LAPORAN AKHIR LISA KUALITATIF DAN KUANTITATIF SENYAWA KATEKIN DAN KUERSETIN PADA 3 MUTU EKSTRAK GAMBIR PROGRAM INSENTIF RISET TERAPAN Fokus Bidang Prioritas: Teknologi Kesehatan dan Obat Kode Produk Target: 2.01. Kode Kegiatan: 2.01.06. Peneliti Utama: Ora. Ani lsnawati, M.Kes,Apt SAT PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN BIOMEDIS DAN FARMASI BAD AN PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN KESEHATAN DEPARTEMEN KESEHAT AN Rl Jl. Percetakan Negara No. 29 Jakarta Pusat 10560 Telepon: Hp:081574406844/Fax:(021 )4261 088 E-mail: [email protected]17 Februari 2010
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
LAPORAN AKHIR
LISA KUALITATIF DAN KUANTITATIF SENYAWA KATEKIN DAN
KUERSETIN PADA 3 MUTU EKSTRAK GAMBIR
PROGRAM INSENTIF RISET TERAPAN
Fokus Bidang Prioritas: Teknologi Kesehatan dan Obat
Kode Produk Target: 2.01.
Kode Kegiatan: 2.01.06.
Peneliti Utama: Ora. Ani lsnawati, M.Kes,Apt
SAT PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN BIOMEDIS DAN FARMASI BAD AN PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN KESEHAT AN
DEPARTEMEN KESEHAT AN Rl
Jl. Percetakan Negara No. 29 Jakarta Pusat 10560 Telepon: Hp:081574406844/Fax:(021 )4261 088
Judul Penelitian: Analisa Kualitatif dan Kuantitatif Senyawa Katekin dan Kuersetin pada 3 Mutu Ekstrak Gambir" Fokus Bidang Prioritas: Teknologi Kesehatan dan obat
Kode Produk Target: 2.01 .
Kode Kegiatan: 2.01 .06. Lokasi Penelitian: Jakarta
Penelitian Tahun Ke : II
Keterangan Lembaga Pelaksana/Pengelola Penelitian
A Lembaga Pelaksana Penelitian Nama Koordinator/Peneliti Utama Ora. Ani lsnawati, M.Kes.
Nama Lembagallnstitusi Badan Litbang Kesehatan Oepkes Rl
Unit Organisasi Puslitbang Biomedis dan Farmasi
Ala mat Jl. Percetakan Negara no. 29 Jakarta Pusat 10560
T elepon/H P/F ax/email 081574406844/4261088 pswt 531
Katekin banyak terdapat di dalam tanaman teh. Kandungan katekinnya
lebih kurang sekitar 25% dari berat kering daun teh segar, walaupun total
konten katekin sangat bervariasi, tergantung pada variasi kelompok, lokasi
berkembang, musiman dan ketinggian. Katekin terdapat di hampir semua teh
yang dibuat dari Camellia sinensis, termasuk teh putih, teh hijau, teh hitam dan
teh oolong.
Katekin juga terdapat di dalam tanaman cokelat, buah-buahan seperti
anggur dan sayur-sayuran serta terdapat di banyak spesies tanaman lain,
termasuk tanaman gambir.
2.2.4 Kegunaan
Banyak studi tentang manfaat kesehatan yang berkaitan dengan isi katekin.
Menurut Norman Hollenberg, Profesor Kedokteran di Harvard Medical School, katekin
( epicathecin) dapat mengurangi risiko dari em pat masalah utama kesehatan, yaitu stroke,
gagaljantung, kanker dan diabetes.
Katekin juga merupakan dekarboksilase histidin inhibitor, yang menghambat
konversi histidin untuk histamin, dan sebagainya. Ini dianggap menguntungkan karena
adanya pengurangan yang berpotensi merusak histamin yang berhubungan dengan
respon imun lokal.
Katekin di dalam teh hijau juga telah terbukti memiliki sifat sebagai antibiotik
karena perannya dalam menganggu tahap tertentu proses replikasi DNA bakteri.
