Bahan yang digunakan adalah pelat KLT

yang mengandung senyawa yang sudah

difraksinasi. Pelat tersebut disterilisasi meng-

gunakan sinar UV selama 1 jam, lalu di-

letakkan di atas agar nutrien pada cawan petri.

Lapisan tersebut kemudian dilapisi oleh

medium agar cair yang mengandung bakteri

11

uji P. aeruginosa dan EPEC K1-1 dengan

metode agar tuang, kemudian diinkubasi pada

suhu 37°C selama 24 jam. Setelah masa

inkubasi, zona bening diamati untuk melihat

fraksi senyawa organik yang dapat meng-

hambat pertumbuhan bakteri (Zheng et al.

2005).

Uji Toksisitas Ekstrak Kasar Meng-

gunakan Brine Shrimp Letality Test (BSLT)

Sebanyak 10 larva A. salina di-tambahkan

ke dalam tabung reaksi yang telah berisi ekstrak kasar dan 3 tetes Tween-80 dengan

berbagai konsentrasi dan kontrol, lalu

ditambahkan air laut hingga volume akhir

adalah 5 mL. Konsentrasi akhir dalam tabung

setelah penambahan air laut adalah 1000

µg/mL, 500 µg/mL, 100 µg/mL, 10 µg/mL,

dan kontrol. Selanjutnya tabung diinkubasi

selama 24 jam. Kematian larva pada setiap

konsentrasi dicatat dan dibandingkan dengan

kontrol, lalu dihitung dengan rumus:

Perhitungan LC50 dilakukan dengan

menggunakan bantuan program SPSS 15.

Suatu ekstrak dikatakan bersifat aktif apabila nilai LC50 yang diperoleh ≤ 1000 µg/mL

(Fajarningsih et al. 2006).

HASIL DAN PEMBAHASAN

Konsentrasi Hambatan Minimum (KHM)

Uji KHM dari keenam isolat mikrob asal

spons Jaspis sp. menghasilkan nilai hambatan

yang berbeda, yaitu antara 12.5 - 100% (Tabel

1). Isolat SAB E-35 dan SAB S-43 memiliki

nilai KHM terhadap E. coli sebesar 12.5%,

yang merupakan konsentrasi penghambatan

minimum dari keenam isolat (Tabel 1). Nilai

tersebut menunjukkan kedua isolat meng-

hasilkan efek senyawa antimikrob yang baik.

SAB E-8 memiliki nilai aktivitas peng-

hambatan terbaik terhadap mikrob uji E. coli

dan EPEC K1-1 dengan nilai konsentrasi

penghambatan sebesar 50%. Isolat SAB E-33

menunjukkan nilai hambatan terbaik dengan

konsentrasi 25% terhadap B. subtilis dan P.

aeruginosa. Isolat SAB E-38 menunjukkan nilai hambatan terbaik terhadap E. coli dengan

konsentrasi minimum sebesar 25%. Isolat

SAB E-40 menunjukkan nilai hambatan

terbaik sebesar 25% terhadap P. aeruginosa.

Sebagian besar isolat SAB mampu

menghambat pertumbuhan ketujuh bakteri

target. Berdasarkan hasil uji KHM, semua

isolat dapat menghambat pertumbuhan bakteri

atau bersifat bakteriostatik. Nilai hambat

terhadap cendawan C. albicans dan C.

tropicalis sangatlah rendah karena kedua cendawan tersebut merupakan cendawan

patogen yang memiliki dinding sel tebal

sehingga sulit untuk didegradasi. Selain itu,

cendawan patogen tersebut memiliki me-

kanisme pertahanan untuk menghambat atau

menghilangkan efek senyawa bioaktif dari

supernatan bakteri asal spons Jaspis sp.

Uji KHM merupakan uji yang bersifat

tidak konstan bergantung dari ukuran

inokulum, bakteri uji, kuantitas bakteri target,

komposisi kultur medium, pertumbuhan isolat yang berbeda dan kondisi inkubasi seperti

temperatur, pH, dan aerasi (Tokayasa 2010).

