-
i
EFEK EKSTRAK KULIT BUAH RAMBUTAN
TERHADAP KADAR MDA DAN SOD
TIKUS YANG DIPAPAR ASAP ROKOK
Skripsi
disusun sebagai salah satu syarat
untuk memperoleh gelar Sarjana Sains
Program Studi Biologi
oleh
Erni Wulandari
4411412053
JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS NEGERI SEMARANG
2016
-
ii
-
iii
-
iv
ABSTRAK
Wulandari, Erni. 2016. Efek Ekstrak Kulit Buah Rambutan terhadap
Kadar
MDA dan SOD Tikus yang Dipapar Asap Rokok. Skripsi. Jurusan
Biologi
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas
Negeri
Semarang. Dr. drh. R. Susanti, M.P. Dr. Lisdiana, M.Si
Asap rokok merupakan polutan bagi manusia dan lingkungan. Asap
rokok
mengandung senyawa radikal bebas yang akan menyebabkan stres
oksidatif. Pada
kondisi stres oksidatif, radikal bebas menyebabkan peroksidasi
lipid membran sel
dan merusak organisasi membran sel. Penelitian ini bertujuan
untuk menganalisis
kadar MDA dan SOD pada tikus yang dipapar asap rokok dan diberi
ekstrak kulit
buah rambutan. Penelitian dilakukan pada 30 ekor tikus putih
jantan galur Wistar
yang dibagi menjadi 6 kelompok, yaitu kelompok A (normal), B
(negatif), C
(positif) dan D, E, F merupakan kelompok perlakuan ekstrak kulit
buah rambutan
dengan dosis secara berturut-turut 3, 6, 12 mg/200 gramBB dan
paparan asap
rokok selama 14 hari. Untuk mengetahui perbedaan kadar MDA dan
SOD setiap
kelompok dilakukan analisis data menggunakan uji one way anova
dan uji lanjut
LSD. Hasil analisis statistik menunjukkan kadar MDA pada
kelompok A tidak
berbeda nyata dengan kelompok C dan E. Kelompok D tidak berbeda
nyata
dengan kelompok F. Aktivitas SOD pada kelompok A berbeda nyata
dengan
kelompok lainnya. Aktivitas SOD kelompok C tidak berbeda nyata
dengan
kelompok E. Simpulan dari penelitian ini adalah ekstrak kulit
buah rambutan
dosis 6 mg/200 gramBB dapat menurunkan kadar MDA dan
meningkatkan
aktivitas SOD pada tikus yang dipapar asap rokok.
Katakunci: Asap rokok, ekstrak kulit buah rambutan, MDA, SOD
-
v
KATA PENGANTAR
Alhamdulillah, segala puji dan syukur penulis panjatkan kepada
Allah SWT
atas rahmat dan hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan
skripsi yang
berjudul Efek Ekstrak Kulit Buah Rambutan terhadap Kadar MDA dan
SOD
Tikus yang Dipapar Asap Rokok. Skripsi ini disusun sebagai salah
satu syarat
untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Program Studi Biologi
Universitas
Negeri Semarang. Penulis menyadari dalam pembuatan skripsi ini
tidak lepas dari
bantuan berbagai pihak, maka pada kesempatan ini penulis
menyampaikan
penghargaan dan terimakasih kepada:
1. Rektor Universitas Negeri Semarang atas kesempatan yang
diberikan untuk
menempuh pendidikan di Unnes.
2. Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Universitas Negeri
Semarang yang telah memberikan izin penelitian.
3. Ketua Jurusan Biologi Universitas Negeri Semarang yang telah
membantu
kelancaran administrasi dalam penyelesaian skripsi.
4. Dr. drh. R. Susanti, M.P. dan Dr. Lisdiana, M.Si. selaku
dosen pembimbing I
dan II atas bimbingan, saran, bantuan dan berbagai kemudahan
selama proses
penyusunan skripsi.
5. Dr. Wiwi Isnaeni, M.S. selaku penguji skripsi yang telah
memberikan kritik
dan saran untuk kelayakan naskah skripsi saya.
6. Bapak, Ibu, Mas Heri, Dek Andry dan semua keluarga atas doa,
perhatian dan
dukungannya.
7. Melisa, Wawan, Alam, Nikmah, Mas Herdi dan Mba Fera atas
bantuannya
selama penelitian.
8. Nok Ely, Tante nCum, Uti Zamia serta teman-teman Biologi 2012
atas
kebersamaan dan kenangan yang tak terlupakan.
9. Teman-teman seperjuangan di Kos Griya Ayu atas persaudaraan
dan
semangat.
Semarang, 3 Oktober 2016
Penulis
-
vi
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL
.........................................................................
i
PERNYATAAN KEASLIAN SKRIPSI
........................................... ii
PENGESAHAN
..................................................................................
iii
ABSTRAK
.......................................................................................
iv
KATA PENGANTAR
......................................................................
v
DAFTAR ISI
.....................................................................................
vi
DAFTAR GAMBAR
........................................................................
viii
DAFTAR TABEL
.............................................................................
ix
DAFTAR LAMPIRAN
.....................................................................
x
BAB I PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
.............................................................................
1
B. Rumusan Masalah
.........................................................................
4
C. Tujuan Penelitian
..........................................................................
4
D. Manfaat Penelitian
........................................................................
4
E. Penegasan Istilah
..........................................................................
4
BAB II LANDASAN TEORI
A. Kandungan Senyawa Kimia Rokok
............................................. 6
B. Asap Rokok sebagai Sumber Radikal Bebas
............................... 11
C. Kandungan Senyawa Kimia Kulit Buah Rambutan
..................... 14
D. MDA
.............................................................................................
20
E. SOD
..............................................................................................
23
F. Senyawa Antioksidan Vitamin C
................................................. 25
G. Mekanisme Kerja Kulit Buah Rambutan sebagai Antioksidan
..................................................................
26
H. Penentuan Aktivitas Penangkapan Radikal DPPH
....................... 27
I. Kerangka Berfikir
.........................................................................
29
J. Hipotesis Penelitian
......................................................................
29
-
vii
BAB III METODE PENELITIAN
A. Waktu dan Tempat Penelitian
...................................................... 30
B. Populasi dan Sampel
....................................................................
30
C. Variabel Penelitian
.......................................................................
31
D. Rancangan Penelitian
...................................................................
31
E. Alat dan Bahan Penelitian
............................................................ 33
F. Prosedur Penelitian
.......................................................................
36
G. Analisis Data
................................................................................
39
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Hasil Penelitian
.............................................................................
40
B. Pembahasan
..................................................................................
41
BAB V SIMPULAN DAN SARAN
A. Simpulan
.......................................................................................
49
B. Saran
.............................................................................................
49
DAFTAR PUSTAKA
.......................................................................
50
LAMPIRAN
......................................................................................
58
-
viii
DAFTAR GAMBAR
Gambar Halaman
1. Kandungan senyawa kimia pada rokok
......................................... 7
2. Sumber eksogen dan endogen radikal bebas
................................. 12
3. Kulit buah rambutan
......................................................................
15
4. Struktur kimia MDA
.....................................................................
22
5. Reaksi antara radikal DPPH dengan antioksidan
.......................... 28
6. Struktur molekul DPPH setelah menerima donor atom OH
......... 28
7. Kerangka berfikir penelitian
......................................................... 29
8. Desain penelitian
...........................................................................
35
-
ix
DAFTAR TABEL
Tabel Halaman
1. Senyawa yang terkandung dalam asap rokok
............................... 8
2. Kandungan total phenolic content, total anthocyanin
content
dan tanin pada kulit buah rambutan
............................................... 16
3. Kandungan geraniin, ellagic acid, corilagin dan asam
askorbat
pada kulit buah rambutan
..............................................................
17
4. Kandungan saponin, alkaloid, tanin dan flavonoid pada
kulit
buah rambutan (mg/100 g berat kering)
........................................ 17
5. Alat penelitian
...............................................................................
33
6. Bahan penelitian
............................................................................
34
7. Prosedur pengukuran kadar MDA
................................................ 38
8. Prosedur pengukuran aktivitas SOD
............................................. 38
9. Hasil rerata kadar MDA dan SOD
................................................ 40
-
x
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran Halaman
1. Hasil pemeriksaan kadar MDA dan aktivitas SOD
....................... 58
2. Uji normalitas, homogenitas, anova dan post hoc kadar MDA
.... 59
3. Uji normalitas, homogenitas, anova dan post hoc
aktivitas SOD
................................................................................
64
4. Hasil identifikasi tumbuhan rambutan
.......................................... 70
5. Hasil uji DPPH ekstrak kulit buah rambutan
................................ 71
6. Dokumentasi penelitian
.................................................................
72
-
1
BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar belakang
Rokok adalah produk dari daun tembakau yang kemunculannya
menyebabkan kontroversial karena mampu menimbulkan pro dan
kontra di
masyarakat (Fitria et al. 2013). Merokok merupakan salah satu
gaya hidup
masyarakat di dunia, salah satunya Indonesia. Mengonsumsi
rokok
diketahui dapat menyebabkan gangguan kesehatan, baik secara
langsung
maupun tidak. Gangguan kesehatan yang ditimbulkan antara lain
dapat
berupa bronkitis kronis, emfisema, kanker paru-paru dan
penyempitan
pembuluh nadi (Church & Pryor 1985). Dampak rokok terhadap
kesehatan
sering disebut sebagai silent killer. Pengaruh tersebut timbul
secara
perlahan, dalam tempo yang relatif lama, tidak langsung dan
tidak nampak
secara nyata (Rupinder 2014).
Indonesia merupakan negara berkembang dengan penduduk
perokok terbesar ketiga di dunia setelah Cina dan India (WHO
2013).
Menurut survei WHO (2008), sepertiga dari penduduk dunia
terutama orang
dewasa adalah perokok. Jumlah perokok setiap tahun cenderung
meningkat
seiring dengan meningkatnya konsumsi rokok. Angka kematian di
dunia
akibat rokok mencapai 500 juta orang per tahun. Dalam setiap
enam detik
terdapat satu kematian akibat rokok
Pembakaran rokok akan menimbulkan asap rokok. Asap rokok
dapat dibedakan menjadi dua, yaitu asap utama (mainstream smoke)
dan
asap samping (sidestream smoke). Asap utama adalah asap yang
dihisap
oleh perokok aktif. Asap samping merupakan asap yang terhirup
oleh
perokok pasif dan secara terus-menerus keluar dari ujung rokok
(Lodovici &
Bigagli 2009). Asap utama terdiri dari 8% fase tar dan 95% fase
gas. Asap
rokok di ruangan sekitar perokok 85% asap samping dan 15% asap
utama
(Lodovici et al. 2004). Asap rokok yang dihirup oleh seorang
perokok
mengandung komponen gas dan partikel. Komponen gas sangat
berpotensi
menimbulkan radikal bebas karbon monoksida, asam hidrosianat,
nitrogen
-
2
oksida dan formalin. Komponen partikel asap rokok diantaranya
adalah tar,
indol nikotin, karbarzol dan kresol (KPAI 2009).
Asap rokok merupakan campuran senyawa yang mengandung
4000 bahan kimia antara lain tar, nikotin, karbon monoksida dan
zat-zat
berbahaya lainnya. Senyawa yang terkandung pada asap rokok
terdiri dari
200 zat bersifat racun (asam hidrosianat, akrolein, oksida
nitrogen) dan
40 zat bersifat karsinogen (tar, nikotin, benzo(a)piren,
senyawa
hidrokarbon) (Palanisamy et al. 2009). Dalam satu kali hisapan
rokok
terdapat 1014-16
molekul radikal bebas yang masuk ke dalam tubuh
(Yanbaeva et al. 2007). Asap rokok adalah polutan bagi manusia
dan
lingkungan.
Asap rokok dapat menimbulkan respons stres, yaitu kondisi
pada
saat individu tidak mampu mengatasi beban fisik atau psikologis.