2.2.5 Isolasi
Katekin yang merupakan bagian dari golongan flavonoid. Secara umum banyak
senyawa dari golongan flavonoid yang mudah larut dalam air, terutama bentuk
glikosidanya dan oleh karena itu senyawa ini berada dalam ekstrak air tumbuhan.
Pelarut yang seringkali digunakan untuk menjadi pelarut ekstraksi adalah metanol,
etanol atau aseton. Pengekstraksian kembali larutan dalam air dengan pelarut organik
yang tidak bercampur dengan air tetapi agak polar sering kali bermanfaat untuk
memisahkan golongan ini dari senyawa yang lebih polar seperti karbohidrat. Etil asetat
merupakan pelarut yang baik untuk menangani katekin dengan cara ini.
(Robinson, Trevor: 1995,208)
Kromatografi partisi kolom dapat digunakan untuk pemisahan senyawa ini,
misalnya kolom magnesol atau asam silikat dengan pengelusi etil asetat yang dijenuhkan
dengan air atau eter. Kolom partisi yang memakai serbuk selulosa telah digunakan untuk
berbagai polifenol, termasuk katekin.
2.2.6 Pencirian atau identiflkasi
Pencirian ini dapat menggunakan berbagai macam reaksi wama dan sifat
kelarutan yang sesuai. Contohnya, reaksi dengan besi (III) klorida telah digunakan
secara luas untuk mengidentiflkasi senyawa fenol, tetapi tidak dapat dipakai untuk
membedakan macam-macam golongan dari flavonoid. Jika kondisi sama, pereaksi ini
memberikan wama kehijauan dengan turunan katekol dan biru dengan turunan pirogalol
(tetapi kondisi ini jarang sama). Jika terjadi wama hitam-biru, ini merupakan bukti
adanya 3,4,5-trihidroksi fenol (misalnya galokatekin), tetapi pembentukan wama hijau
tidak berarti bahwa tidak ada go Iongan senyawa ini atau gugus katekol ( orto-hidroksi).
Penambahan air brom juga dapat dipakai untuk mengidentiflkasi katekin.
Mendidihkan bagian tumbuhan dengan HCI 2M juga digunakan untuk mendeteksi
katekin dengan memberikan hasil wama coklat kuning.
Untuk kromatografi lapis tipis dipakai berbagai lapisan, misalnya silika gel yang
mengandung timbal asetat dan magnesium silikat, atau untuk katekin dapat digunakan
lapisan selulosa.
9
BAB Ill. TUJ UAN DAN MAN FAA T
3.1Tujuan Umum :
Mendapatkan senyawa aktif katekin murni untuk menangani gangguan sirkulasi
darah khususnya penurunan kadar kolesteroi ,HDL,LDL,trigliserid.
3.2Tujuan Khusus : 1. Mendapatkan data karakteristik ekstrak Gambir sesuai Farmakope Herbal
2. Mendapatkan Kadar katekin dan kuersetin pada 3 mutu ekstrak Gambir
3. Mendapatkan metode isolasi katekin yang optimum untuk memperoleh kadar
katekin murni (_::: 95 %)
4. Mendapatkan data kemurnian senyawa katekin
3.3Manfaat Penelitian
Katekin yang diperoleh dari ekstrak Uncaria gambir Roxb dapat dikembangkan
sebagai potensi untuk penyedia bahan baku obat untuk gangguan sirkulasi darah
melalui penurunan kadar kolesteroi,HDL,LDL,trigliserid
10
BAB IV. METODOLOGI
4.1.Kerangka konsep penelitian
Obesitas ----+ Hiperlipidemia Gangguan sirkulasi darah ---...- PJK
~ Uncaria gambir
~
~ senyawa~ -
Uji bioaktivitas • Hipolipidemik
Arteroskletosis
1 Antikoagulan
Hambatanllipid peroksida
Toksisitas akut
T oksisitas sub kronik
Ekstrak terstandar
r Bioaktivitas
ll Senyawa aktif gangguan sirkulasi darah
Cat. :Huruf tebal adalah yang telah dilakukan penelitian tahap I untuk hipolipidemia dan toksisitas akut sedangkan Tahap II adalah isolasi senyawa katekin akan dilakukan tahun 2010.
