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UNIVERSITE KASDI MERBAH-OUARGLA
FACULTE DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE
DEPARTEMENT DES SCIENCES BIOLOGIQUES
Mémoire
MASTER ACADIMIQUE
Domaine: Sciences de la nature et de la vie
Filière : Biologie
Spécialité : Microbiologie appliquée
Présenté par:
Bireche yamina et Berregui fatiha
Thème
Effets de la salinité sur l’activité des bactéries
hydrocarbonoclastes
Soutenu publiquement
Le : 09/06/14
Devant le jury :
- CHELOUFI. H (Professeur) Président UKM Ouargla
- OULD EL HADJ-KHELIL A. (Professeur) Encadreurs UKM Ouargla
- BOUDERHEM .A (MAA) Co -Encadreur UKM Ouargla
- HASSAINE .A (MAA) Examinatrice UKM Ouargla
- ANNOU. G (MAA) Examinatrice UKM Ouargla
Année universitaire: 2013/2014
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Nous tenons tout d’abord à remercier ALLAH le tout puissant de nous avoir aidé à
réaliser ce modeste travail.
Nous remercions très chaleureusement notre encadreur Mme OULDELHADJ-KHELIL A.,
Professeur àl’Université Kasdi Merbah-Ouargla, qui n’aménagé aucun effort pour que ce
mémoire puisse voire le jour. Nous lui exprimons notre gratitude de nous avoir dirigé,
encouragé et sur tout aidé a fin de réaliser ce travail.
Nous a dressons nos remerciements à notre Co-encadreur Melle
BOUDERHAM AMEL
Maitre assistant A à l’Université Kasdi Merbah-Ouargla pour notre avoir guidée et
soutenues.
Nous remercions les membres du jury, Monsieur CHELOUFI HAMID., Professeur
àl’Université Kasdi Merbah-Ouargla pour l’honneur qu’il nous fait en président ce jury.
Melle
HESSAINE A ,Maitre assistant A à l’Université Kasdi Merbah-Ouargla et Madame
ANNOU G., Maitre assistant à l’Université Kasdi Merbah-Ouargla pour avoir accepté
l’évaluation de ce mémoire et d’en être les examinatrices.
Nous remercions tous les enseignants de notre cursus universitaire qui ont contribué à nous
formation.
Nous remercions tous les travailleurs de laboratoire pédagogique de la faculté des sciences
de la nature et de la vie et des sciences de la terre et de l’univers sans exception.
Merci à toutes les personnes qui ont contribué de près ou de loin a la réalisation de ce
travail.
Remerciement
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J’ai l’honneur de dédier ce travail :
A ma chère mère, qui ne cesse de m’encourager, de me souteni
Pendant toute ma formation.
A mon cher père.
A mes sœurs :, Kaltoom, Hakima, Naaima, Saida et
Gamra, Wafa. Zahia,
A mes frères : Abd elfateh, Lahssen et Ali.
A toute la famille Bireche.
A mon binôme : Berregui fatiha et sa famille.
A mes amis : Hanona, Fadila, Nrimene ,Halima
Merry, Samra, Imaine, jiji ,Nedjma.
Qui ont supporté mes sauts d'humeur.
A tous les étudiants de la promotion 2014 de la
Microbiologie appliquée.
Dédicacé
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TABLE DE MATIERE
INTRODUCTION .......................................................................................................................................... 01
PARTIE I : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE ............................................................................................
Chapitre I : Généralités sur hydrocarbures ..................................................................................................... 03
I.1. Définition des hydrocarbures ..................................................................................................................... 03
I.2. Origine des hydrocarbures ......................................................................................................................... 03
I.3. Classification .............................................................................................................................................. 04
I.3.1. Hydrocarbures saturés.............................................................................................................................. 04
a. Alcanes linéaires .............................................................................................. 04Erreur ! Signet non défini.
b. Alcanes ramifiés ............................................................................................... 04Erreur ! Signet non défini.
c.Cycloalcanes ................................................................................................................................................... 04
I.3.2. Hydrocarbures aromatiques...................................................................................................................... 05
I.3.3 .Composés polaires ................................................................................................................................... 05
I.3.4. Asphaltènes ............................................................................................................................................. 05
I.4. Devenir des hydrocarbures dans l'environnement ...................................................................................... 05
1.4.1. Evaporation…………………………………………………………………………………………………………………………06
I.4.2. Solubilisation ..............................................................................................Erreur ! Signet non défini.06
I.4.3. Emulsification ......................................................................................................................................... 06
I.4.4. Sédimentation ........................................................................................................................................... 06
I.4.5.Photo-oxydation ........................................................................................................................................ 07
I.4.6.Biodégradation .......................................................................................................................................... 07
Chapitre II: biodégradation des hydrocarbures .............................................................................................. 08
II 1.Définition………….. ................................................................................................................................. 09
II.2.Voies de dégradation……………………………………………………………………………….09
II.2.1.Aérobie…………………………………………………………………………………………….09
II.2.2. Anaérobie ..................................................................................................Erreur ! Signet non défini.10
II.3.Mécanisme de dégradation ........................................................................................................................ 12
II.4.Modes d’assimilation des hydrocarbures par la cellule bactérienne .............Erreur ! Signet non défini.12
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II.4.1-Utilisation de la phase dissoute(le transfert par solubilisation dans la phase aqueuse ) 12
II.4.2-Transfert interfacial direct(TID) II.4.3-Transfert micellaire (pseudo solubilisation) 12
II.4.3Transfert micellaire (pseudo solubilisation) 12
II.5. Bactéries hydrocarbonoclastes 12
II.6.Facteurs physiques et chimiques affectant la biodégradation : .................................................................. 15
II.6.1. Compositions de polluant ; ....................................................................... 15Erreur ! Signet non défini.
II.6.2. Température ; ............................................................................................ 16Erreur ! Signet non défini.
II.6.3. Ressources en oxygène ; ........................................................................... 16Erreur ! Signet non défini.
II.6.4. Pression ; ................................................................................................................................................ 17
II.6.5. Nutriments ; ........................................................................................................................................... 17
II.6.6. Humidité ; .............................................................................................................................................. 17
II.6.7. Potentiel d’hydrogène (pH) ; ................................................................................................................. 17
II.6.8. Effet de la salinité. ................................................................................................................................. 17
Chapitre III : Effet de la salinité sur la biodégradation des hydrocarbures ......................................................
III. 1. Les microorganismes halophiles ............................................................................................................ 18
III. 1. 1. Non halophiles .................................................................................................................................... 18
III. 1. 2. Faiblement halophiles ......................................................................................................................... 18
III. 1. 3. Halophiles modérés ....................................................................................................................... 18
. III. 1.4Halotolérants ....................................................................................................................................... 18
III.2. Mécanismes d’adaptation à la vie en milieu hypersalin .......................................................................... 19
III.2.1. Adaptation à la salinité par production d’osmoprotecteurs .................................................................. 19
III.2.2. Adaptation à la salinité par accumulation de KCl ................................................................................ 19
III.2 .3. Adaptation des protéines à l’hypersalinité ......................................................................................... 19
III.3. la salinité et la biodégradation ................................................................................................................. 20
PARTIE II: MATERIEL ET METHODES .......................................................................................................
I.. Matériel Biologique ..................................................................................................................................... 22
I.1. Sol……………….. .................................................................................................................................... 22
I.2. Bactéries ...........................................................................................Erreur ! Signet non défini.
I.3. Solution à déférent concentration de Na Cl .....................................................Erreur ! Signet non défini.
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II.2 . Méthodologie ........................................................................................................................................... 23
II.2.1 .Evaluer la Tolérance des souches a différent dégréé de salinité .......................................................... 23
II.2.1.1. Sur gélose nutritive ................................................................................................................... 23
II.2.2.1.4 Sur M63 + 60ulde Pétrole brute ......................................................Erreur ! Signet non défini.
II.2. 2.Traitement. ............................................................................................................................................. 23
II.2.2.1 Evaluation de la biomasse bacterienne ............................................................................................... 23
II.2.2 Dosage de carbone organique totale COT. ............................................................................................ 24
PARTIE III: RESULTATS ET DISCUSSION .................................................................................................
III.1 Résultats
III.1.1. l’évaluation de la Tolérance des souches à différent dégréé de salinité ............................................... 25
III.1.1.1. Sur gélose nutritive. ........................................................................................................................... 25
I.1.1.2.Sur milieu M63 + 60 ul de Pétrole brute .............................................................................................. 26
III.1.2. Cinétique de la croissance microbienne au cours de traitement ........................................................... 26
III.1.2.1. Sable ……………………………………………………………………………………… 26
III.1.2.2. Argile ………………………………………………………………………………………...
27
III.1.3. Teneur résiduelle de carbone organique ............................................................................................... 28
III.1.3..1.Sable 28
28
III.1.3..2.Argile… 28
III. 2.Discussion ............................................................................................................................................... 29
Conclusion……………………………………………….. ...................................................................................... 32
Reference bibliographique ............................................................................................................................... 33
Annexes…………….. .............................................................................................................................................
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Liste de figures
Figure 1 : devenir des hydrocarbures dans l’environnement ................................................ 08
Figure 2: Dégradation aérobie de la matière organique en aérobie . ................................... 10
Figure 3 : Dégradation anaérobie de matière organique en anaérobie ……………………..10.
