EFEK TEPUNG DAUN KELOR VARIETAS NTT TERHADAP KADAR VCAM-1 JARINGAN TIKUS WISTAR DIET ATEROGENIK TUGAS AKHIR Untuk Memenuhi Persyaratan Memperoleh Gelar Sarjana Kedokteran Umum Oleh: Sandy Wijaya NIM: 0710710018 PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG
123
Embed
Efek Tepung Daun Kelor Varietas NTT Terhadap Kadar VCAM-1 Jaringan Tikus Wistar Diet Aterogenik
Vascular Cell Adhesion Molecule 1 (VCAM-1) menyebabkan adhesi sel monosit pada endotel sehingga sel monosit dapat menginfiltrasi endotel dan memfagositosis Low Density Lipoprotein (LDL). VCAM-1 akan mengalami up-regulated ketika terstimuli oleh sel endotel yang teraktifasi oleh zat yang bersifat proinflamatori dan proaterosklerotik, sehingga molekul ini berperan penting dalam gangguan kardiovaskular terutama atherosklerosis. Tepung daun kelor varietas NTT mengandung antioksidan seperti vitamin A, C, dan E, serta flavonoid yang dapat mencegah aterosklerosis. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efek tepung daun kelor varietas NTT terhadap kadar VCAM-1 jaringan tikus wistar yang diberi diet aterogenik. Studi ini menggunakan 35 ekor tikus Wistar jantan yang dibagi ke dalam 7 kelompok perlakuan. Kelompok I adalah tikus diberi diet normal (kontrol negatif) selama 120 hari, kelompok II diberikan diet aterogenik saja (kontrol positif) selama 90 hari, sedangkan kelompok III sampai dengan VII (5 kelompok) diberi diet aterogenik selama 90 hari kemudian diberi pakan normal dan asupan tepung daun kelor varietas NTT dengan berbagai dosis (0, 5, 10, 20, dan 40 mg/ml) secara sonde setiap hari sekali selama 30 hari. Parameter yang diukur adalah jumlah VCAM-1 pada jaringan aorta. Analisis data menggunakan metode One Way ANOVA. Hasil penelitian menunjukkan bahwa terjadi peningkatan jumlah VCAM-1 secara signifikan pada perlakuan II (kontrol positif) dibandingkan dengan perlakuan I (kontrol negatif) (p = 0,044). Sedangkan pada kelompok yang diberi tepung daun kelor menunjukkan penurunan kadar VCAM-1 dimana kadar terendah pada dosis efektif 20 mg/ml (perlakuan VI) dibandingkan dengan kontrol positif (p = 0,025). Kesimpulan penelitian ini adalah tepung daun kelor (Moringa oleifera) varietas NTT mampu menurunkan jumlah VCAM-1 jaringan pada tikus (Rattus norvegicus) strain Wistar diet aterogenik
Welcome message from author
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
EFEK TEPUNG DAUN KELOR VARIETAS NTT
TERHADAP KADAR VCAM-1 JARINGAN TIKUS WISTAR
DIET ATEROGENIK
TUGAS AKHIR
Untuk Memenuhi Persyaratan
Memperoleh Gelar Sarjana Kedokteran Umum
Oleh:
Sandy WijayaNIM: 0710710018
PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER
FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
2010
EFEK TEPUNG DAUN KELOR VARIETAS NTT
TERHADAP KADAR VCAM-1 JARINGAN TIKUS WISTAR
DIET ATEROGENIK
TUGAS AKHIR
Untuk Memenuhi Persyaratan
Memperoleh Gelar Sarjana Kedokteran Umum
Oleh:
Sandy WijayaNIM: 0710710018
PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER
FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
2010
ii
HALAMAN PENGESAHAN
TUGAS AKHIR
EFEK TEPUNG DAUN KELOR VARIETAS NTT TERHADAP KADAR VCAM-1 JARINGAN TIKUS WISTAR
DIET ATEROGENIK
Oleh :
Sandy WijayaNIM: 0710710018
Telah diuji pada
Hari: Senin
Tanggal: 1 November 2010
dan dinyatakan lulus oleh:
Penguji I
Dr. dr. Retty Ratnawati, M.Sc19550201 198503 2 001
Penguji II Penguji III
Dr. dr. Tinny Endang H., SpPK (K) dr. Sudiarto, MS NIP. 19521225 198002 2 001 NIP. 19460913 198002 1 001
iii
KATA PENGANTAR
Segala rasa syukur penulis haturkan untuk Tuhan Yang Maha Esa atas
segala bimbingan dan berkat-Nya dalam penulisan tugas akhir ini. Tanpa turut
campur tangan Tuhan, maka tugas akhir ini tentu tidak akan terselesaikan
dengan baik.
Dalam proses penulisan tugas akhir ini, penulis juga banyak didukung
oleh berbagai pihak. Oleh karena itu melalui kesempatan ini, penulis
mengucapkan terima kasih kepada
1. Dr. dr. Samsul Islam, SpMK, selaku Dekan Fakultas Kedokteran
Universitas Brawijaya Malang.
2. Dr. dr. Tinny Endang Hernowati, SpPK (K) selaku pembimbing I, yang
telah meluangkan waktu dan tenaga serta dengan sabar membimbing
dan memberi masukan sehingga penulis dapat menyelesaikan tugas
akhir ini dengan baik.
3. dr. Sudiarto, MS selaku pembimbing II yang telah menyediakan waktu
untuk membimbing dan memberi saran atas penulisan tugas akhir ini.
4. Dr. dr. Retty Ratnawati, MSc selaku penguji yang telah memberikan
saran dan kritik atas penulisan tugas akhir ini.
5. Seluruh anggota Tim Pengelola Tugas Akhir FKUB yang telah membantu
penulis dalam penyelesaian tugas akhir ini.
6. Keluarga yang telah mendukung dan selalu mendoakan penulis.
7. Mas Budi, Mas Haris, Pak Satuman, Mbak Umi, Mbak Ika, Mbak Bunga,
Mas Didin, Ce Valen, Mbak Kiki dan seluruh staf Laboratorium Faal yang
telah membantu penulis dalam pelaksanaan penelitian tugas akhir ini.
iv
v
8. Fany yang telah meluangkan waktunya membantu memberi semangat
Joshua, Stanley, Jefry, Surojo, Ficky, Arghy, Zeni dan teman-teman
angkatan 2007, atas persahabatan kita selama ini.
10. Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu per satu yang telah
membantu dalam menyelesaikan penulisan tugas akhir ini.
Kiranya Tuhan membalas semua kebaikan dan dukungan serta
partisipasi Saudara-Saudara. Akhirnya penulis mengharapkan agar penulisan
tugas akhir ini dapat menjadi berkat bagi banyak orang.
Malang, September 2010
Penulis
ABSTRAK
Wijaya, Sandy. 2010. Efek Tepung Daun Kelor Varietas NTT Terhadap Kadar VCAM-1 Jaringan Tikus Wistar Diet Aterogenik. Tugas Akhir, Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya. Pembimbing: (1) Dr. dr. Tinny Endang H., SpPK (K). (2) dr. Sudiarto, MS.
Vascular Cell Adhesion Molecule 1 (VCAM-1) menyebabkan adhesi sel monosit pada endotel sehingga sel monosit dapat menginfiltrasi endotel dan memfagositosis Low Density Lipoprotein (LDL). VCAM-1 akan mengalami up-regulated ketika terstimuli oleh sel endotel yang teraktifasi oleh zat yang bersifat proinflamatori dan proaterosklerotik, sehingga molekul ini berperan penting dalam gangguan kardiovaskular terutama atherosklerosis. Tepung daun kelor varietas NTT mengandung antioksidan seperti vitamin A, C, dan E, serta flavonoid yang dapat mencegah aterosklerosis. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efek tepung daun kelor varietas NTT terhadap kadar VCAM-1 jaringan tikus wistar yang diberi diet aterogenik. Studi ini menggunakan 35 ekor tikus Wistar jantan yang dibagi ke dalam 7 kelompok perlakuan. Kelompok I adalah tikus diberi diet normal (kontrol negatif) selama 120 hari, kelompok II diberikan diet aterogenik saja (kontrol positif) selama 90 hari, sedangkan kelompok III sampai dengan VII (5 kelompok) diberi diet aterogenik selama 90 hari kemudian diberi pakan normal dan asupan tepung daun kelor varietas NTT dengan berbagai dosis (0, 5, 10, 20, dan 40 mg/ml) secara sonde setiap hari sekali selama 30 hari. Parameter yang diukur adalah jumlah VCAM-1 pada jaringan aorta. Analisis data menggunakan metode One Way ANOVA. Hasil penelitian menunjukkan bahwa terjadi peningkatan jumlah VCAM-1 secara signifikan pada perlakuan II (kontrol positif) dibandingkan dengan perlakuan I (kontrol negatif) (p = 0,044). Sedangkan pada kelompok yang diberi tepung daun kelor menunjukkan penurunan kadar VCAM-1 dimana kadar terendah pada dosis efektif 20 mg/ml (perlakuan VI) dibandingkan dengan kontrol positif (p = 0,025). Kesimpulan penelitian ini adalah tepung daun kelor (Moringa oleifera) varietas NTT mampu menurunkan jumlah VCAM-1 jaringan pada tikus (Rattus norvegicus) strain Wistar diet aterogenik.