Stres yang
berat diketahui dapat menyebabkan stres oksidatif. Stres
oksidatif adalah
ketidakseimbangan antara jumlah radikal bebas dengan antioksidan
tubuh.
Pada kondisi stres oksidatif, terjadi peningkatan jumlah
reactive oxygen
species (ROS) di dalam tubuh (Haliwell & Gutteridge 1999).
ROS adalah
oksidan yang sangat reaktif. Dampak negatif senyawa tersebut
timbul
karena aktivitasnya, sehingga dapat merusak komponen sel yang
sangat
penting untuk mempertahankan integritas sel. Setiap ROS yang
terbentuk
dapat memulai suatu reaksi berantai yang terus berlanjut hingga
ROS itu
dihilangkan oleh ROS yang lain atau sistem antioksidan (Pillon
& Soulage
2012).
Aktivitas radikal bebas di dalam tubuh diimbangi dengan
mekanisme pertahanan endogen, yaitu tubuh akan memproduksi
antioksidan
yang mempunyai pengaruh sebagai anti radikal bebas. Salah
satu
antioksidan endogen adalah superoxide dismutase (SOD) yang
merupakan
sistem pertahanan tubuh garis pertama terhadap aktivasi ROS
(Fridovich
1981). Pada saat level ROS meningkat melebihi kemampuan
pertahanan
endogen, maka terjadilah ketidakstabilan oksidatif yang disebut
stres
oksidatif. Pada kondisi stres oksidatif, radikal bebas akan
menyebabkan
-
3
peroksidasi lipid membran sel dan merusak organisasi membran
sel. Salah
satu biomarker terjadinya stres oksidatif adalah tingginya
kadar
malondialdehyde (MDA) dan menurunnya aktivitas SOD akibat
proses
peroksidasi lipid yang berlebihan di dalam sel (Hu et al.
2014).
Suatu cara untuk mengendalikan terjadinya stres oksidatif
yang
berlebihan yaitu dengan mengonsumsi antioksidan dari makanan
(antioksidan eksogen). Salah satu sumber antioksidan eksogen
adalah kulit
buah dari tanaman rambutan (Nephelium lappaceum L). Tanaman
rambutan
banyak ditemui di Indonesia. Tanaman rambutan terdiri dari
bagian akar,
daun, biji, buah, kulit kayu dan kulit buah yang memiliki banyak
manfaat
sebagai sumber vitamin dan senyawa berkhasiat obat. Kulit buah
rambutan
merupakan salah satu bagian dari tanaman rambutan yang belum
dimanfaatkan secara maksimal. Kulitnya yang berwarna merah
ditemukan
mengandung berbagai macam senyawa kimia.
Berdasarkan penelitian, kulit buah rambutan memiliki
aktivitas
antioksidan yang mengandung senyawa fenolik, alkaloid, steroid,
terpenoid
(Wardhani & Supartono 2015), asam askorbat (Wall 2006),
flavonoid
(Dirmawati 2008) serta antosianin (Hutapea et al. 2014) dengan
kandungan
tertinggi adalah senyawa fenolik (Fila et al. 2012). Penelitian
Thitilerdecha
et al. (2010) berhasil mengisolasi asam ellagat, korilagin dan
geranin yang
merupakan senyawa fenolik pada kulit buah rambutan. Senyawa
fenolik
bersifat antioksidan kuat dan terdapat paling banyak pada kulit
buah
rambutan. Senyawa tersebut mempunyai cincin aromatik dengan
gugus
hidroksil lebih dari satu dan berperan melindungi sel tubuh dari
bahaya
radikal bebas dengan cara mengikat radikal bebas.
Palanisamy et al. (2008) menyatakan bahwa sebagai tanaman
yang
mengandung antioksidan, kulit buah rambutan diduga dapat
menghambat
terjadinya kerusakan oksidatif, sehingga diperlukan suatu
penelitian untuk
mengetahui pengaruh ekstrak kulit buah rambutan terhadap kadar
MDA dan
aktivitas SOD akibat paparan asap rokok.
-
4
B. Rumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang di atas, maka rumusan masalah
dalam
penelitian ini adalah:
Bagaimana pengaruh pemberian ekstrak kulit buah rambutan
terhadap kadar
MDA dan aktivitas SOD pada tikus yang dipapar asap rokok?
C. Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian ini adalah: Untuk menganalisis kadar MDA
dan
aktivitas SOD pada tikus yang dipapar asap rokok dan diberi
ekstrak kulit
buah rambutan.
D. Manfaat Penelitian
Dengan dilaksanakannya penelitian ini diharapkan dapat
memberi
manfaat sebagai berikut :
1. Memberikan informasi tentang hasil kajian efek pemberian
ekstrak kulit
buah rambutan sebagai sumber antioksidan
2. Meningkatkan kepercayaan masyarakat terhadap penggunaan obat
yang
berasal dari bahan-bahan alami.
3. Berguna sebagai bahan acuan untuk penelitian lebih lanjut
mengenai
ekstrak kulit buah rambutan sebagai antioksidan.
E. Penegasan Istilah
Untuk menghindari salah pengertian dalam memahami isi
skripsi
ini, perlu ada batasan-batasan terhadap beberapa istilah sebagai
berikut :
1. Ekstrak Kulit Buah Rambutan
Ekstrak merupakan sediaan pekat yang diperoleh dengan
mengekstraksi
zat aktif dari simplisia menggunakan pelarut yang sesuai,
kemudian
semua pelarut diuapkan dan massa yang tersisa diperlakukan
sedemikian hingga memenuhi baku yang ditetapkan (Depkes RI
1995).
Ekstrak kulit buah rambutan dalam penelitian ini adalah ekstrak
dari
seluruh bagian kulit buah rambutan yang diperoleh dari hasil
ekstraksi
menggunakan pelarut etanol. Hasil akhirnya berupa pasta.
-
5
2. MDA
MDA merupakan senyawa dialdehida produk akhir dari
peroksidasi
lipid (Winarsi 2007). MDA dalam penelitian ini adalah hasil
peroksidasi lipid oleh senyawa radikal bebas akibat dipapar asap
rokok.
MDA diukur menggunakan spektrofotometer pada panjang
gelombang
545 nm.
3. SOD
SOD adalah antioksidan enzimatis yang melindungi jaringan
dari
kerusakan oksidatif akibat radikal bebas (Muchtadi 2013). SOD
dalam
penelitian ini diukur dengan metode kolorimetri dari
BioVision
Incorporated menggunakan microplate reader pada panjang
gelombang
450 nm.
4. Asap Rokok
Asap rokok merupakan bahan toksik yang diperoleh dari hasil
pembakaran rokok. Jenis rokok dalam penelitian ini adalah rokok
kretek
yang dijual bebas di pasaran dengan kandungan tar 30 mg dan
nikotin
1,8 mg per batang rokok.
-
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
A. Kandungan Senyawa Kimia Rokok
Rokok merupakan salah satu sumber utama paparan toksin yang
secara kimiawi berpengaruh dalam menimbulkan berbagai jenis
penyakit.
Rokok adalah produk dari tembakau yang mengandung nikotin dan
tar.
Rokok berbentuk silinder terdiri dari kertas berwarna putih dan
cokelat,
berukuran panjang antara 70-120 mm (bervariasi tergantung
negara) dengan
diameter 10 mm, berisi cacahan daun tembakau dengan tambahan
sedikit
racikan cengkeh (Triswanto 2007). Rokok dibakar pada salah satu
ujungnya
dan dibiarkan membara agar asapnya dapat dihirup lewat mulut
pada ujung
lainnya. Rokok terdiri dari dua jenis, yaitu rokok yang
berfilter dan rokok
tidak berfilter. Filter pada rokok terbuat dari bahan busa
serabut sintesis
yang berfungsi untuk menyaring nikotin. Filter rokok mampu
mengurangi
jumlah tar dan nikotin dalam asap hingga 40-50% dibandingkan
dengan
rokok tidak berfilter (Shin et al. 2009).
Berdasarkan bahan bakunya rokok terbagi menjadi tiga
kategori
yaitu rokok putih, rokok kretek dan rokok klembak. Rokok putih
adalah
rokok yang terbuat dari daun tembakau dan diberi saus. Rokok
kretek adalah
rokok berbahan daun tembakau dan cengkeh yang diberi saus,
sedangkan
rokok klembak yaitu rokok yang terbuat dari daun tembakau,
cengkeh,
kemenyan dan saus. Fungsi penambahan bahan lain dalam pembuatan
rokok
adalah untuk mendapatkan efek rasa dan aroma tertentu (Sitepoe
2000).
Merokok adalah kegiatan menghisap asap dari pembakaran
tembakau pada rokok. Mengonsumsi rokok sudah menjadi tren dan
bahkan
didalilkan sebagai tanda kedewasaan seseorang. Di Indonesia,
jenis rokok
yang banyak dikonsumsi adalah rokok kretek. Rokok kretek
mengandung
60-70% tembakau, 30-40% cengkeh dan ramuan lainnya (Hutapea
2013).
Rokok kretek mengandung 5 komposisi tambahan yaitu eugenol,
acethyl
6
-
7
eugenol, -caryophillene, -humulene dan caryophillene
epoxide.
Berdasarkan penelitian, eugenol merupakan bahan anestetik yang
digunakan
oleh dokter gigi. Apabila eugenol dikonsumsi maka akan timbul
efek
anestesi pada pengguna rokok kretek. Eugenol juga memiliki
efek
antikonvulsan, penghambat transmisi neural dan peradangan
(Guidotti et al.
1989).
Gambar 1. Kandungan senyawa kimia pada rokok (Kandar 2014)
Pembakaran rokok menghasilkan asap rokok, terdiri dari dua
komponen yaitu 85% komponen cepat menguap yang berbentuk gas
dan
15% komponen partikel-partikel terdispersi di dalamnya. Asap
yang
dihasilkan pembakaran rokok terdiri dari asap utama dan asap
samping.
Asap utama adalah asap rokok yang dihirup & dihembuskan
langsung oleh
perokok, sedangkan asap samping adalah asap dari ujung rokok
terbakar
yang disebarkan ke udara bebas sehingga dapat terhirup oleh
lingkungan
sekitar (Lodovici et al. 2004). Asap rokok merupakan radikal
bebas yang
berasal dari sumber eksogen. Beberapa unsur yang terdapat dalam
asap
rokok dapat diamati dalam Tabel 1.
-
8
Tabel 1. Senyawa-senyawa yang terkandung dalam asap rokok
Fase Asap Rokok Senyawa Efek
Fase Partikel a. Tar Karsinogen
b. Hidrokarbon aromatik polinuklear
Karsinogen, depressor
ganglion, kokarsinogen
c. Nikotin Kokarsinogen & iritan
d. Fenol Kokarsinogen & iritan
e. Kresol Kokarsinogen & iritan
f. -Naftilamin Karsinogen
g. N-Nitrosonomikotin Karsinogen
h. Benzo(a)piren Karsinogen
i. Logam renik Karsinogen
j. Indol Akselerator tumor
k. Karbazol Akselerator tumor l. Katekol Kokarsinogen
Fase Gas a. Karbon monoksida Pengurangan transfer dan pemakaian
O2
b. Asam hidrosianat Sitotoksik & iritan
c. Asetaldehid Sitotoksik & iritan
d. Akrolein Sitotoksik & iritan
e. Amonia Sitotoksik & iritan
f. Formaldehid Sitotoksik & iritan
g. Oksida dari nitrogen Sitotoksik & iritan
h. Nitrosamin Karsinogen
i. Hidrozin Karsinogen
j. Vinil klorida Karsinogen
(Palanisamy et al. 2009)
Fase gas asap rokok berisi hingga 1014
radikal bebas dan zat-zat
reaktif per kepulan asap rokok. Radikal bebas dan oksidan yang
terdapat
pada fase gas asap rokok memiliki waktu paruh pendek namun
senyawa
tersebut dapat memasuki aliran darah dan menyebabkan kerusakan
oksidatif
makromolekul. Fase gas asap rokok terbukti menginisiasi
autooksidasi in
vitro dari PUFA sehingga terjadi peroksidasi lipid (Swan &
Lessov-
Schlagger 2007). Fase gas asap rokok juga mengandung aldehida
jenuh dan
tak jenuh yang lebih stabil daripada radikal bebas dan hidrogen
peroksida.