Figure 4: Mécanisme général de dégradation des hydrocarbures par les microorganismes11
Figure 5:Phylogénie des principaux groupes de bactéries hydrocarbonoclastes.................. 14
Figure 6 : Stratégie de traitement………………………………………………………………24..
Figure 7 :Taux de la croissance des souches bactérienne après 03 jours
(GN)……………….25.
Figure 8 : T aux de la croissance des souches bactérienne après
3jour(M63)………………..26
Figure 09: Évolution de la concentration bactérienne dans échantillons de sable
bioaugmenté (a) et non bioaugmenté (b) au cours de
traitement…………………………27…..
Figure 10: Évolution de la concentration bactérienne dans échantillons d'argile bioaugmenté
(A) et non bioaugmenté (B) au cours de traitement………………………………………27…
Figure 11 : Evolution de teneur résiduelle de carbone organique dans les échantillons
de sable bioaugmenté (1) et non bioaugmenté (2) au cour de traitement…………………28.
Figure 12: Evolution de teneur résiduelle de carbone organique dans les échantillons d'argile
bioaugmenté (3) et non bioaugmenté (4)au cour de traitement……………………………28….
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Liste des tableaux
Tableau :01 solution utilisées……………..………………………………………………22
Tableau 02: la croissance des souches bactériennes pendant le temps(GN)…………..…..25
Tableau 03: la croissance des souches bactériennes pendant le temps(M63)……….……..26
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Liste des abréviations
TID : Transfert interfacial direct
HAP : Hydrocarbures aromatiques polycycliques
mM : millimolaire
Rpm : Rotation Par Minutes
DO : Densité optique.
COT : Carbone Organique Totale
M: Mole
µl : microlitre
UFC: Unité Formant Colonies
ED: Eau Distillée
ER: Eau De Robinet
GN : Gélose Nutritive
S1: Souche1
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Introduction
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Introduction
Avec l’accélération du développement économique, l’homme est de plus en plus
responsable de la pollution de l’environnement. La diversité des produits d’origine industrielle
conduit à une augmentation considérable du nombre de substances totalement étrangères au
monde vivant (ABDELLY, 2006).
L'extraction, le transport et l'utilisation du pétrole entraînent des risques de pollution
(accidentelle et chronique) pour l'environnement pouvant influencer l'équilibre écologique et
parfois entrainer la destruction de l’écosystème (SOLTANI, 2004).
Par ailleurs, le problème majeur rencontré dans les sols pollués par les produits
pétroliers est l’atteinte de la nappe phréatique affectant ainsi la qualité des eaux (BOUDERHEM,
2011).
Ainsi, la commande et les stratégies de traitement pour combattre les effets dangereux
de la pollution pétrolière sont nécessaires (BIDOIA, 2010).
L'élimination du pétrole de l'environnement nécessite l'intervention de différents
facteurs biotiques et abiotiques. Parmi ces facteurs la biodégradation par les microorganismes et
en particulier les bactéries est le processus naturel le plus important dans la dépollution de
l’environnement (SOLTANI, 2004). Même s‘il est relativement lent, ce processus permet une
dégradation quasi-complète (transformation en CO2) des hydrocarbures (SAURET, 2011).
L’intérêt de cette technique réside essentiellement dans le fait qu’elle ne nécessite ni
excavation, ni transport, ce qui rend leur mise en œuvre bien moins coûteuse (NICOLAU, 2008).
Les conditions environnementales jouent un rôle très important dans le contrôle de la
croissance et l’activité bactérienne durant la biodégradation d’hydrocarbure. Par conséquence, il
est très important d’étudier l’effet des facteurs physico-chimiques comme la salinité sur la
biodégradation du pétrole pour une implantation de la biodégradation comme une technologie
de bioremédiation (MESBAIAH, 2013).
L’objectif de ce travail est d’étudier l’effet de la salinité sur la croissance bactérienne
et la biodégradation des hydrocarbures par des souches bactériennes isolées à partir d’un sol
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Introduction
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contaminé ou non par le pétrole brut. Un suivi de la biodégradation a été effectué dans des sols
artificiellement contaminée par le pétrole.
Notre mémoire est partagé en trois parties ;
La première partie présente un rappel des principales données bibliographiques
concernant d’une part les généralités sur les hydrocarbures, les microorganismes
responsables de la dégradation et leurs mécanismes, et d’autre part, l’effet de la
salinité sur l’activité microbienne.
La seconde partie, est réservée à la présentation de la méthodologie adoptée pour la
réalisation de notre travail.
La troisième partie de ce mémoire est consacrée à la présentation et la discussion des
résultats obtenus. Le manuscrit est achevé par une conclusion et des perspectives.
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Synthèse
bibliographiques
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Synthèse bibliographique
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I. Généralités sur les hydrocarbures
Le développement industriel a entraîné un accroissement de la pollution des
écosystèmes naturels. Les pollutions chimiques, dans le cas des hydrocarbures, peuvent être soit
naturelles (par transformation de la matière organique), soit accidentelles (dégazage ou naufrage
de pétroliers) dans les milieux aquatiques. Ou par les rejets, les déversements volontaires ou
accidentellement par des fuites de pétrole dans le milieu terrestre. Ces pollutions présentent un
impact direct ou indirect sur la santé humaine et l’équilibre des écosystèmes (FOURÇANS,
2004 ; MBONIGABA et al, 2009).
I.1.Définition
Les hydrocarbures sont des composés organiques ne contenant que du carbone et de
l’hydrogène, associés en molécules d’une très grande diversité, de la plus simple, le méthane,
constituant principale du gaz naturel, aux plus complexes et mal connues qu’on trouve dans les
fractions lourdes du pétrole brut et dans les schistes bitumineux (BOCARD, 2006).
En plus du carbone et de l’hydrogène, il existe d’autres éléments minoritaires qui sont
des composants qui contiennent des atomes de soufre, d’azote et d’oxygène (résines et
asphaltées) (FATTAL, 2008).
I.2.Origine des hydrocarbures
Les hydrocarbures se trouvent en grande quantité dans les gisements naturels
profonds. Ils proviennent de diverses origines après transformation, sous l’effet de la chaleur, de
la pression et de substances organiques végétales (diagénèse, catagenèse) (FOURÇANS, 2004).
Les hydrocarbures sont émis dans l’environnement par des processus naturels ou anthropiques.
Les processus naturels de génération des hydrocarbures sont divers. On site,
-Les feux de forêt et de prairie, considérés comme les plus importants (JUMEAU S,
1999).
L’éruption volcanique, l’érosion des roches, les fuites de réservoirs naturels ainsi que la
production d’hydrocarbures par les végétaux supérieurs (cires) ou par les algues.
La production de ces végétaux est marquée par la prédominance des n-alcanes. Deux
sources anthropiques sont généralement distinguées : d’une part les sources pétrolières
correspondant à une pétrogenèse à basse température et d’autre part les sources
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Synthèse bibliographique
4
pyrolytiques correspondant à des processus de combustion à haute température
(ROCHER, 2002).
Leur origine principale est l’utilisation et le transport des combustibles fossiles. Ainsi,
la combustion incomplète de la matière organique fossile (charbon, pétrole et dérivés) ou plus
récente (bois), ou pyrolyse, est une source majeure d’HAP (KUON, 2005).
La circulation automobile constitue l’une des principales sources d’hydrocarbures
puisqu’elle combine les deux processus. Les véhicules émettent des gaz d’échappement
provenant de la combustion incomplète des carburants et sont aussi à l’origine de déversements
de produits variés (carburants, huiles lubrifiantes, débris de pneu, etc.).
En milieu urbain, le chauffage urbain et les diverses industries à des processus
pyrolytiques (production de coke, craquage catalytique, etc.) constituent aussi des sources
importantes d’hydrocarbure (ROCHER, 2002).
I.3.Classification
Selon SOLTANI (2004), les hydrocarbures sont groupés en différentes classes parmi
lesquelles on distingue: les hydrocarbures saturés (30 à 70 %), les hydrocarbures aromatiques et
polyaromatiques (20 à 40 %), les composés polaires (5 à 25 %) et les Asphaltènes (0 à 10 %).
I.3.1. Hydrocarbures saturés
Parmi l’hydrocarbure, on distingue :
-Les alcanes linéaires (n-alcanes, CnH2n+2), a de longueur de chaîne varie de 7 à 40
atomes de carbone, constituent une des classes les plus abondantes (10 à 40 % des hydrocarbures
totaux d'un brut pétrolier).
-Les alcanes ramifiés les plus abondants sont les iso-alcanes (groupement méthyle en
position 2), les autres composés ramifiés antéiso (groupement méthyle en position 3) ou
polyramifiés tels que les isoprénoïdes (exemple: pristane, phytane) sont beaucoup moins
nombreux. Ces composés se trouvent dans le pétrole brut à des proportions sensiblement égales à
celles des n-alcanes.
-Les cycloalcanes représentent entre 30 et 50 % des hydrocarbures totaux d’un
pétrole brut. Sont des composés cycliques (à 5 ou 6 atomes de carbone) saturés et le plus souvent
substitués. Quelques dérivés polycycliques sont aussi présents et certains d’entre eux tels que les
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Synthèse bibliographique
5
stéranes et les triterpanes sont caractéristiques d’un pétrole brut. Cette famille peut représenter
entre 30 et 50 % des hydrocarbures totaux d’un pétrole brut.