II
4.2.Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian direncanakan dilakukan di Laboratorium Kimia Farmasi, Puslitbang
Biomedis dan Farmasi , Badan Litbangkes dan laboratorium Kimia Terapan LIPI.
Penelitian dilakukan April 2010- Desember 2010 (1 0 bulan)
4.3.Jenis Penelitian
Eksperimental laboratorium dan membagi penelitian menjadi 4 sub penelitian:
1) Menetapkan karakteristik ekstrak gambir dengan melakukan mikroskopis
larutan gambir dalam air,identifikasi senyawa katekin, kadar air, kadar
abu , kadar abu larut asam, kadar senyawa katekin.
2) Mendapatkan metode isolasi optimum dengan melakukan fraksinasi
dengan kromatografi kolom berdasarkan perbedaan kelarutan serta
melakukan identifikasi terhadap hasil fraksinasi guna mengelompokkan
senyawa kimia sejenis
3) Elusidasi struktur senyawa isolat dengan menggunakan spektrofotometer
IR (Infra Red),UV-Vis (sinar Ultra violet dan visibei,GCMS (Gas
Chromatography Mass Spektrum) dan NMR (molekul resonansi)
4) Menetapkan kemurnian katekin dengan melakukan penetapan kadar
senyawa tersebut.
4.4. Desain Penelitian
Penelitian ini menggunakan desain cross-sectional untuk mendapatkan isolat senyawa kimia
4.5.Bahan dan Cara Kerja
4.5.1 Bahan uji
Bahan uji adalah ekstrak gambir yang diperoleh dari hasil ekstraksi daun dan ranting
Uncaria gambir dengan air, berasal dari pengumpul ekstrak Gambir di Padang,
Sumatera Barat.
4. 5.2.Cara kerja
Penelitian I
Karakteristik ekstrak Gambir (4•13
)
Ekstrak Gambir yang diperoleh ditetapkan karakteristiknya sesuai dengan yang telah
L
dipersyaratkan oleh Farmakope Herbal dan pedoman standarisasi ekstrak secara
umum. Adapun jenis karakteristik tersebut adalah
a. Penetapan mikroskopis ekstrak
Ekstrak Gambir dilarutkan dalam air, kemudian larutan dilihat dengan mikroskop
b. ldentitas ekstrak meliputi :
a) ldentifikasi senyawa katekin
ldentifikasi dilakukan dengan menggunakan KLT (Kromatografi Lapis Tipis)
dengan parameter sebagai berikut :
F as a mobil : a sam asetat 15 %
Fasa diam : plat selulosa
Larutan uji : 0,1 % larutan katekin yang setara dengan 1 gram ekstrak
Gambir dalam metanol
Larutan standar : 0,1 % katekin dalam metanol
Volume yang diteteskan : 5 ul
Larutan pendeteksi : Larutan 1% FeCI3
b) Penetapan kadar air
Lebih kurang 10 gram ekstrak ditimbang seksama dalam wadah yang telah
ditara kemudian ekstrak dimasukkan dalam labu bundar. Ke dalam labu
bundar ditambatikan lebih kurang 200 ml toluen dan didestilasi.Destilat
adalah lapisan air dan toluen. Kadar air diukur dan dihitung dalam %
vulume/berat ekstrak
c) Penetapan kadar abu
Lebih kurang 2 gram sampai 3 gram ekstrak gambir yang telah ditimbang
seksama, dimasukkan ke dalam krus silikat yang telah dipijarkan dan ditara,
lalu diratakan. Selanjutnya, dilakukan pemijaran perlahan-lahan hingga
arang habis, dinginkan dan ditimbang. Jika arang tidak dapat dihilangkan,
tambahkan air panas dan disaring melalui kertas saring bebas abu. Sisa
pemijaran dan kertas saring dipijarkan dalam krus yang sama. Filtrat
13
dimasukkan kedalam krus, diuapkan, dipijari<an hingga bobot tetap.
d) Penetapan kadar abu tidak larut asam
Abu yang diperoleh pada penetapan pada point c. Dilarutkan dalam 25 ml
asam klorida pereaksi. Krus ditutup dengan kaca arloji dan dipanaskan
selama 5 menit. Kemudian saring dengan kertas saring bebas abu. Endapan
pada kertas saring dicuci dengan air panas sampai diperoleh larutan netral.