Bioasai Ekstrak Kasar

Hasil berikutnya yaitu ekstraksi senyawa

bioaktif dari bakteri dengan menggunakan

pelarut etil asetat. Proses ekstraksi

menghasilkan ekstrak kasar senyawa bioaktif

Tabel 1 Konsentrasi hambatan minimum (KHM) dari supernatan bakteri asal spons Jaspis sp.

terhadap bakteri dan cendawan patogen

Bakteri &

cendawan uji

KHM (%)

SAB E-8 SAB E-33 SAB E-35 SAB S-38 SAB E-40 SAB

S-43

Escherichia coli* 50 100 12.5 25 50 12.5

Bacillus subtilis * 100 25 50 50 50 100

Staphylococcus aureus 100 100 50 100 100 50

Pseudomonas

aeruginosa 100 25 50 100 25 50

Enteropathogenic

Escherichia coli

(EPEC) K1-1 50 100 100 100 100 100

Candida albicans 100 100 50 100 100 100

Candida tropicalis 100 100 100 100 100 100

* non patogen

12

yang positif sebagai antimikrob. Hasil yang

didapat dari uji bioasai menggunakan difusi

paper disk menunjukkan hasil yang positif

terhadap mikrob target (Tabel 2). Indikasi

aktivitas positif dari senyawa antimikrob

tersebut ditandai oleh adanya zona bening di

sekitar koloni. Untuk kontrol, kontrol negatif

ditandai dengan tidak terbentuknya zona

bening di sekitar cakram serta kontrol positif

(amplisilin 100 mg/mL) akan menghasilkan

zona bening (Gambar 1). Penelitian ini merupakan penelitian lanjut-

an dari Abubakar (2009) yang telah di-

laporkan bahwa ekstrak kasar dari spons

Jaspis sp. bersifat antimikrob. Ekstrak kasar

bakteri asal spons Jaspis sp. hasil ekstraksi

dengan menggunakan pelarut etil asetat

menunjukkan bahwa hampir seluruh ekstrak

dapat menghambat pertumbuhan bakteri uji.

Isolat SAB E-35 mampu menghambat semua

bakteri dan cendawan uji kecuali E. coli.

Ekstrak kasar SAB E-38 dan SAB S-43 juga mampu menghambat keseluruhan bakteri

kecuali C. albicans dan C. tropicalis. Nilai

hambat terbesar yang ditandai oleh besarnya

diameter zona bening diperoleh dari isolat

SAB E-38 terhadap S. aureus dengan diameter

zona bening sebesar 23 mm.

Hampir keseluruhan hasil penapisan yang

diperoleh memiliki kesamaan dengan pe-

nelitian sebelumnya. Perbedaan yang ada dari

penelitian sebelumnya disebabkan karena

aktivitas sekresi metabolit yang dihasilkan

berbeda pada tingkat pertumbuhan isolat yang

berbeda pula (Sudirman 1992).

Fraksinasi Ekstrak Kasar

Analisis kandungan senyawa ekstrak kasar etil asetat ini dilakukan dengan menggunakan

teknik kromatografi lapis tipis. Isolat yang

ekstrak kasarnya akan diuji, dipilih ber-

dasarkan hasil yang paling baik dari uji

bioasai. Isolat yang diuji yaitu SAB E-35,

SAB E-38, dan SAB S-43. Isolat SAB E-35,

SAB E-38, dan SAB S-43 masing-masing

terfraksinasi pada eluen n-butanol: etil asetat:

air {(2:3:1) & (2:5:1)} dan pada eluen n-

butanol : etil asetat (3:7) menjadi tiga fraksi

besar kecuali pada eluen n-butanol: etil asetat (3:7), isolat SAB S-43 terfraksinasi menjadi 4

fraksi.

Tabel 2 Aktivitas antimikrob ekstrak etil asetat dari bakteri asal spons Jaspis sp. terhadap bakteri

dan cendawan patogen

Kode

Isolat

Mikrob Uji

Staphylococcus

aureus

Pseudomonas

aeruginosa EPEC

Bacillus

subtilis*

Escherichia

coli *

Candida

albicans

Candida

tropicalis

SAB

E-8 + + - - + + -

SAB

E-33 - + - - + - -

SAB

E-35 +++ + ++ ++ - + +

SAB

E-38 ++++ + ++ +++ + - -

SAB

E-40 +++ + + ++ - - -

SAB

S-43 +++ + + + + - - (+) Diameter zona hambat 6-9 mm; ++ : 10-14 mm; +++ : 15-19 mm; ++++: 20-24mm *: non patogen.

13

Semua fraksi yang telah didapatkan,

selanjutnya diuji menggunakan metode bio-

autografi. Hasil uji bioautografi disajikan pada

Tabel 3. Hasil dengan eluen n-butanol: etil

asetat: akuades (2:3:1) pada isolat SAB E-35

memiliki nilai Rf sebesar 0.7; 0.84; dan 0.95.

