フローラ解析による微生物汚染源の 迅速推定システムの活用と効果 アース環境サービス株式会社 総合分析センター センター長 猪野 毅
フローラ解析による微生物汚染源の 迅速推定システムの活用と効果
アース環境サービス株式会社
総合分析センター センター長 猪野 毅
サービス株式会社Earth Environmental Service Co.,Ltd.
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製品の微生物汚染源の迅速推定 システムの目的
同定せずに集団で存在する微生物をフローラ解析
により、製品の微生物汚染源や汚染経路を探索し
迅速かつ効率的に適切な対策を講じることで、製
品汚染クレームを削減する。
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製品の微生物汚染源の迅速推定 システム (1)
●ラピコムRapicom
大腸菌群(MACキット)・乳酸菌群(MALキット)
芽胞菌群(MABキット)
特長:工場検査室でも可能・滅菌ガーゼによる
拭き取り・増菌培養
埼玉県産業技術総合センター・コージンバイオ
(株)・アース環境サービス(株)の共同開発
経済産業省のサポイン事業支援
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製品の微生物汚染源の迅速推定 システム (2)
●ジェノゲート GENOGATE
DNAチップを用いたカビの遺伝子検査システム
「ラピコム」のカビバージョン
東洋製罐グループホールディングス(株)が開発
アース環境サービス(株)が採用
共同でバージョンアップを
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製品汚染源の迅速推定システム Rapicom (ラピコム)とは
Rapicom:
Rapidly detect a Contaminated Origin
by Microflora
(商標登録第5237105号)
大腸菌群用
MACキット
Rapicom®シリーズ専用培地
乳酸菌群用
MALキット
芽胞菌群用
MABキット
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バイオフィルム形成する主な細菌
≪食中毒起因菌≫ Salmonella Typhimurium Yersinia enterocolitica Listeria monocytogenes Escherichia coli
Staphylococcus aureus
≪腐敗微生物他≫ Alcaligenes faecalis Bacillus subtilis Enterobacter sp. Klebsiella pneumoniae Flavobacterium meningosepticum
Serratia marcescens Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus sp.
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「ラピコムRapicom」の特長 (1)
●バイオフィルムを考慮した「滅菌ガーゼ」による
サンプリングと増菌培養を採用
●4種類の専用培地キットを用いたフローラ
パターン解析
●同定検査が不要なため、汚染源・汚染経路の
推定が、検査から1ー3日で
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「ラピコムRapicom」の特長 (2)
●大掛かりな機器を必要としないため工場の
検査室でも可能
●清掃の重大管理ポイントが明確になることで
製造現場の負担も軽減
●製造現場でのデータベース構築で汚染予防
管理が可能に
●クレーム削減や資源の有効活用など経営
メリットも
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「ラピコムRapicom」の適用事例
●大腸菌群
ゆでめん・弁当惣菜・和洋菓子・冷凍食品・
魚肉練り製品・豆腐など
●乳酸菌群
食肉製品・惣菜・和洋菓子・豆腐など
●芽胞菌群
和菓子・発酵食品・惣菜・食品添加物・飲料・
医薬原料など
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「ラピコムRapicom」の活用場面
●微生物汚染源・汚染経路の推定による製品汚染対策
●洗浄消毒バリデーションや洗浄消毒計画の見直し
●製造現場での従業員教育・訓練のツール
●HACCPPプランの妥当性の確認 など
→微生物のクレームの削減や衛生管理の
レベルアップに寄与
DNAチップを利用した カビの一括同時検査
【東洋鋼鈑(株)社製:ジーンシリコン®】 高密度なDNA断片が配置
3 mm
64スポット
3mm
(プローブ)
DNAチップとは?