Kata Kunci: diet aterogenik, VCAM-1, tepung daun kelor varietas NTT
vi
ABSTRACT
Wijaya, Sandy. 2010. Effect of Moringa oleifera NTT Variant Leaf Powder towards VCAM-1 Level in Tissues of Wistar Rats with Atherogenic Diet. Final Assignment, Medical Faculty of Brawijaya University. Supervisors: (1) Dr. dr. Tinny Endang H., SpPK (K). (2) dr. Sudiarto, MS.
Vascular Cell Adhesion Molecule 1 (VCAM-1) causes monocyte adhesion on endothel so monocyte can infiltrate endothelial and phagocytize Low Density Lipoprotein (LDL). VCAM-1 will be up-regulated when it is stimulated by endothelial cell which was activated by proinflammatory and proatherogenic substances, making this molecule plays important role in cardiovascular disease especially atherosclerosis. Moringa oleifera variant NTT (Nusa Tenggara Timur) leaf powder contains antioxidant substance, such as vitamin A, C, and E, also flavonoid that can prevent atherosclerosis. The aim of this research to determine the effects of Moringa oleifera NTT variant leaf powder towards VCAM-1 level in tissues of Wistar rats fed with atherogenic diet. The study used 35 male Wistar rats, that were randomly divided into seven groups. Group I rats were fed with standard diet for 120 days (negative control), group II were rats fed with atherogenic diet for 90 days (positive control), and group III-VII (five groups) were rats fed with atherogenic diet for 90 days consequently given different doses Moringa oleifera leaf powder (0, 5, 10, 20, dan 40 mg/ml) per oral everyday added with standard diet in 30 days. Parameters measured were the VCAM-1 level in aorta tissue. Data analysis which uses the One-Way ANOVA method. Research result showed VCAM-1 dose in group 2 (positive controle) is higher than group 1 (negative controle) significantly (p = 0,044). While in group given Moringa oleifera leaf powder showed the decrease of VCAM-1 dose which the lowest VCAM-1 dose was effective dose 20 mg/ml (group VI) compared with positive control (p = 0,025). The conclusion of this research is Moringa oleifera NTT variant leaf powder decreases VCAM-1 level in tissues of Wistar rats (Rattus norvegicus) with atherogenic diet.
BAB I PENDAHULUAN1.1 Latar Belakang..............................................................................11.2 Rumusan Masalah.........................................................................21.3 Tujuan Penelitian...........................................................................31.4 Manfaat Penelitian.........................................................................3
BAB II TINJAUAN PUSTAKA2.1 Aterosklerosis................................................................................4
2.3 Zat Oksidan dan Zat Antioksidan..................................................72.3.1 Reactive Oxygen Species (ROS).........................................72.3.2 Zat Antioksidan.....................................................................11
2.4 Moringa oleifera.............................................................................122.4.1 Klasifikasi dan Morfologi........................................................132.4.2 Kegunaan..............................................................................142.4.3 Kandungan Nutrisi.................................................................15
2.5 Hubungan Antara Aterosklerosis, VCAM-1, dan Moringa oleifera .......................................................................................................18
BAB III KERANGKA KONSEP DAN HIPOTESIS PENELITIAN3.1 Kerangka Konsep..........................................................................203.2 Penjelasan Kerangka Konsep.......................................................213.3 Hipotesis Penelitian.......................................................................22
viii
ix
BAB IV METODE PENELITIAN4.1 Rancangan Penelitian...................................................................234.2 Binatang Coba...............................................................................23
4.2.1 Binatang Coba, Objek, dan Teknik Randomisasi.................234.2.2 Estimasi Jumlah Pengulangan.............................................244.2.3 Kriteria Inklusi.......................................................................244.2.4 Kriteria Eksklusi....................................................................25
4.3 Variabel Penelitian.........................................................................254.4 Lokasi dan Waktu Penelitian.........................................................264.5 Alat dan Bahan Penelitian.............................................................26
4.5.1 Alat........................................................................................264.5.2 Bahan Penelitian..................................................................26
4.8 Pengolahan dan Analisis Data......................................................31
BAB V HASIL PENELITIAN DAN ANALISIS DATA5.1 Hasil Penelitian..............................................................................325.2 Analisis Data................................................................................ .38
BAB VI PEMBAHASAN..............................................................................41
BAB VII PENUTUP7.1 Kesimpulan....................................................................................457.2 Saran.............................................................................................45
DAFTAR PUSTAKA....................................................................................46
Tabel 2.2 Kandungan Vitamin Daun Moringa oleifera..................................16
Tabel 2.3 Kandungan Zat Gizi Kelor Varian NTT per 100gr Tepung...........17
Tabel 5.1 Karakteristik Tikus Pada Awal Percobaan...................................32
Tabel 5.2 Karakteristik Tikus Pada Akhir Percobaan...................................33
x
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 2.1 Jalur Pembentukan Reactive Oxygen Species (ROS).............8
Gambar 2.2 Produksi Superoksida Pada Mitokondria.................................9
Gambar 2.3 Mekanisme Kerja Reactive Oxygen Species...........................10
Gambar 2.4 Oksidasi LDL yang Menimbulkan Aterosklerosis dan Penghambatannya oleh Antioksidan...................................................11
Gambar 2.5 Tepung Daun Moringa oleifera.................................................14
Gambar 5.1 Grafik Hubungan Antara Kelompok Perlakuan dan Rata-rata Kenaikan Berat Badan Tikus...............................................................34
Gambar 5.2 Hasil Pengamatan Pada Kelompok Perlakuan I (Kontrol Negatif)...............................................................................................35
Gambar 5.3 Hasil Pengamatan Pada Kelompok Perlakuan II (Kontrol Positif).................................................................................................35
Gambar 5.4 Hasil Pengamatan Pada Kelompok Perlakuan III (90 hari diet aterogenik+30 hari diet normal dan 0mg/ml kelor).............................35
Gambar 5.5 Hasil Pengamatan Pada Kelompok Perlakuan IV (90 hari diet aterogenik+30 hari diet normal dan 5mg/ml kelor).............................36
Gambar 5.6 Hasil Pengamatan Pada Kelompok Perlakuan V (90 hari diet aterogenik+30 hari diet normal dan 10mg/ml kelor)...........................36
Gambar 5.7 Hasil Pengamatan Pada Kelompok Perlakuan VI (90 hari diet aterogenik+30 hari diet normal dan 20mg/ml kelor)...........................36
Gambar 5.8 Hasil Pengamatan Pada Kelompok Perlakuan VII (90 hari diet aterogenik+30 hari diet normal dan 40mg/ml kelor)...........................37
Gambar 5.9 Grafik Hubungan Antara Kelompok Perlakuan dan Rata-rata Jumlah VCAM-1 jaringan....................................................................38
xi
DAFTAR LAMPIRAN
HalamanLampiran 1 Tabel Perubahan Berat Badan Tikus .......................................51
Lampiran 3 Tabel Pengamatan Jumlah VCAM-1 (Raw Score) Pada Kelompok Perlakuan I (Kontrol Negatif)............................................................64
Lampiran 4 Tabel Pengamatan Jumlah VCAM-1 (Raw Score) Pada Kelompok Perlakuan II (Kontrol Positif).............................................................64
Lampiran 5 Tabel Pengamatan Jumlah VCAM-1 (Raw Score) Pada Kelompok Perlakuan III.....................................................................................65
Lampiran 6 Tabel Pengamatan Jumlah VCAM-1 (Raw Score) Pada Kelompok Perlakuan IV.....................................................................................65
Lampiran 7 Tabel Pengamatan Jumlah VCAM-1 (Raw Score) Pada Kelompok Perlakuan V......................................................................................66
Lampiran 8 Tabel Pengamatan Jumlah VCAM-1 (Raw Score) Pada Kelompok Perlakuan VI.....................................................................................66
Lampiran 9 Tabel Pengamatan Jumlah VCAM-1 (Raw Score) Pada Kelompok Perlakuan VII....................................................................................67
Lampiran 10: Jumlah dan Rata-rata VCAM-1 yang Digunakan untuk Analisis Data..................................................................................................68
Lampiran 11 Uji Normalitas Data ................................................................68
Flavonoid adalah salah satu kelompok polifenolat yang terkandung dalam
tumbuhan. Senyawa ini dapat ditemukan pada sayur dan buah-buahan.