I.3.2. Hydrocarbures aromatiques
Sont moins abondants que les alcanes, et ne représentent que 10 à 30 % des
hydrocarbures totaux d'un brut pétrolier. De nombreuses familles d'hydrocarbures aromatiques et
polyaromatiques dont le nombre de noyaux varie de 2 à 6 sont présentes dans les pétroles bruts.
Elles sont dominés par des composés mono-, di- et tri-aromatiques.
. I.3.3. Composés polaires
Cette fraction correspond à des molécules hétérocycliques, telles que:
- Les composés oxygénés: phénols, acides carboxyliques, alcools, aldéhydes,…
- Les composés soufrés: mercaptans, sulfures, disulfures,…
- Les composés azotés: pyridines, quinoléines,…
Les dérivés soufrés sont dans la plupart des cas plus abondants que les composés oxygénés ou
azotés.
I.3.4. Asphaltènes
Les Asphaltènes regroupent dans une classe des composés de hauts poids
moléculaires, insolubles dans le pentane ou l’hexane. Leur structure est mal connue à cause de
leur composition chimique complexe (à base de cycles aromatiques condensés, de naphtéo-
aromatiques, de ramifications et d’hétéroatomes O, N, S) d’une part, et d’autre part de méthodes
analytiques difficilement utilisables. Les métaux sont également présents mais à l’état de traces.
Les plus abondants sont levanadium et le nickel, mais du fer, du sodium, du cuivre et de
l’uranium ont également été détectés.
I.4.Devenir des hydrocarbures au contact de l’environnement
Les hydrocarbures rejetés dans l’environnement subissent à des séries de modification
suite l’action de facteurs abiotiques et biologiques, peuvent être déplacé, transformer ou éliminer
ces polluants, on citera les facteurs environnementaux qui sont :
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Synthèse bibliographique
6
I.4.1.Evaporation
La transformation d’hydrocarbure fluide à sa forme gazeuse est plus ou moins longue.
Il dépend des conditions climatiques (vent, température), du type de pétrole et de l’épaisseur de
la nappe. Ainsi, de l’essence et/ou du gazole s’évaporent totalement et plus rapidement dans des
températures ambiantes chaudes et avec des vents notables. A titre d’exemple, la fraction légère
des hydrocarbures déversés par le Braers’est évaporée dans les 24 heures qui ont suivi la
catastrophe, malgré les températures peu élevées des Shetland (FATTAL, 2008).
Après l’évaporation des fractions légères, il ne reste que celles qui sont lourdes,
comme les Asphalténes ou les métaux (principalement le nickel et le vanadium), qui rendent ces
résides plus denses et plus visqueux (FATTAL, 2008).
I.4.2. Dissolution
C’est un processus de dissociation des molécules de pétrole dans l’eau, il est
généralement réduit. En effet, les hydrocarbures sont faiblement solubles (1%) et seules les
fractions aromatiques légères peuvent rapidement se dissoudre au contact de l’eau (benzène,
toluène, et autres). Cette dissolution qui disperse le polluant est fonction de la viscosité, du taux
de solubilité d’hydrocarbures ainsi que des conditions environnementales (FATTAL, 2008).
I.4.3.Emulsification
Deux types d’émulsions peuvent se former : eau dans l'huile appelée "mousse
Chocolat" et huile dans l'eau. Les émulsions eau dans l'huile sont constituées par des
hydrocarbures de haut poids moléculaires. Ces émulsions difficilement dégradables sont les
précurseurs des résidus goudronneux retrouvés sur les plages, alors que les émulsions « huile
dans l'eau » facilitent l’élimination des hydrocarbures (SOLTANI, 2004).
I.4.4. Sédimentation
La sédimentation est le passage du pétrole de la surface vers le fond. Ce phénomène
concerne les résidus goudronneux constitués de la fraction pétrolière la plus lourde et dont la
densité est supérieure à celle de l’eau de mer (VANDERSTEEL, 2005).
La sédimentation conduit à la constitution d’agrégat de haute densité difficilement
dégradable par voie naturelle (SOLTANI ,2004).
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Synthèse bibliographique
7
I.4.5. Photo-oxydation
La photo-oxydation est observée au niveau de la surface de l’eau où l’air (oxygène) et
la lumière (radiations solaires) sont présents pour la transformation des hydrocarbures
(PAYNEET, 1985). L’efficacité de ce phénomène dépend de la nature des hydrocarbures et de la
présence de composés non hydrocarbonés (Bertrand et Mille, 1989). Ainsi, la photo-oxydation
touche plus particulièrement les composés aromatiques qui sont plus photosensibles que les
composés aliphatiques. Parmi ces derniers, les composés ramifiés sont plus facilement photo-
oxydés que les n-alcanes (RONTANI et GIUSTI, 1987).
I.4.6. Biodégradation
La biodégradation est le processus naturel le plus important dans la dépollution de
l’environnement. Les microorganismes en sont responsables, en particulier les bactéries.
L’importance de la biodégradation dans l’élimination du pétrole, les voies métaboliques
d’oxydation des hydrocarbures par les bactéries et les paramètres qui peuvent influencer la
biodégradation seront traitées dans les paragraphes suivants (VOGEL, 2001).
D’après MORGAN et WATKINSON (1989), en peut résumer le devenir des
hydrocarbures au contact de l’environnement par la figure (1).
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Synthèse bibliographique
8
Figure 01 : devenir des hydrocarbures dans l’environnement
(MORGAN et WATKINSON, 1989)
II- Biodégradation des hydrocarbures
Le devenir des produits pétroliers rejetés dans l’environnement est principalement
gouverné par le processus de biodégradation. L’existence de ce phénomène dépend non
seulement de la biodégradabilité intrinsèque du polluant mais aussi de la présence de microflores
déprédatrices compétentes dans les sols et les eaux (AKAMOUCI-TOUMI SIHOM 2009).
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Synthèse bibliographique
9
II-1- Définition
La biodégradation est une dégradation biologique effectuée par les êtres vivants
(bactéries, champignons…). Elle est due à l’abondance et à la variété des micro-organismes dans
le milieu considéré. L'attaque d'une molécule chimique par des micro-organismes a pour
aboutissement sa minéralisation et l’obtention de métabolites de faibles poids moléculaires
(BOUCHESEICHE et al, 2002).
Les processus de la biodégradation sont :
- la biodégradation primaire qui est l’évaluation de la disparition de la substance en milieu
généralement aqueux, dans des conditions définies par mesure de la quantité résiduelle ou perte
des propriétés (BEGBEG ,2008)
- la biodégradation ultime qui est une dégradation complète conduisant à la formation de dioxyde
de carbone, méthane, eau, éléments minéraux. Cette biodégradation, si elle se fait rapidement,
conduit à l’élimination du polluant dans le milieu (BOUCHESEICHE et al ,2002).
II-2-Voies de la biodégradation
II-2-1-Aérobie
La biodégradation aérobie se fait au cours d’une respiration bactérienne utilisant
l’oxygène comme accepteur terminal d’électrons. Ce métabolisme met en œuvre des mono- ou
di-oxygénases qui attaquent les molécules par addition d’oxygène (MOUNIER, 2013).
La biodégradabilité d’une substance organique, est le degré de mobilité physique et
chimique que subi cette matière organique provoquer par des microorganismes. Le schéma
suivant illustre le processus de biodégradation d’une substance organique en condition aérobie.
Celle-ci peut être affectée par la modification de l’un des facteurs suivants:
Vitesse de dégradation des composés organiques
Quantité d’oxygène consommée
Produits résultant de la dégradation
Activité microbienne (ZHANPENG et al, 2002).
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Synthèse bibliographique
10
Figure 02: Dégradation aérobie de la matière organique en aérobie (ZHANPENG et al, 2002).
II-2-2- Anaérobie
En absence d’oxygène, les bactéries métabolisent les HAP par voie anaérobie, mais
beaucoup plus lentement qu’en aérobiose (MARTIN, 2011).
L'activité métabolique des microorganismes produit des substances organiques simples non
complètement oxydées telles que des acides organiques et d'autres composés comme le méthane
et l'hydrogène gazeux (KING, 1992).
Le schéma suivant illustre parfaitement les processus anaérobies que subi la matière
organique (HONGWEI et al, 2003 et BEGBEG, 2008).
Figure 03 : Dégradation anaérobie de matière organique en anaérobie (HONGWEI et al, 2003 et
BEGBEG, 2008).
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Synthèse bibliographique
11
II-3-Mécanisme de dégradation
La biodégradation des hydrocarbures est l’un des premiers mécanismes conduisant à la
transformation de ces polluants en produits moins toxiques, sous l’action des micro-organismes
qui utilisent les hydrocarbures comme source de carbone et d’énergie. Une partie du carbone
pétrogénique biodégradé est minéralisée (dégradation en gaz carbonique et en eau), une autre
transformée en carbone microbien (biomasse) et une autre fraction est transformée en métabolite
(bioconversion). Le mécanisme principal du métabolisme des micro-organismes permettant
l’élimination d’une partie du carbone pétrogénique dans le milieu est l’oxydation des molécules
hydrocarbonées (BLONDEL, 2007).
Figure 04: Mécanisme général de dégradation des hydrocarbures par les microorganismes
(DAS et al, 2011).
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Synthèse bibliographique
12
II.4.Modes d’assimilation des hydrocarbures par la cellule bactérienne
Le transport des hydrocarbures à travers la paroi des microorganismes est mal élucidé
bien que les gouttelettes d’hydrocarbure soient fréquemment observées dans la cellule. Ainsi, du
fait de la faible solubilité de la plupart des hydrocarbures, il y a quatre modes d’assimilation
bactériennes que l’on peut décrire comme suit :
II.4.1-Utilisation de la phase dissoute(le transfert par solubilisation dans la phase aqueuse)
Généralement, les bactéries ne peuvent utiliser que les molécules se solubilisant dans l’eau
(COMEAU, 1999).
