Effect of Dexamethasone treatment on the immune response of Gulf Coast Native lambs to Haemonchus contortus infection

Effect of Dexamethasone treatment on the immune response of Gulf Coast Native lambs to Haemonchus contortus infection M.T. Peña a,1, J.E. Miller a,b,c,∗, D.W.

Horohov a,2

C H R I S T O P H E R C Ô RT E S E R E N A N C O N I

S A L V A D O R / B A2 0 1 4

Universidade Federal da BahiaEscola de Medicina Veterinária

Imunologia Aplicada à Saúde e a Produção Animal

Efeitos do tratamento com Dexametasona sobre a resposta imune de cordeiros nativos da Costa do Golfo infectados por Haemonchus contortus

Introdução• A evidência para a variação genética da resistência à infecção com

nemátodos gastrointestinais parasitas vem de três fontes: variação dentro da raça, variação entre raças, e a identificação de genes que contribuem para a variação .

• Resistencia da raça Gulf Coast Native comparada a raça Suffolk.

• Inferior contagem de ovos fecal, 5.300 cordeiros EPF Suffolk, em comparação com 430 EPF cordeiros nativos; e inferior.fardo nematóide, 9105 no total H. contortus contados em cordeiros Suffolk, em comparação com 500 no total H.contortus contados em cordeiros Gulf Coast Native.

• Cordeiros Suffolk necessário substancialmente mais tratamento com anti-helmíntico.

• Mortes devido a haemonchosis só foram observados em cordeiros Suffolk.

Introdução• Estudos têm demonstrado que a resistência à infecção gastrointestinal nemátodo

dentro da raça está relacionada com uma reacção inflamatória local, envolvendo diferentes tipos de células, anticorpos, muco gastrointestinais, e mediadores inflamatórios. Esta resposta local, conhecido como exclusão imunitário, em que as larvas de entrada falhar estabelecer, tem sido documentada em ovelhas contra a infecção por H. Contortus.

• Estudos têm demonstrado que a exclusão imune pode ser reduzida pelo tratamento com corticosteróide.

• Observaram que a resistência à H. contortus em um genótipo resistente deovelhas Merino foi revogada pelo tratamento com corticosteróides e esta perda de resistência foi associado a um declínio em mastócitos e densidade de leucócitos e declínio no concentrações de proteinase dos mastócitos em tecidos da mucosa abomasal.

• Os linfócitos T são um componente importante da resposta inflamatória local a infecção por nematóides e o papel dos linfócitos T auxiliares tem sido demonstrada em estudos onde as ovelhas se tornaram altamente suscetíveis a H. contortus desafio depois de ser esgotado estas células.

Introdução• Diferentes mecanismos efectores foram relatados para entre-raça

variações na resistência ao nematóide infecção.

• Resistente ovelhas Red Maasai e Scottish Blackface mostraram fortes respostas de eosinófilos periféricos que foram associados com altos níveis de leucócitos e específico muco IgA do H.contortus.

• O mecanismo envolvido na resistência em ovelhas Gulf Coast Native não foi caracterizado.

• O objetivo deste estudo foi determinar se uma base imunológica subjacente à naturais resistência de ovelhas Gulf Coas Native para infecção por H. contortus por suprimir a resposta imune com dexametasona durante o período de exposição a infecção natural inicial como cordeiros recém-nascidos e durante uma infecção experimental após o desmame.

Materiais e Métodos O delineamento experimental

A infecção natural em cordeiros recém-nascidos

• Em 4 semanas de idade • 8 cordeiros nativos que foram criados a pasto desde o nascimento, foram alocados em um

tratamento • um grupo controle (4 cordeiros) • tratamento com dexametasona (Azium®, 1 mg / kg de peso corporal, IM) três vezes por semana

por um período de nove semanas.• Os cordeiros foram mantidos naturalmente infectados azevém com suas mães na Fazenda Sheep

Estação Central, Louisiana Agrícola Estação Experimental, Baton Rouge, LA.• As amostras de fezes e de sangue foram coletadas em uma base semanal para monitorar o nível

de infecção com base no volume da célula FEC e sangue embalado (PCV). O sangue também estava processado por leucócitos determinação diferencial, e o soro foi testado para os níveis de anticorpos em resposta a amadurecer H. contortus antígeno de verme todo (WWA).