Dari ketiga nilai Rf tersebut, hanya pada fraksi

1 yang memiliki aktivitas antimikrob P. aeruginosa. Isolat SAB E-38 memiliki 3

fraksi dengan eluen yang sama, yaitu sebesar

Rf 0.58; Rf 0.71; dan Rf 0.95. Tiga fraksi yang

didapatkan dari isolat SAB E-38, fraksi 1

menunjukkan adanya kemampuan anti-mikrob

terhadap EPEC K1-1 dan fraksi 3 memiliki

kemampuan antimikrob terhadap P.

aeruginosa.

Tiga fraksi juga didapatkan dari Isolat

SAB S-43 dengan eluen sama yang mem-

punyai nilai Rf masing-masing sebesar 0.4; 0.73; 0.9. Dari ketiga fraksi yang didapatkan,

hanya fraksi 2 yang memiliki kemampuan

untuk menghambat pertumbuhan mikrob

EPEC K1-1 dan P. aeruginosa. Hasil pe-

misahan fraksi dengan eluen n- butanol: etil

asetat: akuades (2:5:1) didapatkan masing-

masing tiga fraksi pada ketiga isolat yang

berbeda. Isolat SAB E-35 mendapatkan 3

fraksi yang berhasil dipisahkan dengan nilai Rf

masing-masing sebesar 0.64; 0.76; dan 0.95.

Fraksi 1 memiliki kemampuan penghambatan terhadap mikrob patogen P. aeruginosa dan

fraksi 2 aktif dalam menghambat per-

tumbuhan EPEC K1-1. Isolat SAB E-38 juga

memiliki tiga fraksi yang berhasil dipisahkan

yaitu dengan nilai Rf sebesar 0.62; 0.76; dan

0.9. Fraksi 1 aktif dalam menghambat per-

tumbuhan P. aeruginosa dan fraksi 2 aktif

memiliki kemampuan antimikrob EPEC K1-1.

Isolat SAB S-43 dipisahkan menjadi 3 fraksi

dengan nilai Rf masing-masing sebesar 0.62;

0.76; dan 0.93. Dari ketiga fraksi yang

didapatkan, hanya fraksi 2 saja yang mampu menghambat pertumbuhan EPEC K1-1.

Hasil pemisahan dengan menggunakan

eluen n-butanol:etil asetat (3:7) didapatkan

masing-masing 3 fraksi setiap isolatnya,

kecuali pada isolat SAB S-43 yang terdapat 4

fraksi. Isolat SAB E-35 terpisahkan menjadi 3

fraksi dengan nilai Rf masing-masing sebesar

0.67; 0.82; dan 0.95. Fraksi 1 memiliki

kemampuan menghambat pertumbuhan bakteri P. aeruginosa dan fraksi 2 memiliki

kemampuan penghambatan terhadap bakteri

EPEC K1-1. Isolat SAB E-38 memiliki nilai

Rf masing-masing sebesar 0.67; 0.78; dan

0.91. Dari ketiga fraksi yang dapat dipisahkan,

hanya fraksi 3 yang memiliki aktivitas meng-

hambat pertumbuhan bakteri EPEC K1-1.

Isolat SAB S-43 memiliki nilai Rf masing-

masing sebesar 0.36; 0.64; 0.82; dan 0.95.

Dari keempat fraksi yang dapat dipisahkan,

hanya fraksi 2 yang memiliki aktivitas positif untuk menghambat pertumbuhan bakteri

patogen EPEC K1-1 dan P. aeruginosa.

Jumlah fraksi setiap eluen berbeda-beda

tergantung pada tingkat kepolaran eluen yang

digunakan. Eluen yang terdiri dari n-butanol:

etil asetat: air (2:3:1) memiliki tingkat

kepolaran yang lebih tinggi dibandingkan

dengan eluen n-butanol: etil asetat (3:7).

Untuk mengoptimalkan hasil fraksinasi,

digunakan dua eluen yang berbeda tingkat

kepolarannya, yaitu eluen dengan tingkat kepolaran yang tinggi dan eluen yang tingkat

kepolarannya rendah. Nilai Rf belum dapat

dijadikan sebagai identifikasi komponen

senyawa, tetapi hanya untuk melihat jumlah

komponen yang terkandung dalam ekstrak

senyawa dan sebagai dasar purifikasi pada

kromatografi kolom atau kromatografi cair

kinerja tinggi (HPLC) (Sudirman 2005).