Senyawa tersebut dapat masuk ke dalam aliran darah menghasilkan
ROS
melalui interaksi dengan enzim NADPH. Akibatnya, jaringan yang
jauh dari
-
9
paru-paru juga dapat mengalami peningkatan stres oksidatif
(Tostes et al.
2008).
Fase partikel asap rokok mengandung kompleks hidrokarbon
yang
akan bereaksi dengan nitrogen oksida (NO) dan membentuk
senyawa
radikal lain. NO yang terdapat pada asap rokok dapat
menginisiasi PUFA
dan mengakibatkan pembentukan peroksidasi lipid. Fase partikel
asap rokok
memiliki waktu paruh lebih lama daripada fase gas. Fase
partikel
mengandung ion logam yang dapat menghasilkan radikal hidroksil
dari
hidrogen peroksida. Radikal tersebut dapat menembus membran sel
dan
dapat menginduksi stres oksidatif (Pryor 1997). Radikal bebas
akan
mengikat molekul-molekul yang paling rentan pada membran sel
seperti
PUFA. Jembatan metilen pada PUFA merupakan sasaran utama
radikal
bebas yang akan membentuk radikal alkil, peroksil dan alkoksil
(Allard et
al. 1994).
Zat-zat yang terkandung dalam asap rokok sangat beracun
karena
mampu menimbulkan efek inflamasi dan radikal bebas yang
dapat
menurunkan efek antioksidan. Menurut Fitria et al. (2013) racun
utama pada
asap rokok yang mengganggu kesehatan sebagai berikut:
1. Tar
Tar adalah sejenis cairan kental berwarna coklat tua atau
hitam,
merupakan substansi hidrokarbon yang bersifat lengket dan
menempel pada
paru-paru. Tar merupakan suatu zat karsinogen yang dapat
menimbulkan
kanker pada saluran pernafasan dan paru-paru. Tar terdiri dari
dua fase yaitu
fase tar dan fase gas. Pada fase tar, merupakan pembentuk
radikal bebas
seperti quinon, semiquinon dan hidroquinon dalam bentuk matriks
polimer.
Pada fase gas, mengandung nitrit oksida dan nitrit peroksida
yang dapat
mengubah oksigen menjadi radikal bebas superoksida dan radikal
bebas
hidroksil yang sangat merusak (Lustbrader et al. 1983).
2. Nikotin
Nikotin adalah senyawa porillidin dalam Nicotiana tabacum,
Nicotiana rustica dan spesies lainnya yang bersifat adiktif
serta dapat
-
10
mengakibatkan ketergantungan. Nikotin berbentuk cair, tidak
berwarna dan
merupakan basa yang mudah menguap. Nikotin dapat meracuni saraf
tubuh,
meningkatkan tekanan darah, menimbulkan penyempitan pembuluh
darah
tepi dan menyebabkan ketagihan serta ketergantungan pada
pemakainya
(Benowitz 2008). Jumlah nikotin yang dihisap perokok dipengaruhi
oleh
berbagai faktor, yaitu kualitas rokok, jumlah tembakau setiap
batang rokok,
dalamnya isapan dan penggunaan filter.
Kandungan nikotin dalam rokok kretek lebih besar daripada
rokok
filter. Nikotin yang terdapat dalam asap rokok samping 46 kali
lebih besar
dari asap rokok utama. Rokok kretek mengandung lebih banyak
nikotin
dibandingkan dengan rokok putih. Kadar nikotin pada rokok kretek
sebesar
46,8 mg sedangkan pada rokok putih yaitu 16,3 mg. Nikotin
yang
dikeluarkan oleh rokok kretek jumlahnya lebih banyak karena
rokok kretek
tidak dilengkapi dengan filter (Susanna et al. 2003).
3. Karbon monoksida
Karbon monoksida adalah sejenis gas beracun yang tidak
berwarna
dan tidak berbau. Gas CO yang dihasilkan sebatang rokok dapat
mencapai
3-6%, sedangkan CO yang dihisap oleh perokok sejumlah 400 ppm
(parts
per million). Karbon monoksida terkandung dalam asap rokok
mainstream
maupun sidestream. Pada dosis rendah, paparan karbon monoksida
dapat
meningkatkan kadar karboksi hemoglobin (COHb) dalam darah
sejumlah 2-
16% yang dapat menyebabkan kekurangan oksigen pada jaringan
(Sitepoe
2000).
4. Logam timbal (Pb)
Timbal adalah logam beracun yang berwarna abu-abu. Timbal
paling banyak ditemukan pada gas buangan kendaraan bermotor dan
asap
rokok (Rodgaman & Perfetti 2009). Timbal yang dihasilkan
oleh sebatang
rokok adalah sebesar 0,5 g, sementara ambang batas bahaya Pb
yang
masuk ke dalam tubuh adalah 20 g per hari (Patrick 2006).
Paparan timbal
yang terjadi secara terus-menerus di dalam tubuh dapat
menimbulkan efek
-
11
negatif dalam tubuh serta menyebabkan penurunan kemampuan
antioksidan
sehingga menyebabkan stres oksidatif.
B. Asap Rokok sebagai Sumber Radikal Bebas
Radikal bebas adalah suatu senyawa yang memiliki satu atau
lebih
elektron tidak berpasangan di orbital luarnya (unpaired
electron). Oleh
karena elektronnya tidak berpasangan, maka senyawa tersebut
labil dan
sangat reaktif mencari pasangan. Radikal bebas akan menyerang
dan
mengikat elektron molekul di sekitarnya. Molekul yang
terambil
elektronnya akan mewarisi sifat reaktifnya sehingga timbul
reaksi berantai
yang tidak terputus (Muchtadi 2013). Reaksi rantai akan berhenti
apabila
reaktivitasnya diredam oleh senyawa yang bersifat
antioksidan.
Radikal bebas dapat terbentuk melalui 3 tahapan reaksi yaitu
inisiasi, propagasi dan terminasi.
1. Tahap inisiasi (permulaan), yaitu tahap pembentukan awal
radikal-
radikal bebas.
Misalnya:
Fe++
+ H2O2 Fe
+++ + OH
- + OH
R1 H + OH R1 + H2O
2. Tahap propagasi (perambatan), yaitu tahap radikal bebas
mengawali
sederetan reaksi sampai terbentuk radikal bebas baru yang sering
disebut
sebagai reaksi rantai
R2 H + R1 R2 + R1 H
R3 H + R2 R3 + R2 H
3. Tahap terminasi (pengakhiran), yaitu tahap terputusnya daur
propagasi
oleh reaksi-reaksi terminasi. Reaksi ini mengubah radikal bebas
menjadi
radikal bebas yang stabil dan tidak reaktif.
R1 + R1 R1 R1
R2 + R1 R2 R1
Radikal bebas dapat berasal dari dalam tubuh (endogen)
maupun
dari luar tubuh (eksogen). Radikal yang berasal dari dalam tubuh
terbentuk
-
12
sebagai sisa proses metabolisme protein, karbohidrat, lemak
pada
mitokondria, proses inflamasi, reaksi antara besi logam transisi
dalam
tubuh, fagosit, xantin oksidase, peroksisom maupun pada kondisi
iskemia.
Sumber dari luar tubuh adalah asap rokok, asap kendaraan
bermotor, polusi
lingkungan, radiasi ultraviolet, obat-obatan dan pestisida.
Radikal bebas
terpenting dalam tubuh adalah radikal derivat dari oksigen yang
disebut
kelompok oksigen reaktif (ROS) (Haliwell & Gutteridge 2007).
ROS adalah
senyawa pengoksidasi turunan oksigen yang bersifat sangat
reaktif, terdiri
atas kelompok radikal bebas dan kelompok nonradikal. Kelompok
radikal
bebas antara lain superoxide anion (O2-), hydroxyl radicals (OH)
dan
peroxyl radicals (RO2). Kelompok nonradikal misalnya hydrogen
peroxide
(H2O2) dan organic peroxides (ROOH) (Haliwell & Whiteman
2004).
Gambar 2. Sumber eksogen dan endogen radikal bebas
(Young & Woodside 2001)
Radikal bebas dalam jumlah normal diperlukan bagi
kelangsungan
beberapa proses fisiologis dalam tubuh, karena radikal bebas
berperan
dalam transportasi elektron (Ott et al. 2007). Pada saat tubuh
mengandung
radikal bebas dalam jumlah yang banyak, maka radikal bebas
akan
dinetralkan oleh enzim yang berperan sebagai antioksidan
intraseluler
menjadi molekul yang lebih stabil. Namun, apabila jumlah radikal
bebas
terus menerus mengalami peningkatan, maka antioksidan dalam
tubuh tidak
-
13
dapat mengikat radikal bebas lagi. Hal tersebut berbahaya karena
radikal
bebas berpotensi untuk berikatan dengan molekul lain sehingga
molekul lain
tidak stabil, menyebabkan peroksidasi lipid membran sel yang
berlebihan,
serta menyebabkan kerusakan pada protein dan DNA (Packer
1994).
Merokok telah diketahui dapat menyebabkan gangguan kesehatan
yang diakibatkan oleh nikotin dari asap perokok aktif dan asap
perokok
pasif. Target utama asap rokok adalah paru-paru. Rusaknya
paru-paru
sebagai target utama yang langsung terkena asap rokok dapat
dijelaskan
dengan adanya paparan agen kimia di dalam asap rokok. Namun,
efek yang
menyebabkan penyakit kronik pada sistem organ lain kemungkinan
adalah
hasil pajanan secara tidak langsung (Yanbaeva et al. 2007).
Merokok juga
merupakan salah satu faktor resiko utama terhadap penyakit
kardiovaskuler.
Mekanisme potensial yang disebabkan merokok terhadap
penyakit
kardiovaskuler meliputi gangguan homeostasis, abnormalitas lipid
dan
disfungsi endotel (Papathanasiou et al. 2014).
Berdasarkan mekanisme kerjanya di dalam tubuh manusia, racun
dibagi menjadi dua yaitu racun yang bekerja lokal dan sistemik
(Wu &
Wang 2005). Racun yang bekerja lokal dapat bersifat korosif,
iritasi atau
anestetik. Racun yang bekerja sistemik biasanya mempunyai
afinitas
terhadap salah satu sistem, contohnya alkohol dan karbon
monoksida.
Adapun racun yang bekerja lokal maupun sistemik misalnya asam
karbol,
arsen dan Pb. Efek lokal maupun sistemik dari paparan asap rokok
dapat
dijelaskan melalui mekanisme stres oksidatif dan inflamasi
(Pearson et al.
2003).
Radikal bebas dari asap rokok dapat menyebabkan peroksidasi
dari
asam lemak tak jenuh membran sel yang memperkuat stres oksidatif
selama
merokok. Stres oksidatif akan terjadi apabila ROS yang
dihasilkan lebih
besar dibandingkan yang dapat diredam oleh mekanisme pertahanan
sel.
Apabila senyawa-senyawa tersebut tidak diredam, maka oksigen
akan
berbalik menjadi racun bagi tubuh (Droge 2002).
-
14
Stres oksidatif dapat dilihat dari beberapa tanda yang berbeda,
yaitu
dengan pengukuran langsung agen oksidatif seperti produksi ROS
oleh sel
darah perifer, efek stres oksidatif pada target molekul (produk
lipid
peroksidasi dan protein teroksidasi), atau respon kapasitas
antioksidan
dalam plasma (Yanbaeva et al. 2007). Paparan bahan kimia oksidan
dalam
asap dikaitkan dengan penurunan tingkat antioksidan endogen
dalam
kompartemen sistemik. Sejumlah penelitian melaporkan bahwa
merokok
mengakibatkan rendahnya konsentrasi antioksidan dalam
plasma.