• Para testar a funcionalidade de linfócitos, linfócitos foram isoladas do sangue nas semanas 1, 6 e 9 de tratamento com dexametasona e de linfonodos abomasal na necropsia.

• Na semana 8 de tratamento, todos os cordeiros foram vacinados com a Brucella abortus cepa 19 (1 mg em 1 ml de soro fisiológico para cada animal, IM) vacina. As amostras de soro foram testadas para uma resposta no dia da vacinação e 10 dias após a vacinação com o cartão de brucelose teste.

• Todos os cordeiros foram sacrificados (Beuthanasia®-D, 1 mL por 10 kg de peso corporal, IV), na extremidade do estudo (semana 9) para recuperar abomaso nematóides dos nódulos linfáticos e do tracto gastrointestinal.

Materiais e Métodos O delineamento experimental

A infecção natural em cordeiros recém-nascidos

• Em 4 semanas de idade • 8 cordeiros nativos que foram criados a pasto desde o nascimento, foram alocados em um tratamento • um grupo controle (4 cordeiros) • tratamento com dexametasona (Azium®, 1 mg / kg de peso corporal, IM) três vezes por semana por

um período de nove semanas.• Os cordeiros foram mantidos naturalmente infectados azevém com suas mães na Fazenda Sheep

Estação Central, Louisiana Agrícola Estação Experimental, Baton Rouge, LA.• As amostras de fezes e de sangue foram coletadas em uma base semanal para monitorar o nível de

infecção com base no volume da célula FEC e sangue embalado (PCV). O sangue também estava processado por leucócitos determinação diferencial, e o soro foi testado para os níveis de anticorpos em resposta a amadurecer H. contortus antígeno de verme todo (WWA).

• Para testar a funcionalidade de linfócitos, linfócitos foram isoladas do sangue nas semanas 1, 6 e 9 de tratamento com dexametasona e de linfonodos abomasal na necropsia.

• Na semana 8 de tratamento, todos os cordeiros foram vacinados com a Brucella abortus cepa 19 (1 mg em 1 ml de soro fisiológico para cada animal, IM) vacina. As amostras de soro foram testadas para uma resposta no dia da vacinação e 10 dias após a vacinação com o cartão de brucelose teste.

• Todos os cordeiros foram sacrificados (Beuthanasia®-D, 1 mL por 10 kg de peso corporal, IV), na extremidade do estudo (semana 9) para recuperar abomaso nematóides dos nódulos linfáticos e do tracto gastrointestinal.

Materiais e Métodos EPG e necropsia

• Amostras fecais individuais foram obtidas diretamente do reto e foram processados para determinarEPF utilizando a técnica modificada de McMaster e relatado como ovos por grama (EPG).

• Os nemátodos foram recuperados a partir do tracto gastrointestinal e na necropsia e contadasidentificadas e descritas .

• O processo de recuperação foi modificado de modo a queconteúdo de órgãos foram levados até um volume de 5 litros e uma alíquota de 500 ml foram recolhidos e preservados com formalina.

Materiais e MétodosHematologia

• O PCV sangue foi obtido por um analisador automático de hematologia (INC Sistema Baker.9110 + Plus).

• Percentagens diferencial de leucócitos foram feitas em esfregaços de sangue corados commodificada coloração de Wright.

Materiais e métodosEnsaios de linfoproliferação

• Ensaios de linfoproliferação foram executados em células mononucleares do sangue periférico (CMSP).

• Os linfócitos foram isolados a partir de sangue total usando Ficoll-Plaque.

• Após três lavagens com PBS, 1 ml de meio RPMI-1640was adicionado, e concentração celulares estava determinada com um hemacitómetro utilizando azul de tripano para se obter uma suspensão final de 2 × 106 células / ml. Fitohemaglutinina (PHA), Concanavalina A (ConA), e Pokeweed (PW) foram usados para testar linfócitos T função.

• ConA e PW foram usadas a 4, 2 ou 1 _g / ml de PHA e foi utilizado em 8, 4 ou 2, _g / ml.

• Mitogénios foram diluídas em meio RPMI-1640 e adicionou-se respectivos poços em volumes de 100_l.

• RPMI-1640 foi adicionado aos poços de controlo, e, em seguida, 100 _l da suspensão de células foiadicionado a todos os poços.

