DYNAMOF : un programme pour l'analyse dynamique de données de relaxation obtenues à champs magnétiques multiples

DYNAMOF : un programme pour l’analyse dynamique de donnéesde relaxation obtenues à champs magnétiques multiples

Philippe Barthe, Virginie Ropars, Christian Roumestand *

Centre de biochimie st ructurale, UMR CNRS 5048–Inserm 554–UMI, faculté de pharmacie, 15, avenue Charles-Flahault, BP 14491,34093 Montpellier cedex 05, France

Reçu le 5 avril 2005 ; accepté le 13 juin 2005

Disponible sur internet le 31 août 2005

Résumé

Cet article décrit un programme écrit en langage MATLAB utilisable pour l’analyse dynamique de données de relaxationenregistrées à différentes valeurs d’induction magnétique B0. Suivant l’approche de l’échantillonnage réduit des densités spec-trales — fondée sur l’approximation des hautes fréquences — ce programme calcule les valeurs des densités spectrales J(0),J(xX) et < J(xH) > à partir des vitesses de relaxation hétéronucléaire (15N ou 13C) R1, R2 et de la valeur du NOE hétéronu-cléaire. Un ajustement des densités spectrales avec différentes variantes du modèle de Lipari–Szabo est alors proposé, permet-tant l’obtention des paramètres du mouvement (temps de corrélation et paramètres d’ordre) ainsi que de la contribution d’échangeRéch. Le choix du modèle approprié peut alors être réalisé par une analyse statistique (test du v2, F-test). Un exemple d’applica-tion est donné sur l’analyse de données de relaxation 15N mesurées à 9,4, 11,75 et 14,1 Tesla (correspondant à des fréquencesprotons de 400, 500 et 600 MHz) sur la protéine P13MTCP1. Pour citer cet article : P. Barthe et al., C. R. Chimie 9 (2006).© 2005 Académie des sciences. Publié par Elsevier SAS. Tous droits réservés.

Abstract

DYNAMOF: a program for the dynamics analysis of relaxation data obtained at multiple magnetic fields. Thismanuscript describes a MATLAB program devoted to the analysis of relaxation data obtained at different values of magneticinduction B0. Using Reduced Spectral Density Mapping (based on the High-FrequencyApproximation), J(0), J(xX) and < J(xH) >are calculated from heteronuclear (15N ou 13C) R1, R2 relaxation rates and heteronuclear NOE ratio values. In order to obtain themotion parameters (correlation times and order parameters), spectral densities are then fitted with the different variants of theLipari–Szabo model. Then, the choice of the right model can be chosen through a statistical analysis (v2, F-test). As an applica-tion, the dynamics analysis of the 15N relaxation data obtained at 9.4, 11.75 and 14.1 Tesla (corresponding to proton frequenciesof 400, 500 and 600 MHz) on the protein P13MTCP1 is given. To cite this article: P. Barthe et al., C. R. Chimie 9 (2006).© 2005 Académie des sciences. Publié par Elsevier SAS. Tous droits réservés.

Mots clés : Relaxation hétéronucléaire ; Analyse dynamique ; Modèle de Lipari–Szabo ; MATLAB

Keywords: Heteronuclear relaxation; Dynamics analysis; Lipari–Szabo model; MATLAB

* Auteur correspondant.Adresse e-mail : [email protected] (C. Roumestand).

C. R. Chimie 9 (2006) 503–513

http://france.elsevier.com/direct/CRAS2C/

1631-0748/$ - see front matter © 2005 Académie des sciences. Publié par Elsevier SAS. Tous droits réservés.doi:10.1016/j.crci.2005.06.023