Konsentrasinya lebih besar pada daun dan kulit daripada di dalam jaringan
dalam pada tumbuhan. Flavonoid telah diketahui memiliki zat antioksidan. Zat di
dalam flavonoid dapat menghambat senyawa oksidan dan dapat bertindak
sebagai metal chelators dan radical scavenger antioxidant (Niki, 2003). Selain
itu, sebenarnya flavonoid berfungsi untuk menstabilkan asam askorbat, terutama
ketika terdapat ion logam yang dapat menghancurkan asam askorbat secara
cepat (Sreelatha, 2009)
2.5 Hubungan Antara Aterosklerosis, VCAM-1, dan Moringa oleifera
Terjadinya aterosklerosis diawali oleh monosit dan LDL yang
menginfiltrasi dinding arteri yang diikuti oleh terjadinya pembentukan sel busa.
Peningkatan LDL dalam plasma menyebabkan sel endotel pada dinding arteri
terpapar oleh LDL itu sendiri. Jika kadar LDL berlebihan, maka LDL akan
menginfiltrasi ke dalam lapisan subendotelial. LDL akhirnya terkumpul di dalam
ruang subendotelial dan terjadi retensi. Retensi itu menyebabkan endotel
teraktifasi yang disebabkan oleh gagalnya proses perlindungan (ateroprotektif)
dan proses vasodilasi yang dilakukan oleh nitric oxide (NO). Aktifasi endotel
menyebabkan ekspresi molekul adhesi seperti VCAM-1 muncul dan meningkat
(up-regulated) (Chen,1999). VCAM-1 memediasi infiltrasi monosit ke dalam
lapisan intima arteri. Monosit kemudian berdiferensiasi menjadi makrofag dan
memakan LDL yang tertahan di dalam dinding arteri dan mengoksidasi LDL
tersebut. Di dalam makrofag, LDL dioksidasi menjadi bentuk oxLDL. Makrofag
19
dengan oxLDL di dalamnya ini membentuk sel busa yang menjadi cikal bakal
terjadinya plak atau trombus pada aterosklerosis.
Salah satu cara untuk mencegah timbulnya aterosklerosis adalah dengan
zat antioksidan. Untuk aterosklerosis dan penyakit kardiovaskular pada
umumnya, yang dibutuhkan adalah zat antioksidan yang larut lemak, seperti
vitamin A dan E (Petterson,1996), selain itu juga dibutuhkan vitamin C yang
digunakan untuk regenerasi vitamin E. Pada tanaman Moringa oleifera Lam, kita
dapat ditemukan kandungan antioksidan berupa β-karoten, vitamin C, dan
vitamin E (Sreelatha,2009). Antioksidan akan berikatan dengan LDL sehingga
makrofag tidak dapat mengoksidasi LDL dan membentuk sel busa. Selain itu,
dapat membatasi perluasan rusaknya sel endotel sehingga aktifasi sel endotel
akan berkurang dan kadar VCAM-1 dalam jaringan akan turun.
BAB III
KERANGKA KONSEP DAN HIPOTESIS PENELITIAN
3.1 Kerangka Konsep
Keterangan:
20
Efek meningkatkan Efek menghambat
LDL ↑
oxLDL ↑
Stres Oksidatif
Aktivasi Faktor Transkripsi(NF-κB ↑)
↓Ekspresi Gen Proinflamasi
Kelor
Antioksidan(β-karoten, Vitamin C, Vitamin E,
Senyawa Polifenolat)
Zat Pro-inflamasi(Kadar VCAM-1 ↑)
ROS ↑
Diet Aterogenik
Trauma Mikro Endotel
Kerusakan Endotel ↑
Aterosklerosis
Inflamasi
21
3.2 Penjelasan Kerangka Konsep
Diet aterogenik akan meningkatkan kadar LDL dalam tubuh. Peningkatan
LDL ini merupakan faktor penyebab rusaknya sel endotel. LDL akan
menginfiltrasi dinding arteri dan menyebabkan inflamasi. Selanjutnya, sel endotel
akan mengeluarkan nitric oxide (NO) yang berperan sebagai ateroprotektif,
sekaligus dapat menjadi zat oksidan yang poten, serta mengalami aktifasi
sehingga sel endotel mengeluarkan zat proinflamasi termasuk molekul adesi
VCAM-1. Bersamaan dengan itu, zat oksidan menstimulasi aktivasi faktor
transkripsi, salah satunya adalah NF-κB, yang pada tahap berikutnya juga akan
mengekspresikan gen proinflamasi. Gen-gen pro-inflamasi ini akan memproduksi
zat-zat proinflamasi, termasuk VCAM-1, sehingga kadarnya semakin meningkat.
Peningkatan kadar VCAM-1 menyebabkan makin banyak monosit (makrofag)
yang menginfiltrasi dinding arteri. Makrofag akan menghasilkan reactive oxygen
species (zat oksidan) yang akan kembali merangsang NF-κB untuk aktif dan
mendorong aktifasi gen proinflamasi.
Makrofag yang menginfiltrasi dinding arteri juga akan memakan LDL yang
menumpuk, dan LDL yang difagosit oleh makrofag akan mengalami oksidasi dan
membentuk oxLDL. Makrofag yang berisi oxLDL akan membentuk foam cell yang
bila menumpuk akan membentuk plaque dan akan berkembang menjadi
aterosklerosis (Hansson, 2005)
Dengan pemberian tepung daun kelor (Moringa oleifera) varietas NTT,
yang mengandung antioksidan pro-vitamin A, vitamin C, vitamin E, dan senyawa
polifenolat dalam jumlah cukup tinggi, diharapkan ROS dapat diikat, yang akan
22
ditandai dengan menurunnya kadar VCAM-1, yang akhirnya dapat menekan
inflamasi, juga menghambat stress oksidatif dan memperbaiki aterosklerosis.
3.3 Hipotesis Penelitian
Pemberian tepung daun kelor (Moringa oleifera) varietas NTT dapat
menurunkan kadar Vascular Cell Adhesion Molecule 1 (VCAM-1) pada jaringan
tikus (Rattus norvegius) strain Wistar dengan diet aterogenik.
BAB IV
METODE PENELITIAN
4.1 Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental. Rancangan
eksperimental yang digunakan adalah rancangan eksperimen sederhana (post
test control group design) dimana subyek dibagi menjadi 7 kelompok (I sampai
dengan VII) secara random. Tiap kelompok terdiri dari 5 tikus. Kelompok I adalah
tikus diberi diet normal saja (kontrol negatif), kelompok II tikus diberi diet
aterogenik saja, sedangkan kelompok III sampai dengan VII (5 kelompok) diberi
diet aterogenik selama 90 hari, kemudian diberi asupan tepung daun kelor
varietas NTT dengan dosis berbeda (0, 5, 10, 20, dan 40 mg/ml) (Chumark et al.,
2007) secara per oral dengan sonde setiap hari sekali selama 30 hari. Selama
pemberian tepung daun kelor varietas NTT, diet kelima kelompok (III sampai
dengan VII) diganti diet normal. Kemudian diobservasi dan dibandingkan efek
tepung daun kelor varietas NTT terhadap kadar VCAM-1 dalam jaringan aorta
tikus (Nahrendorf et.al, 2006).
4.2 Binatang Coba
4.2.1 Binatang Coba, Objek dan Teknik Randomisasi
Binatang coba dalam penelitian ini adalah tikus jenis Rattus norvegius
galur wistar yang dipelihara di Laboratorium Fisiologi Fakultas Kedokteran
Universitas Brawijaya Malang. Pemeliharaan dilakukan dalam kandang bebas
patogen penyakit.
Objek penelitian yang dipakai adalah tikus wistar jenis kelamin jantan,
dewasa dengan umur ± 2 bulan. Teknik randomisasi untuk pengelompokan
23
24
perlakuan menggunakan metode Rancangan Acak Lengkap (RAL) atau
Randomized Completely Design (RCD) mengingat baik hewan coba, bahan
pakan, dan bahan penelitian lainnya dapat dikatakan homogen. Pada rancangan
ini dimungkinkan setiap hewan coba berpeluang sama untuk mendapat
kesempatan sebagai sampel baik dalam kelompok perlakuan maupun dalam
kelompok kontrol.
4.2.2 Estimasi Jumlah Pengulangan
Dalam penelitian ini terdapat 7 perlakuan, maka jumlah binatang coba
untuk masing-masing perlakuan dapat dicari dengan rumus [(np-1) – (p-1)] ≥ 16
dengan n = jumlah pengulangan tiap perlakuan; p = jumlah perlakuan. Dari
sejumlah sampel ini akan diuji dengan level signifikasi 95%.