Hasil penelitian Adyttia et al. (2014) menunjukkan bahwa
pemberian asap rokok (3 batang/hari) pada tikus selama 14
hari
mengakibatkan peningkatan kadar MDA. Penelitian Muhammad
(2009),
melaporkan bahwa pemberian asap rokok (4 batang/hari selama 30
hari)
pada tikus menunjukkan adanya kenaikan kadar MDA dan
penurunan
aktivitas SOD. Hal ini dikarenakan keadaan stres akibat
pemaparan asap
rokok dapat meningkatkan jumlah radikal bebas yang
menyebabkan
penggunaan SOD semakin banyak sehingga jumlahnya semakin
berkurang.
C. Kandungan Senyawa Kimia Kulit Buah Rambutan
Tanaman rambutan merupakan salah satu tanaman tropis asli
Asia
Tenggara. Tanaman tersebut sangat mudah dijumpai dan
dikembangkan.
Saat ini tanaman rambutan telah menyebar hingga Amerika Latin
dan dapat
ditemukan di daratan yang mempunyai iklim sub tropis. Tanaman
rambutan
dapat tumbuh subur pada ketinggian 30-50 mdpl. Tanaman
rambutan
memiliki klasifikasi sebagai berikut:
Kingdom : Plantae
Divisi : Magnoliophyta
Kelas : Magnoliopsida
Subkelas : Rosidae
Ordo : Sapindales
Famili : Sapindaceae
Genus : Nephelium
Spesies : Nephelium lappaceum L.
Kultivar : Nephelium lappaceum L. Sekaran (Lampiran 4)
-
15
Rambutan merupakan tumbuhan yang memiliki banyak manfaat
dan sangat digemari masyarakat. Salah satu bagian yang belum
dimanfaatkan secara maksimal adalah kulit buah rambutan.
Banyak
penelitian telah membuktikan berbagai macam senyawa kimia
yang
terkandung di dalamnya. Kulit buah rambutan ditemukan memiliki
efek
biologis seperti aktivitas antioksidan, antibakteri (Palanisamy
et al. 2008;
Thitilerdecha et al. 2008), antiproliferasi (Khonkarn et al.
2010), anti herpes
simplex virus tipe 1 (Nawawi et al. 1999) dan
antihiperglikemik
(Palanisamy et al. 2011).
Gambar 3. Buah rambutan kultivar Sekaran (Dokumentasi penulis
2016)
Kulit buah rambutan mengandung berbagai macam antioksidan
seperti alkaloid, fenolik, steroid, terpenoid (Wardhani &
Saptono 2015),
tanin (Thinkratok 2011), saponin (Fila et al. 2012) dan asam
askorbat (Wall
2006). Kulit buah rambutan juga mengandung flavonoid dan
antosianin.
Antosianin merupakan senyawa golongan flavonoid yang
memberikan
pigmen sehingga berwarna merah tua (Nurdin et al. 2013).
-
16
Tabel 2. Kandungan total phenolic content, total anthocyanin
content dan tanin pada kulit buah rambutan
Metode ekstraksi Pelarut Total phenolic
content
Total
anthocyanin
content (mg/100
g ekstrak segar)
Tanin
(% ekstraksi)
Referensi
Maserasi Butanol
Etanol
Etil asetat
Heksana
Metanol
1.73 0.03a
0.72 0.05a
2.28 0.02a
0.29 0.01a
2.05 0.11a
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Khonkarn et al. (2010)
Maserasi Etanol
Air
762b
300b
-
-
-
-
Palanisamy et al. (2008)
Maserasi Etanol - - - Palanisamy et al. (2011a)
Maserasi Etanol
Air
Aquades
975 34b
428 21b
393.2 7.4c
-
-
-
-
-
-
Palanisamy et al (2011b)
Maserasi Eter
Metanol : Etanol
293.3 0.5c
542.2 0.0c
-
-
-
-
-
-
Thitilerdecha et al. (2008)
Maserasi Water : asam
asetat (60:39:1)
- 181.3
-
-
-
Sun et al. (2011)
Maserasi Air - - 21.18 Wongsiri et al. (1993)
a = mg gallic acid/ml; b = mg gallic acid/g berat ekstrak
kering; c = mg katekin/g ekstrak kering
-
17
Tabel 3. Kandungan geraniin, ellagic acid, corilagin dan asam
askorbat pada kulit buah rambutan
Metode ekstraksi Pelarut Geraniin Ellagic acid
(mg/g ekstrak
kering)
Corilagin (mg/g
ekstrak kering)
Asam askorbat
(mg/100 g
berat segar)
Referensi
Maserasi Etanol
Air
37.9 8.3d
15.2 2.3d
-
-
-
-
-
-
Palanisamy et al. (2011b)
Maserasi Etanol 3.79%c - - - Palanisamy et al. (2011a)
Maserasi Methanol 568d 53.5 71.9 - Thitilerdecha et al.
(2010)
- - - - - 36.4 Wall 2006
Tabel 4. Kandungan saponin, alkaloid, tanin dan flavonoid pada
kulit buah rambutan (mg/100 g berat kering)
Metode ekstraksi Pelarut Saponin Alkaloid Tanin Flavonoid
Referensi
- - 2.24 0.57 4.41 0.01 1.72 0.02 22.30 0.30 Fila et al.
(2010)
-
18
Alkaloid merupakan kelompok dari metabolit sekunder yang
memiliki atom nitrogen, dan merupakan bagian dari cincin
heterosiklik.
Sebagian besar alkaloid mempunyai aktivitas biologis tertentu.
Beberapa
alkaloid dilaporkan memiliki sifat beracun, tetapi ada pula yang
sangat
berguna dalam pengobatan. Senyawa alkaloid dapat bertindak
sebagai
penangkap radikal bebas dan dapat mencegah terjadinya
peroksidasi lipid
pada hepatik mikrosomal (Moura et al. 2007).
Terpenoid merupakan senyawa yang mengandung atom karbon
kelipatan lima. Terpenoid merupakan antioksidan alami, seperti
halnya
tokoferol dan asam askorbat. Terpenoid merupakan senyawa
hidrokarbon
isometrik terdapat pada lemak esensial, dapat membantu tubuh
dalam proses
sintesis organik dan pemulihan sel-sel tubuh. Terpenoid mampu
menunda,
memperlambat dan mencegah proses oksidasi lipid (Grassman
2005).
Tanin merupakan senyawa polifenol yang memiliki berat
molekul
cukup tinggi (lebih dari 1000) dan dapat membentuk kompleks
dengan
protein. Berdasarkan strukturnya, tanin dibedakan menjadi dua
kelas yaitu
tanin terkondensasi (condensed tannins) dan tanin
terhidrolisiskan
(hydrolysable tannins) (Harborne 1996). Tanin dilaporkan
memiliki efek
fisiologis seperti mempercepat pembekuan darah, menurunkan
tekanan
darah, menurunkan kadar lipid serum, menghasilkan nekrosis hati
dan
memodulasi respons imun (Chung et al. 1998). Tanin mempunyai
kemampuan untuk mengikat protein dan juga menimbulkan
astringent
sensation (rasa tidak enak) bagi hewan ternak atau manusia
yang
mengkonsumsinya. Astringent sensation ini ditimbulkan karena
adanya
ikatan kompleks antara mukoprotein dengan tanin (Farida et al.
2000).
Konsumsi senyawa tanin dalam jumlah banyak akan menimbulkan
pengaruh negatif, misalnya menghambat penyerapan mineral. Selain
itu,
tanin juga berperan sebagai zat karsinogenik, hepatoksik dan
memiliki
aktivitas antinutritional (Chung et al. 1998).
Tanaman yang mengandung senyawa flavonoid telah terbukti
mempunyai aktivitas antioksidan (Alan & Miller 1996).
Flavonoid adalah
-
19
senyawa golongan fenolik yang mempunyai struktur kimia
C6-C3-C6
Flavonoid merupakan salah satu kelompok fenol yang terbesar di
alam.
Lebih dari 4000 jenis flavonoid telah diidentifikasi dan
beberapa
diantaranya memberikan warna pada bunga, buah dan daun.
Flavonoid
merupakan pigmen tumbuhan kuning, kuning jeruk, dan merah yang
dapat
ditemukan pada buah, sayuran, kacang, biji batang, bunga, herba,
rempah-
rempah, serta produk pangan dan obat dari tumbuhan seperti teh,
minyak
zaitun, cokelat, anggur merah dan obat herbal (de Groot &
Rauen 1998).
Flavonoid adalah senyawa polifenol yang mempunyai sifat kimia
fenol,
yaitu bersifat agak asam sehingga dapat larut dalam basa.
Flavonoid
mempunyai gugus hidroksil tak tersulih atau suatu gula,
sehingga
merupakan senyawa polar. Flavonoid larut dalam pelarut polar
seperti
etanol, metanol, butanol, aseton, dimetilsulfoksida,
dimetilformamida, dan
lain-lain (Markham 1988).
Flavonoid berperan sebagai antioksidan dengan cara mengkelat
logam, berada dalam bentuk glukosida (memiliki rantai samping
glukosa)
atau dalam bentuk bebas yang disebut aglikon. Mekanisme
flavonoid
sebagai antioksidan yaitu mendonorkan ion hidrogen sehingga
menetralisir
efek toksik dari radikal bebas serta meningkatkan ekspresi gen
antioksidan
endogen melalui aktivasi nuclear factor erythroid 2 related
factor 2 (Nrf2 ).
Akibat dari proses tersebut akan terjadi peningkatan gen yang
berperan
dalam sintesis enzim antioksidan endogen, misalnya SOD
(Sumardika &
Jawi 2012).
Kandungan senyawa kimia tertinggi pada kulit buah rambutan
adalah senyawa fenolik (Fila et al. 2012). Senyawa fenolik
adalah senyawa
antioksidan alami yang berupa flavonoid, turunan asam sinamat,
kumarin,
tokoferol dan asam-asam organik. Komponen senyawa fenolik
bersifat polar
dan memiliki kemampuan antioksidan melalui mekanisme sebagai
pereduksi, penangkap radikal bebas, pengkelat logam, peredam
terbentuknya singlet oksigen serta pendonor elektron (Winarsi
2007).
Senyawa fenolik dapat larut dalam air. Penelitian Thitilerdecha
et al. (2010)
-
20
berhasil mengisolasi senyawa fenolik bentuk polifenol dalam
kulit buah
rambutan. Senyawa tersebut yaitu asam ellagat, corilagin dan
geraniin yang
berpotensi sebagai antioksidan. Polifenol merupakan senyawa
kimia yang
mempunyai cincin aromatik dengan gugus hidroksil lebih dari
satu.
Komponen fenolik merupakan terminator dari radikal bebas dan
sebagai pengkelat ion logam redoks aktif. Ion logam tersebut
memungkinkan peranannya untuk mengatalisasi reaksi peroksidasi
lipid.
Antioksidan fenolik menghalangi oksidasi lipid dan molekul lain
dengan
cara mendonasikan atom hidrogen ke senyawa radikal membentuk
intermediet radikal fenoksil. Senyawa intermediet radikal
fenoksil relatif
stabil sehingga tidak mampu lagi menginisiasi reaksi radikal
selanjutnya.
Aktivitas biologis yang tinggi pada senyawa fenolik terletak
pada posisi dan
jumlah gugus OH (Nzaramba 2008).
Grup fenolik memiliki aktivitas sebagai antioksidan juga
prooksidan. Banyaknya konsentrasi antioksidan yang ditambahkan
dapat
berpengaruh pada laju oksidasi. Pada konsentrasi rendah, grup
fenolik dapat
menghambat atau mencegah pembentukan radikal bebas. Namun,
pada
konsentrasi tinggi aktivitas antioksidan grup fenolik sering
lenyap bahkan
antioksidan tersebut menjadi prooksidan (Gordon 1990).
