Effect of Various Percoll Washings on Motile Sperm Recovery … · 2011-04-08 · (Key words : Bovine frozen semen, Cryopreservation, Percoll, Motion kinematics, Motile sperm recovery

Reprod Dev Biol 35(1) : 61-65 (2011) 61

* 이 논문 2009년도 중앙대학 학술연구비 지원에 한 것임.†Corresponding author : Phone: +82-31-670-4841, E-mail: [email protected]

다양한 Percoll세척 방법이 동결-융해된 한우 정자의 회수율

운동역학에 미치는 향

윤성재1․박유진

1․정진용

1․정규

1․김민섭

1․유새미

1․

김연희1․권우성

1․El-Sayed A. Mohamed

1․방명걸

1,2,†

1앙 학교 생명자원공학부 동물생명공학 공,

2앙 학교 생명환경연구원

Effect of Various Percoll Washings on Motile Sperm Recovery Rate

and Motion Kinematics in Frozen-thawed Bovine Semen

Sung-Jae Yoon1, Yoo-Jin Park

1, Jin-Yong Cheong

1, Kyu-Hyun Jeong

1, Min-Seop Kim

1, Sae-Mi Yoo

1,

Yun-Hee Kim1, Woo-Sung Kwon

1, El-Sayed A. Mohamed

1 and Myung-Geol Pang

1,2,†

1Department of Animal Science and Technology, School of Bioresource & Bioscience,

Chung-Ang University, Anseong 456-756, Korea2BET Research Institute, Chung-Ang University, Anseong 456-756, Korea

ABSTRACT

The objective of this study was to examine the effect of various discontinuous Percoll washing conditions on motile sperm recovery rate and motion kinematics. Frozen semen samples from 3 bulls (0.5 ml plastic straws, 6% glycerol in egg yolk-Tris-glycerol extender) were thawed in 37℃ water bath for 1 min. After thawing, the mixed semen sam-ples were randomly allocated to 12 treatment groups. Briefly, the spermatozoa were centrifuged for three different time lengths (10, 20, and 30 min) at two gravities (300×g and 700×g) through two concentrations of discontinuous Percoll density gradient of 1 ml 90%: 1 ml 45% Percoll and 2 ml 90%: 2 ml 45% Percoll to remove extender, debris, and dead spermatozoa. Motile sperm recovery rate and motion kinematics were evaluated by computer assisted sperm analyzer using Makler counting chamber. Sperm motility (%) and motile sperm recovery rate showed similar pattern in all treatment groups. However, sperm motility (%) and motile sperm recovery rate were highest at 700×g for 30 min through a discontionous Percoll density gradient of 1 ml 90%: 1 ml 45% Percoll. There were no significant diffe-rences in motion kinematics after various Percoll washings. These results suggest that force of centrifugation, centrifu-gation time, and Percoll volume significantly affect motile sperm recovery rate.

(Key words : Bovine frozen semen, Cryopreservation, Percoll, Motion kinematics, Motile sperm recovery rate)

서 론

에 동결 액 한 공수 생산 진시키 해 보편 사 는

다. 하지만 공수 공률 50% 도 , 러한 에 가에 는 연 귀하 는 경향

늘고 다. 그러므 공수 공률 해는 동결 액에 수태 진단 에 한 연 가 행 어야 한다. 재 사 는 액 검사 는

computer assisted sperm analysis(CASA; Holt 등, 1997), chlortetracycline(CTC) 염색 (Thundathil 등, 1999), In-

vitro fertilization(Parrish 등, 1986), 막 난 (Sharara 등, 1995), 거 햄스 난 를

한 (sperm penetration assay; Oh 등, 2010)등 사 고 다. 러한 검사 시 과 동해 지 사 하는 glycerol 등 체 처리시 악 향 끼 므 한 검사를 해 는 러한 질 벽 거하고 운동 만 리해 내는 한 단계를 거쳐야만 한다(Henkel과 Schill, 2003).