[(np-1) – (p-1)] ≥ 16
[(7n-1) – (7-1)] ≥ 16
(7n-1) – 6 ≥ 16
(7n-1) ≥ 22
7n ≥ 23
n ≥ 3,29 (4)
Dari rumus tesebut, jika banyak perlakuan adalah 7 maka jumlah
pengulangan yang dibutuhkan untuk tiap-tiap kelompok perlakuan adalah 4.
Sedangkan 1 ekor sisanya untuk cadangan. Jadi untuk 7 kelompok dibutuhkan
sebanyak 35 tikus (Solimun, 2001).
4.2.3 Kriteria Inklusi
1. Strain wistar
2. Umur 2 bulan
25
3. Berat badan ± 200 gr
4. Jenis kelamin jantan
5. Dalam keadaan sehat selama penelitian
4.2.4 Kriteria Eksklusi
Tikus yang selama penelitian tidak mau makan, tikus yang kondisinya
menurun, sakit dalam masa persiapan atau adaptasi.
4.3 Variabel Penelitian
Variabel bebas pada penelitian ini adalah pemberian per oral tepung daun
kelor varietas NTT dengan dosis 0, 5, 10, 20, 40 mg/ml . Pemberian per oral
tepung daun kelor varietas NTT dengan sonde dilakukan selama 30 hari
(Chumark et al., 2007).
Variabel tergantung pada penelitian ini adalah kadar VCAM-1 dalam
jaringan aorta tikus.
Variabel kendali adalah variabel yang dapat dikendalikan oleh peneliti
agar objek penelitian selalu terkendali dan dalam keadaan homogen. Variabel
kendali dalam penelitian ini meliputi sebagai berikut.
1. Jenis tikus
2. Umur tikus
3. Jenis kelamin tikus
4. Berat badan awal
5. Pemberian diet aterogenik
6. Kondisi lingkungan kandang
7. Pemberian per oral tepung daun kelor dengan sonde
26
4.4 Lokasi dan Waktu Penelitian
Eksperimen ini dilaksanakan di Laboratorium Fisiologi Fakultas
Kedokteran Universitas Brawijaya pada bulan Januari sampai dengan Juni 2010.
4.5 Alat dan Bahan Penelitian
4.5.1 Alat
1. Alat Pemeliharaan Binatang Coba
Kandang dari kotak plastik, tutup kandang dari anyaman kawat, botol
air, rak tempat menaruh kandang
2. Alat Pembuat Makanan Binatang Coba
Baskom plastik, timbangan, sarung tangan, gelas ukur
3. Alat Pengambilan Sampel
Seperangkat alat bedah, kapas, alat pemotong jaringan
4. Alat Pemeriksaan VCAM-1 pada jaringan aorta.
Preparat imunohistokimia dan mikroskop.
4.5.2 Bahan Penelitian
1. Bahan Makanan Tikus
Pakan tikus dewasa per ekor per hari adalah 30 gram. Dalam
penelitian ini terdapat dua macam pakan tikus yaitu diet aterogenik
untuk tikus kelompok perlakuan tepung daun kelor varietas NTT dosis
0, 5, 10, 20, 40 mg/ml serta kelompok tikus dengan diet aterogenik
dan diet normal untuk kelompok kontrol negatif. Adapun komposisi
pakan normal dan diet aterogenik akan dijelaskan sebagai berikut.
a. Pakan normal yang terdiri dari comfeed PARS 53% (dengan
kandungan air 12 %, protein 11 %, lemak 4 %, serat 7 %, abu 8
27
%, Ca 1,1 %, fosfor 0,9 %, antibiotika, coccidiostat 53 %) dan
tepung terigu 23,5 %, dan air 23,5 %.
b. Diet aterogenik yang terdiri dari PARS 50 %, tepung terigu 25 %,
kolesterol 2,2 %, minyak babi 5 %, dan air 17,8 %.
2. Tepung daun kelor varietas NTT
Tepung daun kelor varietas NTT yang digunakan yaitu tepung daun
kelor yang diproduksi oleh PT. Timor Mulia Sentosa.
3. Bahan Pemeriksaan Imunohistokimia
Jaringan tikus, VCAM-1, alat untuk melakukan imunohistokimia
4.6 Definisi Operasional
1. Pemberian per oral tepung daun kelor varietas NTT
Perlakuan (Intervensi) adalah pemberian suplementasi tepung kelor 0,
5, 10, 20, 40 mg/ml/hari (Chumark et al., 2007) dengan cara
dimasukkan per oral dengan sonde.
2. Tikus Wistar
Tikus yang digunakan adalah dari galur wistar dengan jenis kelamin
jantan, berumur 2 bulan, dan berat badan ± 200 gr, yang diperoleh
dari Laboratorium Fisiologi Universitas Brawijaya Malang.
3. Diet aterogenik
Diet aterogenik adalah pakan tinggi kolesterol yang dimodifikasi
dengan formulasi khusus untuk menimbulkan keadaan
aterosklerosis pada hewan coba tikus yang terdiri dari Comfeed
PARS 50 %, tepung terigu 25 %, kolesterol 2,2 %, minyak babi 5 %,
dan air 17,8 %. Pemberian pakan ini dilakukan selama 90 hari
(Tsalissavrina, 2005).
28
4. Kadar VCAM-1 dalam jaringan aorta
Kadar VCAM-1 dalam jaringan adalah kadar VCAM-1 yang diukur
dengan metode Imunohistokimia pada setiap kelompok tikus.
4.7 Prosedur Penelitian
Penelitian ini dilakukan untuk memperoleh pengetahuan mengenai efek
tepung daun kelor (Moringa oleifera) varietas Nusa Tenggara Timur (NTT)
terhadap kadar Vascular Cell Adhesion Molecule 1 (VCAM-1) jaringan aorta tikus
(Rattus norvegius) wistar dengan diet aterogenik. Alur penelitian dapat dijelaskan
melalui bagan berikut.
Adaptasi (7 hari)
Diet Aterogenik (90 hari)
I Kontrol negatif(120 hari)
IIKontrol positif(dibunuh pada hari ke 90)
Pemeriksaan Kadar VCAM-1 Jaringan
Analisa data
IIIDiet normal + 0 mg/mlKelor(30 hari)
IVDiet normal + 5 mg/mlKelor(30 hari)
VDiet normal + 10 mg/mlKelor (30 hari)
VIDiet normal + 20mg/mlKelor (30 hari)
VIIDiet normal +40mg/mlKelor (30 hari)
35 ekor tikus
Diet normal
29
4.7.1 Adaptasi
Selama proses adaptasi, semua kelompok tikus diberi pakan standart
(normal) yang terdiri dari comfeed PARS, tepung terigu, dan air. Masing-masing
tikus mendapatkan 30 gram dari campuran bahan tersebut dan diberikan secara
ad libitum, yang berarti tikus diberi makan dan diberi kebebasan untuk
mengonsumsi makanannya sesuai dengan kebutuhan biologisnya.
4.7.2 Diet Aterogenik
Diet aterogenik yang terdiri dari PARS 50 %, tepung terigu 25 %,
kolesterol 2,2 %, minyak babi 5 %, dan air 17,8 %. Pemberian pakan ini
berlangsung selama 90 hari. Tiap minggu tikus ditimbang berat badannya. Berat
pakan sisa tikus ditimbang setiap hari. Data berat pakan sisa ini dipergunakan
untuk mengetahui kalori tikus per hari. Setelah 90 hari, 1 kelompok perlakuan
tikus kontrol positif dibunuh untuk melihat adanya plak aterosklerosis.
4.7.3 Perlakuan
4.7.3.1 Pemeliharaan
Dalam masa ini keenam kelompok tikus mendapat perlakuan yang
berbeda. Untuk kelompok III, setiap tikus mendapatkan pemberian tepung daun
kelor varietas NTT per oral dengan dosis 0 mg/ml + diet normal. Kelompok IV
diberi tepung daun kelor varietas NTT per oral dengan dosis 5 mg/ml dengan
sonde + diet normal. Kelompok V diberi tepung daun kelor varietas NTT per oral
dengan dosis 10 mg/ml + diet normal. Kelompok VI diberi tepung daun kelor
varietas NTT per oral dengan dosis 20 mg/ml + diet normal. Kelompok VII diberi
tepung daun kelor varietas NTT per oral dengan dosis 40 mg/ml + diet normal.
Kelompok diet aterogenik diberikan diet aterogenik saja tanpa diberi tepung daun
30
kelor varietas NTT per oral. Kelompok kontrol mendapat pakan normal (standar).
Sehari setelah pemberian per oral pertama, dilakukan pengulangan dengan
dosis yang sama untuk masing-masing kelompok. Kemudian dilakukan
pengulangan 29 kali lagi dengan selang waktu satu hari tiap pengulangan.