Kertsa saring beserta endapan dimasukkan dalam krus dan dipanaskan
dalam muffle furnace sampai diperoleh bobot tetap. Perhitungan kadar abu
tidak larut asam ditentukan berdarakan % beratlberat.
e) Penetapan kadar katekin dalam ekstrak
Pembuatan bahan baku pembanding .
Katekin standar dikeringkan di dalam oven pada temperatur 105°C sampai
bobot konstan. Ditimbang 50 mg dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml,
dilarutkan dengan etil asetat. Larutan dihomogenkan dengan penangas
ultrasonik selama 5 menit. Sebanyak 2 ml larutan dimasukkan ke dalam
erlemeyer bertutup 100 ml dan ditambah etil asetat sebanyak 50 ml dan
dihomogenkan lagi dengan penangas ultrasonik selama 5 menit.
Pembuatan larutan sampel
Sampel gambir dibaluskan dan diratakan di atas kaca arloji atau cawan petri,
dikeringkan di dalam oven pada temperatur 105°C sampai bobot konstan.
Ditimbang 50 mg ekstrak kering , dimasukkan dalam labu tentukur 50 ml,
dilarutkan dalam etil asetat dan dihomogenkann dengan penangas
ultrasonik selama 5 menit, kemudian disaring. Sebanyak 15 ml filtrat hasil
penyaringan pertama dibuang dan penyaringan diteruskan. Sebanyak 2 ml
filtrat dimasukkan ke dalam erlenmeyer bertutup 100 ml, ditambahkan etil
asetat sebanyak 50 ml, dan dihomogenkan lagi dengan penangas
ultrasonik selama 5 menit.
Pengukuran absorban larutan blanko (etil asetat), larutan katekin standar
dan larutan sampel dilakukan dengan alat spektrofotometer ultraviolet pada
14
panjang gelombang 279 nm dan 300 nm. Absorban sampel pada 300 nm
tidak lebih dari 0,03.
Perhitungan dilakukan dengan rumus:
% Katekin = As 279 x Ws x 100% Ap 279 W
As 279 = Absorban sampel pada ~ 279 nm Ap 279 = Absorban katekin standar pada ~ 279 nm Ws = Berat katekin standar W = Berat ekstrak gambir (Kadar katekin tidak kurang dari 90,0%)
Penelitian 2
lsolasi senyawa katekin (14"
16·17
)
1).1solasi dengan Kromatografi kolom
Ekstrak yang digunakan pada penelitian tahap I dan telah menunjukkan potensi
sebagai antilipidemia adalah ekstrak kasar dalam air. Pada tahap awal
isolasi terhadap ekstrak kasar dilakukan pemisahan kromatografi kolom
dengan menggunakan fase diam selulosa dan fase geraknya yaitu n-heksan :
aseton dan aseton secara gradient dengan rentang 0-100%. Cara pemisahan
kromatografi kolom adalah sebagai berikut : mula-mula kapas dimasukkan
pada dasar kolom untuk menyangga fase diamnya. Lalu fase diam (selulosa)
disuspensikan dengim menggunakan eluen (fase gerak) sampai terbentuk
bubur 15ambia kemudian dimasukkan ke dalam kolom. Selama proses
pengendapan, kolom kromatografi tersebut dapat diketuk-ketuk pada semua
sisi secara perlahan-lahan agar diperoleh lapisan yang seragam. Keran dapat
dibuka atau ditutup selama penambahan, asal permukaan pelarut tetap diatas
permukaan penjerap (fase diam/15ambia)
Ekstrak kental kemudian ditimbang dan digerus bersama fase diam,
dimasukkan ke dalam kolom. Setelah itu dielusi dengan fase gerak
terpilih .Tiap-tiap fraksi yang keluar ditampung dengan erlenmeyer 20 ml dan 50
mi. Lalu fraksi dalam erlenmeyer tersebut dipekatkan menggunakan rotary
15
evaporator sampai didapat fraksi yang lebih pekat dari sebelumnya. Kemudian
fraksi tersebut diujikan pada plat KL T menggunakan fase diam selulosa
dengan eluen larutan asam asetat 15 %. Fraksi yang sama Rf-nya kemudian
digabung menjadi satu fraksi.
