PRESENTA: APARICIO LÓPEZ EDEN UNIVERSIDAD AUTÓNOMA BENITO JUÁREZ DE OAXACA FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS LICENCIATURA EN QUÍMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGO ASESORA: DRA. EN C. ITANDEHUI BELEM GALLEGOS VELASCO EXPRESIÓN DEL ANTÍGENO T Y GALECTINA 3 EN CÉLULAS MCF-7 ESTIMULADAS CON LIPOPOLISACÁRIDOS. PROTOCOLO DE TESIS
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Eden Aparicio Tesis Expresion de Agt y Galectina 3 en Celulas Mcf 7 Estimuladas Con Lps
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PRESENTA:
APARICIO LÓPEZ EDEN
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA BENITO JUÁREZ DE OAXACA
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS LICENCIATURA EN QUÍMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGO
ASESORA: DRA. EN C. ITANDEHUI BELEM GALLEGOS VELASCO
OAXACA DE JUÁREZ, OAXACA MARZO 2015
EXPRESIÓN DEL ANTÍGENO T Y GALECTINA 3 EN CÉLULAS MCF-7 ESTIMULADAS CON
LIPOPOLISACÁRIDOS.
PROTOCOLO DE TESIS
ÍNDICE
I. FUNDAMENTO TEÓRICO......................................................................................................4
LINEAS CELULARES DEL CANCER DE MAMA....................................................................4
LINEA CELULAR MCF-7............................................................................................................6
PARTICIPACIÓN DE LA GALECTINA-3 EN EL DESARROLLO DEL CANCER DE MAMA.....................................................................................................................................12
La primera línea celular humana fue creada en un laboratorio de Baltimore, hace más de 50 años por George Gey (1). Esta línea celular llamada HeLa deriva de una dama cuyo nombre era Henrietta Lacks, que tenía carcinoma cervical. La visión de Gey allanó el camino para el cultivo celular tal como la conocemos hoy en día, lo que permite su desarrollo generalizado como una herramienta experimental importante en la investigación del cáncer. Uno de los principales beneficios de usar líneas de células cultivadas en la investigación del cáncer es que ofrecen un suministro infinito de una población de células relativamente homogéneas que son capaces de autorreplicarse en un medio de cultivo celular estándar.
La primera línea celular de cáncer de mama humano (BT-20) fue establecido por Lasfargues y Ozzello en 1958 a partir del cultivo de un pedazo de explante de un tumor de una mujer caucásica de 74 años de edad (2). Estas células son receptor alfa de estrógeno (ER) negativas, receptor de progesterona (PR) negativas, factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) positivas, y el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) positivas (3).
BT-20 es la línea celular de cáncer de mama más antiguamente establecida, sin embargo, no es la línea más comúnmente utilizada. Por el momento, la línea celular de cáncer de mama más ampliamente utilizado en todo el mundo es la línea celular MCF-7 (4). Fue establecida en 1973 por Soule y sus colegas de la Michigan Cancer Foundation, de donde se deriva su nombre. Las célilas MCF-7 fueron aisladas de la efusión plural de una mujer de 69 años de edad con enfermedad metastásica (5). Desde su creación, MCF7 se ha convertido en el modelo de cáncer de mama positivo para ER (6). El establecimiento de otras líneas celulares ha seguido, incluyendo los de otros tipos de cáncer de mama, como mutante BRCA, triple negativo, que sobreexpresan HER2, y los derivados de las células epiteliales mamarias normales como las células MCF-10A.
La evaluación de las líneas celulares existentes indica que la mayoría de las líneas celulares de cáncer de mama en uso se derivan de cáncer metastásico y no de otros fenotipos de cáncer de mama (7). De hecho, la tasa global de éxito del establecimiento de una línea celular es sólo el 10%.
La mayoría de las líneas celulares que existen en la actualidad se han derivado de derrame pleural en lugar provenir de tumores primarios y son principalmente líneas-ER (revisado en Lacroix y Laclercq, 2004). Esto es sorprendente, ya que cáncer de mama ER negativo sólo
- Conocer la expresión de galectina 3 y antígeno T mediante el empleo de las técnicas
de Inmunofluorescencia y citometría de flujo.
V. HIPÓTESIS
HIPÓTESIS ALTERNATIVA
Hay cambios en la cantidad de la expresión del antígeno T y galectina 3 en las células
MCF-7 cuando son estimuladas con lipopolisacáridos, con respecto a las células no
estimuladas.