【弊社DNAチップの特徴】
シリコン基板表面にDLC (Diamond-Like Carbon) コーティング
・化学修飾が可能 → DNAが強固に結合
・炭素密度が高い → DNA固定化量が多い 高シグナル,低ノイズ →高感度な検出が可能
各スポットに、検出したいカビの特異的なDNA配列を配置 →色々な種類のカビを一括同時に検査することが可能
DNAチップによる一括同時検査
・従来の同定手順 (形態同定、シークエンス解析)
・DNAチップ検査
・形態同定
・シークエンス解析
AGGCTC・・
・DNAチップ解析
個々に検査
検体(5cfu)
一括で検査
【一括同時検査とは?】
DNA増幅& 蛍光標識 カビの一括回収
アカカビ、コウジカビを検出
培養
励起光
蛍光検出
3mm
アカカビ アオカビ
コウジカビ クロカビ
サンプリング DNA一括抽出
DNAチップと反応 (ハイブリダイゼーション)
DNAチップを拡大
DNA液を滴下
Before After
検出イメージ
レーザー光
DNAチップによる検査フロー
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ジェノゲートバージョンアップの特徴
東洋製罐GH(株)と共同で、検出対象菌種の
拡大に取り組む → ver.2.3に
●カテゴリーは13から32に、検査対象カビ種
が363種から637種に拡大
●好乾性II類・耐乾性II類・好湿性IV類を細分
●12カテゴリーを新規開発(耐熱性カビ・好冷
性カビ等追加)
●耐乾性3-aでByssochlamys fulva対象に
湿度 特性
分類 代表的なカビ種名 耐熱性 好冷性
カビ毒 産生 大 小 属 種
好乾性
1
a
Aspergillus
penicillioides
b restrictus
c vitricola
2 Eurotium herbariorum
3 Wallemia sebi
GENOGATEカビ検査用 [ver.2.3] カテゴライズ表
・好乾性
湿度 特性
分類 代表的なカビ種名 耐熱性 好冷性
カビ毒 産生 大 小 属 種
耐乾性
1
a
Aspergillus
flavus ○ ○
b fumigatus ○ ○
c ochraceus ○ ○
d niger ○ ○
e terreus ○ ○
f versicolor ○
2
a
Penicillium
expansum ○ ○
b implicatum
c glabrum ○
d citrinum ○ ○
3 a
Paecilomyces variotii ○
b lilacinus
GENOGATEカビ検査用 [ver.2.3] カテゴライズ表
・耐乾性
湿度 特性
分類 代表的なカビ種名 耐熱性 好冷性
カビ毒 産生 大 小 属 種
好湿性
1
a
Acremonium
butyri
b charticola
c strictum
2 Alternaria alternata
3 a
Arthrinium phaeospermum
b japonicum
4 Aureobasidium pullulans ○
5 Chaetomium globosum ○
6 Cladosporium cladosporioides ○
7 Curvularia lunata
8
a
Fusarium
solani ○
b graminearum ○
c oxysporum ○
9 Phoma exigua ○
10 Stachybotrys chartarum ○
GENOGATEカビ検査用 [ver.2.3] カテゴライズ表
・好湿性
例) 工場内のカビの菌叢をモニタリングしたい →工場の各ポイントで “5検体、50コロニー” のカビを検査
分離培養工程の省略可能 →
日数 (納期)
費用
2週間程度*
1ヶ月程度*
70万円以上
DNAチップ検査
DNAチップ検査
形態同定
形態同定
*:培養日数込み 25万円
迅速&低コストな理由
複数カビを一括検査 →
“迅速”
“低コスト”
特徴②、③: 迅速、低コスト
計323菌株の野生のコロニーにおいて、配列解析による同定結果に対する 形態同定およびDNAチップ検査の一致率を算出
・胞子未形成のカビも検査可能
高精度のカビ種識別性能
・マルチプレックスPCRを利用した「1菌種2領域*判定」の採用
高精度な理由
判定方法 配列解析との一致率
形態同定(従来法として) 88%
DNAチップ検査 92%
(*2領域・・・ リボソームRNA遺伝子ITS領域、β-tubulin領域)
④ 高精度
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DNAチップによるカビの一括検査 の活用法 (1)
《考え方》