D. Malondialdehida (MDA)
Kerusakan oksidatif pada senyawa lipid terjadi ketika
senyawa
radikal bebas bereaksi dengan senyawa polyunsaturated fatty acid
(PUFA).
Lipid membran bilayer diketahui merupakan campuran fosfolipid
dan
glikolipid yang berikatan dengan asam lemak pada C1 dan C2
rantai gliserol.
Tingkat maupun jenis reaksi oksidasi pada berbagai asam lemak
akan
berlainan. Perbedaan ini sangat bergantung pada jumlah dan
posisi ikatan
rangkap pada rantai asam lemaknya (Muchtadi 2013).
Peroksidasi lipid pada membran dapat mendegradasi asam lemak
tak jenuh secara selektif kemudian mengakumulasikannya menjadi
aldehid,
hidrokarbon dan produk-produk cross linking (Winarsi 2007).
Peroksidasi
-
21
lipid merupakan inisiasi reaksi berantai oleh radikal hidrogen
atau oksigen
yang menyebabkan teroksidasinya PUFA. PUFA lebih rentan
terhadap
reaksi radikal bebas dibandingkan asam lemak jenuh. Jembatan
metilen
yang dimiliki PUFA merupakan sasaran utama radikal bebas yang
akan
membentuk radikal alkil, peroksil, dan alkoksil. Bentuk produk
oksidasi
lipid yang banyak ditemukan dalam cairan biologis antara lain
diena
terkonjugasi dalam plasma, hidroperoksida dalam plasma, LDL
teroksidasi
dalam plasma, aldehid dalam plasma seperti TBARs, MDA dan 4-
hidroksinoneal (Allard et al. 1994).
MDA terbentuk dari peroksidasi lipid pada membran sel yang
merupakan reaksi radikal bebas. Apabila aktivitas radikal bebas
melebihi
mekanisme pertahanan normal, maka akan terjadi berbagai
gangguan
metabolis dan seluler. Radikal bebas dapat merusak sel dengan
cara
merusak membran sel tersebut. Kerusakan pada membran sel dapat
terjadi
dengan cara:
a. Radikal bebas berikatan secara kovalen dengan enzim
dan/atau
reseptor yang berada di membran sel sehingga mengubah
aktivitas
komponen-komponen yang terdapat pada membran sel tersebut
b. Radikal bebas berikatan secara kovalen dengan komponen
membran
sel sehingga mengubah struktur membran dan mengakibatkan
perubahan fungsi membran dan/atau mengubah karakter membran
menjadi seperti antigen
c. Radikal bebas mengganggu sistem transpor membran sel
melalui
ikatan kovalen, mengoksidasi kelompok thiol atau dengan
mengubah
PUFA
d. Radikal bebas menginisiasi peroksidasi lipid secara
langsung
terhadap PUFA dinding sel
Radikal bebas akan menyebabkan terjadinya peroksidasi lipid
membran sel.
Peroksida-peroksida lipid akan terbentuk dalam rantai yang makin
panjang
dan dapat merusak organisasi membran sel. Peroksidasi lipid
akan
-
22
mempengaruhi fluiditas membran, cross-linking membran, serta
struktur
dan fungsi membran (Powers & Jackson 2008).
Mekanisme kerusakan sel akibat serangan radikal bebas yang
paling awal diketahui dan terbanyak diteliti adalah peroksidasi
lipid.
Peroksidasi lipid paling banyak terjadi di membran sel, terutama
asam
lemak tidak jenuh yang merupakan komponen penting penyusun
membran
sel. Pengukuran tingkat peroksidasi lipid diukur dengan mengukur
produk
akhirnya, yaitu malondialdehida (Lima et al. 2004). MDA
merupakan
produk peroksidasi lipid yang relatif konstan terhadap proporsi
peroksidasi
lipid, oleh karena itu merupakan indikator yang tepat untuk
mengetahui
kecepatan (rate) proses peroksidasi lipid in vivo.
Malondialdehida memiliki
tiga rantai karbon dengan rumus molekul C3H4O2 (Pryor et al.
1976).
MDA dapat bereaksi dengan komponen nukleofilik atau
elektrofilik. Aktivitas non spesifiknya, MDA dapat berikatan
dengan
berbagai molekul biologis seperti protein, asam nukleat dan
aminofosfolipid
secara kovalen (Muchtadi 2013). Efek negatif senyawa radikal
maupun
metabolit elektrofilik dapat diredam oleh antioksidan, baik
antioksidan zat
gizi maupun antioksidan non gizi. Oleh karena itu, tinggi
rendahnya kadar
MDA sangat bergantung pada status antioksidan dalam tubuh
seseorang.
Gambar 4. Struktur kimia MDA (Current Protocols 2010)
Winarsi et al. (2005), menemukan bahwa dalam tubuh wanita
perimenopause banyak terbentuk radikal bebas. Hal tersebut
diketahui
melalui pengukuran kadar MDA plasma. Tingginya produk MDA
merupakan bukti rendahnya status antioksidan tubuh sehingga
tidak dapat
mencegah reaktivitas senyawa radikal bebas. Di sisi lain,
tingginya kadar
-
23
MDA plasma membuktikan kerentanan komponen membran sel
terhadap
reaksi oksidasi.
Pemeriksaan kadar MDA dapat dilakukan menggunakan beberapa
cara, salah satunya dengan metode thiobarbituric acid reactive
substance
(TBARs) yang dapat dilakukan secara in vivo maupun in vitro
(Josephy
1997). Tes ini didasarkan pada reaksi kondensasi antara satu
molekul MDA
dengan dua molekul TBA pada kondisi asam. Jumlah MDA yang
terdeteksi
menggambarkan banyaknya peroksidasi lipid yang terjadi.
E. Superoksida Dismutase (SOD)
Antioksidan adalah senyawa pemberi elektron yang mampu
menangkal atau meredam dampak negatif oksidan dalam tubuh.
Antioksidan
bekerja dengan cara mendonorkan satu elektronnya kepada senyawa
yang
bersifat oksidan sehingga aktivitas senyawa oksidan tersebut
bisa dihambat.
Antioksidan terbagi menjadi tiga kelompok besar yaitu:
a. Antioksidan primer
Antioksidan primer disebut juga antioksidan enzimatis.
Antioksidan meliputi enzim SOD, katalase dan glutation
peroksidase (GSH-
Px). Enzim-enzim tersebut mampu menekan atau menghambat
pembentukan radikal bebas dengan cara memutus reaksi berantai
dan
mengubahnya menjadi produk lebih stabil, disebut sebagai reaksi
chain
breaking antioxidant. Suatu senyawa dikatakan sebagai
antioksidan primer
apabila dapat memberikan atom hidrogen secara cepat kepada
senyawa
radikal, kemudian radikal antioksidan yang terbentuk segera
berubah
menjadi senyawa yang lebih stabil (Winarsi 2007).
b. Antioksidan sekunder
Antioksidan sekunder merupakan antioksidan non enzimatis
atau
antioksidan eksogen. Antioksidan dalam kelompok ini disebut
sebagai
sistem pertahanan preventif. Dalam sistem pertahanan ini,
terbentuknya
senyawa oksigen reaktif dihambat dengan cara pengkelatan logam
atau
dirusak pembentukannya. Antioksidan non enzimatis dapat
berupa
-
24
komponen non nutrisi dan komponen nutrisi dari sayuran dan
buah-buahan
meliputi vitamin E, vitamin C, -karoten, flavonoid, asam urat,
bilirubin dan
albumin. Kerja antioksidan non enzimatis dengan cara memotong
reaksi
oksidasi berantai dari radikal bebas atau dengan cara menangkap
radikal
bebas (scavenger free radical). Akibatnya, radikal bebas tidak
akan bereaksi
dengan komponen seluler (Lampe 1999).
c. Antioksidan tersier
Kelompok antioksidan tersier meliputi sistem enzim DNA
repair
dan metionin sulfoksida reduktase. Enzim-enzim tersebut
berfungsi dalam
perbaikan biomolekuler yang rusak akibat reaktivitas radikal
bebas.
Enzim SOD merupakan antioksidan penting yang berasal dari
tubuh sendiri, berpengaruh sangat kuat dan merupakan pertahanan
tubuh
garis pertama dalam mengatasi stres oksidatif (Fridovich 1981).
SOD
merupakan antioksidan pencegah yang dapat menghambat kerusakan
anion
superoksida. Cara kerja SOD yaitu dengan mengkonversi anion
superoksida
menjadi komponen lain yang kurang berbahaya, yaitu hidrogen
peroksida.
Hidrogen peroksida di dalam mitokondria akan mengalami
detoksifikasi
oleh enzim katalase menjadi senyawa H2O dan O2, sedangkan H2O2
yang
berdifusi ke dalam sitosol akan didetoksifikasi oleh enzim
glutation
peroksidase (Lee et al. 2004). SOD bersifat tidak stabil
terhadap panas,
cukup stabil pada kondisi basa dan masih mempunyai aktivitas
walaupun
disimpan sampai lima tahun pada suhu 5 0C.
SOD
O2- + O2
- + 2H
+ H2O2 + O2
Aktivitas enzim SOD memiliki peran penting dalam sistem
pertahanan tubuh, terutama terhadap aktivitas senyawa oksigen
reaktif yang
dapat menyebabkan stres oksidatif. Berdasarkan adanya logam
yang
berperan sebagai kofaktor pada sisi aktif enzim, dapat
dikelompokkan
menjadi 3 yaitu Cu/ZnSOD, MnSOD dan FeSOD (Bannister et al.
1987).
Menurut Haliwell & Gutteridge (2007), aktivitas SOD
tertinggi ditemukan
-
25
di hati, kelenjar adrenalin, ginjal, darah, limfa, pankreas,
otak, paru-paru,
lambung, usus, ovarium dan timus.
F. Senyawa Antioksidan Vitamin C
Vitamin C atau L-asam askorbat merupakan antioksidan yang
larut
dalam air (aqueous antioxidant). Senyawa tersebut merupakan
bagian dari
sistem pertahanan tubuh terhadap senyawa oksigen reaktif dalam
plasma
dan sel (Zakaria 1996). Vitamin C merupakan antioksidan yang
bekerja
sebagai donor elektron dengan cara memindahkan satu elektron ke
senyawa
logam Cu. Vitamin C juga dapat menyumbangkan elektron ke dalam
reaksi
biokimia intraseluler dan ekstraseluler. Vitamin C mampu
menghilangkan
senyawa oksigen reaktif di dalam sel netrofil, monosit, protein
lensa dan
retina. Vitamin tersebut juga dapat berinteraksi dengan
Fe-ferritin. Di luar
sel, vitamin C mampu menghilangkan senyawa oksigen reaktif,
mencegah
terjadinya LDL teroksidasi, mentransfer elektron ke dalam
tokoferol
teroksidasi dan mengabsorpsi logam dalam saluran pencernaan
(Levine et
al. 1995).
Kulit buah rambutan mengandung senyawa kimia, salah satunya
adalah vitamin C. Rata-rata kadar vitamin C yang terkandung pada
kulit
buah rambutan adalah 36,4 mg/100 g (Wall 2006). Penelitian
Palanisamy et
al. (2008), menunjukkan bahwa ekstrak etanol kulit buah
rambutan
memiliki aktivitas penangkapan radikal bebas sebanding dengan
vitamin C
dan jauh lebih tinggi dari biji anggur. Antioksidan vitamin C
mampu
bereaksi dengan radikal bebas kemudian mengubahnya menjadi
radikal
askorbil. Senyawa radikal terakhir tersebut akan segera berubah
menjadi
askorbat dan dehidroaskorbat. Asam askorbat dapat bereaksi
dengan
oksigen teraktivasi, seperti anion superoksida dan radikal
hidroksil. Pada
konsentrasi rendah, vitamin C dapat bereaksi dengan radikal
hidroksil
menjadi askorbil yang sedikit reaktif. Pada konsentrasi tinggi
asam tersebut
tidak akan bereaksi. Kerja askorbat sebagai antioksidan secara
tidak
-
26
langsung juga meregenerasi ikatan antioksidan membran dengan
cara
menangkap radikal peroksil dan oksigen singlet (Zakaria
1996).