II.4.2-Transfert interfacial direct(TID)
Dans ce cas, le microorganisme adhérent du fait de sa forte hydrophobicité à
l’interface phase hydrophobe/phase aqueuse (BALLERINI et VANDECASTEELE, 1999).
Selon FINNERTY et SINGER (1985), beaucoup de microorganismes dégradant des
hydrocarbures ont des surface hydrophobes et peuvent donc s’associer aux gouttelettes
d’hydrocarbure ou même entrer dans la phase organique pendant la culture.
II.4.3-Transfert micellaire (pseudo solubilisation)
La production de biosurfactant par certain microorganisme peut solubiliser les
substrats dans des micelles afin de leur tour seraient directement assimilé (COMEAU, 1999).
Plusieurs microorganismes capables de produire des biosurfactant, par exemple :
Rhodococcus aurantiacus, mycobactéries paraffinicum, corynebacterium spp, Bacillus subtilis
etc.… (HOMMEL, 1994 ; BODOUR et al, 2003). Les espèces les plus importants sont celles
appartenant au genre Pseudomonas produisant les rhamnolipides et les espèces de Torulopsis
produisant les sophrolipides (CHAYABUTRA et JU, 2000).
II.5.Bactéries hydrocarbonoclastes
Les microorganismes jouent un rôle important dans la biodégradation des polluants
organiques dans les écosystèmes terrestres. Cette dégradation résulte de voies métaboliques qui
mettent en jeu des populations microbiennes spécifiques ou des capacités métaboliques
combinées concernant différentes communautés microbiennes (TRZESICKA-MLYNARZ et
WARD ,1995).
Page 24
Synthèse bibliographique
13
Les bactéries hydrocarbonoclastes utilisent les hydrocarbures pétroliers comme seule
source de carbone. La plupart de ces bactéries appartiennent aux α-protéobactéries. On peut noter
quelques genres majoritaires parmi les 79 récemment répertoriés : Acinetobacter, Alcanivorax,
Alcaligenes, Cycloclasticus, Flavobacterium, Marinobacter, Pseudoalteromonas, Pseudomonas,
Thallassolituus, Oleispiraet Vibrio (PRINCE, 2005).
De nombreuses études ont montré qu‘elles étaient ubiquistes et présentes en faible
quantité même dans les environnements dépourvus de contamination. Naturellement, leurs
effectifs sont accrus dans les zones chroniquement polluées par les hydrocarbures et augmentent
après un apport de pétrole. Mais chacun de ces genres bactériens n‘est capable de dégrader qu‘un
nombre restreint d‘hydrocarbures alors que le pétrole est composé de centaines voire de milliers
de molécules différentes (SAURET, 2011).
La biodégradation totale d‘un pétrole n‘est donc possible que grâce à la mise en place
d‘un consortium bactérien comprenant des groupes dont les équipements enzymatiques
complémentaires permettent la biodégradation quasi-totale de ces différents types
d‘hydrocarbures. Si les bactéries dégradant les composés les plus simples (comme les alcanes
linéaires à courte chaine) sont abondantes dans l‘environnement, celles qui possèdent les
machineries enzymatiques pour dégrader les composés les plus complexes (comme par exemple
les composés aromatiques de plus de quatre cycles) sont beaucoup moins répandues (SAURET,
2011).
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Synthèse bibliographique
14
Figure 05 : Phylogénie des principaux groupes de bactéries hydrocarbonoclastes marines. En
bleu, les microorganismes qui dégradent les hydrocarbures saturés, en rouge, ceux qui
dégradent les hydrocarbures aromatiques polycycliques et en noir les bactéries non-dégradantes
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Synthèse bibliographique
15
Les bactéries aptes à biodégrader les hydrocarbures sont génétiquement stable, apte à se
reproduire rapidement suite à un entreposage de longue durée, apte à biodégrader une vaste
étendue de polluants pétroliers, activité enzymatique et croissance des bactéries dans des
conditions environnementales optimum, aucun effet secondaire néfaste et produits finaux non
toxiques, 63% pigmentés (orange, jaune et rouge), la majorité des souches bâtonnées Gram
négatives et 32% des bactéries motiles ou mobiles, 20% des bactéries à Gram positives et
filamenteux (PELMONT, 1995).
II-6-Facteurs physiques et chimiques affectant la biodégradation
La biodégradation des hydrocarbures est l’un des premiers mécanismes conduisant à la
transformation de ces polluants en produits moins toxiques. Les travaux de recherche sur
l’oxydation des hydrocarbures par les microorganismes ont montré que ce processus dépend de
la structure chimique des hydrocarbures et des conditions environnementales (COSTES et
DRUELLE ,1997).
Les facteurs physicochimiques influant sur la vitesse de biodégradation microbienne
sont :
II-6-1- Structure et nature du sol
Les bioprocédés s’appliquent à une grande variété de sol. Pour cela, il est important
de connaitre la structure et la nature du sol à traiter (LECOMTE, 1995).
La taille des pores et les propriétés de l’eau et de l’air dans ces pores sont facteurs
spécifiques de chaque sol (GIRARD et al, 2005).
Les particules élémentaires du sol sont généralement liées entre elles par les forces
électrostatiques formant des agrégats plus au moins volumineuses groupés en unités structurales
du sol. En effet, les agrégats tendent à diminuer l’activité microbienne dans le sol de manière
indirect. Par un ralentissement de la diffusion de l’oxygène et l’apport des nutriments à
l’intérieur de l’unité structurale et par la protection mécanique des substrats qu’elle renferme
(GIRARD et al, 2005).
II-6-2-Composition du polluant
Les composés pétroliers différents par leur susceptibilité à l’attaque microbienne.
Ainsi la vitesse de biodégradation est plus élevée pour les saturés, viennent en suite les
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Synthèse bibliographique
16
aromatiques légers, les aromatiques à haut poids moléculaire, les composés polaires ayant la
vitesse de dégradation la plus faible.
La biodégradabilité du pétrole brut est très fortement dépendante de leur composition
à une température déterminée, un pétrole léger est plus susceptible d’être biodégradé qu’un
pétrole lourd (SOLTANI, 2004).
RATLEDGE (1978), a rassemblé des règles qui ont une application générale à
l’ensemble des micro-organismes:
1- Les hydrocarbures aliphatiques sont assimilés par une grande variété de
microorganismes, les composés aromatiques peuvent être oxydés mais sont assimilés par
quelques bactéries seulement.
2- Les n-alcanes à chaînes courtes, tel que le n-nonane ne sont pas toujours assimilés,
mais peuvent être oxydés. Seules quelques bactéries ont la capacité de croître sur des alcanes
plus courts que le n-octane. Quand la longueur de chaîne augmente au delà de C9, le facteur de
production augmente, mais la vitesse d’oxydation décroît.
3- Les composés saturés sont plus rapidement dégradés que les insaturés.
4- Les composés ramifiés sont moins rapidement dégradés que les composés non
substitués.
II-6-3- Température
La biodégradation des hydrocarbures affecte par la température, lorsque la basse
température ralenti la volatilisation des composes toxiques à faible poids moléculaires, et
augmente la viscosité du pétrole qui difficulté leur émulsification(SAURET ,2011).
Généralement, la biodégradation est favorisée à des températures se situant autour de
25°C à 37°C (BEAUDOIN, 1996).
II-6-4- Ressources en oxygène
La teneur des sols en oxygène est contrôlée par différents facteurs. Un minimum
d’espaces occupés par l’air 10%(en volume) est généralement considéré comme nécessaire pour
l’activité microbienne (OUALD RABAH, 2012).
Selon LECOMTE(1995), l’oxygène peut être fourni sous plusieurs formes :
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Synthèse bibliographique
17
l’oxygène pure ;
l’air atmosphérique ;
le peroxyde d’hydrogène(H2O2) ou eau oxygénée.
II-6-5- Pression
La pression semble également être un facteur important dans la dégradation des
hydrocarbures. Dans le cas d‘un accident pétrolier, l‘attention est généralement portée sur le
pétrole qui s‘étale à la surface de l‘eau mais une grande partie de ce pétrole coule au fond de la
mer. Or la profondeur moyenne des mers et océans est de 3800m, ce qui correspond à une
pression de 380 bars, un état qui ralentit fortement l‘activité métabolique des microorganismes
(SAURET ,2011).
II-6-6-Nutriments
Les nutriments sont nécessaires pour le développement et l’activité microbienne, en
particulier l‘azote et le phosphore, est un facteur clé dans le processus de bioremédiation
naturelle des hydrocarbures (SAURET ,2011).
II-6-7-Humidité
L'humidité est un paramètre important dans les processus de dégradation des
composés organiques simples ou complexes. Il est connu que les faibles humidités inferieures à
2% limitent la vitesse de biodégradation. Inversement, des teneurs trop élevées vont influer sur la
perméabilité des sols aux gaz et générer des conditions de limitations de transfert d'oxygène et
donc de limitation de métabolisme microbien aérobie (BALLERINI, 1999).