1. Introduction

L’utilité de l’analyse de la dynamique interne desmacromolécules biologiques pour la compréhension desprocessus impliqués dans leurs mécanismes d’actionn’est plus à démontrer. De ce fait, les mesures de relaxa-tion hétéronucléaire — plus spécialement celles desnoyaux 15N — se sont particulièrement développéesau cours de cette dernière décennie (pour une revuerécente, voir : [1]). L’analyse de ces données en termesde dynamique interne peut se faire par différentesapproches, allant de l’interprétation directe de l’alluredes fonctions de densités spectrales (Spectral densitymapping) [2–6], jusqu’à une analyse plus élaborée pardivers formalismes, permettant l’obtention des paramè-tres du mouvement. Dans cette dernière approche, leformalisme de Lipari–Szabo (Model Free) [7] est pro-bablement le modèle le plus populaire et le plus utilisé.La relevance des résultats obtenus par cette approcherepose néanmoins sur la qualité et la quantité des don-nées expérimentales recueillies (R1, R2 et NOE hétéro-nucléaires, en général). Bien que relativement simple,l’ajustement du modèle aux données expérimentalessera d’autant plus précis et fiable que les données expé-rimentales fournies seront plus nombreuses, surtoutdans le cas de mouvements complexes nécessitantl’ajustement de nombreux paramètres (modèle de Lipa-ri–Szabo étendu) [8,9]. De ce fait, une analyse des don-nées de relaxation mesurées à plusieurs intensités dechamp magnétique paraît être une approche souhaita-ble [10,11]. Nous présentons ici un programme MAT-LAB (DYNAMOF, pour DYNamics Analysis withMOdel-Free) permettant l’analyse de telles données.Ce programme permet de calculer les densités spectra-

les réduites J(0), J(xN) et < J(xH) > à partir des don-nées expérimentales précitées, puis de les ajuster avecle(s) formalisme(s) de Lipari–Szabo. Nous présente-rons un exemple d’application sur des données derelaxation mesurées à trois inductions B0 différentessur la protéine oncogène P13MTCP1 [12,13].

2. Matériels et méthodes

Théorie : quand la relaxation d’un hétéronoyau Xdépend essentiellement de l’interaction dipolaire avecun proton directement lié et de l’anisotropie de sondéplacement chimique, les données de relaxation peu-vent être interprétées en termes de mouvement du vec-teur X–1H [14]. Sachant que les trois paramètres derelaxation mesurés expérimentalement (RX(Xz) ou R1,RX(Xxy) ou R2, et X{1H}NOE) dépendent des valeursdes fonctions de densité spectrale à cinq fréquences dif-férentes [2,3], le calcul des densités spectrales peut êtreapproché par l’approximation des hautes fréquencespermettant un échantillonnage « réduit » de la fonctionde densité spectrale. L’approximation des hautes fré-quences implique une quasi égalité des valeurs des den-sités spectrales à haute fréquence (J(xH – xN)≈ J(xH + xN) ≈ J(xH) = < J(xH) >, ce qui impose untemps de corrélation relativement important (> 1 ns) etdes valeurs d’inductions de champ magnétique relati-vement élevées pour réaliser les mesures de relaxation(en général ≥ 9,4 T). Ces conditions sont généralementréalisées lors de l’étude de la dynamique interne d’uneprotéine en solution. Si ces conditions sont réunies, lesvitesses de relaxation sont directement traduites en den-sités spectrales à trois fréquences [4–6] par la relation :

(1)�J(0)

J(xX)

J(xH)� =�

−3

4(3d2 + c2)

3

2(3d2 + c2)

−9

10(3d2 + c2)

1

(3d2 + c2)0

− 7

5(3d2 + c2)

0 01

5d2

� × �RX(Xz)

RX(Xx ,y)

RX(H z → X z)�

dans laquelle d2 = � l0

4 p�2� h cH cX

4 p rXH3 �2

et c2=1

3(cX B0)2(Dr)2

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où µ0 est la perméabilité du vide, h la constante dePlanck, cH (2.6752 × 108 rad T−1 par seconde) le rap-port gyromagnétique du proton, cX les rapports gyro-magnétiques des noyaux X (2.711 × 107 et6.726 × 107 rad T−1 par seconde pour 15N et 13C, res-pectivement), xH et xX les fréquences de Larmor 1H etX, et rXH la distance internucléaire X–1H (1,02 et 1,07 Åpour 15N–1H et 13Ca–1H, respectivement), B0 l’inten-sité du champ magnétique, et Dr la différence entre lescomposantes parallèles et perpendiculaires du tenseurde déplacement chimique de symétrie axiale (–170 ppmpour 15N [15], 25 ppm pour 13Ca [22]). La vitesse decorrélation croisée RX(Hz→Xz) entre le noyau X et leproton lié est corrélée au NOE hétéronucléaire et cal-culée par la relation : NOE = 1 + (cH/cX) RX

(Hz→Xz)/RX(Xz). La fréquence de la densité spectralemoyenne < J(xH) >, a été prise égale à 0,87 xH [16].