Penelitian Huang et al. (2002) pada perokok menunjukkan
bahwa
pemberian suplemen vitamin C 500 gram memberikan pengaruh
dalam
menurunkan peroksidasi lipid subjek yang diukur dengan kadar
8-iso-
prostaglandin F2 urin. Mahfudz (2013), melaporkan bahwa
pemberian
vitamin C mampu menurunkan kadar MDA dan meningkatkan FMD
(Flow
Mediated Dilatation) pada pasien PGK stadium V yang
menjalani
hemodialisis. Ramatina (2014), melaporkan bahwa suplementasi
vitamin C
500 mg mampu menurunkan kadar MDA plasma pada kelompok
wanita
muda sehat, mahasiswi alih jenis IPB. Berdasarkan hal tersebut,
dapat
disimpulkan bahwa vitamin C merupakan antioksidan sekunder
yang
mampu menangkap radikal bebas (scavenger free radical) sehingga
radikal
bebas tidak akan bereaksi dengan komponen seluler.
G. Mekanisme Kerja Kulit Buah Rambutan sebagai Antioksidan
Dalam pengertian kimia, senyawa antioksidan adalah senyawa
pemberi elektron (electron donors). Secara biologis, pengertian
antioksidan
adalah senyawa yang mampu menangkal atau meredam dampak
negatif
oksidan dalam tubuh. Antioksidan mampu memerangi radikal bebas
baik
dengan cara mencegah, menghentikan ataupun memperlambat
proses
oksidasi. Antioksidan melindungi sel dan jaringan sasaran dengan
cara
memusnahkan ROS secara enzimatik atau dengan reaksi kimia
langsung,
mengurangi pembentukan ROS, mengikat ion logam yang terlibat
dalam
pembentukan ROS (tranferin, seruplasmin, albumin),
memperbaiki
kerusakan sasaran serta menghancurkan molekul yang rusak dan
menggantinya dengan yang baru (Schuler 1990).
Antioksidan bereaksi melalui pembersihan senyawa ROS atau
penurunan konsentrasinya secara lokal (eliminating oxygen),
pembersihan
ion logam katalitik (immobilizing catalysts or metal ion),
pembersihan
radikal bebas yang berfungsi sebagai inisiator seperti
hidroksil, peroksil dan
-
27
alkalosil (terminating chain reaction), pemutus rantai dari
rangkaian reaksi
yang diinisiasi oleh radikal bebas (inhibiing radical generating
enzymes)
dan peredam reaksi serta pembersih singlet oksigen (Kartikawati
1999).
Kulit buah rambutan mengandung senyawa polifenol yang
berperan sebagai zat antioksidan. Polifenol memiliki struktur
kimia yang
sangat baik dalam aktivitas scavenging radikal dan menunjukkan
aktivitas
antioksidasi yang lebih efektif secara in vitro dibandingkan
dengan asam
askorbat dan -tokoferol. Aktivitas antioksidasi dari polifenol
ditandai
dengan aktivitas yang relatif tinggi sebagai donor hidrogen
(elektron),
pemutus rantai dan pengkelat transisi logam (Rice-Evans et al.
1995).
Aktivitas antioksidan senyawa polifenol dapat menghambat kerja
radikal
bebas melalui pengubahan senyawa radikal bebas reaktif menjadi
stabil.
Polifenol mampu menangkal oksigen dan radikal alkil dengan
memberikan
donor elektron (hidrogen) kepada radikal bebas sehingga
terbentuk radikal
fenoksil. Radikal fenoksil memiliki ikatan rangkap terkonjugasi
sehingga
tidak menimbulkan radikal bebas dan bersifat lebih stabil
(Thitilertdecha et
al. 2010).
H. Penentuan Aktivitas Penangkapan Radikal menggunakan DPPH
DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) merupakan suatu radikal
bebas yang stabil pada suhu ruangan dan dapat bereaksi dengan
atom
hidrogen dari suatu antioksidan membentuk DPPH tereduksi.
DPPH
berperan sebagai sumber radikal bebas. Penangkapan radikal
bebas
menggunakan DPPH paling umum digunakan untuk menentukan
aktivitas
antioksidan suatu ekstrak tumbuhan. Radikal DPPH adalah suatu
senyawa
organik yang mengandung nitrogen tidak stabil dengan absorbansi
kuat pada
maks 517 nm dan berwarna ungu gelap. DPPH akan bereaksi
dengan
senyawa antioksidan kemudian mereduksi DPPH. Proses tersebut
akan
menyebabkan perubahan warna menjadi kuning. Perubahan warna
menjadi
kuning dapat diukur menggunakan spektrofotometer. Aktivitas
antioksidan
dinyatakan dengan persentase penghambatan (inhibisi) yang
diperoleh dari
-
28
nilai absorbansi blanko dikurangi absorbansi sampel (Kedare
& Singh
2011). Reaksi penangkapan radikal bebas menggunakan DPPH oleh
suatu
antioksidan dapat dilihat pada Gambar 6.
Gambar 5. Reaksi antara radikal DPPH dengan antioksidan (Windono
2001)
Gambar 6. Struktur molekul DPPH setelah menerima donor atom
H
(Cowie & Arrighi 2007)
Penggunaan DPPH sebagai metode penangkapan radikal
mempunyai keuntungan, yaitu mudah digunakan, mempunyai
sensitivitas
yang tinggi dan dapat menganalisis sejumlah sampel dalam waktu
yang
singkat.
-
29
I. Kerangka Berfikir
Gambar 7. Kerangka berfikir penelitian
J. Hipotesis Penelitian
Berdasarkan rumusan masalah yang telah dikemukakan, maka
hipotesis yang akan diuji dalam penelitian ini adalah:
Pemberian ekstrak kulit buah rambutan menurunkan kadar MDA
dan
meningkatkan aktivitas SOD tikus yang dipapar asap rokok.
Peroksidasi lipid
Ekstrak kulit buah
rambutan
Kandungan senyawa
fenolik, alkaloid,
steroid, terpenoid, tanin,
flavonoid, asam
askorbat, antosianin
MDA SOD
ROS meningkat
Karbon monoksida, tar,
nikotin dan senyawa
berbahaya lainnya
Paparan asap rokok
Antioksidan MDA SOD
Peroksidasi lipid
Menghambat
-
30
BAB III
METODE PENELITIAN
A. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan selama 2 bulan. Penelitian ini terdiri
dari
beberapa tahap, yaitu pembuatan ekstrak kulit buah rambutan,
pengukuran
aktivitas antioksidan, pemeliharaan hewan coba, pemeriksaan
kadar MDA
dan aktivitas SOD. Pembuatan ekstrak kulit buah rambutan
dilakukan di
Laboratorium Farmasi FK Unissula. Pemeliharaan hewan coba
dilakukan di
Laboratorium Biologi FMIPA Unnes. Pengukuran aktivitas
antioksidan
dilakukan di Laboratorium Pangan Unika Soegijapranata.
Pemeriksaan
kadar MDA dilakukan di Laboratorium Biokimia Fakultas
Kedokteran
UNDIP dan pemeriksaan aktivitas SOD dilakukan di Laboratorium
Gizi
Pusat Studi Pangan dan Gizi UGM.
B. Populasi dan Sampel
Populasi
Populasi yang digunakan dalam penelitian adalah tikus putih
(Rattus novergicus) galur Wistar yang diperoleh dari
Laboratorium Biologi
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas
Negeri
Semarang.
Sampel
Sampel yang digunakan dalam penelitian adalah tikus putih
galur
Wistar jantan terdiri dari 30 ekor, berumur 2 bulan dengan berat
badan 150-
200 gram, sehat, tidak cacat secara anatomi. Sampel diambil
secara acak
dan dibagi menjadi 6 kelompok. Masing-masing kelompok terdiri
dari 5
ekor. Banyaknya jumlah sampel sesuai rekomendasi dari WHO
(1993)
bahwa besar sampel minimal yang digunakan untuk uji
eksperimental
adalah 5 ekor setiap kelompoknya.
-
31
C. Variabel Penelitian
Ada 3 macam variabel dalam penelitian ini yaitu:
1. Variabel Bebas
Variabel bebas berupa ekstrak kulit buah rambutan.
2. Variabel terikat
Variabel terikat dalam penelitian ini adalah kadar MDA dan
aktivitas
SOD tikus.
3. Variabel kendali
Variabel kendali dalam penelitian ini adalah jenis rokok,
jenis
kelamin, umur, berat badan, jenis pakan tikus, ukuran dan
kondisi
lingkungan kandang tikus.
D. Rancangan Penelitian
Desain penelitian adalah Randomized Post Test Only With
Control
Group Design dengan rancangan kelompok:
Kelompok A : Merupakan kelompok kontrol normal, tikus diberi
akuades
Kelompok B : Merupakan kelompok kontrol negatif, tikus
diberi
paparan asap rokok selama 14 hari
Kelompok C : Merupakan kelompok kontrol positif, tikus
diberi
asap rokok dan vitamin C 1 mg/200gBB selama 14
hari
Kelompok D : Merupakan kelompok tikus dengan perlakuan asap
rokok dan ekstrak kulit buah rambutan 3
mg/200gBB selama 14 hari
Kelompok E : Merupakan kelompok tikus dengan perlakuan asap
rokok dan ekstrak kulit buah rambutan 6
mg/200gBB selama 14 hari
Kelompok F : Merupakan kelompok tikus dengan perlakuan asap
rokok dan ekstrak kulit buah rambutan 12
mg/200gBB selama 14 hari
-
32
Ekstrak kulit buah rambutan dalam penelitian ini adalah kulit
buah
rambutan kultivar Sekaran yang diperoleh dari Gunungpati,
Semarang.
Paparan asap rokok dalam penelitian ini merupakan hasil
pembakaran 3
batang rokok kretek sebagai bahan penyebab peningkatan radikal
bebas.
Desain penelitian dapat dicermati pada Gambar 8.
Penentuan Dosis Ekstrak Kulit Buah Rambutan, Vitamin C dan
Rokok
1. Dosis ekstrak kulit buah rambutan
Dosis ekstrak kulit buah rambutan mengacu pada penelitian
Sandhiutami et al. (2015). Dosis ekstrak kulit buah rambutan
yang
digunakan yaitu: 21 mg/kgBB, 42 mg/kgBB dan 84 mg/kgBB.
Sandhiutami
et al. (2015) melaporkan bahwa dosis efektif untuk menurunkan
kadar
MDA mencit yang diberi aktivitas fisik berlebihan selama 7 hari
adalah 42
mg/kgBB.
Dosis per 200 gram tikus adalah sebagai berikut:
Dosis I :
Dosis II :
Dosis III :
Dosis ekstrak kulit buah rambutan yang digunakan dalam
penelitian ini
yaitu 3 mg/ekor/hari, 6 mg/ekor/hari dan 12 mg/ekor/hari.
2. Dosis vitamin C
Dosis vitamin C mengacu pada penelitian Sandhiutami et al.
(2015). Penelitian tersebut melaporkan bahwa pemberian vitamin C
6,5
mg/kgBB mampu meningkatkan aktivitas SOD pada mencit yang
diberi
aktivitas fisik berlebihan selama 7 hari. Dosis per 200 gram
tikus adalah
sebagai berikut:
Dosis Vit C : 0,13 x 7 = 1 mg
Dosis vitamin C yang digunakan adalah 1 mg/ekor/hari.