II-6-8- Potentiel d’hydrogène (pH)
L'activité microbienne est largement influencée par le pH, dont l’optimum est compris
entre 6 et 8 pour les bactéries et entre 4 et5 pour les champignons (BOCARD, 2006 ; GABET,
2004).
II-6-9-Effet de la salinité
La salinité est un paramètre affecte la biodégradation, alors que la forte salinité
diminue le nombre de micro-organismes dans le sol qui est ralenti les processus de
l'humification et de la minéralisation des matières organiques. En effet, de tous les processus
biologiques, la nitrification est la plus touchée, ainsi que le dégagement de CO2. Les fortes
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Synthèse bibliographique
18
salinités constituent donc une barrière naturelle pour la biodégradation (MALLOUHI, 1989 ;
BERTRAND et al, 1993).
III- Salinité et biodégradation des hydrocarbures
III.1.Microorganismes halophiles
Les bactéries halophiles sont distinguées par leur exigence des concentrations salines
pour se développer (VENTOSA et al, 1999). Ainsi, ces microorganismes sont classés dans cinq
catégories : non halophiles, faiblement halophiles, halophiles modérés, halotolérantes et
halophiles extrêmes (KHEMILI, 2008).
III.1.1.Bactéries non halophiles
Les bactéries non halophiles représentent la plupart des Eubactéries qui ne se
développent pas en présence de sel ou, du moins, à des concentrations<0,2M (1,16%) de sel
(KUSHNER, 1993).
.III.1.2. Bactéries faiblement halophiles
Ces bactéries représentent une bonne croissance sur des milieux contenant 0,2M à
0,5M de sel (1,16% - 2,9%). C’est le cas des microorganismes marins (KUSHNER, 1993).
III.1.3.Bactéries halophiles modérées
Ce sont des microorganismes qui se développent dans un milieu contenant entre 3% et
15% de sel. On peut citer comme exemple : Vibrio costicola, Paracoccus, Halodenitrificans et
Pseudomonas (KUSHNER, 1993).
III.1.4.Bactéries halotolérants
Les bactéries ne nécessitent pas de sel pour leur croissance, mais peuvent pousser en sa
présence et supportent jusqu’a 1,8M (10,4%) de sel, comme Staphylococcus epidermidis,
Halomonas elongata, champignons et algue (KHEMILI, 2008).
III.2.Mécanismes d’adaptation en milieu hypersalin
Les microorganismes halophiles et halotolérants utilisent différents mécanismes pour
leur adaptation à la pression osmotique exercée par la très haute salinité du milieu. Puisque
toutes les membranes biologiques sont perméables à l’eau, tous les microorganismes doivent
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Synthèse bibliographique
19
maintenir leur cytoplasme au moins, en iso-osmose avec leur environnement. Dans tous les cas,
les ions Na+ sont exclus du cytoplasme autant que possible. Deux principales stratégies sont
utilisées par différents groupes de microorganismes. Elles sont basées sur le principe de créer
une haute pression osmotique dans le cytoplasme, tout en gardant une faible concentration en
Na+ (OREN, 2002).
III.2.1. Adaptation à la salinité par la production d’osmoprotecteurs
L’adaptation est basée sur l’expulsion des sels du cytoplasme et l’accumulation de
solutés organiques afin de fournir et de soutenir la balance osmotique, les solutés peuvent être
des sucres, des acides aminés, des éctoine et des polyalcools. Cette stratégie est largement
utilisée dans les trois domaines Bacteria, Archaea et Eucarya. Le soluté le plus utilisé dans le
domaine Bacteria est l’éctoine (synthétisée par une large variété de microorganismes) et à
moindre degré la glycine betaine (accumulé par beaucoup de bactéries hétérotrophes à partir du
milieu) (CHUN et al, 2000).
Le mode d’action des osmoprotecteurs est loin d’être clair. Ils pourraient n’être
simplement que des solutés compatibles inoffensifs, ou au contraire, ils pourraient jouer un rôle
protecteur actif interagissant avec les protéines et les protègent de cette façon de l’action
destructrice due à l’osmolarité (PAPAGEORGION et MURATA, 1995 ; WELSH, 2000).
III.2.2. Adaptation à la salinité par accumulation de KCl
Cette stratégie est adoptée par des groupes de bactéries halophiles anaérobies de
l’ordre des Haloanerobialeset par la bactérie aérobie telle que Salinibacter ruber. Ils accumulent
essentiellement du KCl (OREN, 2001 ; OREN et al, 2002 ; GRANT, 2004)..
L’exclusion du Na+ du cytoplasme se fait grâce à un antiport Na
+/H
+, localisé au
niveau de la membrane cytoplasmique. Généralement, les ions K+ entrent passivement via un
système uniport sous l’impulsion du potentiel de la membrane. Ce système revient à remplacer
une partie du sodium cellulaire par du potassium. Des systèmes multiples de transport actif des
ions K+
(OREN, 2001 ; OREN et al, 2002 ; GRANT, 2004).
III.2.3. Adaptation des protéines à l’hyper salinité
En accumulant dans leur cytoplasme des quantités de sel proche de la saturation, les
bactéries halophiles empêchent la sortie d’eau en s’adaptant au stress salin.
Page 31
Synthèse bibliographique
20
Les protéines « halophiles » concentrent fortement le sel prés de leur surface et
utilisent ses capacités hygroscopiques pour capturer les molécules d’eau nécessaires à leur
repliement, leur stabilisation et leur solubilisation. Ce phénomène est rendu possible par une
abondance d’acides aminés, connus pour interagir fortement avec les molécules d’eau et les
cations tels que le K+ (LOZACH, 2001 ; EISENBERG et al, 1992).
III.3.Effet de Salinité sur la biodégradation
La salinité exerce un effet osmotique sur les micro-organismes, qui ont aussi des
besoins en sels comme NaCI, KCI et MgCI2. Les fortes concentrations ont tendance à dénaturer
les protéines, c'est-à-dire à casser la structure tertiaire des protéines qui est essentielle à l'activité
enzymatique (ATLAS et BARTHA, 1993).
La plupart des micro-organismes ont des besoins limités en sels et sont inhibés par des
teneurs en NaCI supérieures à 2%, sauf les espèces halophiles (bactéries, champignons, algues)
qui croissent en milieux salins et supportent bien des teneurs en NaCI de 15% (BIDAUD, 1998).
Les halobacteries peuvent être des agents dépolluants. En effet certaines archaebactéries utilisent
les hydrocarbures tels que le pétrole comme seule source de carbone, cette biodégradation n’a
aucune conséquence négative sur les écosystèmes Salins, contrairement au traitement par des
agents chimiques (KHEMILI S, 2008).
Il semblerait que la salinité n‘ait que peu d‘impact sur la dégradation des
hydrocarbures. Le métabolisme de ces molécules est compatible avec des salinités très faibles
(eaux douces) ou plus élevées (eau de mer) puisqu‘il concerne, dans ces deux types de milieux,
des microorganismes adaptés à ces salinités. Seules de très fortes salinités comme celles des
marais salants seraient un frein à la dégradation en raison du manque d’oxygène régnant dans ces
zones (SAURET, 2011).
L'effet de la salinité sur l'activité des bactéries hydrocarbonoclaste dépend de la
variation d'amplitude de la concentration en sel imposée à la salinité de l'habitat des
microorganismes (ABED et al, 2006).
D’après DIAZ et al. (2002), les concentrations très basses en sel réduisent l'activité
des hydrocarbonoclastes et les résultats optimaux de biodégradation sont atteints dans les marges
de salinité modérées.
Page 32
Synthèse bibliographique
21
Il est tout d'abord nécessaire de considérer que les hydrocarbures sont moins
biodégradables dans des environnements hypersalins que dans les non salins. C'est une
conséquence de l'effet de "salage" : parce que les sels solubles réduisent l'hydrosolubilité des
composés organiques hydrophobes. Plus la concentration en sels dans la phase aqueuse est
élevée plus la tendance des composés organiques à d’être adsorbés à la matrice pleine (sédiment
ou sol) augmente (MACKAY et al, 2006 ; TAPILATU et al, 2010) ; Comme raison du bas
nombre des halophiles connus dégradants l'hydrocarbure.
Plusieurs halophiles sont des producteurs d’émulsifiant, la caractéristique qui est
attendue pour améliorer le transfert de masse pendant la métabolisation des hydrocarbures
(MARSTINEZ-CHECA et al, 2002). Ce composé d'émulsification est un exopolysaccharide qui
émulsionne le pétrole brut. Dans ce sens, l'application des émulsifiants ou les producteurs
émulsifiant- halophiles peut faire partie d'une stratégie de bioremediation.
La salinité élevée limite non seulement l'accès microbien aux hydrocarbures mais
également la disponibilité de l'oxygène, puisque sa solubilité diminue au fur et à mesure que la
concentration en sel augmente (MCGENITY, 2010 ; PFEIFER et al, 1997).
Page 33
Matériel et méthodes
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Matériel et méthodes
22
II. Matériel et méthodes
L’objectif de ce travail est d’étudier l’effet de la salinité sur la croissance bactérienne et la
biodégradation des hydrocarbures par des souches bactériennes isolée à partir des sols contaminés
ou non par les hydrocarbures. Un suivi de la biodégradation a été effectué dans deux types des sols
artificiellement contaminées par les hydrocarbures.