Cette approche, dite de « cartographie », de la fonc-tion de densité spectrale permet de juger rapidementde la dynamique interne de la protéine. En effet, uneprotéine en solution est soumise aux lois de la thermo-dynamique : elle représente un système à l’équilibredont l’énergie est conservée. Cela se traduit par laconservation de la quantité de mouvement pour cha-cun des vecteurs (15N–H ou 13C–H) caractéristiques dechacun de ses résidus, et donc la conservation de l’airesous la courbe des fonctions de densité spectrale pro-pres à chacun de ces vecteurs (voir Fig. 2). Ainsi, leszones flexibles de la protéine sont caractérisées par desvaleurs faibles de J(0) (fréquence représentative desmouvements lents), contrebalancées par des valeurs éle-vées de < J(xH) > (fréquence représentative des mou-vements rapides). À l’inverse, les zones rigides présen-tent des valeurs élevées de J(0) et faibles de < J(xH) >.Certains résidus peuvent déroger à cette règle à caused’une contribution adiabatique à leur relaxation, géné-ralement apportée par des phénomènes d’échange chi-mique ou conformationnel s’établissant sur une échellede temps supérieure à celle du temps de corrélation dela molécule (µs–ms). Bien que parfaitement rigou-reuse, cette analyse des fonctions de densité spectralen’apporte qu’une information qualitative sur la dyna-mique de la protéine étudiée : aucune information surles échelles de temps caractéristiques des mouvementsqui animent chaque résidu ne peut être obtenue. Néan-moins, elle peut être facilement complétée par l’utili-sation d’un modèle de mouvement permettant d’ajus-ter aux mieux les densités spectrales des différents

vecteurs. L’approche model-free de Lipari et Szabo [7]peut être ainsi utilisée pour ajuster les valeurs expéri-mentales des fonctions de densités spectrales et obtenirles paramètres du mouvement. Du fait de la différenceimportante de leur domaine de temps respectif, ce for-malisme fait l’hypothèse d’une contribution indépen-dante du mouvement global (ou des mouvements glo-baux) et des mouvements internes à la fonctiond’autocorrélation des vecteurs X–1H. Pour une pro-téine qui se réoriente de façon isotrope, on obtient :

(2)J(x) =

2

5{S2 sc

1 + (x sc)2 + (1 − S2)

s

1 + (x s)2

où sc est le temps de corrélation global du vecteurX–1H, s la somme harmonique des temps decorrélation global et interne (rapide) relatif à chaquerésidu : s−1 = sc

−1 + sf−1. Les mouvements rapides

internes sont caractérisés par le paramètre d’ordregénéralisé S2, relié aux amplitudes relatives de cesmouvements et variant entre 0 (mouvement noncontraint) et 1 (absence de mouvement), et le temps decorrélation sf.

Pour certains résidus, l’équation [2] s’avère insuffi-sante pour ajuster les valeurs expérimentales des den-sités spectrales : cela notamment pour des résidus quiprésentent des mouvements internes sur un domainede temps proche de 1 ns. Dans ce cas, l’expression dela fonction de densité spectrale est étendue à [8,9] :

(3)

J(x) =2

5�Sf2 Ss

2 sc

1 + (x sc)2 + S f

2 (1 − S s2)

s

1 + (x s)2

+ (1 − S f2)

s ′

1 + (x s ′ )2�où s−1 = sc

−1 + ss−1 et s′−1 = sc

−1 + sf−1. Sf

2 et Ss2 sont

respectivement les carrés des paramètres d’ordrepartiel pour les mouvements internes rapides (sf,échelle de la picoseconde) et lents (ss, échelle de lananoseconde). Le carré du paramètre d’ordregénéralisé S2, defini comme Sf