재 동결 해 액 검사에 주 사 는 Per-coll density gradient 수 에 악 향 끼 는 죽 질 감 시키고(Reddy 등, 1979),

운동 (%) 태 상 수

재 등62

여 다(Parrish 등, 1995; Somfai 등, 2002). 하지만 원심리 건과 Percoll 도 등 수많 Percoll 척 건

에 른 능 연 는 미 한 실 다.본 연 는 다양한 Percoll 척 건들에

수 과 운동역학 변수를 비 하여 원심 리 건에 른 운동 수 , 운동 (%) 운동역학 변 를

하 하여 수행하 다.

재료 방법

동결보존액 및 배양액 조

본 실험에 사 보 액 Tris-egg yolk buffer(TYB; 250 mM Tris, 88.5 mM citric acid, 68.8 mM glucose, 20% egg yolk)를 사 하 고, 양액 는 Tyrode's al-bumin lactated pyruvate(TALP; 100 mM NaCl, 3.1 mM KCl, 25 mM NaHCO3, 0.3 mM NaH2PO4, 21.6 mM lactate, 2 mM CaCl2, 0.4 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 1 mM pyruvate)를 사 하 다.

액의 동결

사 한우 수 액 (주) 산(경 도 시)에 도 수 상체 미 에 채취하 다. 채취 액 TYB에 하여 2시간 동안 천천 4℃지 도를 하강시켰다. 동결 stress를 하 하여 glycerol 12% 함 TYB를 각각 20 간격 고 1, 2, 4 ml 하여 6% 액 하 다. 평 맞 해 다시 4℃에 2시간 동안 시켰다. 후 0.5 ml straw에 액 주 하고 액체질 2.5 cm 에 15 간 한 후 액체질 에 어 보 하 다.

액의 척

동결 보 3개체 액 37℃ 류수에 1 간 해하여 15 ml tube에 겨 담았다. 사 3개체 액 합하여 사 하 다. Percoll 원액 10×Dulbe-

cco's phosphate buffered saline(DPBS) 9:1비 (v/v) 하여 90% Percoll 하 다. 또한, 90% Percoll과

Table 1. Definition of chosen motility kinematic descriptions

Name Units Description

Curvilinear velocity (VCL) μm/sTime-average velocity of sperm head along its actual curvilinear trajectory as perceived in two dimensions under the microscope

Straight-line velocity (VSL) μm/sTime-average of a sperm head along the straight line between its first detected position and its last position

Average path velocity (VAP) μm/s Time-average velocity of a sperm head along its spatial average trajectory

Linearity (LIN) VSL/VCL

Mean amplitude of head lateral displacement (ALH) μmMean head displacement along its curvilinear trajectory around the mean trajectory

Percentage of hyperactivated sperm (HYP) %Percentage of sperm with increased curvilinear velocity and lateral head movement sperm, and decreased linearity; curvilinear velocity≥80, linea-rity≤65, amplitude of head lateral displacement≥6.5

1×DPBS를 각각 1:1 비 (v/v) 하여 45% Percoll 한 후, 를 하여 12개 처리 건 만들었

다. 1 ml 90%: 1 ml 45% Percoll 에 액 0.5 ml씩 주하여 300×g에 10 (T300/10-1), 20 (T300/ 20-1) 30 간(T300/30-1) 원심 리하 고, 2 ml 90%: 2 ml 45% Percoll 에 액 0.5 ml씩 주하여 300×g에 10 (T300/10-2), 20 (T300/20-2) 30 간(T300/30-2)

원심 리하 다. 또한, 1 ml 90%: 1 ml 45% Percoll 에 액 0.5 ml씩 주하여 700×g에 10 (T700/10-1), 20(T700/20-1), 30 (T700/30-1) 원심 리하 다. 2 ml

90%: 2 ml 45% Percoll 에 액 0.5 ml씩 주하여 700×g에 10 (T700/10-2), 20 (T700/ 20-2), 30 (T-700/30-2) 원심 리하 다. 원심 리 후 상 액 거하고 하단 만 수하 , Percoll 거하 해 TALP 5 ml를 첨가하여 5 간 원심 리를 실시하

다. 원심 리 후 상 액 거하고 TALP media를 1 ml 첨가하여 를 재 하 다.