4.7.3.2 Pembedahan
Pemeriksaan kadar VCAM-1 jaringan tikus wistar pada eksperimen ini
memerlukan tindakan pembedahan. Setelah pemberian per oral ketigapuluh,
tikus dimatikan dengan cara pembiusan eter. Thorax dibuka kemudian sampel
jaringan diambil. Kemudian dari jaringan diperiksa kadar VCAM-1 pada jaringan
aorta tikus.
Cara Pemeriksaan dengan IMUNOHISTOKIMIA
1. Deparafinisasi dan rehidrasi
Xylol 1 selama 5 menit
Xylol 2 selama 5 menit
Xylol 3 selama 5 menit
Alkohol 100% selama 5 menit
Alkohol 95% selama 5 menit
Alkohol 90% selama 5 menit
Alkohol 80% selama 5 menit
Alkohol 70% selama 5 menit
2. Mencuci dengan PBS pH 7,4 (3 X 5 menit)
3. Menambah H2O2 3% inkibasi selama 20 menit
4. Mencuci dengan PBS pH 7,4 (3 X 5 menit)
5. Melakukan blocking dengan BSA 1 % selama 30 menit
6. Mencuci dengan PBS pH 7,4 (3 X 5 menit)
31
7. Menginkubasi dengan AB primer IgG mouse anti human VCAM-1 dalam PBS
1 jam temperatur 37oC
8. Mencuci dengan PBS pH 7,4 (2 X 5 menit)
9. Menambah AB sekunder anti IgG mouse anti human VCAM-1 biotin dalam
PBS 1 jam, suhu ruang
10. Mencuci dengan PBS pH 7,4 (3 X 5 menit)
11. Ditambah dengan SA HRP dalam PBS 1 jam, suhu ruang
12. Mencuci dengan PBS pH 7,4 (3X 5 menit)
13. Menambah DAB substrat, inkubasi selama 1 jam
14. Mencuci dengan akuades 3 x 5 menit
15. Counter strain dengan mayer hematoxylin
16. Mencuci dengan air kran secukupnya
17. Mounting dengan entelan
18. Menghitung jumlah VCAM-1 di bawah mikroskop dengan pembesaran
obyektif 100x sebanyak 10 lapang pandang.
4.8 Pengolahan dan Analisis Data
Hasil pengukuran kadar VCAM-1 jaringan aorta tikus kontrol dan
perlakuan dianalisis secara statistik dengan menggunakan program SPSS 15
untuk Windows XP dengan tingkat signifikansi 0,05 (p= 0,05) dan taraf
kepercayaan 95% (α= 0,05)
BAB V
HASIL PENELITIAN DAN ANALISIS DATA
5.1 Hasil Penelitian
Pada penelitian ini didapatkan data hasil untuk masing-masing kelompok
perlakuan. Penelitian ini terdiri dari tujuh macam perlakuan, yaitu kelompok I
adalah tikus diberi diet normal saja (kontrol negatif), kelompok II tikus diberi diet
aterogenik saja, sedangkan kelompok III sampai dengan VII (5 kelompok) diberi
diet aterogenik selama 90 hari, kemudian diberi asupan tepung daun kelor
varietas NTT dengan dosis berbeda (0, 5, 10, 20, dan 40 mg/ml) secara per oral
dengan sonde setiap hari sekali selama 30 hari. Selama pemberian tepung daun
kelor varietas NTT, diet kelima kelompok (III sampai dengan VII) yang awalnya
berupa diet aterogenik selama 90 hari, diganti dengan diet normal selama 30
hari. Perincian data hasil penelitian berupa kenaikan berat badan adalah sebagai
berikut.
Tabel 5.1 Karakteristik Tikus Pada Awal Percobaan
Kelompok Perlakuan
I II III IV V VI VIIP
n (jumlah) 5 5 5 5 5 5 5Rata-rata Berat Badan Awal (gr)
137,82±9,36
137,58±9,62
139,9±16,08
131,60±21,45
131,20±14,58
135,62±5,79
129,60±11,53
0,854
Tabel 5.2 Karakteristik Tikus Pada Akhir Percobaan
Kelompok Perlakuan
I II III IV V VI VII
PDiet
Normal 120 hari
Diet Aterogenik
90 hari
Perlakuan Terapi Setelah 90 Hari Diet Aterogenik Diet
normal +0
mg/ml kelor 30
hari
Diet normal
+5 mg/ml
kelor 30 hari
Diet normal
+10 mg/ml
kelor 30 hari
Diet normal
+20 mg/ml
kelor 30 hari
Diet normal
+40 mg/ml
kelor 30 hari
Jumlah (n) 5 5 5 5 5 5 5Rata-rata
Berat 340,29±
48,08363,35±
27,19392,08±
40,41381,48±
18,43350,85±53,71
385,55±36,23
374,98±19,89
0,280
32
33
Badan Akhir (gr)Rata-rata Kenaikan
Berat Badan (gr)
202,47±53,56
225,77±27,17
252,18±46,71
249,88±29,81
219,65±59,76
249,93±40,33
245,38±24,29
0,420
Rata-rata Jumlah VCAM-1
(sel/lapang pandang)
2,20±1,67(a)
5,78±0,86(b)
4,98±2,11(ab)
4,38±1,91(ab)
3,20±1,77 (ab)
1,93±1,04(a)
2,98±0,62(ab)
0,013
Kenaikan berat badan tertinggi terdapat pada kelompok perlakuan III
dengan rata-rata sebesar 252,18±46,17 gram dan terendah pada kelompok
perlakuan I dengan rata-rata sebesar 202,47±53,56 gram. Hal ini menunjukkan
bahwa tikus kelompok perlakuan kontrol negatif mengalami peningkatan berat
badan yang lebih kecil daripada kelompok perlakuan yang diberi diet aterogenik,
seperti yang telah ditampilkan pada gambar 5.1.
P=0,420Gambar 5.1 Grafik Hubungan Antara Kelompok Perlakuan dan Rata-rata Kenaikan Berat
Badan Tikus Keterangan: I (Kontrol Negatif); II (Kontrol Positif); III (90 hari diet aterogenik+30 hari diet normal); IV (90 hari diet aterogenik+30 hari diet normal dan 5 mg/ml kelor); V (90 hari diet aterogenik+30
hari diet normal dan 10 mg/ml kelor); VI (90 hari diet aterogenik+30 hari diet normal dan 20 mg/ml kelor); VII (90 hari diet aterogenik+30 hari diet normal dan 40 mg/ml kelor)
34
Penghitungan jumlah VCAM-1 dilakukan terhadap kelompok II dengan
menggunakan metode pewarnaan Immunohistokima (IHK) dari jaringan aorta
tikus Wistar yang diamati pada hari ke-90 perlakuan dan pada hari ke-120
perlakuan untuk kelompok I, III, IV, V, VI, dan VII. Penghitungan jumlah VCAM-1
pada jaringan aorta tikus Wistar yang dilakukan terhadap masing-masing
kelompok perlakuan ditampilkan pada lampiran 3 dan lampiran 4. Jumlah VCAM-
1 pada masing-masing jaringan aorta tikus dihitung sebanyak 10 lapang
pandang, lalu diambil rata-ratanya dan dijumlahkan atau dikurangkan dengan
standar deviasi.
Gambar 5.2 Hasil Pengamatan Pada Kelompok Perlakuan I (Kontrol Negatif)Keterangan: Huruf L menunjukkan lumen aorta, sedangkan E menunjukkan lapisan endotel. Pada gambar tidak ditemukan adanya VCAM-1 di endotel. Diamati dengan mikroskop pembesaran 100X.