HIPÓTESIS NULANo hay cambios en la cantidad de la expresión del antígeno T y galectina 3 en las células
MCF-7 cuando son estimuladas con lipopolisacáridos, con respecto a las células no
estimuladas.
VI. METODOLOGÍA
Materiales, reactivos y equipos a utilizar
- Campana de flujo laminar
- Incubadora con suministro de CO2
- Cronómetro
- Pipetas
- Puntas para pipetas
- Botellas con células MCF-7
- Placas de 16 pozos
- Medio DMEN con Suero Fetal Bovino
- Medio DMEN sin Suero Fetal Bovino
- Lipopolisacáridos [20ng/ml]
- Verseno
- Tripsina
MUESTRALas células MCF-7 que se utilizaron se obtuvieron del Centro de Investigación Facultad de Medicina UNAM-UABJO, las cuales se encuentran sembradas en botellas de 75 cm3 en el medio DMEN adicionado con glutamina y Suero Fetal Bovino al 10%.
PREPARACIÓN DE LAS CÉLULAS MCF-7
Se realiza el proceso de rasurado de las células MCF-7 (siempre y cuando las células presenten confluencia), las cuales se encuentran dentro de las botellas de cultivo; primeramente se saca el medio, posteriormente se le añade a la botella verseno 2 veces dejándolo actuar por un momento y después se le añade tripsina, se mezcla suavemente para lograr el desprendimiento de las células, posteriormente se incuba por 10 minutos.
Después del proceso de incubación se recupera el contenido de la botella donde se encuentran las células MCF-7, pasándolo a un tubo Corning: en seguida se le añade medio con suero fetal bovino a la botella y se guarda en la incubadora con suministro de CO2.
El tubo Corning se centrifuga a 2,000 r.p.m. por 2 minutos, luego se decanta el tubo y se recuperan el sedimento (células MCF-7), al cual se le agrega medio con SFB.
PREPACIÓN DE PLACAS PARA CITOQUÍMICA
Las células MCF-7 se siembran en placas de 12 pozos de fondo plano con la ayuda de una pipeta, encontrándose aproximadamente 200,000 células/pozo, en seguida se añade 1 ml del medio DMEN AL 10% a cada pozo. Se incuba la placa por 24 horas para que las células se peguen.
Deprivado celular. Cumplido ese lapso de tiempo, se le quita el medio con SFB que contienen los pozos, en seguida se lavan con PBS y se les agrega medio DMEN sin SFB, finalmente se guarda la placa. Este procedimiento se realiza de igual manera por 24 horas.
Estimulación, Una vez trascurridas las 24 horas, se le quita el medio DMEN sin SFB y se añade el estímulo que es lipopolisacárido a una concentración de 20 ng/ml, este proceso se realiza a 1, 3 y 5 horas por cada fila, además se deja una fila sin estimulación que son los pozos basales.
Después se fijan con p-formaldehído y se marcan con las lectinas y posteriormente se observan en el microscopio de fluorescencia.
TIPO DE ESTUDIO
Experimental y trasversal
VARIABLES
Id Variable Definicion operacional
Escala Codificación Tipo
TIEMPO Tiempo de estimulación de las céiulas MCF-7
Discretas Valor entero positivo
Explicativa
EXPRESIÓN
ANTÍGENO T
Expresión del antígeno con respecto al tiempo de estimulación (IF y citometría de flujo)
-Cualitativas ordinales
-Numericas
Discretas
Presencia-ausencia
Valor entero positivo
Respuesta
EXPRESIÓN GALECTINA 3
Expresión de la galectina con respecto al tiempo (IF y citometría de flujo)
-Cualitativas ordinales
-Numericas
Discretas
Presencia-ausencia
Valor entero positivo
Respuesta
BIBLIOGRAFÍA
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La glicosilación en el cáncer sufre cambios, sobre todo en los glicanos. Por lo que no hay todavía una justificación
algunos núcleos se encuentran enmascarados con la adición de otros azucares y una vez expuestos a la superficie, se forman nuevos antígenos que se asocian al cáncer como es el caso del cáncer de mama.
Por lo cual en este tema nos permitirá conocer cómo interactúan las células del cáncer de mama en relación a una persona que tiene ésta enfermedad y que además presenta una infección de tipo bacteriana, como también qué relación hay en cuanto a la expresión del ácido siálico.