2).1solasi senyawa katekin dengan kromatografi preparatif
Ekstrak Gambir ditimbang sejumlah lebih kurang 1 g dilarutkan dalam 100 ml
methanol. Kemudian dibuat larutan standar katekin 0,1 % dalam methanol
yaitu dengan melarutkan 50 mg katekin baku dalam 50 ml methanol.
Selanjutnya dilakukan kromatografi lapis tipis dengan menggunakan fase mobil
asam asetat 15 % dan sebagai fasa diam adalah plat selulosa. Pada satu plat
secara bersama-sama totolan katekin baku dan sebagian besar totolan ekstrak
Gambir. Kromatogram dengan bentuk, warna dan mempunyai ketinggian yang
sama dengan katekin baku diduga adalah katekin. Untuk meyakinkan
dilakukan identifikasi dengan menggunakan larutan Fe Cl3 pada kromatogram
bagian pinggir. Bagian kromatogram ekstrak Gambir yang diduga katekin
dikerok kemudian ditempatkan pada gelas piala. Demikian dilakukan
pengerjaan seperti tersebut di atas secara berulang-ulang, sampai diperoleh
serbuk selulosa yang mengndung katekin cukup.Kemudian hasil kerokan
dilarutkan kembali dalam methanol/etil asetat, disaring. Larutan isolate siap
untuk dilakukan pemurnian.
3).1solasi senyawa katekin dengan perbedaan kepolaran pelarut
Untuk melakukan isolasi dengan perbedaan kepolaran pelarut dapat dilakukan
2 cara:
a. Cara 1 : Ekstrak dilarutkan dulu dalam air kemudian ditarik dengan
menggunakan suatu pelarut yang dapat melarutkan dengan baik
senyawa katekin dalam suatu corong pisah, dikocok dan dilakukan
secara berulang-ulang.Bagian yang larut dalam pelarut organik diambil
disatukan kemudian diuapkan Kristal/serbuk yang terbentuk kemudian
dilakukan pemurnian. Pelarut organic yang digunakan adalah : etil
asetat,Eter, kloroform, aseton.
b. Cara 2 : Ekstrak dilarutkan dulu dalam air panas kemudian setelah dingin
16
ditambahkan pelarut non polar seperti : heksan dan petroleum eter dalam
suatu corong pisah. Dikocok secara berulang-ulang. Bagian yang tidak
larut diambil dan dikeringkan di udara terbuka, kemudian dilarutkan
dengan pelarut etil asetat atau methanol dan uapkan. Dilakukan
pemurnian.
4).Pemurnian senyawa isolat
Kristal/serbuk yang terbentuk direkristalisasi dengan menggunakan pelarut
tertentu yang dapat melarutkan isolat (sesuai) dengan baik dan dilakukan
secara berulang-ulang sehingga diperoleh senyawa murni.
Penelitian 3
Elusidasi struktur <14·15
•16
•17
>
1). GC-MS
Setelah pengkondisian alat kromatografi gas dan spektrometri massa, cuplikan
diinjeksikan melalui lubang masuk cuplikan. Pada suhu tinggi cuplikan tersebut
akan berubah menjadi gas; bersama gas pembawa pada kenaikan suhu
komponen yang mempunyai titik lebur yang sama, secara otomatis data
terekam di dalam komputer. Bandingkan dengan data spectrum dengan baku
standar dan data NIST (National Institute of Standard and Technology).