Gambar 1 Aktivitas antimikrob ekstrak etil asetat dari bakteri asal spons Jaspis sp. terhadap S. aureus dengan kode isolat

(a) SAB E-8, (b) SAB E-33, (c) kontrol negatif, (d) SAB E-35, (e) SAB E-38, (f&g) kontrol negatif , (h) SAB

E-40, (i) SAB S-43, (j) kontrol negatif, dan (k) kontrol positif (amplisilin 100 mg/mL).

j

k

a b

c

d

e

f

g h i

14

Aktivitas Antimikrob Senyawa Hasil

Fraksinasi (Bioautografi)

Hasil fraksi yang telah didapatkan dari

hasil fraksinasi ekstrak senyawa antimikrob,

selanjutnya diuji aktivitasnya terhadap P.

aeruginosa dan EPEC K1-1 dengan metode

bioautografi. Hasil uji ini menunjukan bahwa

ketiga isolat terbaik hasil seleksi bioasai yaitu

SAB E-35, SAB E-38, dan SAB S-43

memiliki fraksi yang aktif sebagai senyawa

bioaktif dan fraksi pengotor.

Isolat SAB E-35 sendiri memiliki tiga fraksi yang terpisah dan saat diuji melalui uji

bioautografi, hanya fraksi dengan nilai Rf 0.7

saja yang mampu menghambat pertumbuhan

dari bakteri patogen P. aeruginosa. Isolat

SAB E-38 memiliki tiga fraksi yang berhasil

dipisahkan. Dua fraksi setelah uji bio-

autografi, diketahui memiliki kemampuan

positif sebagai senyawa antimikrob EPEC K1-

1 dan P. aeruginosa yaitu masing-masing

dengan nilai Rf 0.95 dan Rf 0.58. Isolat SAB S-43 memiliki empat fraksi yang berhasil

dipisahkan. Empat fraksi yang berhasil

dipisahkan, ada satu fraksi yang mampu

menghambat pertumbuhan dari dua bakteri

patogen uji EPEC K1-1 dan P. aeruginosa

yaitu fraksi dengan nilai Rf 0.64. Fraksi

lainnya juga ada yang positif menghambat

pertumbuhan bakteri EPEC K1-1.

Tiga fraksi SAB E-35 dan SAB E-38 pada

eluen n-butanol: etil asetat: air (2:3:1), dua

fraksi diantaranya memiliki nilai Rf yang sama yaitu fraksi 1 dan 3. Kedua fraksi

tersebut kemungkinan memiliki komposisi

senyawa yang sama, namun setelah di uji

bioaktivitasnya, ternyata memiliki perbedaan

penghambatan terhadap EPEC dan P.

aeruginosa seperti terlihat pada Tabel 3. Hal

tersebut disebabkan karena adanya perbedaan

keaktifan senyawa pada fraksi 1 dan fraksi 3

Tabel 3 Fraksinasi dan uji aktivitas ekstrak kasar terhadap EPEC K1-1 dan Pseudomonas

aeruginosa

Fase gerak Kode isolat Fraksi Rf Aktivitas

EPEC P. aeruginosa

n-butanol:etil asetat:air

(2:3:1)

SAB E-35 1 0.70 - +

2 0.84 - -

3 0.95 - -

SAB E-38 1 0.58 - +

2 0.71 - -

3 0.95 + -

SAB S-43 1 0.40 - -

2 0.73 + +

3 0.90 - -

n-butanol:etil asetat:air

(2:5:1)

SAB E-35 1 0.64 - +

2 0.76 + -

3 0.95 - -

SAB E-38 1 0.62 - +

2 0.76 - -

3 0.90 + -

SAB S-43 1 0.62 - -

2 0.76 + -

3 0.93 - -

n-butanol:etil asetat (3:7)

SAB E-35 1 0.67 - +

2 0.82 + -

3 0.95 - -

SAB E-38 1 0.67 - -

2 0.78 - -

3 0.91 + -

SAB S-43 1 0.36 - -

2 0.64 + +

3 0.82 - -

4 0.95 - - (+) Ada zona bening di sekitar pelat KLT.