II.1. Matériel biologique
II.1.1. Sol
Pour la réalisation de nos expériences, nous avons utilisé deux types de sols :un sol sableux
prélevé à partir de l''exploitation agricole de l'université de Ouargla, il est contaminée
artificiellement par le pétrole. Avant une semaine de leur usage pour laisser le contaminant à
adsorber dans le sol, et un sol argileux prélevé de willaya de Skikda, elle est sèche et broyer puis
tamiser pour obtient des petites granules, puis il est contaminée par le pétrole et laisse une semaine
pour l’adsorption.
II.1.2. Bactéries
Les souches bactériennes utilisées sont isoles à partir de différent sols pollués ou non par les
hydrocarbures pétrolières. Ces 18 souches présentent une activité de dégradation de différents types
d’hydrocarbure (aliphatiques et aromatique) (BOUDERHEM ; 2011).
1I.1.3. Solutions de sel de (Na Cl)
Pour tester la tolérance des souches au cour de la dégradation des hydrocarbures ; des
solutions stériles de différentes concentration de NaCl ont été préparées (0mM ,50mM ,150mM
.300mM .600mM).
Tableau 01: solution utilisées
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Matériel et méthodes
23
II.2. Méthodologie
II.2.1. Evaluation de la Tolérance des souches a différent dégréé de salinité
II.2.1.1. Sur gélose nutritive
Pour évaluer le degré de tolérance des souches étudiées à la salinité, les souches sont
repiquer sur gélose nutritif contenant différent concentration de NaCl (0 mM, 50 mM ,150mM
,300 mM 600Mm), puis elles sont incubées à 30°C.
II.2.1.2. Sur milieu minéral M63 + Pétrole
Le test de biodégradation ont été réalisé sur milieu minéral de M63 solide à différent
concentration de NaCl (0 mM, 50 mM 150mM, 300 mM, 600 mM ,1 M,1.5 M,2 M) ,
additionné de la source de carbone (2% pétrolé brut) l’incubation se fait à température 30°C.
II.2.2.Traitements
Pour bioaugmenté les échantillons traités, des cultures liquides de souches isolées sont
effectuées dans le bouillon nutritif et incubées à 30°C sous agitation (160rpm).
Pour évaluer l’activité dégradante de ces souches, dans deux types de sols contaminé elles sont
distribuée dans des tubes à essai, contenant chacun 5g de sol contaminé et 15 ml de eau distillée
à différent concentration de NaCl. Des témoins non bioaugmenté par la suspension bactérienne,
maintenus dans les mêmes conditions, ses échantillons du milieu réactionnel sont prélevés
chaque semaine pour évaluer la biomasse bactériennes on mesure la densité optique et le taux de
la dégradation de hydrocarbures en dosage de le carbone organique totale. (fig.6).
Dont 50% de ces tubes sont bioaugmentés par la suspension bactrienne, tout ces tubes sont
incuber à 30°C sous agitation 160 rpm.
II.2.2.1. Evaluation de la biomasse bactérienne
L’augmentation de La biomasse microbienne est un indicateur direct de biodégradation
c’est pour cela on a suivi leur évolution dans le temps par la mesure de la densité optique par
spectrophotomètre de type ultra violet1240 à longueur d’onde 600mm.qui nous permet de
calculer la biomasse selon la formule y = 0.022x-0.023.
Page 36
Matériel et méthodes
24
II.2.2.2. Dosage de carbone organique totale COT
La méthode de détermination de carbone organique est basée sur l’oxydation de ce dernier
par le bichromate de potassium (K2 Cr2 O7) on milieu acide sulfurique (source de chaleur)
(PEILTAIN, 2009).Ce dosage nous permettra de suivre l’évaluation des polluants hydrocarbures
les échantillons de sols traites.
Figure 06 : Stratégie de traitement.
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25
Résultats et discussions
Page 38
26
Tableau 02: la croissance des souches bactériennes pendant le temps.
Figure 07: Taux de croissance des souches bactérienne après 3jours.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 50 150 300 600 1000 1500 2000
po
urc
enta
ge d
e n
br
des
so
uch
es
Concentration de NaCl
0
50
150
300
600
1000
1500
2000
[C mM]
[C] mM JOURS
0 50 150 300 600 1000 1500 2000
1ere S1,.S2.S3 S4 S5 S6
S7 S8 S9 S10 S11
S12 S13 S14 S15
S16 S17 S18 S1
18 18 18 18 18 S1.S3. S14
0
2eme 18 souches 18 18 18 18 18 S16 S15 0
3eme 18 18 18 18 18 18 S1.S3.S14.S16.S15 0
Page 40
Résultats et discussion
25
II. Résultats et discussions
III.1. Résultats
III.1.1.Evaluation de Tolérance des souches à différent dégréé de salinité
III.1.1.1. Sur gélose nutritive
Après 24h d’incubation a température 30C°, en absence de NaCl, toutes les souches sont pu
croitre (fig.7), alors qu’en présence de 50Mm de NaCl. Au-delà de cette concentration le nombre
de souche ayant poussé est inversement proportionnel à la concentration en NaCl. En effet, les
fortes concentrations de NaCl, 1.5M et 2M inhibent fortement la croissance bactérienne,
SeulesS1.S3.S14.S16.S15 ….sont apparente sous 1.5M, et aucune souches n’a poussé en présence de
2M (Tab : 2).
Le nombre total de souches s’étant développée sous les toutes concentrations de NaCl est
représenté dans la figure(07).
On constat qu’en croissance dans les concentrations allant de 50mM à 1M de NaCl, toutes
les souches arrivent à développer au bout de 24h de culture, au-delà, de 1.5M seules 20% des
souches s’y développent. La concentration de 2M ne présent le développement d’aucune souche
(fig07).
Page 41
Résultats et discussion
26
Tableau 03 : la croissance des souches bactériennes pendant le temps.
Jours 0mM 50 mM 150 mM 300 mM 600 mM 1000 mM 1500 mM 2000 mM
1ere
S1.S3…..
…..S18
18 18 S1.S2.S3.S4S5.S9
.S10.S11.S15.S16.S17
S1.S3.S9.S10
S13.S14.S16
S1.S10.S16 S1.S14 0
2eme
18 18 18 18 .S2..S4.S5
.S6.. S12
S5. S18 S1.S14 0
3eme
18 18 18 18 18 S2S4S6S9
S14S15S17
S16 0
08: Taux de croissance des souches bactérienne pendant 3jours
% =pourcentage de nbr
de souches.
[C mM]= concentration
de NaCl.
Page 42
Résultats et discussion
27
III.1.1.2. Sur milieu minéral M63 additionnée 2%de Pétrole brut
La variation de croissance des souches isolées sur milieu minéral M63 à différente
concentration en NaCl additionnée le pétrole comme seul source de carbone en fonction de
temps est présente dans la figure08.
Après 24h d’incubation, toutes les souches sont pu croitre en absence de NaCl (fig.08),
alors qu’en présence de 50mM de NaCl. Au-delà de cette concentration le nombre de souche
ayant poussé est inversement proportionnel à la concentration en NaCl. En effet, les fortes
concentrations de NaCl, 1M, 1,5M et 2M inhibent fortement la croissance bactérienne, Seules
S1 ,S2, 4S S5, S6 ,S9,S10 S14,S15,S16, S17 et S18, S14et S16 sont apparente sous 1M et1.5M
respectivement, aucune souches n’a poussé en présence de 2M (Tab :03).
Le nombre total de souches s’étant développée sous les toutes concentrations de NaCl est
représenté dans la figure08.
On constat qu’en croissance dans les concentrations allant de 50mM à 600mM de NaCl,
toutes les souches arrivent à développer au bout de 48h de culture, au-delà, de 1 M 66.6% des
souches s’y développent et pour 1,5M seules 16.6%. La concentration de 2M ne présent le
développement d’aucune souche (fig08).
III.1.2. -Cinétique de la croissance microbienne au cours de traitement
III.1.2.1.Sable
Afin de mieux comprendre le phénomène de la biodégradation du pétrole à partir de sol
pollue par les hydrocarbures dans deux types de sol a différent concentration de NaCl
(0mM ,50mM, 150mM ,300mM, 600mM), avec et sans addition de suspension bactérienne
(mélange de 18 souches), nous avons suivi l’évolution de certains paramètres comme la
concentration microbienne ,et carbone organique totale à partir des sols traités ou non.
La cinétique de croissance des souches bactériennes au cours de traitement a été suivi
en mesurant la biomasse microbienne dans la différente concentration de sel en fonction de
temps, ce qui nous permis de tracer les courbes ci- dessous :
L’augmentation de la biomasse proportionnelle au temps dans tous les concentrations qui
compris entre 4 et 5,5 .108UFC/ml à partir la 1
ère semaine, puis sont diminues lentement dans les
Page 43
Résultats et discussion
28
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Résultats et discussion
29
concentrations 50mM, 150mM, 600mM qui atteint des valeurs de 4,6.108 UFC/ml, 3,6.10
8
UFC/ml, 2.1 .108UFC/ml respectivement à 4
eme semaine (fig. 09).
Par ailleur, La plus forte biomasse microbienne enregistrée pour les échantillons de
l’eau distillé et eau de robinet, qui atteint des valeurs supérieurs a proche de 9 .108UFC/ml
durant à 4eme
semaine.
Pour les échantillons de sable pollué non augmenté, on assiste à deux cas de figures. Le
premier concernant les biomasses des échantillons en présence d’eau distillée, 50mM ou 150mM
de sel qui tendant à augmenter pour atteindre un maximum de 5.5.108UFC /ml en présence
d’eau distillée et 50mM, et 6.45UFC .108
/ml pour 150mM en sel, pendant la première semaine
puis diminuent progressivement entre la 1ere
et la 3eme
semaine pour atteindre un plateau à la
dernière d’expérimental.