CASA를 이용한 운동 자 회수 및 운동 (%) 측

동결 해 10 μl를 39℃ 가열 Makler coun-ting chamber에 린 후 CCD 라(JVC, Japan)가 착 학 미경(Nikon, Japan)에 연결 SAIS system (Me-

dical Supply, 울, 한 ) 하여 운동 수(%) 운동역학 변수를 하 다. Percoll 척후 각 처리 에 른 운동 수 과

운동역학 변수를 비 하 다. 운동역학 변수 에 한 각 항 는 Table 1과 같다. 운동 수 아래 공식에 근거하여 산 하 다(

등, 1993).

i: 해 직후 액 결과 f: 액 처리 후 액 결과

통계 분

통계 통계 프 그램(SPSS 12.0) 사 하 ,

Percoll 해 운동 에 미 는 향 63

원 산 T-test 실시하여 각 처리 간 운동 수 운동역학 변수를 비 하 다.

변량 상 계수 과 다 귀 하여 운동 수 과 운동 (%) 간 상 계를 하 다. p<0.05 통계 하다고 단하 다.

결 과

처리구에 따른 운동 자 회수 의 차이

각 처리 에 라 Percoll 척한 후 운동 수 비 하 , 수 차 는 Fig. 1과 같다. 원심 에 한 차 에 는 T300/10-1, T700/30-1 T700/ 30-2를 하고는 1 ml/1 ml Percoll에 2 ml/2 ml Percoll보다 수 보 다. 10 간 원심 리한 보다 30 간 원심 리한 에

수 보 다. T300/10-1과 T700/30-1 T700/30-2에 는 차 는 없었 나, 2 ml/2 ml Percoll에 수 보 다. 300×g에 는 원심리 시간에 른 차 는 나타나지 않았다. 에 700×g 건에 는 원심 리 시간 늘어날수

운동 수 가하 , Percoll 1 ml 처리에 2 ml 처리 시보다 운동 수 았다.

처리구에 따른 자의 운동 (%) 및 운동역학 변

Percoll 척 건에 른 운동 (%) 변

Fig. 1. Effects of Percoll volume and centrifugation time at 300×g

and 700×g conditions on motile sperm recovery rate (%). The effects

of different Percoll volume, centrifugation time, and gravity were

compared. Data are expressed as the mean±SE. A～D Significantly di-

fferent in 700×g (p<0.05). * Significantly different between 300×g and

700×g (p<0.05).

Table 2. Multiple linear regression analysis to assess the relationship of gravity, time, and volume of Percoll with motile sperm recovery

rate

Model Estimate (B) S.E Beta t-value p-value

Gravity 0.416 0.001 0.007 6.213 0.006

Volume —0.538 0.427 —3.430 —8.041 0.000

Time 0.628 0.026 0.245 9.382 0.000

Fig. 2. Effects of Percoll volume and centrifugation time at 300×g

and 700×g conditions on sperm motility (%). The effects of diff-

erent Percoll volume, centrifugation time, and gravity were com-

pared. Data are expressed as the mean±SE. A,B Significantly diff-

erent in 300×g (p<0.05), a,b

Significantly different in 700×g (p<0.05).

* Significantly different between 300×g and 700×g (p<0.05).

운동역학 변 를 CASA를 하여 비 하 다. 처리 건에 른 운동 (%) 변 는 Fig. 2 같다. 원심 에 한 차 에 는 T300/30-1과 T700/30-1 하고는 700 ×g에 운동 (%) 보 다. T300/10-1과 T300/10-2에 1 ml Percoll 사 하 2 ml Percoll 사 시보다 운동 (%) 았다. 또한, 를 한 든 처리 건에 차 는 없었지만 Per-

coll 1 ml 사 하 가 2 ml 사 하 보다 운동 (%) 았다. 운동역학 변수 HYP, VCL, VSL, VAP, LIN ALH에 는 처리 건에 른 차 가견 지 않았다.