●カビのスクリーニング検査である
●ラピコムのカビバージョンで対策重視の
システムである
例1.飲料(果汁)工場でカビ毒パツリンを産生す
るカビを確認したい
パツリン産生カビは「耐乾性2-a~d」に5種
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DNAチップによるカビの一括検査 の活用法 (2)
例2.問題(クレーム)の耐熱性カビのネオサルトリ
アがどこにいるのか調査したい
ネオサルトリアは「耐乾性1-b」に含まれている
例3.環境・工程にどのようなカビがいるか、製品
に問題を起こす可能性のあるカビがいるか
バイオバーデンの把握
危害分析
管理(洗浄消毒、保管方法など)の見直し
システムの活用と効果(まとめ)
ゆで麺、惣菜、豆腐、食肉製品 汚染源・汚染経路の特定
飲料、和洋菓子などの食品 洗浄消毒バリデーション
医薬原料など、とくに加熱工程 HACCP プランの検証
を含む製品で採用。包材でも。 従業員教育などに活用。
効果的な対策で製品クレームの削減や衛生管理の向上に寄与
今後ともシステムのバージョンアップと精度向上に努め、製造事業所
での微生物管理体制の充実化とクレーム削減に大いに寄与したい。
参考文献 ●富永達矢、猪野毅、大川三郎、関根正裕:マイクロフロ-ラ解析に よるアドバンスドサニタリ-システムの開発、食品工業、Vol.51 No.16,pp27-33(2008) ●吉田充裕:DNAチップを利用したカビの一括検査法、食品と開発 Vol.47,No.1 (2011) ●アース環境サービス(株)・東洋製罐グループホールディングス (株):短時間・低コスト・高精度で微生物汚染状況を一括検査 月刊HACCP、Vol.19,No.5,pp40-43(2013) ●アース環境サービス(株)・東洋製罐グループホールディングス (株):クレームの原因対策で技術協力、月刊食品工場長、Vol. 17,No.1,pp44-45(2013) ●アース環境サービス(株)・東洋製罐グループホールディングス (株):GENOGATE(ジェノゲート)の視点で探るカビの分類と対 策のポイント、月刊食品工場長、Vol.17,No.4,pp26-27(2013) ●猪野毅:微生物汚染源の迅速推定システム「ラピコム」、クリー ンテクノロジー、Vol.23,No.8,pp70-73(2013)
●猪野毅:微生物汚染源迅速推定システムを活用した製品へのカビ汚
染防止対策、ジャパンフードサイエ ンスVol.53、No.4、pp65-70
(2014)
●アース環境サービス㈱:微生物汚染源の迅速推定システム,微生物
の簡易迅速検査法、p699、㈱テクノ システム,(2013)
●東洋製罐グループホールディングス㈱:遺伝子検査システム
GENOGATE:ジェノゲート(受託検査)、微生物の簡易迅速検査法、
p720、㈱テクノシステム (2013)
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ジェノゲート活用に関する詳細情報
●月刊食品工場長
2014年7-9月号
カビ汚染対策として
仮説、計画~検査、対策立案~対策、検証
●月刊HACCP
2014年7月号
衛生検査・点検を現場改善に活用
危害分析に利用
現場の声を吸い上げるしくみ
現場からの情報源
工場内危害地図の作成
アンケート例 1.清掃しにくいところはどこですか。
2.清掃できない所はどこですか。
3.製造ラインで溶接部分はありますか。
それはどこですか。
4.製造ラインの上(高所)で、ほこりがたまりやすいところはありますか。
それはどこですか。
5.塗装がはげたり、さびがついたりしているところはありますか。
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これからの総合的衛生管理
工場での衛生管理のニーズの多様化に対応 ・品質保証システム(HACCP・GMP・ISO)導入 ・製品事故、クレームの削減 ・作業者の衛生意識レベルの向上 ・検査の精度向上と自主検査態勢の充実化 など 汚染源など危害ポイントの抽出(バイオバーデン) 作業の簡素化・標準化・効率化・迅速化の推進 データの信頼性の確保(不確かさの要因の排除) 潜在的危害への予防管理
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まとめ ●製造事業所の衛生管理
キーワード:「科学的根拠」・「再現性」・「現場主義」
●微生物管理・検査
キーワード:「量レベル(菌数)」から「質レベル(危害菌)」
フローラ解析による製品の微生物汚染源迅速推定システム
●ラピコム
●ジェノゲート の活用をお奨めします。
ご清聴ありがとうございました。