Le deuxième cas est celui des biomasse des échantillons en présence d’eau de robinet,
300mM et 600mM de NaCl qui connaissent une légère diminution au cours de la 1ere
semaine
puis augmentent progressivement jusqu’à atteindre de valeur maximum de 5.5UFC.108 au cours
de 3eme
semaine, puis rechutent pour atteindre des valeurs de 4.1, 3.5, 3.9UFC.108a la fin de
l’expérimentation.
III.1.2.2. Argile
Les variations de biomasse bactérienne dans les échantillons d’argile bioaugmenté sont
représentées par la figure (10), on observe une augmentation de la concentration bactérienne
dans toutes les concentrations en sel. En effet, une maximum biomasse bactérienne enregistrés
au bout de 3eme
semaine elle est 8.7 .108UFC/ml et 8.57 .10
8UFC/ml dans la tube contenants
concentration 150mM et la eau distillée, et au-delà de 3eme
semaine, les concentrations
bactériennes se diminuent jusqu’à la fin de l'expérience.
Concernant les échantillons de l'argile non bioaugmenté (figure 10), La croissance
bactériennes dans tous les cultures sont diminuent parallèlement pendant de 1ere
semaine
suivis d’une accélération important qui se poursuit jusqu’a atteindre des valeurs maximales
(5.6.108 UFC/ml pour la concentration 50mM de NaCl) , Au-delà de 3
eme semaine les
concentrations bactériennes se diminuent jusqu’à la fin de l’incubation pour atteinte de valeur
voisine de 4.108UFC/ml.
Page 45
Résultats et discussion
30
Page 46
Résultats et discussion
31
III.1.3. Teneur résiduelle du carbone organique
III.1.3.1. Sable
L’évolution de la teneur résiduelle du carbone organique dans les échantillons de sable
bioaugmenté (A) et non bioaugmenté (B) au cour de traitement sont présente dans la figures
(11).
La teneur initial de carbone est de 0,6mg, elle est diminué fortement dans tous cas pour
atteinte de valeur de 0,2mg à la 2eme
semaine, puis diminue lentement durant la 2eme
et la 4eme
semaine de traitement.
III.1.3.2. Argile
Pour évolution de la teneur résiduelle de carbone organique dans les échantillons
d’argile (bioaugmenté et non), les résultats obtenus montrent la similarité de leur évolution
dans tout les échantillons, d’après les figures (12), la teneur initiale de carbone est de 0,5mg,
elle diminue fortement dans toutes les concentrations qui atteindre la de valeur de 0,2mg à la
2eme
semaine, puis diminue lentement jusqu’à la fin de traitement.
Page 47
Résultats et discussion
32
III.2. Discussions
La croissance de toutes les bactéries isolées à partir de sols pollués ou pas par les
hydrocarbures, en présence du pétrole, comme seules source de carbone, suggère leur capacité à
dégrader les hydrocarbures.
Plusieurs études ont montré que la biodégradation des hydrocarbures dépend des
conditions environnementales comme le pH, la température et la salinité. Ces derniers peuvent
influencer la biodégradation par l’inhibition de la croissance bactérienne (MESBAIAH.F et
ABDELMALEKB, 2013).
La salinité exerce un effet osmotique sur les micro-organismes, qui ont aussi des besoins
en sels comme NaCI, KCI et MgCI2. Les fortes concentrations ont tendance à dénaturer les
protéines, c'est-à-dire à casser la structure tertiaire des protéines qui est essentielle à l'activité
enzymatique (ATLAS et BARTHA, 1993). La plupart des micro-organismes ont des besoins
limités en sels et sont inhibés par des teneurs en Na CI supérieures à 2%, sauf les espèces
halophiles (bactéries, champignons, algues) qui croissent en milieux salins et supportent bien des
teneurs en Na CI de 15% (BIDAUD, 1998).
La mise en culture des souches bactériennes sur milieu de culture gélose nutritive à
diffèrent degré de salinité permet de montrer que Les 18 souches donnent une bonne résistance
à des concentrations en sel très importantes arrivant à 58.4 g/l (1M).
L’apparition de cultures mixtes (différentes souches) sur les boites contenant le milieu
minérale M63 à différentes concentrations de NaCl et enrichis de pétrole démontre les
capacités des souches bactériennes à utiliser ces substrats comme seule source de carbone dans
les conditions salines. Les bactéries ont le pouvoir de dégrader les hydrocarbures et les utiliser
comme source de carbone pour survivre. Cette utilisation permet de déduire que la période
d’adaptation au pétrole était courte (24h).
Selon SAURET(2011), Il semblerait que la salinité n‘ait que peu d‘impact sur la
dégradation des hydrocarbures. Le métabolisme de ces molécules est compatible avec des
salinités très faibles (eaux douces) ou plus élevées (eau de mer) puisqu‘il concerne, dans ces
deux types de milieux, des microorganismes adaptés à ces salinités. Seules de très fortes salinités
comme celles des marais salants seraient un frein à la dégradation en raison du manque
d’oxygène régnant dans ces zones.
Page 48
Résultats et discussion
33
L'effet de la salinité sur l'activité des bactéries hydrocarbonoclastes dépend de la
variation d'amplitude de la concentration en sel imposée et à la salinité de l'habitat des
microorganismes (ABED et al, 2006).
Selon KHEMILI (2008), les halobacteries peuvent être des agents dépolluants. En effet,
certaines archaebactéries utilisent les hydrocarbures tels que le pétrole comme seule source de
carbone, cette biodégradation n’a aucune conséquence négative sur les écosystèmes Salins,
contrairement au traitement par des agents chimiques.
La variation de l’augmentation de la biomasse dans les différentes concentrations en
NaCl indique la biodégradation des HC. D’après BOUDERHEM (2011), la différence de la
biomasse bactérienne entre les échantillons est due à l'effet de salinité qui semble avoir affecté la
prolifération bactérienne.
Dans les échantillons de sols non bioaugmenté La diminution de la biomasse au début de
traitement puis augmente après la 2 eme
semaine indiquée la phase de l’adaptation des microflores
de sols avec le milieu salin. Sol possède une microflore autochtone importante, qui suggère la
possibilité de cette dernière à assurer la biodégradation des hydrocarbures lorsque les bonnes
conditions du milieu sont réunies.
D’après HOMMEL (1994), certaines bactéries peuvent interagir avec les hydrocarbures
dissous dans la phase aqueuse par les facteurs de solubilisation extracellulaires, d’autres peuvent
mettre en jeu des stratégies comme l’excrétion des vésicules extracellulaires d’Acinetobacter sp.
HO1-N, la production de biosurfactants ou une augmentation de l’hydrophobicité de la paroi
externe de la bactérie, ce qui permet à cette dernière d’introduire facilement les hydrocarbures
au niveau de la cellule.
L’augmentation de la biomasse pendant la 1ère
semaine de traitement indique de le la
facilité d’’adaptation de la population bactérienne à la salinité.
Le développement bactérien dans les échantillons d’argile bioaugmenté au cours du traitement
dans toutes les concentrations de NaCl démontré leur adaptation à la salinité expliquent la
dégradation des hydrocarbures.
BERTRAND et al. (1993) ont étudié l’influence de la concentration en chlorure de
sodium sur la biodégradation des hydrocarbures par deux communautés microbiennes, ils ont
Page 49
Résultats et discussion
34
trouvé que la biodégradation est maximale pour une concentration de 0,4 M et diminue
lentement pour des valeurs supérieures et inférieures à celle-ci.
L’augmentation en biomasse est accompagnée par un changement de concentration de
carbone organique dans le milieu qui subit une diminution progressive dans les cultures.
L’abaissement de la concentration de carbone organique totale dans l’échantillon de sable
bioaugmentée et non bioaugmentée due serait à l’accumulation puis la métabolisation du substrat
à partir des bactéries hydrocarbonoclastes ajoutés comme inoculum bactérien où les bactéries
autochtone présentent naturellement dans les sols. Les microflores des sols pollués présentent
en général une capacité de dégradation légèrement supérieure.
La cinétique de dégradation se divise en deux phases. Une phase rapide de dégradation
qui débute après le 1er jour et qui se termine après 1 semaine d’incubation. Selon
(Vandecasteele1 et al, 2001), cette période ont caractérisée par un ralentissement de la
consommation d’oxygène. On constate que ce ralentissement correspond à un épuisement du
carbone, qui est le composé essentiel du pétrole. La première phase est suivie d’une phase de
dégradation lente au cours de laquelle la vitesse de dégradation de carbone diminue.
La dégradation a démarré dès le début de la phase rapide pour toutes les classes
d’hydrocarbures (n-alcanes, isoalcanes, cycloalcanes, alcènes, et aromatiques)
(VANDECASTEELE1et al, 2001).
Les résultats obtenus montrent que la dégradation des hydrocarbures est possible dans
un milieu salin, les souches sélectionnées supportent des concentrations en sel(NaCl )arrivant
à58.4g/l (1M).
Page 51
Conclusion
32
Conclusion
L’objectif de notre travail est d’étudier l’effet de la salinité sur la croissance bactérienne et
la biodégradation des hydrocarbures par des souches bactériennes isolées à partir des sols
contaminés ou non par les hydrocarbures. Un suivi de la biodégradation a été effectué dans deux
types des sols artificiellement contaminés par les hydrocarbures.