운동 자 회수 및 운동 (%)과 처리 조건의 상 계

Percoll 척 건에 른 운동 수 과 상 계를 하 하여 다 귀 실시

하 다(Table 2). 원심 과 원심 리 시간 운동 수 과 양 상 계를 보 고(p<0.05),

Percoll 양에 른 운동 수 상 계를 나타냈다(p<0.05). 또한, 원심 리 시간 Percoll 양 원심 에 비해 수 에 가 큰 향 주었다

(R2=0.857). 또한, Percoll 척 건과 운동 (%)과 상

계를 다 귀 실시하 다(Table 3). 원심 원심 리 시간과 운동 (%) 양 상 계를

보 (p<0.05), Percoll량에 른 운동 (%) 상 계를 나타냈다(p<0.05). 또한, 운동

수 과 마찬가지 원심 리 시간 운동 (%)에

재 등64

Table 3. Multiple linear regression analysis to assess the relationship of gravity, time, volume of Percoll with motility(%)

Model Estimate (B) S.E Beta t-value p-value

Gravity 0.291 0.007 0.018 2.741 0.043

Volume —0.477 2.692 —12.089 —4.490 0.002

Time 0.573 0.165 0.890 5.396 0.000

가 큰 향 끼쳤다(R2=0.64).

고 찰

동결 해 는 동결보 액 죽 등 질에 악 향 주는 많 들에 어 다.

러한 거 지 않 는 공수 시 생리

첨체 단계 지 가지 못하여 수 에 실 하게

다(Watson, 2000). 라 동결보 액 죽

거는 처리 시 드시 행 어야 하는 단계 다.

를 통해 운동 수 과 운동 (%) 여 수 진시킬 수 다.

수 운동 해 Percoll 주 사 고 다. Percoll colloidal silica

어 , 숙과 과 도 등 특 에 라 를 리한다(Oshio, 1988). 운동 (%) 는 Percoll 척 시 그 지 않 보다 빨리 가라앉게 는 , 그 는 운동 원심 리 원심 라 가 다(Rhemrev

, 1989). Percoll 한 에는 continuous 과

discontinuous , discontinuous 운동 수 에 어 보

고하고 다(Iizuka 등, 1988).Valcarcel 등(1996) 양 액에 discontinuous Per-

coll 운동 가지 , 첨체막 상 지 않

를 수하는 합하다고 보고하 다. 에 동결

해 액에 는 해 시 운동 낮거나(27～30%), 첨체막 한 비 낮 액에 만

Percoll 었다(Rodrigez-Martinez 등,

1997). 에 Somfai 등(2002) 해 후 운동 40%

상 액에 도 처리 후 운동 수 운동

(%) 았다고 보고하 다. 러한 차 가 나타난

는 하지 않지만 Rodrgez-Martinez는 40% 80% discontinuous Percoll 400×g에 척하 고, Somfai

는 45% 90% discontinuous Percoll 하여 300×g에 척하 다는 차 다. 후에도 Percoll gra-

dient는 상 를 수할 수 는 라고 많 연 진들에 해 보고 어 다(Somfai 등, 2002). 그럼에도 하고 다른 척 과 마찬가지 Percoll 척 시 사 하는 원심 리는 에 상 수 는 한 과

(Aitken과 Clarkson, 1988), Percoll 통과할 가 학 질에 직 도 한다. 그 에

원심 리 도 Percoll 양 에 미 는 향

어야 한다. 본 연 에 는 다양한 Percoll 척에 라 운동 (%)과 운동 수 비하여 가 알아보고 하 다. 또한,

Percoll 척 운동 수 운동 (%)에 향 주는 알아보았다. 각 척 에 라 운동 (%) 한 운동역학 변수에 는

차 가 나타나지 않았지만 운동 수 과 운동(%)에 는 상 계가 나타났다. 운동 수 처리 수 운동 (%) 나타냈고,

Percoll 한 원심 리 시간 어질수 운동 수 과 운동 (%) 게 나타났다. 또한, Percoll

양 차 에 는 든 실험 에 1 ml Percoll 척한 수 과 운동 (%) 2 ml Percoll보다 게 나타났는 , 가 Percoll 통과하는 동안 직

하 상 것 생각

다. 원심 리 도에 른 운동 수 과 운동(%) 비 시 700×g에 처리한 들 300×g에

척한 들보다 운동 수 과 운동 (%) 나타냈는 , 는 원심 에 운동 가Per-

coll 욱 하게 통과한다고 생각할 수 다. Percoll 척 시 원심 , 처리 시간 Percoll 양에 른 운동

(%) 운동 수 비 에 원심 리 시간 가 큰 변수 하는 것 나타났다.

라 Percoll 하여 동결보 액 운동 수 운동 (%) 고 할 Percoll 양,

원심 리 시간 원심 하여 상 를 수하는 것 람직하다.

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