15

Gambar 2 (a) Kromatogram ekstrak kasar metanol isolat SAB E-38; (b) Hasil uji bioautografi SAB E-38

yang positif (Rf 0.95); (c) hasil uji bioautografi yang negatif (Rf 0.71); dan (d) hasil uji positif (Rf

0.58).

untuk menghambat pertumbuhan EPEC dan

P. aeruginosa. Satu fraksi yang sama dapat

dilihat pula pada eluen n-butanol:etil asetat:air

(2:5:1) untuk SAB E-35 dan SAB E-38 yaitu

fraksi 2 dengan nilai Rf 0.76. Namun terdapat

perbedaan keaktifan untuk menghambat

mikrob uji, dimana pada fraksi 2 SAB E-35

mampu menghambat pertumbuhan EPEC

sementara pada fraksi 2 SAB E-38 tidak mampu menghambat pertumbuhan EPEC. Hal

tersebut berarti senyawa yang kemungkinan

sama belum tentu memiliki nilai keaktifan

terhadap mikrob uji yang sama. Untuk

fraksinasi yang menggunakan eluen n-

butanol:etil asetat (3:7), terdapat 1 fraksi pada

SAB E-35 dan SAB E-38 yang memiliki nilai

Rf sama yaitu fraksi 3 pada SAB E-35 dan

fraksi 4 pada SAB E-38. Kesamaan nilai Rf

dapat memberikan kemungkinan bahwa fraksi

tersebut memiliki komponen senyawa dan sifat yang sama.

Fraksi-fraksi yang aktif dalam meng-

hambat pertumbuhan mikrob patogen uji

dapat dilihat dari zona bening yang terbentuk

di sekitar pelat (Gambar 2). Sementara itu,

tidak semua fraksi yang terpisah dan setelah

melalui uji bioautografi merupakan fraksi

yang aktif dapat menghambat mikrob patogen,

hal ini karena fraksi tersebut tidak membawa

senyawa yang berfungsi sebagai senyawa

bioaktif namun hanya sebagai senyawa

organik pengotor saja ataupun senyawa aktif yang tidak terdeteksi dengan mikrob uji EPEC

K1-1 dan P. aeruginosa. Selain itu, penyebab

lainnya yaitu fraksi tersebut merupakan

senyawa yang aktif namun tidak sensitif

terhadap bakteri uji yang digunakan

(Sudirman 2005). Uji bioautografi merupakan

uji pendahuluan yang dapat dipakai untuk

melihat dan mengisolasi berapa banyak

senyawa organik yang memiliki kemampuan

senyawa bioaktif dari setiap ekstrak kasar

isolat bakteri asal spons Jaspis sp.

Beberapa faktor yang membuat uji ini

dapat berhasil dilakukan, antara lain yaitu

keterampilan dalam membuat spot di atas

KLT, komposisi eluen yang digunakan,

tingkat sterilisasi KLT sesaat sebelum uji

bioautografi, kuantitas bakteri patogen uji dan

penyebaran bakteri uji yang merata serta lama waktu inkubasi dan penetrasi senyawa yang

terdapat di dalam pelat untuk menyebar ke

dalam agar medium (Sudirman 2005).

Kekuatan eluen dalam menarik senyawa dan

dalam mengelusi sampel juga merupakan

faktor penting dalam keberhasilan proses uji

bioautografi. Sistem KLT akan menghasilkan

pita yang baik jika ruang penjenuhan yang

digunakan benar-benar dalam kondisi telah

jenuh dengan uap sistem pelarut (Cristian

1994).

Toksisitas Ekstrak Kasar Terhadap Larva

Udang A. salina dengan Metode BSLT

Hasil uji yang terakhir yaitu uji BSLT. Uji

ini dapat digunakan untuk mengetahui apakah

suatu senyawa dapat bersifat toksisitas

terhadap sel hidup atau tidak. Dalam analisis,

digunakan suatu standar perhitungan yang

disebut sebagai LC50. LC50 merupakan standar

kematian organisme uji hingga 50% dari

organisme awal akibat dari pemberian suatu

senyawa, dengan kata lain jika suatu senyawa

dapat mematikan minimal 50% organisme uji dengan kadar konsentrasi ≤1000 µg/mL, maka

senyawa tersebut dapat dikatakan memiliki

kemampuan aktivitas toksisitas (Fajarningsih

et al. 2006). Dalam membantu perhitungan

nilai LC50 dapat digunakan program SPSS 15.

Hasil uji BSLT menunjukkan bahwa

hampir semua isolat SAB memiliki ke-

mampuan aktif dalam uji toksisitas terhadap

larva udang A. salina kecuali isolat SAB E-33

yang disajikan pada Tabel 4.

Rf : 0.95

Rf : 0.71

Rf : 0.58

16

Dilakukan 3 kali pengulangan menggunakan larva (nauplii) A. salina.