L
E
35
Gambar 5.3 Hasil Pengamatan Pada Kelompok Perlakuan II (Kontrol Positif)Keterangan: Huruf L menunjukkan lumen aorta, sedangkan E menunjukkan lapisan endotel. Pada gambar banyak ditemukan VCAM-1 di endotel. Tanda panah menunjukkan VCAM-1. Diamati dengan mikroskop pembesaran 100X
Gambar 5.4 Hasil Pengamatan Pada Kelompok Perlakuan III (90 hari diet aterogenik+30 hari diet normal dan 0mg/ml kelor)
Keterangan: Huruf L menunjukkan lumen aorta, sedangkan E menunjukkan lapisan endotel. Pada gambar dapat ditemukan VCAM-1 di endotel. Tanda panah menunjukkan VCAM-1. Diamati dengan mikroskop pembesaran 100X
Gambar 5.5 Hasil Pengamatan Pada Kelompok Perlakuan IV (90 hari diet aterogenik+30 hari diet normal dan 5mg/ml kelor)
Keterangan: Huruf L menunjukkan lumen aorta, sedangkan E menunjukkan lapisan endotel. Pada gambar dapat ditemukan VCAM-1 di endotel dalam jumlah yang sedikit. Tanda panah menunjukkan VCAM-1. Diamati dengan mikroskop pembesaran 100X
L E
LE
L
E
36
Gambar 5.6 Hasil Pengamatan Pada Kelompok Perlakuan V (90 hari diet aterogenik+30 hari diet normal dan 10mg/ml kelor)
Keterangan: Huruf L menunjukkan lumen aorta, sedangkan E menunjukkan lapisan endotel. Pada gambar dapat ditemukan VCAM-1 di endotel dalam jumlah yang lebih sedikit dibandingkan dengan kelompok perlakuan IV. Tanda panah menunjukkan VCAM-1. Diamati dengan mikroskop pembesaran 100X
Gambar 5.7 Hasil Pengamatan Pada Kelompok Perlakuan VI (90 hari diet aterogenik+30 hari diet normal dan 20mg/ml kelor)
Keterangan: Huruf L menunjukkan lumen aorta, sedangkan E menunjukkan lapisan endotel. Pada gambar dapat ditemukan VCAM-1 di endotel dalam jumlah yang sangat sedikit atau bahkan tidak ditemukan sama sekali. Diamati dengan mikroskop pembesaran 100X
Gambar 5.8 Hasil Pengamatan Pada Kelompok Perlakuan VII (90 hari diet aterogenik+30 hari diet normal dan 40mg/ml kelor)
Keterangan: Keterangan: Huruf L menunjukkan lumen aorta, sedangkan E menunjukkan lapisan endotel. Pada gambar dapat ditemukan VCAM-1 di endotel dalam jumlah yang sedikit. Tanda panah menunjukkan VCAM-1. Diamati dengan mikroskop pembesaran 100X
L
L
L
E
E
E
37
Rata-rata jumlah VCAM-1 jaringan kelompok 120 hari diet normal (kontrol
negatif) sebesar 2,20±1,67 sel/lapang pandang. Rata-rata jumlah VCAM-1
jaringan kelompok yang 90 hari hanya diberi diet aterogenik (kontrol positif)
sebesar 5,78±0,86 sel/lapang pandang. Rata-rata jumlah VCAM-1 jaringan
kelompok 90 hari diet aterogenik yang dilanjutkan dengan 30 hari diet normal
tanpa pemberian kelor sebesar 4,98± 2,11 sel/lapang pandang. Rata-rata jumlah
VCAM-1 jaringan kelompok 90 hari diet aterogenik yang dilanjutkan dengan 30
hari diet normal dan pemberian kelor 5 mg/ml sebesar 4,38±1,91 sel/lapang
pandang. Rata-rata jumlah VCAM-1 jaringan kelompok 90 hari diet aterogenik
yang dilanjutkan dengan 30 hari diet normal dan pemberian tepung kelor 10
mg/ml sebesar 3,20±1,77 sel/lapang pandang. Rata-rata jumlah VCAM-1
jaringan kelompok 90 hari diet aterogenik yang dilanjutkan dengan 30 hari diet
normal dan pemberian tepung kelor 20 mg/ml sebesar 1,93±1,04 sel/lapang
pandang. Rata-rata jumlah VCAM-1 jaringan kelompok 90 hari diet aterogenik
yang dilanjutkan dengan 30 hari diet normal dan pemberian kelor 40 mg/ml
sebesar 2,98±0,62 sel/lapang pandang.
p=0,013
38
Gambar 5.9 Grafik Hubungan Antara Kelompok Perlakuan dan Rata-rata Jumlah VCAM-1 jaringan (sel/lapang pandang)
Keterangan: I (Kontrol Negatif); II (Kontrol Positif); III (90 hari diet aterogenik+30 hari diet normal); IV (90 hari diet aterogenik+30 hari diet normal dan 5 mg/ml kelor); V (90 hari diet aterogenik+30
hari diet normal dan 10 mg/ml kelor); VI (90 hari diet aterogenik+30 hari diet normal dan 20 mg/ml kelor); VII (90 hari diet aterogenik+30 hari diet normal dan 40 mg/ml kelor)
Dari gambar 5.9 terlihat rata-rata jumlah VCAM-1 jaringan terendah
terdapat pada kelompok perlakuan VI (90 hari diet aterogenik+30 hari deit normal
dan 20mg/ml kelor) yaitu sebesar 1,93±1,04 sel/lapang pandang. Sedangkan
rata-rata jumlah VCAM-1 jaringan tertinggi terdapat pada kelompok perlakuan 90
hari diet aterogenik saja yaitu sebesar 5,78±0,86 sel/lapang pandang.
5.2 Analisis Data
Data yang didapatkan dari hasil penelitian “Efek Tepung Daun Kelor
Varietas NTT terhadap Kadar VCAM-1 Jaringan Tikus Wistar Diet Aterogenik”
dianalisis dengan menggunakan program komputer SPSS 15 untuk Windows XP.
Rata-rata jumlah VCAM-1 jaringan berdasarkan gambar 5.2 menunjukkan bahwa
pada kelompok III, IV, V, VI, dan VII yang mendapat diet normal dengan atau
tanpa kelor memiliki jumlah VCAM-1 yang lebih rendah dibandingkan dengan
kelompok II (kontrol positif).
Hasil penelitian tersebut diuji dengan uji normalitas data dan homogenitas
varian, seperti tersusun dalam lampiran 5 dan 6. Untuk menguji normalitas
distribusi data digunakan Shapiro-Wilk. Didapatkan bahwa distribusi data hasil
penelitian ini adalah normal. Sedangkan untuk menguji homogenitas varian
digunakan Levene test. Dari hasil Levene test tampak bahwa data berasal dari
populasi-populasi yang memiliki varian sama (p=0,129). Oleh karena data hasil
penelitian memiliki distribusi normal, dan varian yang homogen, dapat dilakukan
pengujian One-way ANOVA.
39
Dari hasil tes tersebut didapatkan nilai rata-rata jumlah VCAM-1 dari
ketujuh populasi memang berbeda (p=0,013). Dengan demikian terdapat minimal
2 kelompok yang berbeda signifikan.
Analisis dilanjutkan dengan Post hoc test (Least Significant Difference)
yang bertujuan untuk mengetahui kelompok mana yang berbeda secara
signifikan dari hasil tes ANOVA. Pada analisis ini digunakan Tukey HSD test
(lampiran 14).
Dari hasil Tukey HSD test terdapat perbedaan jumlah VCAM-1 jaringan
tikus secara nyata antara kelompok I (kontrol negatif) dan kelompok II (kontrol
positif) (p=0,044), namun kelompok I tidak memilik perbedaan yang signifikan
dengan kelompok perlakuan III (p=0,184), IV (p=0,433), V (p=0,964), VI
(p=1,000), dan VII (p=0,990). Selain itu ditemukan pula perbedaan yang
signifikan antara kelompok II (kontrol positif) dengan kelompok VI (90 hari diet
aterogenik+30 hari diet normal dan 20mg/ml kelor) (p=0.025). Selain itu tidak lagi
ditemukan adanya perbedaan yang siginifikan antara kelompok perlakuan II
dengan kelompok perlakuan III (p=0,988), IV (p=0,845), V (p=0,251), dan VII
(p=.0,176).
Untuk melengkapi hasil dari uji Tukey digunakan Homogeneous Subsets
yang digunakan untuk mencari grup atau subset mana saja yang memiliki
perbedaan rata-rata (Mean Difference) yang tidak berbeda secara signifikan.
Pada subset 1 menunjukkan adanya 6 kelompok, I (kontrol negatif), III (90 hari
diet aterogenik + 30 hari diet normal tanpa pemberian tepung daun kelor), IV (90
hari diet aterogenik+30 hari diet normal dan 5 mg/ml kelor), V (90 hari diet
aterogenik + 30 hari diet normal dan 10mg/ml kelor), VI (90 hari diet aterogenik +
30 hari diet normal dan 20 mg/ml tepung daun kelor), dan VII (90 hari diet
40
aterogenik+30 hari diet normal dan 40 mg/ml kelor) tidak memiliki perbedaan
yang signifikan satu dengan yang lain. Pada subset 2 terdapat kelompok
II,III,IV,V, dan VII. Namun dapat disimpulkan bahwa ada perbedaan yang
signifikan sesuai hasil uji Tukey.
Dari hasil-hasil tersebut dapat dilihat penghitungan jumlah VCAM-1
jaringan pada kelompok perlakuan (III-VII) tidak signifikan meskipun cenderung
menurun dibandingkan dengan kontrol positif . Perbedaan yang signifikan terjadi
pada kelompok perlakuan II (kontrol positif) dengan VI (90 hari diet aterogenik +
30 hari diet normal dan 20mg/ml kelor) (p = 0,025), yang menjadikan kelompok
perlakuan VI (20 mg/ml) sebagai dosis efektif. Oleh karena itu dapat diambil
kesimpulan bahwa kelor memiliki efek menurunkan jumlah VCAM-1 jaringan.