2). Spektrofotometri Ultra Violet (UV)
Pemeriksaan spektrofotometri UV menggunakan sejumlah sampel yang
dilarutkan dengan etil asetat (p.a) sampai larut, dan dideteksi menggunakan
spektrofotometri UV sehingga terlihat puncak panjang gelombang yang
merupakan karakteristik suatu senyawa, kemudian grafik yang terbentuk
direkam. Grafik yang terbentuk menampilkan serapan dan panjang gelombang
dari sampel tersebut. Spektrum yang ada dibandingkan dengan baku standar.
3). Spektrofotometri infra merah (IM)
Senyawa yang didapat kemudian dilanjutkan identifikasi dengan
spektrofotometri infra merah (FT-IR) dengan tujuan untuk mengetahui gugus
fungsi apa saja yang terdapat dalam senyawa. Caranya, cuplikan/sampel
dilarutkan dengan pelarut kloroform atau karbon tetraklorida atau karbon
17
disulfida, dan dicatat spektrum dari larutan ini. Larutan biasanya (1 - 5 %)
ditempatkan dalam sel larutan yang terdiri dari bahan transparan. Sel yang
kedua berisi pelarut murni ditempatkan pada berkas sinar. Cara yang sama
dilakukan juga untuk baku standar sebagai pembanding .
4). Spektroskopi 1H NMR dan 13 C NMR (15)
Senyawa dilarutkan dalam deuterochloroform (CDCb), kemudian dimasukkan
ke dalam tabung dengan sejumlah pelarut dicukupkan sampai setinggi ± 5 em.
Setelah itu, dideteksi dengan alat spektrofotometri NMR (Varian Unity INOVA
500 MHz NMR) (1s).
Penelitian 4
Penetapan kadar untuk melihat kemurnian senyawa (4·19
)
Penetapan kadar katekin sama seperti dilakukan pada penelitian 1 bagian 2 sub
bagian e.
4.6.Pertimbangan Etik Penelitian
Penelitian ini tidak menggunakan manusia ataupun hewan sebagai subyek penelitian,
sehingga dibutuhkan pembebasan (excempted) dari komisi etik Balitbang.Surat
pernyataan ini telah diperoleh dari Komisi Etik.
4.7.Hasil yang diharapkan .
Penelitian Gambir ( Uncaria gambir) merupakan penelitian terintegrasi dari aspek
farmakologi eksperimental (tahap 1) dan sapek kimia (tahap 2) dan akan dilanjutkan
pada tahap 3 mengenai toksisitas subkronik. Seluruh hasil penelitian diharapkan akan
menghasilkan herbal terstandar untuk gangguan sirkulasi darah, selain itu dengan
diperolehnya senyawa aktif maka senyawa tersebut dapat dikembangkan lebih lanjut
sebagai bahan baku obat modern untuk penghambat gangguan sirkulasi darah.
18
BAB V. HASIL DAN PEMBAHASAN
Ekstrak Gambir diperoleh dari hasil perkebunan di Padang dan merupakan ekstrak
berbentuk kering . Ekstrak kering ini mempunyai 2 kualitas mutu dan dari penelitian
yang pertama (terdahulu diperoleh 1 mutu ekstrak, sehingga keseluruhan sample
menjadi 3 ekstrak dengan mutu yang berbeda . Adapun bentuk dari berbagai mutu
ekstrak Gambir dapat dilihat pada Gambar 1 di bawah ini :
Gambar 1. Ekstrak Gambir kualitas 1
Gambar 2. Ekstrak Gambir kualitas 2
19
Gambar 3. Ekstrak Gambir kualitas 3
5.1 Karakterisasi Ekstrak
Penetapan karakteristik non spesifik meliputi : susut pengeringan,kadar air, kadar
abu,kadar abu larut asam Tahap ini masih dalam pengerjaan, sehingga belum bisa
dilaporkan hasilnya. Adapun pengerjaan pada karakterisasi ini meliputi : Kadar abu
total, kadar abu tidak larut asam, kadar air, dan susut pengeringan.
Data yang sudah dikerjakan adalah sebagai berikut :