La mise en culture des souches bactériennes sur gélose nutritive à différents degrés de
salinité a permis de montrer que les 18 souches ont une bonne résistance à des concentrations
en sel très importantes arrivant jusqu’à 1.5 M de NaCl.
La croissance des différentes souches sur milieu minéral M63 enrichis de pétrole en
présence de différentes concentrations de NaCl permet de démontrer la capacité des souches
bactériennes à utiliser ce substrat comme seule source de carbone dans les conditions salines
après une courte période d’adaptation.
L’abaissement de la concentration de carbone organique total dans l’échantillon de sable
et d’argile bioaugmenté ou non serait due à l’accumulation puis la métabolisation du substrat à
partir des bactéries hydrocarbonoclastes ajoutées comme inoculum bactérien ou les bactéries
autochtones présentes initialement dans les sols. Les microflores des sols pollués présentent en
général une capacité de dégradation légèrement supérieure.
La biodégradation des hydrocarbures est un processus complexe qui dépend de la nature
et la quantité d’hydrocarbures présente, des conditions environnementales et de la composition des
communautés microbiennes.
Les résultats obtenus montrent que la dégradation des hydrocarbures par les souches
bactériennes dans les échantillons à salinité élevée est possible à cause de leur résistance à ces
conditions. Une bonne croissance bactérienne a été observée accompagnée d’une dégradation du
pétrole dans les milieux, ce qui favoriserait l’utilisation de ces souches dans la bioremédiation des
milieux extrêmes.
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Références
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Page 59
Annexes
Annexes : 01
Milieu gélose nutritif (GN) (AOUATI ;2009)
Pour 1litre de milieu il faut :
Peptone :………………………………………….5g
Extrait de levure :…………………………….. 2g
Extrait de viande : …………………………….1g
Na Cl : ………………………………………………5 g
Agar :……………………………………………… 15g
L’eau distillée : ……………………………….1000ml
PH=07
Milieu solide M63
KH2PO4 : …………………………………………….68.0
Carbohydrate solution : ………………………… 10 ml
(NH4) 2SO4 : …………………………………………10 g
FeSO4 :………………………………………………….2.5 mg
MgSO4 :………………………………………………. 1.0ml
Agar : …………………………………………………..15 g
L’eau distillée : …………………………………....1000ml
PH=07
.
Page 60
Annexes
Annexe 02:Suivi de la croissance microbienne a différent dégréé de salinité
Sur gélose nutritive
Culture à 0 Mm de Na Cl Culture à 50 Mm de Na Cl
Culture à 150Mm de Na Cl Culture à 300Mm de Na Cl
Culture à 600 Mm de Na Cl
Page 61
Annexes
Annexe 03
Tab
leau
02: S
uiv
i de la
croissa
nce m
icrob
ienn
e d
e18
sou
ches cu
ltivées su
r le milieu
M63 a
dd
ition
né d
e 2%
de p
étrole b
rut
Page 62
Annexes
Annexe 04
(A) (B)
Tableau : Suivi de la concentration microbienne des échantillons de sable
bioaugmenté(A)et non bioaugmenté (B )au cours du traitement.
(A) (B)
Tableau : Suivi de la concentration microbienne des échantillons d’argile bioaugmenter (B) et
non bioaugmenté (A) au cours du traitement.
ED ER 50 150 300 600
S1 4,638 4,725 4,725 4,941 4,292 4,075
S2 5,309 3,75 5,244 6,11 3,253 3,621
S3 4,573 4,811 5,482 5,504 4,443 4,551
S4 3,296 5,439 4,551 3,729 4,184 5,244
S5 3,296 3,967 4,249 3,729 3,703 3,204
ED ER 50 150 300 600
S1 2,993 2,993 3,426 1,586 1,695 1,738
S2 5,374 4,941 5,374 4,075 4,508 4,292
S3 4,725 4,725 5,482 4,378 3,426 3,642
S4 8,491 6,976 5,222 5,201 4,292 3,383
S5 9,486 9,01 3,642 4,205 4,616 2,192
ED ER 50 150 300 600
S1 2,777 3,231 1,695 3,426 2,863 2,971
S2 3,253 3,664 2,409 4,681 4,378 2,214
S3 7,062 5,331 3,902 5,85 4,227 4,1
S4 8,577 7,712 5,158 8,707 5,331 5,482
S5 2,56 2,733 4,032 1,63 4,075 4,184
ED ER 50 150 300 600
S1 6,456 4,941 4,985 3,378 4,985 4,963
S2 2,56 2,733 4,032 1,63 4,075 4,184
S3 4,833 5,05 5,655 5,179 5,404 5,266
S4 3,21 3,318 3,231 3,383 3,404 3,231
S5 4,119 4,119 3,642 3,383 3,556 3,967
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Annexes
Annexe 05
S0 S1 S2 S3 S4
ED 0,594 0,272 0,22 0,178 0,164
ER 0,594 0,263 0,197 0,173 0,167
50 0,594 0,228 0,185 0,169 0,159
150 0,594 0,283 0,19 0,173 0,163
300 0,594 0,266 0,214 0,166 0,17
600 0,594 0,23 0,223 0,184 0,185
Tableau : Suivi de teneur résiduelle de carbone organique des échantillons de sable
bioaugmenter(A) et non bioaugmenté (B) au cours du traitement.
(A ) (B)
Tableau : Suivi de teneur résiduelle de carbone organique des échantillons d’argile
bioaugmenter (A ) et non bioaugmenté (B) au cours du traitement.
S0 S1 S2 S3 S4
ED 0,594 0,235 0,226 0,224 0,159
ER 0,594 0,249 0,223 0,22 0,165
50 0,594 0,242 0,174 0,172 0,156
150 0,594 0,254 0,183 0,183 0,158
300 0,594 0,259 0,171 0,17 0,153
600 0,594 0,248 0,182 0,183 0,168
S0 S1 S2 S3 S4
ED 0,512 0,256 0,255 0,226 0,223
ER 0,512 0,255 0,227 0,218 0,19
50 0,512 0,252 0,219 0,213 0,19
150 0,512 0,242 0,22 0,179 0,175
300 0,512 0,257 0,225 0,184 0,18
600 0,512 0,253 0,221 0,184 0,18
S0 S1 S2 S3 S4
ED 0,512 0,239 0,224 0,209 0,196
ER 0,512 0,258 0,235 0,203 0,192
50 0,512 0,227 0,213 0,196 0,187
150 0,512 0,252 0,219 0,199 0,195
300 0,512 0,251 0,248 0,236 0,192
600 0,512 0,226 0,219 0,216 0,201
Page 64
Résume :
L’objectif de notre travail est d’étudier l’effet de la salinité sur la croissance bactérienne et la biodégradation des
hydrocarbures par des souches bactériennes isolées à partir des sols contaminés ou non par les hydrocarbures. Un suivi de la
biodégradation a été effectué dans deux types des sols artificiellement contaminées par les hydrocarbures.
Les résultats obtenus montrent le développement de la majorité des souches sur gélose nutritive et milieu minéral M63
additionnés de 2% de pétrole comme seule source de carbone et des concentrations de sel allant jusqu’à 1.5M de NaCl au bout de 3
jours d’incubation.
L’augmentation de la biomasse des échantillons (sable, argile) bioaugmenté est importante en absence du sel (eau distillée et
eau de robinet). Leurs valeurs respectives étant de 9 et 9,4 108UFC/ml pour le sable, alors que pour l’argile les meilleurs résultats sont
observés pour les échantillons traités à l’eau distillée, l’eau de robinet et même en présence de 150mM de NaCl à des valeurs
respectives de 8,57 ; 7,7 et 8,07 108UFC/ml. Cette augmentation indique la métabolisation du polluant par les bactéries
hydrocarbonoclastes.
Ces résultats sont confirmés par la diminution du taux de carbone organique total dans les échantillons atteignant des valeurs
minimales comparables de 0.18mg à la fin de l’expérimentation pour les deux types de sols.
Mots clés : hydrocarbures, salinité, biodégradation, bactéries hydrocarbonoclastes, biomasse, carbone organique total.
Summary:
The objective of our work is to study the effect of salinity on the bacterial growth and biodegradation of hydrocarbons by stocks
bacterial S insulated starting from the grounds contaminated or not by hydrocarbons. A follow-up of the biological breakdown
was carried out in two types of the grounds artificially contaminated by hydrocarbons. The results obtained shows NT the
development of the nutritive majority of the stocks on gélose and mineral medium M63 added with oil 2% like only source of
carbon and of the salt concentrations going until NaCl 1.5M from 3 days of incubation.
The increase in the biomass of the samples (sand, clay) bioaugmentés is significant in absence of salt (distilled water and
water of tap). Their respective values being of 9 and 9,4 10 8
UFC/ml for sand, whereas for clay the best results are observed for
the samples treated with distilled water, water of tap and even in the presence of NaCl 150mM to respective values of 8,57; 7,7
and 8,07 10 8 UFC/ml. This increase indicates the metabolisation of the pollutant by the bacteria hydrocarbonoclastes.
These results are confirmed by the reduction D U rate of total organic carbon in the reaching samples of S minimal values
comparable of 0.18mg at the end of the experimentation for the two types of grounds.
Key words: hydrocarbons, salinity, biological breakdown, bacteria hydrocarbonoclastes, biomass, total organic carbon.
: الملخص
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