-
33
3. Dosis rokok
Penentuan jumlah rokok yang digunakan dalam penelitian ini
mengacu pada penelitian Adyttia et al. (2014). Pada penelitian
tersebut
menunjukkan bahwa pemberian rokok 3 batang/hari selama 14 hari
pada
tikus mampu meningkatkan kadar MDA tikus. Oleh sebab itu,
pada
penelitian ini jumlah rokok yang digunakan adalah 3 batang/hari
selama 14
hari.
E. Alat dan Bahan Penelitian
Alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian disajikan dalam
Tabel 5
dan 6.
Tabel 5. Alat penelitian
No Nama Alat Fungsi
1. Gelas ukur Tempat untuk mengukur aquades dan
larutan ekstrak kulit buah rambutan
2. Pengaduk Untuk mengaduk ekstrak kulit buah
rambutan
3. Neraca digital Untuk menimbang berat tikus
4. Wadah minum Tempat minum tikus
5. Sonde lambung spuit Alat untuk menginjeksi ekstrak kulit
buah
rambutan secara oral
6. Kandang tikus Tempat pemeliharaan tikus dengan ukuran
36 cm x 28 cm x 12 cm
7. Smoking chamber Tempat untuk pengasapan rokok pada
tikus dengan ukuran 42 cm x 29 cm x 33
cm
8. Pipet hematokrit Untuk mengambil darah pada sinus
orbitalis tikus
9. Tabung eppendorf Untuk menampung darah
10. Sentrifuge scientific Untuk memisahkan bagian-bagian pada
sel
darah
11. Container box Untuk penyimpanan sementara sampel
darah saat dibawa ke laboratorium
12. Kamera Sebagai dokumentasi
-
34
Tabel 6. Bahan penelitian
No Nama Bahan Fungsi
1. Ekstrak kulit buah
rambutan
Bahan uji coba yang dilakukan
2. Asap rokok kretek Bahan uji coba sebagai radikal bebas
3. Akuades Pelarut ekstrak kulit buah rambutan
4. EDTA Untuk mencegah terjadinya koagulasi atau
penggumpalan darah
5. Tikus putih jantan Hewan uji coba
6. Asam pikrat Untuk menandai tikus
7.
8.
Kapas/tissue
Etanol
Untuk membersihkan alat
Pelarut ekstraksi kulit buah rambutan
-
35
Gambar 8. Alur penelitian
30 ekor tikus
E
Asap rokok
+ ekstrak
kulit buah
rambutan 6
mg/200gB
B
D
Asap rokok
+ ekstrak
kulit buah
rambutan 3
mg/200gBB
C
Asap rokok
+ Vitamin C
1
mg/200gBB
B
Asap
rokok/har
i
A
akuades
F
Asap rokok
+ ekstrak
kulit buah
rambutan
12
mg/200gBB
Aklimatisasi selama 7 hari dengan pemberian pakan standar dan
akuades
Perlakuan dilakukan selama 14 hari
Mengambil sampel darah pada hari ke
15
Mengukur kadar MDA dan SOD
Analisis data
Randomisasi menjadi 6 kelompok
-
36
F. Prosedur Penelitian
1. Pembuatan Ekstrak Kulit Buah Rambutan
Kulit buah rambutan yang digunakan dalam penelitian ini
adalah
kulit buah yang telah dipotong menjadi bagian kecil. Kulit buah
kemudian
dicuci menggunakan air mengalir dan dikeringkan di dalam ruangan
selama
3-5 hari. Kulit yang sudah kering selanjutnya dihaluskan
menggunakan
blender hingga didapat serbuk kering. Metode ekstraksi yang
digunakan
dalam penelitian ini adalah metode maserasi. Serbuk kering
diekstrasi
menggunakan pelarut etanol 96% selama 24 jam pada suhu kamar
dengan
perbandingan 1:1. Suspensi yang diperoleh disaring menggunakan
kertas
Whatman No. 1. Filtrat yang terkumpul diuapkan menggunakan
rotary
evaporator hingga terbentuk pasta.
2. Pengukuran Aktivitas Antioksidan Menggunakan DPPH
Pengukuran diawali dengan pembuatan larutan DPPH. Sebanyak
1,97 mg DPPH dilarutkan dengan metanol dalam labu ukur sampai
100 ml,
sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 0,05 mM.
Selanjutnya
dilakukan pengukuran aktivitas antioksidan ekstrak kulit buah
rambutan.
Sebanyak 25 mg ekstrak kulit buah rambutan dilarutkan dengan
metanol
dalam labu ukur sampai 25 ml. Kemudian pada labu ukur sampel
ditambahkan 5 ml larutan DPPH 0,5 mM. Larutan blanko dibuat
dengan
cara larutan DPPH 0,5 mM dipipet sebanyak 5 ml kemudian
dimasukkan ke
dalam labu ukur 25 ml lalu volumenya dicukupkan dengan metanol
sampai
garis tanda. Absorbansi DPPH diukur menggunakan spektrofotometer
pada
panjang gelombang 515 nm. Kemampuan antioksidan diukur
sebagai
penurunan serapan larutan DPPH akibat adanya penambahan
sampel.
Nilai serapan larutan DPPH dihitung dengan rumus sebagai berikut
(%):
-
37
3. Perlakuan Hewan Percobaan
Penelitian ini diawali dengan mempersiapkan 30 ekor tikus
putih
galur Wistar yang diaklimatisasi selama 7 hari. Hewan
percobaan
dikelompokkan secara acak menjadi 6 kelompok masing-masing
kelompok
5 ekor. Hewan ditempatkan pada kandang individual yang
dibersihkan
setiap hari. Tikus diberi pakan standar dan air minum secara ad
libitum
selama penelitian. Proses pemaparan dilakukan setiap pagi
menggunakan 3
batang rokok dalam satu hari. Pemaparan dilakukan selama 14
hari. Pada
saat akan diberi paparan asap rokok, hewan coba dipindahkan ke
dalam
kandang khusus yaitu smoking chamber sesuai kelompoknya.
Kandang
tersebut merupakan kotak pengasapan yang di dalamnya terdapat
jeruji
pembatas untuk memisahkan hewan coba dengan ujung rokok yang
terbakar. Apabila hewan coba dimasukkan maka tikus dapat secara
langsung
terkena paparan asap rokok. Asap rokok dihembuskan berulang kali
dengan
bantuan tabung injeksi hingga rokok habis terbakar. Pemberian
ekstrak kulit
buah rambutan dilakukan satu jam setelah paparan asap rokok.
4. Pengambilan Darah
Pengambilan darah dilakukan pada hari ke 15 penelitian.
Darah
diambil dari sinus orbitalis dengan hematokrit sebanyak 3 ml
dan
ditampung dalam tabung eppendorf yang telah berisi EDTA. Sampel
yang
digunakan untuk pengukuran kadar MDA adalah plasma darah dan
untuk
pengukuran aktivitas SOD adalah whole blood. Darah yang
terkumpul
selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 1000 rpm selama 10
menit pada
suhu 4 0C. Plasma yang terbentuk dipindah ke dalam tabung baru
dan
disimpan pada suhu -80 0C sampai siap untuk dianalisis. Larutan
penyangga
yang terbentuk dihilangkan dari pelet eritrosit, kemudian
eritrosit dilarutkan
sebanyak 5X volumenya dengan menggunakan ddH2O. Eritrosit yang
telah
dilarutkan disentrifugasi selama 10 menit pada kecepatan 10000
rpm dan
supernatan yang terbentuk disimpan pada suhu -80 0C sampai siap
untuk
dianalisis.
-
38
5. Pengukuran Kadar MDA
Pemeriksaan kadar MDA menggunakan plasma darah. Prosedur
pengukuran kadar MDA dapat dilihat pada Tabel 7.
Tabel 7. Prosedur pengukuran kadar MDA
Sampel Blanko
Sampel plasma 200 l -
TCA 15% 2000 l 2000 l
TBA 0,37% dalam HCl 0,25 N 2000 l 2000 l
Campuran tersebut selanjutnya dipanaskan dalam waterbath
pada
suhu 950C selama 60 menit. Kemudian tabung diletakkan pada ice
bath
selama 15 menit. Sampel yang sudah dingin disentrifugasi
dengan
kecepatan 3000 rpm selama 15 menit. Supernatan yang
terbentuk
dipindahkan ke dalam kuvet kemudian dibaca absorbansinya
menggunakan
spektrofotometer pada panjang gelombang 545 nm.
Rumus penghitungan kadar MDA (nmol/ml) :
6. Pengukuran Aktivitas SOD
Pemeriksaan aktivitas SOD dilakukan menggunakan metode
kalorimetri. Sampel yang digunakan dalam pengukuran ini adalah
whole
blood. Prosedur pengukuran aktivitas SOD dapat dilihat pada
Tabel 8.
Tabel 8. Prosedur pengukuran aktivitas SOD
Sampel Blanko 1 Blanko 2 Blanko 3
Whole blood 20 l - 20 l -
ddH2O - 20 l - 20 l
Larutan pereaksi WST 200 l 200 l 200 l 200 l
Larutan pengencer buffer - - 20 l 20 l
Larutan pereaksi enzim 20 l 20 l - -
Semua larutan dihomogenkan dan diinkubasi pada suhu 370C selama
20 menit,
selanjutnya dilakukan pengukuran absorbansi pada panjang
gelombang 450 nm
menggunakan microplate reader
Rumus penghitungan aktivitas SOD (%) :
( ) ( )
( )
-
39
G. Analisis Data
Analisis data dalam penelitian ini meliputi uji normalitas
menggunakan uji Kolmogorov-Smirnov test dilanjutkan uji
homogenitas
dengan uji Levene test. Untuk mengetahui perbedaan rata-rata
antara
kelompok dilakukan uji komparasi menggunakan uji one way Anova
dan
dilanjutkan dengan uji Least Significant Differences (LSD).
Analisis
statistik dibantu dengan program SPSS (Statistical Product and
Service
Solutions) for windows versi 17.
-
40
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Hasil Penelitian
Hasil penelitian aktivitas antioksidan yang diuji
menggunakan
DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil) dan dinyatakan sebagai %
inhibisi,
menunjukkan bahwa aktivitas antioksidan ekstrak kulit buah
rambutan
memiliki nilai sebesar 77,83% yang termasuk dalam kategori
sedang. Hasil
penelitian menunjukkan bahwa setiap kelompok memiliki variasi
kadar
MDA dan SOD. Berdasarkan uji normalitas diketahui bahwa data MDA
dan
SOD berdistribusi normal. Hasil uji one way anova menunjukkan
ekstrak
kulit buah rambutan berpengaruh terhadap kadar MDA dan SOD tikus
yang
dipapar asap rokok (Lampiran 2 & 3).
Hasil uji LSD (Tabel 9) menunjukkan bahwa pada kelompok A
yaitu
kelompok normal memiliki kadar MDA terendah dan SOD
tertinggi.
Kelompok normal digunakan sebagai kelompok kontrol untuk
mengetahui
kadar MDA dan SOD pada keadaan normal tanpa pemberian ekstrak
kulit
buah rambutan dan paparan asap rokok. Kadar MDA pada kelompok
A
berbeda nyata dengan kelompok B, D, F dan tidak berbeda nyata
dengan
kelompok C dan E. Aktivitas SOD kelompok A berbeda nyata
dengan
kelompok lainnya (B, C, D, E dan F).