• Todas as culturas foram feitas em triplicado. As placas foram incubadas a 39 ◦C numa incubadora humidificada com 5% de CO2 durante 3 dias.

• As placas foram então pulsadas com 0,5 _ci [3H] timidina por poço, durante 4 h e, em seguida, colhidas para contagem de cintilação líquida.

Materiais e MétodosELISA

• O teste ELISA foi usado uma modificação do procedimento .

• As placas de microtitulação foram revestidas com 50 _l ofWWAobtained de maduros H. contortus vermesem necropsy.WWA foi obtido seguindo o procedimento descrito por Kabagambe .

• Resumidamente, os nemátodos foram lavados em água com um filtro de 500 _m, e lavadas em fosfatosolução salina tamponada (PBS).

• Os nematóides foram homogeneizado em cerca de 5 ml de PBS e o homogenato foi centrifugado a 5000 x g.

• O sobrenadante foi recolhido e armazenado a -20 ◦C. A concentração total de proteína foi determinada utilizando uma placa de microtitulação adaptado.

• Os ensaios de ácido bicinconínico (Pierce, Rockford, IL, EUA).

• O antigénio foi diluído em carbonato (pH 9,6) tampão de revestimento a 10 _g / ml. As placas foram incubadas à temperatura ambiente durante a noite e, em seguida, lavadas com PBS contendo 0,05% de Tween-20 (tampão de lavagem) soro .

• As amostras diluídas 1/500 em diluente de soro foram adicionadas às placas e, em seguida, incubadas durante2 h à temperatura ambiente (24 ◦C).

• O soro de uma ovelha madura, com um nível de infecção alta foi utilizado como controlo positivo e soro de colostro privados cordeiros foi utilizado como um negativo controlo e ambos também foram diluídas até uma diluição de 1/500 em diluente de soro e incubadas durante 2 h à temperatura ambiente.

• Todas as amostras de soro (teste, negativos e os controlos positivos) foram feito em triplicado.

• Após outra lavagem, 50 _l de coelho anti-ovelha fosfatase alcalina IgG foi adicionado 1000 em tampão de bloqueio: conjugado (Kirkegaad e Perry, MD, EUA), diluída a 1e incubou-se durante 2 h.

• As placas foram, em seguida, lavou-se e secou-se, e 75 _l de substrato pNPP foi adicionado (Kirkegaad e Perry, MD, EUA).

• As placas foram então incubadas no escuro durante 1 h e a reacção de cor foi interrompida com 75 _l de EDTA a 5%. As placas foram lidas a405 nm com um leitor de placas de ELISA automático.

Materiais e MétodosAnálise Estatística

• A análise estatística foi feita com dados em bruto, excepto para o FEC e a contagem total de nemátodoque foram transformados de log (log x + 1) para estabilizar a variância.

• As médias dos grupos eram comparados usando PROC MIXED e PROC GLM para medidas repetidas em SAS.

• teste de Tukey foi utilizada para comparar as diferenças na contagem de nemátodos entre os grupos de teste e de Scheffe foiutilizado para comparações entre os grupos de tratamento de pares de linfócitos por cento. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas quando P ≤ 0,05.

Resultados

♦ Cordeiros Recém-Nascidos / Cordeiros Desmamados

• Tratado / Controle– Contagem de ovos nas fezes– Contagem de nematóides totais em necropsia – Hematócrito – Diferencial de glóbulos brancos– Ensaios de linfoproliferação (DADOS NÃO APRESENTADOS)

– ELISA para Haemonchus contortus– Teste do cartão para brucelose

Resultados

Resultados

Resultados

Resultados

Resultados

Resultados

Resultados

Discussão

• O tratamento com Dexametasona tornou os cordeiros mais susceptíveis a infecção por H. contortus.

• Cordeiros tratados com Dexametasona tiveram uma depressão consistente em percentuais de linfócitos.

• Os resultados indicaram que o tratamento com dexametasona causou uma linfopenia e redução na produção de anticorpos, sugerindo que os anticorpos humorais são importantes no mecanismo de resistência de cordeiros nativos para infecção por H. contortus.

Referência

Effect of dexamethasone treatment on the immune response of Gulf Coast Native lambs to Haemonchus

contortus infectionM.T. Peña a,1, J.E. Miller a,b,c,∗, D.W. Horohov a,2