Nilai LC50 masing-masing isolat, yaitu

SAB E-8 (620), SAB E-35 (83), SAB E-38

(81), SAB E-40 (138), dan SAB S-43 (403)

memiliki nilai LC50 dibawah 1000 µg/mL

yang berarti ekstrak kasar dari isolat tersebut

bersifat aktif. Hasil dari nilai LC50 terbaik

diperoleh oleh isolat SAB E-35 dan SAB E-38

dengan nilai masing-masing sebesar 83µg/mL

dan 81 µg/mL. Nilai keaktifan ekstrak kasar

dua isolat, yaitu SAB E-35 dan SAB E-38 tersebut dapat dikatakan sangat aktif karena

mendekati nilai standar keaktifan dari

National Cancer Institute (NCI) Amerika

yang menyatakan standar efektifitas kom-

ponen bioaktif untuk melawan sel kanker

adalah ≤ 30µg/mL (Albuntana 2011).

Penggunaan metode BSLT ini merupakan

metode yang banyak digunakan para peneliti

untuk dapat menganalisis suatu ekstrak kasar

senyawa baru yang didapatkan baik dari

tumbuhan, hewan, maupun mikroorganisme

yang berpotensi sebagai senyawa bioaktif antikanker. Penggunaan hewan uji standar

yaitu A. salina karena tingkat pembelahan sel

A. salina pada rentang waktu 0-24 jam hampir

sama dengan pembelahan sel kanker. Ada

beberapa faktor yang dapat memengaruhi

keberhasilan pengujian toksisitas meng-

gunakan BSLT, yaitu umur dari A. salina

dibawah 48 jam. Jika umur A. salina telah

mencapai 48 jam maka membran sel A. salina

telah terbentuk kompleks sehingga ekstrak

yang diberikan tidak dapat masuk ke dalam sel A. salina (Juniarti 2009).

Faktor lain yang dapat memengaruhi

keberhasilan pengujian toksisitas meng-

gunakan BSLT, yaitu konsentrasi ekstrak dan

air laut yang digunakan dalam setiap

pengujian harus konstan, penambahan zat

yang membantu melarutkan ekstrak dalam air

laut seperti Tween-80, ketepatan dan

ketelitian peneliti untuk menghitung jumlah

larva awal dan yang mati serta pengulangan

minimal 2 kali pengulangan untuk dapat

memberikan nilai ketepatan uji yang tinggi (Septina 2005).

SIMPULAN

Keenam isolat bakteri asal spons Jaspis sp.

yaitu SAB E-8, SAB E-33, SAB E-35, SAB E-38, SAB E-40, dan SAB S-43 merupakan

bakteri penghasil senyawa bioaktif antimikrob

dengan spektrum yang luas. Hasil ekstraksi

ekstrak kasar isolat bakteri tersebut me-

nunjukkan aktivitas antimikrob terhadap E.

coli, B. subtilis, EPEC K1-1, S. aureus, P.

aeruginosa, C. albicans, dan C. tropicalis.

Isolat-isolat bakteri tersebut memiliki nilai

konsentrasi hambat minimum yang berbeda-

beda berkisar antara 12.5-100% tergantung

mikrob uji yang digunakan. Hasil fraksinasi, tiga isolat terbaik (SAB E-35; SAB E-38;

SAB S-43) memiliki kemampuan bioaktif

antimikrob terhadap bakteri P. aeruginosa dan

EPEC K1-1 dengan nilai Rf yang berbeda-

beda. Hasil uji BSLT, nilai LC50 terbaik

ditunjukkan oleh isolat SAB E-38 dan SAB E-

35 sebesar 81 µg/mL dan 83 µg/mL.

SARAN

Perlu dilakukan penelitian lanjutan untuk

memurnikan dan mengoptimasi fraksi

senyawa antimikrob yang dihasilkan oleh bakteri isolat SAB E-35 dan SAB E-38 yang

berasosiasi dengan spons Jaspis sp. melalui

kromatografi kolom dan preparatif guna

mendapatkan nilai LC50 yang lebih rendah.

DAFTAR PUSTAKA

Abubakar H. 2009. Bakteri yang berasosiasi

dengan spons Jaspis sp.: analisis penghasil

senyawa antimikrob dan keragaman

genetiknya [tesis]. Bogor: Program Pasca-

sarjana, Institut Pertanian Bogor.

Albuntana A, Yasman, Wardhana W. 2011.

Uji toksisitas ekstrak empat jenis teripang suku Holothuriidae dari Kepulauan

Penjaliran Timur, Kepulauan Seribu,

Jakarta menggunakan brine shrimp

lethality test (BSLT). J Iltek Keltrop 3:65-

72.