Tabel 9. Hasil rerata kadar MDA dan SOD
Kelompok Perlakuan Kadar MDA
(nmol/ml)
Aktivitas SOD
(%)
A Normal 10,24 0,55a 81,09 4,37
a
B Asap rokok 15,30 0,57b 29,45 3,50
b
C Asap rokok + vitamin C 1
mg/200gBB
10,82 1,22a 65,81 3,49
c
D Asap rokok + ekstrak kulit buah
rambutan 3 mg/200gBB
12,59 1,20c 50,18 4,91
d
E Asap rokok + ekstrak kulit buah
rambutan 6 mg/200gBB
11,06 1,71a 60,72 6,62
ec
F Asap rokok + ekstrak kulit buah
rambutan 12 mg/200gBB
13,53 0,55dc
42,91 6,62f
Keterangan : Angka yang diikuti oleh huruf pada kolom yang
sama
menunjukkan perbedaan pada setiap kelompok perlakuan
dengan taraf ketelitian p
-
41
Pada kelompok B yaitu kelompok kontrol negatif memiliki
kadar
MDA sebesar 15,30 nmol/ml dan merupakan kelompok dengan kadar
MDA
tertinggi. Kelompok B memiliki aktivitas SOD terendah, yaitu
sebesar
29,45%. Kelompok B merupakan kelompok yang dipapar asap rokok
3
batang/hari. Kadar MDA dan aktivitas SOD pada kelompok B
berbeda
nyata dengan semua kelompok lainnya (A, C, D, E dan F)
Pada kelompok E dan F merupakan kelompok yang diberi ekstrak
kulit buah rambutan dengan dosis 6 mg/200gBB dan 12 mg/200gBB
.
Kadar MDA kelompok E berbeda nyata dengan kelompok B, D, F dan
tidak
berbeda nyata dengan kelompok A dan C. Aktivitas SOD kelompok
E
berbeda nyata dengan kelompok A, B, D, F dan tidak berbeda nyata
dengan
kelompok C. Kadar MDA kelompok F berbeda nyata dengan kelompok
A,
B, C, E dan tidak berbeda nyata dengan kelompok D. Aktivitas
SOD
kelompok F berbeda nyata dengan kelompok lainnya.
B. Pembahasan
Hasil penelitian menunjukkan pemaparan asap rokok
menyebabkan
peningkatan kadar MDA. Pada kelompok kontrol negatif (kelompok
B)
memiliki kadar MDA tertinggi yang berbeda nyata dengan
kelompok
lainnya. Pada keadaan normal, radikal bebas terbentuk di dalam
tubuh
sangat lambat dan perlahan. Pada saat radikal bebas meningkat
melebihi
kemampuan pertahanan endogen, maka akan terjadi
ketidakseimbangan
antara jumlah radikal bebas dengan antioksidan endogen,
sehingga
terjadilah ketidakstabilan (stres) oksidatif. Stres oksidatif
menyebabkan
peroksidasi lipid yang berlebihan. Hasil dari peroksidasi lipid
adalah MDA,
sehingga meningkatnya peroksidasi lipid dapat menyebabkan kadar
MDA
dalam tubuh meningkat (Winarsi 2007).
Paparan asap rokok dapat menyebabkan kerusakan pada organ
paru-paru. Rusaknya paru-paru sebagai target utama yang langsung
terkena
asap rokok dapat dijelaskan dengan adanya paparan agen kimia di
dalam
asap rokok. Namun, efek yang menyebabkan penyakit kronis pada
sistem
-
42
organ lain kemungkinan adalah hasil pajanan secara tidak
langsung
(Yanbaeva et al. 2014).
Fase gas asap rokok terbukti menginisiasi autooksidasi in vitro
dari
PUFA sehingga terjadi peroksidasi lipid. Fase gas asap rokok
dapat berisi
hingga 1014
radikal bebas dan zat-zat reaktif per kepulan asap rokok.
Radikal bebas dan oksidan yang terdapat pada fase gas asap rokok
memiliki
waktu paruh pendek, namun senyawa tersebut dapat memasuki aliran
darah
dan menyebabkan kerusakan oksidatif makromolekul (Swan &
Lessov-
Schlagger 2007). Fase gas asap rokok juga mengandung aldehida
jenuh dan
tak jenuh yang lebih stabil daripada radikal bebas dan hidrogen
peroksida.
Senyawa tersebut dapat masuk ke dalam aliran darah menghasilkan
ROS
melalui interaksi dengan enzim NADPH. Akibatnya, jaringan yang
jauh dari
paru-paru juga dapat mengalami peningkatan stres oksidatif
(Tostes et al.
2008).
Fase partikel asap rokok mengandung kompleks hidrokarbon
yang
akan bereaksi dengan nitrogen oksida (NO) dan membentuk
senyawa
radikal lain. NO yang terdapat pada asap rokok dapat
menginisiasi PUFA
dan mengakibatkan pembentukan peroksidasi lipid. Fase partikel
asap rokok
memiliki waktu paruh lebih lama daripada fase gas. Fase
partikel
mengandung ion logam yang dapat menghasilkan radikal hidroksil
dari
hidrogen peroksida. Radikal tersebut dapat menembus membran sel
dan
dapat menginduksi stres oksidatif (Pryor 1997). Radikal bebas
akan
mengikat molekul-molekul yang paling rentan pada membran sel
seperti
PUFA. Jembatan metilen pada PUFA merupakan sasaran utama
radikal
bebas yang akan membentuk radikal alkil, peroksil dan alkoksil
(Allard et
al. 1994).
Kadar MDA pada kelompok perlakuan ekstrak kulit buah
rambutan
dengan variasi 3 dosis mengalami penurunan. Ekstrak kulit buah
rambutan
mengandung senyawa metabolit sekunder alkaloid, steroid,
terpenoid,
fenolik (Wardhani & Saptono 2015) yang berfungsi sebagai
antioksidan.
Senyawa fenolik adalah senyawa antioksidan alami yang berupa
flavonoid,
-
43
turunan asam sinamat, kumarin, tokoferol dan asam-asam
organik.
Komponen senyawa fenolik bersifat polar dan memiliki
kemampuan
antioksidan melalui mekanisme sebagai pereduksi, penangkap
radikal bebas,
pengkelat logam, peredam terbentuknya singlet oksigen serta
pendonor
elektron (Winarsi 2007). Senyawa fenolik dapat larut dalam air.
Penelitian
Thitilerdecha et al. (2010) berhasil mengisolasi senyawa fenolik
bentuk
polifenol dalam kulit buah rambutan. Senyawa tersebut yaitu asam
ellagat,
corilagin dan geraniin yang berpotensi sebagai antioksidan.
Komponen fenolik merupakan terminator dari radikal bebas dan
sebagai pengkelat ion logam redoks aktif. Ion logam tersebut
memungkinkan peranannya untuk mengatalisasi reaksi peroksidasi
lipid.
Antioksidan fenolik menghalangi oksidasi lipid dan molekul lain
dengan
cara mendonasikan atom hidrogen ke senyawa radikal membentuk
intermediet radikal fenoksil. Senyawa intermediet radikal
fenoksil relatif
stabil sehingga tidak mampu lagi menginisiasi reaksi radikal
selanjutnya
(Nzaramba 2008). Pada kelompok perlakuan ekstrak kulit buah
rambutan
didapatkan dosis efektif untuk menurunkan kadar MDA yaitu dosis
6
mg/200gBB (kelompok E).
Kadar MDA kelompok C 10,821,22 nmol/ml berbeda nyata
dengan kelompok B (kontrol negatif) ), D dan F. Kelompok C
merupakan
kelompok kontrol positif. Penelitian tersebut menunjukkan bahwa
vitamin C
dapat mencegah proses peroksidasi lipid dengan mendonorkan
elektron.
Vitamin C memiliki sifat antioksidan yang dapat melindungi
molekul yang
dibutuhkan oleh tubuh (seperti protein, lipid, karbohidrat dan
asam nukleat)
dari kerusakan oleh radikal bebas (Winarsi 2007).
Kadar MDA pada kelompok perlakuan ekstrak kulit buah
rambutan
dosis 12 mg/200gBB (F) sebesar 13,53 nmol/ml tidak berbeda
nyata
dengan kelompok perlakuan ekstrak kulit buah rambutan 3
mg/200gBB
(kelompok D). Penelitian Sandhiutami et al. (2015) juga
memaparkan
bahwa ekstrak kulit buah rambutan dosis 84 mg/kgBB meningkatkan
kadar
MDA mencit yang diberi aktivitas fisik berlebihan. Fila et al.
(2012)
-
44
melaporkan bahwa kandungan senyawa tertinggi pada kulit buah
rambutan
adalah senyawa fenolik. Beberapa penelitian menunjukkan
bahwa
antioksidan fenolik juga memiliki aktivitas prooksidan dalam
kondisi
tertentu, seperti pada dosis tinggi, pH tinggi atau di hadapan
ion logam
(Decker 1997). Banyaknya konsentrasi antioksidan yang
ditambahkan dapat
berpengaruh pada laju oksidasi. Pada konsentrasi rendah, grup
fenolik dapat
menghambat atau mencegah pembentukan radikal bebas. Namun,
pada
konsentrasi tinggi aktivitas antioksidan grup fenolik sering
lenyap bahkan
antioksidan tersebut menjadi prooksidan (Bouayed & Bohn
2010). Oleh
karena itu, diperlukan penelitian lebih lanjut mengenai dosis
ekstrak kulit
buah rambutan sehingga diketahui dosis yang efektif sebagai
antioksidan
dan prooksidan.
Enzim SOD adalah antioksidan enzimatis yang memegang peranan
penting dalam melindungi sel dari stres oksidatif (Fridovich
1981). SOD
mengatalisis reaksi dismutasi dari radikal anion superoksida
menjadi
hidrogen peroksida (H2O2). H2O2 akan diubah menjadi H2O oleh
enzim
katalase dan glutation peroksidase (Lee et al. 2004).
Kesempurnaan kerja
sistem enzim antioksidan diperankan oleh tiga macam enzim
tersebut (SOD,
katalase, glutation peroksidase), namun antioksidan seluler
tidak dapat
bekerja secara individual tanpa dukungan asupan antioksidan
sekunder dari
bahan pangan. Oleh karena itu, diperlukan konsumsi bahan makanan
yang
kaya akan komponen antioksidan dengan jumlah memadai agar
mampu
memacu kerja enzim antioksidan dalam tubuh (Lampe 1999).
Pembentuk radikal bebas dari asap rokok terdapat dalam dua
fase,
yaitu fase gas yang berupa NO & nitrit peroksida (NO2) dan
fase partikel
berupa quinine, semiquinone & hydroquinone (Trabel et al.
2000). Kedua
fase pembentuk radikal bebas tersebut apabila bereaksi dengan
logam
transisi seperti Fe dan Cu akan menghasilkan radikal bebas O2
dan H2O2
yang selanjutnya membentuk radikal hidroksil. Pemakaian enzim
SOD yang
terlalu besar untuk menetralisir radikal bebas secara
terus-menerus akan
menurunkan aktivitas enzim tersebut (Muhammad 2009).
-
45
Penurunan aktivitas SOD pada kelompok B menunjukkan bahwa
pemaparan asap rokok mengakibatkan peningkatan radikal bebas
pada tikus.
Pada saat pemaparan asap rokok akan terbentuk radikal
superoksida (O2),
yaitu zat reaktif yang berbahaya bagi tubuh. Enzim SOD dapat
menetralisir
radikal tersebut dengan mengubah dua molekul O2 menjadi H2O2 dan
O2.
Peningkatan O2 secara terus-menerus akan mengganggu aktivitas
SOD
yang menyebabkan ketidakseimbangan antara oksidan dan
antioksidan
endogen (Fridovich 1981). Hal ini didukung oleh penelitian
Muhammad
(2009) yang menyatakan bahwa keadaan stres dapat meningkatkan
jumlah
radikal bebas. Kondisi tersebut akan menyebabkan penggunaan
enzim SOD
semakin banyak sehingga enzim SOD yang tersedia jumlahnya
semakin
berkurang.
Pada kondisi stres oksidatif, imbangan normal antara ROS
dengan
kemampuan antioksidan tubuh untuk mengeliminasinya mengalami
gangguan sehingga menggoyahkan rantai reduksi-oksidasi
normal.
Akibatnya, terjadilah kerusakan jaringan (stres oksidatif).
Kerusakan
jaringan akibat radikal bebas tergantung pada beberapa faktor,
antara lain
target molekuler, tingkat stres yang terjadi, mekanisme yang
terlibat serta
waktu dan sifat alami dari sistem yang diserang