BAB VI
PEMBAHASAN
Rata-rata kenaikan berat badan tikus menunjukkan bahwa tikus
perlakuan I (kontrol negatif) mengalami kenaikan berat badan yang lebih kecil
dari kelompok perlakuan lainnya. Tikus perlakuan II – VII diberi diet aterogenik
yang menyebabkan peningkatan berat badannya lebih besar. Pemberian diet
aterogenik itu juga menyebabkan tikus mengalami hiperlipidemia yang menjadi
salah satu faktor resiko terbentuknya plak dalam aterosklerosis (Falk, 2005)
Perbedaan jumlah VCAM-1 pada jaringan aorta di antara tikus wistar
yang telah diberi perlakuan juga terlihat dengan jelas. Nampak bahwa kelompok
perlakuan kontrol negatif memiliki jumlah VCAM-1 yang lebih rendah
dibandingkan dengan kelompok perlakuan kontrol positif secara signifikan. Hal ini
sesuai dengan penjelasan dan penelitian Ley (2001) dan Falk (2005) yang
menegaskan bahwa diet aterogenik itu merupakan stimuli penting akan timbulnya
aterosklerosis yang ditandai dengan meningkatnya jumlah VCAM-1 seperti yang
nampak pada kontrol postif.
Selain peningkatan VCAM-1 pada kelopok perlakuan kontrol positif
terhadap kontrol negatif, terjadi pula penurunan jumlah VCAM-1 jaringan pada
kelompok III, VI, dan V dibandingkan dengan kontrol positif, walaupun penurunan
tersebut tidak bermakna. Penurunan yang terjadi pada perlakuan VI bila
dibandingkan pada perlakuan II (kontrol positif) menunjukkan adanya penurunan
yang signifikan dibandingkan dengan kelompok III dan V. Pada perlakuan VII,
jumlah VCAM-1 mengalami kenaikan setelah sebelumnya pada perlakuan III – VI
41
42
mengalami penurunan, walaupun kenaikan yang terjadi tidak signifikan. Seperti
yang telah diteliti oleh Fahey (2005) dan Chumark (2007), Moringa oleifera Lam
memiliki kandungan antioksidan yang memiliki kemampuan untuk mengurangi
terjadinya inflamasi yang mendasari proses terjadinya aterosklerosis. Penelitian
yang dilakukan Fruebis (1999) telah memberi penjelasan bahwa antioksidan
menghambat ekspresi dari VCAM-1 pada dinding arteri. Dari beberapa penelitian
yang telah lama dilakukan itu, dapat dikatakan bahwa kemungkinan besar
kandungan antioksidan pada tepung daun kelor yang diberikan kepada tikus
mengakibatkan turunnya jumlah VCAM-1 jaringan yang merupakan sel adhesi
proaterosklerotik ini.
Aterosklerosis merupakan penyakit yang dikenal dengan istilah
“pengerasan arteri”. Penyakit ini merupakan chronic immunoinflammatory
disease dan merupakan penyebab penyakit kardiovaskular (Falk, 2005). Erling
Falk menuturkan bahwa level kolesterol plasma yang meningkat dapat memulai
fase awal terjadinya aterosklerosis.
Lesi aterosklerotik awalnya bermula dari sel endotel yang utuh, namun
mengalami disfungsi. Sel endotel yang rusak tidak dapat memproduksi nitric
oxide yang berfungsi untuk vasodilator dan ateroprotektif. Pada pasien dengan
hiperkolesterolemia, kadar LDL dalam darah amat tinggi dan amat mudah
memapar sel endotel. LDL akan menginfiltrasi sel endotel yang rusak dan
tertahan di bagian ruang subendotel pada intima arteri tersebut. LDL itu akan
dioksidasi oleh nitric oxide synthase (NOS) terlebih dahulu sehingga berubah
menjadi sitotoksik, proinflamatori, kemotaksik, dan proaterogenik. Selain itu, nitric
oxide yang dikeluarkan oleh sel endotel merupakan oksidan yang poten yang
berfungsi sebagai ateroprotektif. Hal ini mengakibatkan terjadinya inflamasi,
43
selain itu, sel endotel akan menjadi aktif dan ekspresi dari molekul adhesi dan
gen inflammasi yang dikeluarkan oleh sel endotel akan meningkat. (Falk, 2005).
Endotel yang teraktivasi oleh stimulus aterogenik dan proinflamatori akan
meningkatkan ekspresi molekul adhesi, terutama vascular-cell adhesion
molecule 1 (VCAM-1). Pengaktifan VCAM-1 terjadi melalui mekanisme redox-
sensitive yang melibatkan aktivasi faktor transkripsi NF-κB (Nuclear Factor κB).
NF-κB akan aktif ketika sel endotel mengalami kerusakan dan tidak dapat
menghasilkan NO (Chen and Medford, 1999). Meningkatnya jumlah VCAM-1
menyebabkan sel-sel monosit menempel ke endotel yang teraktivasi tersebut.
Monosit yang menempel pada VCAM-1 masuk ke tunica intima dan berubah
menjadi makrofag dan mencerna LDL. Makrofag yang mencerna LDL dan
mengeluarkan zat oksidan berupa nitric oxide (yang juga dihasilkan oleh sel
endotel) yang mengakibatkan sel makrofag menjadi nampak seperti busa (foam
cell) (Hansson, 2005). Sel busa makrofag ini kemudian berkumpul menjadi satu
dan membentuk plak (fatty streak). Jika makrofag yang memakan lipoprotein
aterogenik mati karena apoptosis dan nekrosis, maka akan timbul inti kaya lemak
(lipid-rich core) di dalam plak itu. Maka, dengan menurunkan jumlah sel VCAM-1
jaringan, terbentuknya fatty streak dapat berkurang dan dapat mengurangi resiko
terjadinya aterosklerosis (Ley, 2001).
Kelor merupakan tanaman yang diharapkan dapat mengurangi terjadinya
aterosklerosis. Hal ini disebabkan oleh tepung daunnya yang mengandung
vitamin A, C, dan E, serta flavonoid yang merupakan antioksidan (Petterson,
1996; Sreelatha, 2009) yang dapat menekan terjadinya inflamasi pada endotel.
Antioksidan ini akan berikatan dengan LDL dalam darah, sehingga LDL tidak
dapat dioksidasi menjadi oxLDL. selain itu, antioksidan yang dihasilkan oleh
44
tepung daun kelor dapat mencegah meluasnya kerusakan pada sel endotel
pembuluh darah sebagai akibat dari adanya nitric oxide synthase (NOS). NOS
sendiri muncul karena adanya sistem perlindungan sel endotel sebagai
ateroprotektif yang justru menimbulkan oksidasi pada LDL sehingga LDL itu
berubah menjadi proinflamatori yang menyebabkan inflamasi sel endotel dan
mengaktifkan sel endotel. Sel endotel yang aktif akan mengeluarkan molekul
adhesi seperti VCAM-1. (Falk,2005)
Dosis efektif adalah dosis tepung daun kelor yang diperlukan untuk
menurunkan jumlah VCAM-1. Sedangkan dosis optimum adalah dosis tepung
daun kelor yang diperlukan untuk mencapai jumlah VCAM-1 paling sedikit. Pada
hasil penelitian menunjukkan bahwa pada perlakuan VI (90 hari diet aterogenik +
30 hari diet normal dan 20 mg/ml tepung daun kelor) mengalami penurunan yang
signifikan dibandingkan dengan perlakuan II (kontrol negatif). Tetapi perlakuan VI
tidak mengalami perbedaan yang siginifikan terhadap kelompok perlakuan I
(kontrol positif), III, IV, V, dan VII. Pada perlakuan VII, jumlah VCAM-1
mengalami kenaikan kembali. Hal ini menunjukkan bahwa dosis kelor yang
dipakai pada penelitian ini sudah mencapai dosis optimum.
BAB VII
PENUTUP
7.1 Kesimpulan
Pada studi ini, pemberian tepung daun kelor (Moringa oleifera) varietas
Nusa Tenggara Timur (NTT) pada tikus (Rattus norvegicus) strain Wistar yang
dipapar diet aterogenik mampu menurunkan jumlah VCAM-1 jaringan dengan
dosis optimum 20mg/ml.
7.2 Saran
1. Perlu dilakukan penelitian untuk mengetahui efek lain dari pemberian kelor.
2. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui hubungan antara
antioksidan dalam kelor dan terapi tikus dengan aterogenik.
45
DAFTAR PUSTAKA
American Heart Association. 2009. Indonesia. (Online). (http://www.americanheart.org/presenter.jhtml?identifier=2573, diakses 26 September 2009)
Bodary, Peter F., Gu, S., Shen, Y., Hasty, A. H., Buckler, J. M., Eitzman, D. T. 2005. Recombinant Leptin Promotes Atherosclerosis and Thrombosis in Apolipoprotein E-deficient Mice. Arterioscler. Thromb.Vasc.Biol.;25;e119-e122.