Tabel 4 Nilai toksisitas/LC50 senyawa ekstrak kasar bakteri asal spons Jaspis sp.

Kode Isolat Nilai LC50 (µg/mL)

SAB E-8 620

SAB E-33 5248 SAB E-35 83

SAB E-38 81

SAB E-40 138

SAB S-43 403

17

Christian DG. 1994. Analytical Chemistry. Ed

ke-5. Seattle: University of Washington.

Fajarningsih ND, Januar HI, Nursid M,

Wikanta T. 2006. Potensi antitumor

ekstrak spons Crella papilata asal Taman

Nasional Laut Kepulauan Seribu. J Pas

Biol Kel Perik 3:35-41.

Hentschel U et al. 2002. Molecular evidence

for a uniform microbial community in

sponges from different oceans. Appl

Environ Microbiol 68:4431-4440.

Juniarti, Osmeli D, Yuhernita. 2009.

Kandungan senyawa kimia, uji toksisitas

(Brine Shirmp Lethality Test) dan

antioksidan (1,1-diphenyl-2-pikrilhydra-

zyl) dari ekstrak daun saga (Abrus

precatorius L). Makara Sains 13:50-54.

Kennedy J, Beker P, Piper C, Cotter PD,

Walsh M. 2009. Isolation and analysis of

bacteria with antimicrobial activities from

the marine spons Haliclona simulans

collected from Irish waters. Mar Biotechnol 11:384-396.

Khopkar SM. 1990. Konsep Dasar Kimia

Analitik. Saptoharjo, penerjemah. Jakarta:

UI Pr. Terjemahan dari: Basic Concepts of

Analytical Chemistry.

Lee B, Kroken S, Chou DYT, Robbertse B,

Yoder OC. 2005. Funcional analysis of all

nonribosomal peptide synhetases in

Cochliobolus heterostrophus reveals a

factor, NPS6, involved in virulence and

resistance to oxidative stress. Eukaryot Cell 4:545-555.

Müller WEG, Grebenjuk VA, Thakur NL,

Thakur AN, Batel R. 2004. Oxygen-

controlled bacterial growth in the sponge

Suberites domuncula: toward a molecular

understanding of the symbiotic relation-

ships between sponge and bacteria. Appl

Environ Microbiol 70:2332-2341.

Rizqoh D. 2011. Karakterisasi bakteri yang

berasosiasi dengan spons Jaspis sp.

sebagai penghasil senyawa antimikrob

berspektrum luas [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahu-

an Alam, Institut Pertanian Bogor.

Schirmer A et al. 2005. Metagenomic analysis

reveal diverse polyketide synthase gene

cluster in microorganisme associated with

the marine sponge Discodermia dissoluta.

Appl Environ Microbiol 71:4840-4849.

Septina YA. 2005. Identifikasi dan uji tok-

sisitas asam tanat dalam ekstrak daun

ketapang (Terminalia catappa L) [skripsi].

Semarang: Fakultas Matematika dan Ilmu

Pengetahuan Alam, Universitas Dipone-

goro.

Sudirman LI. 1992. Purification et recherche

de la structure d’antibiotique de Lentinus

squarrosulus actifs contre Rigidoporus

lignosus, a parasite de l’hevea [disertasi].

Nancy: Faculte de Science, Universite de Nancy I.

Sudirman LI. 2005. Detection of antimicrobial

compounds isolated from several tropical

Lentinus by bioautographic method.

Hayati 12:67-72.

Taylor MW, Radax R, Steger D, Wagner M.

2007. Spons associated microorganisms:

evolution, ecology, and biotechnological

potential. Microbiol Mol Biol Rev 71:295-

347.

Thakur NL, Műller WEG. 2004. Bio-technological potential of marine sponges.

Curr Sci 11:86.

Thakur AN, Thakur NL, Indap MM, Pandit

RA, Datar VV, Műller WEG. 2006.

Antiangiogenik, antimicrobial, and cito-

toxic potential of sponges-associated

bacteria. Mar Biotechnol 7:245-252.

Tokasaya P. 2010. Sponge-associated bacteria

producing antimicrobial compounds and

their genetic biodiversity analysis [tesis].

Bogor: Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.

Wang G. 2006. Diversity and biotechnological

potential of the sponges-associated

microbial consortia. J Ind Microbiol

Biotechnol 33:545-551.

Zheng L, Chen H, Yan X. 2005.

Antimicrobial screening and active

compound isolation from marine

bacterium NJ6-3-1 associated with the

sponge Hymeniacidon perleve. World J

Microbiol Biotechnol 21:201-206.