Chen, Xi-Lin and Medford, Russel M. 1999. Oxidation-reduction Sensitive Regulation of Vascular Inflammatory Gene Expression in Pearson J. D. (Ed). Vascular Adhesion Molecules and Inflammation. Birkhäuser Verlag, Basel. p. 161-178.
Chumark, P., Khunawat, P., Sanvarida, Y., Phornchirasilp, S., Morales, N. P., Phivthong-ngam, L., Ratanachamnong, P., Srisawat, S., Pongrapeeporn, K. S. 2007. The In Vitro and Ex Vivo Antioxidant Properties, Hypolipidaemic, and Antiatherosclerotic Activities of Water Extract of Moringa oleifera Lam. leaves. J Etnopharmacol, doi: 10.1016/j.jep.2007.12.010.
Das N. P., L. Ramanathan. 1992. Studies on Flavonoids and Related Compounds as Antioxidant in Food in A. S. H. Ong, L. Packer (eds). Lipid-Soluble Antioxidants: Biochemistry and Clinical Applications. Birkhäuser Verlag, Basel. p.295-306.
Fahey, Jed W. 2005. Moringa oleifera: A Review of the Medical Evidence for Its Nutritional, Therapeutic, and Prophylactic Properties. Part 1. Tree For Life Journal,1:5
Falk, Erling. 2006. Pathogenesis of Atherosclerosis. J. Am. Coll. Cardiol;47;C7-C12.
FloraPur. 2009. Horseradish Tree, (Online). (http://florapur.com/horseradish-tree.html, diakses 30 Desember 2009).
Fruebis, J., Silvestre, M., Shelton, D., Napoli, C., Palinski, W. 1999. Inhibition of VCAM-1 Expression in the Arterial Wall is Shared by Structurally Different
Antioxidants that Reduce Early Atherosclerosis in NZW Rabbits. J. Lipid Res;40:1958-1966.
Gutteridge, John M. C., Barry Halliwell. 1994. Antioxidants in Nutrition, Health, and Disease. Oxford University Press, Oxford.
Hansson, Goran K. Mechanisms of Disease: Inflammation, Atherosclerosis, and Coronary Artery Disease. N Eng J Med 2005;352:1685-95.
Hsu, R., Midcap, S., Arbainsyah, Lucienne, D. W. 2006. Moringa oleifera: Medicinal and Socio-Economic Uses. International Course on Economic Botany. Netherlands: National Herbarium Leiden.
Indra, M. Rasjad. 2007. Fisiologi Kardiovaskular. Penerbit Laboratorium Ilmu Faal Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya, Malang.
Johnson, Ian and Gary Williamson. 2003. Phytochemical functional foods. CRC Press, Boca Raton.
Kartesz, John T.. Plants Profile: Moringa oleifera Lam. (horseradish tree). (Online), (http://plants.usda.gov/java/nameSearch?keywordquery=moringa+oleifera&mode=sciname&submit.x=2&submit.y=8 diakses 26 September 2009)
Katzung, B. G., Trevor, A. J., Masters, S. B. 2002. Pharmacology: Examination & Board Review, Sixth Edition. The McGraw-Hill Companies, Inc. New York.
Kojda, Georg and David Harrison. 1999. Interaction between NO and reactive oxygen species: pathophysiological importance in atherosclerosis, hypertension, diabetes and heart failure. Cardiovascular Research; 43:562-571.
Kunsch, C., Chen, X. 2006. Reactive Oxygen Species as Mediators of Signal Transduction in Cardiovascular Diseases in M.G. Bourassa, Jean-Claude Tardif (Eds). Antioxidants and Cardiovascular Disease Second Edition. Springer Science+Business Media, Inc. New York. p.103-130.
Landmesser, U., Drexler, H. 2006. General Concepts abaout Oxidative Stress in M.G. Bourassa, Jean-Claude Tardif (Eds). Antioxidants and Cardiovascular Disease Second Edition. Springer Science+Business Media, Inc. New York. p. 1-15.
Ley, Klaus, Elena Galkina. 2007. Vascular Adhesion Molecule in Atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol;27;2292-2301.
Ley, Klaus, Yuqing Huo. 2001. VCAM-1 is critical in Atherosclerosis. J. Clin. Invest. 107(10): 1209-1210.
Link, E. M. 1993. Inflammation and a Mechanism of Hydrogen Peroxide Cytotoxicity in G. Poli, E. Albano, M.U. Dianzani (eds). Free Radicals: From Basic Science to Medicine. Birkhäuser Verlag, Basel. p.113 - 123
Nahrendorf, M., Jaffer, F. A., Kelly, K. A., Sosnovik, D. E., Aikawa, E., Libby, P., Weissleder, R. 2006. Noninvasive Vascular Adhesion Molecule-1 Imaging Identifies Inflammatory Activation of Cells ini Atherosclerosis. Circulation;114;1504-1511
National Heart Lung and Blood Institute. 2009. Atherosclerosis (Online). http://www.nhlbi.nih.gov/health/dci/Diseases/Atherosclerosis/Atherosclerosis_WhatIs.html , diakses 17 Nopember 2010.
Nelson, Nathan C. The Free Radical Theory of Aging (Online). http://www.physics.ohio-state.edu/~wilkins/writing/Samples/shortmed/nelson/radicals.html . diakses 17 Nopember 2010.
Packer, L. 1992. New Horizons in Vitamin E Research – The Vitamin E Cycle, Biochemistry, and Clinical Applications in A. S. H. Ong, L. Packer (eds). Lipid-Soluble Antioxidants: Biochemistry and Clinical Applications. Birkhäuser Verlag, Basel. p.1-14.
Petterson, K.S., Ostlund-Lindqvist, A. M., Westerlund, C. 1996. The potential of antioxidants to prevent atherosclerosis development and its clinical manifestations in Morris Karmazyn (Ed). Myocardial Ischemia: Mechanisms, Reperfusion, Protection. Birkhäuser Verlag, Basel. p.21-31.
Singh, V. N.. 1992. Role of β-Carotene in Disease Prevention with Special Reference to Cancer in A. S. H. Ong, L. Packer (eds). Lipid-Soluble Antioxidants: Biochemistry and Clinical Applications. Birkhäuser Verlag, Basel. p.208-227.
Solimun. 2001. Diktat Metodologi Penelitian LKIP dan PKM Kelompok Agrokompleks. Malang: Universitas Brawijaya.
Spiecker, Martin and James K. Liao. 2001. Nitric oxide Regulation of Leucocyte Adhesion Molecule Expression in Daniela Salvemini, Timothy R. Billiar, Yoram Vodovotz (Eds). Nitric oxide and Inflammation. Birkhäuser Verlag, Basel. p. 99-116.
Sreelatha S., P. R. Padma. 2009. Antioxidant Activity and Total Phenolic Content of Moringa oleifera Leaves in Two Stages of Maturity. Plant Foods Hum Nutr, 64 (4): 303-311.
Stavric B., T.I. Matula. 1992. Flavonoids in Foods: Their Significance for Nutrition and Health in Food in A. S. H. Ong, L. Packer (eds). Lipid-Soluble Antioxidants: Biochemistry and Clinical Applications. Birkhäuser Verlag, Basel. p.274-294.
Szeto, Hazel H. 2006. Mitochondria-Targeted Peptide Antioxidants: Novel Neuroprotective Agents. The AAPS Journal; 8 (3) Article 62.
Therik, Johannis W. D.. 2008. Hasil Pemeriksaan Kandungan Zat Gizi Kelor Varietas Lokal NTT Jenis Kelor Hijau (H) dan Merah (M) per 100 g Tepung Daun Kelor Oter Kapsul Berdaarkan Hasil Uji Kimia. Surabaya: Balai Besar Laboratorium Kesehatan.
Trees For Life. 2005. Moringa Book, (Online). (http://www.treesforlife.org/documents/moringa/English%20moringa_book_view.pdf, diakses 7 Desember 2009)
Tsalissavrina, Iva. 2005. Pengaruh Pemberian Diet Tinggi Karbohidrat Dibandingkan Diet Tinggi Lemak terhadap Kadar Trigliserida dan HDL Darah pada Rattus Norvegius Strain Wistar. Tugas Akhir. Tidak diterbitkan, Program Studi Ilmu Gizi Kesehatan Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya, Malang.
United States Department of Agriculture. Moringa oleifera Lam. Horseradishtree, (Online),( http://plants.usda.gov/java/profile?symbol=MOOL, diakses 1 Nopember 2010)
World Health Organization. 2009. Cardiovascular diseases (CVDs), (Online), (http://www.who.int/ mediacentre/ factsheets/fs317/en/index.html, diakses 1 November 2009).
LAMPIRAN
Lampiran 1 : Tabel Perubahan Berat Badan Tikus
Tabel Berat Badan Tikus (Rattus Norvegicus) Wistar