LAMPIRAN

19

Lampiran 1 Komposisi medium sea water complete (SWC)

Komposisi untuk 1 liter

Pepton 5 gram

Yeast Extract 1 gram

Glicerol 3 mL

Bacto Agar 15 gram

Air laut steril 750 mL

Aquades 250 mL

20

Lampiran 2 Penetasan larva A. salina

Satu gram telur A. salina grade A dimasukkan ke dalam medium penetasan (botol, gelas,

toples) yang sebelumnya telah berisi kurang lebih 250 mL air laut steril. Selanjutnya diberi

gelembung udara menggunakan aerator yang berfungsi agar telur tidak jatuh ke dasar medium

penetasan. simpan di tempat kering dan tempatkan di tempat yang memiliki pencahayaan yang

cukup (jika pencahayaan kurang, dapat diberikan pencahayaan tambahan menggunakan lampu

yang tidak terlalu terang). Inkubasi selama 24 jam. setelah 24 jam, larva yang sudah menetas

dipindahkan ke tabung baru, dan siap digunakan untuk uji BSLT.

21

Lampiran 3 Peralatan medium penetasan A.salina

22

Lampiran 4 Perhitungan LC50 pada metode BSLT

Setelah pengujian menggunakan metode BSLT dilakukan, dan inkubasi selama 24 jam

telah selesai, kemudian dihitung jumlah larva yang mati dan masih hidup dari tiap lubang. Angka

mati dihitung dengan menjumlahkan larva yang mati dalam setiap konsentrasi (3 lubang). Angka

hidup dihitung dengan menjumlahkan larva yang hidup dalam setiap konsentrasi (3 lubang).

Perhitungan akumulasi mati tiap konsentrasi dilakukan dengan cara berikut: akumulasi mati untuk

konsentrasi 10 ppm = angka mati pada konsentrasi tersebut, akumulasi mati untuk konsentrasi 100

ppm = angka mati pada konsentrasi 10 ppm + angka mati pada konsentrasi 100 ppm, akumulasi

mati untuk konsentrasi 200 ppm = angka mati pada konsentrasi 10 ppm + angka mati pada

konsentrasi 100 ppm + angka mati pada konsentrasi 200 ppm. Akumulasi angka mati dihitung

sampai konsentrasi 1000 ppm. Perhitungan akumulasi hidup tiap konsentrasi dilakukan dengan

cara berikut: akumulasi hidup untuk konsentrasi 1000 ppm = angka hidup pada konsentrasi 1000

ppm, akumulasi hidup untuk konsentrasi 500 ppm = angka hidup pada konsentrasi 1000 ppm +

angka hidup pada konsentrasi 500 ppm, akumulasi hidup untuk konsentrasi 200 ppm = angka

hidup pada konsentrasi 1000 ppm + angka hidup pada konsentrasi 500 ppm + angka hidup pada

konsentrasi 200 ppm. Akumulasi angka hidup dihitung sampai konsentrasi 10 ppm.

Selanjutnya dihitung mortalitas dengan cara: akumulasi mati dibagi jumlah akumulasi hidup

dan mati (total) dikali 100%. Grafik dibuat dengan log konsentrasi sebagai sumbu x terhadap

mortalitas sebagai sumbu y. Nilai LC50 merupakan konsentrasi di mana zat menyebabkan kematian

50% yang diperoleh dengan memakai persamaan regresi linier y = a + bx. Suatu zat dikatakan

aktif atau toksik bila nilai LC50 < 1000 ppm untuk ekstrak dan < 30 ppm untuk suatu senyawa.

23

Lampiran 5 Tabel perhitungan LC50 isolat SAB E-38

Konsentrasi

(mg/L) Ulangan

Σ Larva

Artemia

Σ Larva

mati

%

Mortalitas Rerata Probit

SAB E-38 SAB E-38 SAB E-38 SAB E-38

0

1 10 - 0

0.0 - 2 10 - 0

3 10 - 0

10

1 10 1 10

10.0 3.7 2 10 1 10

3 10 1 10

100

1 10 2 20

23.3 4.3 2 10 2 20

3 10 3 30

500

1 10 9 90

86.7 6.1 2 10 9 90

3 10 8 80

1000

1 10 10 100

100.0 8.1 2 10 10 100

3 10 10 100

24

Lampiran 6 Grafik probit LC50 dari isolat SAB E-38

y = 2,0113x + 1,1684 R² = 0,8136

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 1 2 3 4

Probit SAB E-38

probit sab e-38

Linear (probit sab e-38)