2Ss2, constitue une

mesure de l’amplitude totale des mouvements internes.En général, on peut négliger la contribution desmouvements internes les plus rapides, si bien quel’expression de la fonction de densité spectraledevient :

(4)J(x) =2

5�Sf2 Ss

2 sc

1 + (x sc)2 + S f2 (1 − Ss

2)s

1 + (x s)2�

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Enfin, certains résidus présentent des valeurs de J(0)anormalement élevées, signant la présence d’une contri-bution adiabatique à la fonction de densité spectrale.Cette contribution est due à la présence de mouve-ments sur une échelle de temps allant de la micro- à lamilliseconde (plus lent que le temps de réorientationde la molécule), généralement reliés à un échangeconformationnel et essentiellement perçus par la mesurede R2. Pour de tels résidus, la valeur de J(0) doit êtrecorrigée de cette contribution d’échange (Réch) avantd’ajuster la fonction de densité spectrale par le modèlede Lipari–Szabo. Cette correction peut être apportéegrâce à une relation linéaire existant entre la valeur de2 R2 – R1 et les fréquences de Larmor hétéronucléairesxX

2 [17,23] :

(5)2 R2 − R1 = d2� J(0) +3

2J(xH)� + � 4 c2

9J(0) + 2φ�xX

2

la valeur du facteur d’échange φ (Réch = φ xX2 [Eq.

(6)]) est obtenue d’après la valeur de la pente. Lavaleur de J(0) peut alors être corrigée en utilisant larelation :

(7)J(0)obs = J(0)cor+kφxX2

où k est un facteur d’échelle dépendant de la fréquencede mesure et égal à (3/2) [1/(3 d2 + c2)]. Alternati-vement, la valeur de φ peut être obtenue parl’ajustement direct de la fonction de densité spectralepar le modèle de Lipari–Szabo, en utilisant la fonctionsuivante pour J(0), obtenue en combinant les équations[2] et [7] :

(8)J(0) =2

5� Sf

2sc + � 1 − Sf2 �s � + kφxX

2

La complexité croissante de ces différents modèlesentraîne une augmentation très significative du nombrede paramètres permettant leur description. Ainsi, géné-ralement deux paramètres sont à ajuster pour une ana-lyse avec le modèle de Lipari–Szabo simple, contre trois— voire quatre ! — avec le modèle de Lipari–Szaboétendu. Or, les données de relaxation classiquementenregistrées à un seul champ magnétique ne permet-tent d’obtenir que seulement trois valeurs de densitéspectrale : J(0), J(xN) et <J(xH)>.

Le problème devient très vite sous-estimé (du moinspartiellement), et le recours à un meilleur échantillo-nage de la fonction densité spectrale nécessaire. La

simulation reportée sur la Fig. 1 montre bien qu’en effet,si l’analyse à une fréquence est suffisante pour détecterla contribution d’un mouvement interne au mouve-ment global d’un vecteur, seul le recours à une analyseà plusieurs fréquences est capable de révéler la relativecomplexité de ce mouvement interne.

Le programme DYNAMOF présenté dans ce manus-crit utilise cette stratégie pour analyser les données derelaxation enregistrées à plusieurs intensités de champmagnétique. Une procédure de type SIMPLEX a étéadoptée pour ajuster les valeurs de densités spectralesexpérimentales aux différentes variantes du modèle deLipari–Szabo, dont la convergence est assurée par laminimisation d’un v2 calculé entre les valeurs expéri-mentales et les valeurs théoriques obtenues avec les dif-férents modèles. Le choix du modèle pertinent se feraensuite en comparant les valeurs de v2 obtenues pourles différents ajustements grâce à un test de Fischer–Snedecor (F-test).

Mesures expérimentales : Les expériences de RMNont été réalisées à 9,4, 11,75 et 14,1 Tesla sur des spec-tromètres Bruker Avance 400, 500 et 600 équipés desondes 5 mm triple résonance 1H–13C–15N munies degradient-z, et sur un échantillon de protéine P13MTCP1

uniformément enrichie en 15N dissoute à une concen-tration de 1 mM dans 500 µl de tampon Tris-HCl 10 mMpH 7,0 (5% 2H2O pour le lock). La température demesure a été soigneusement calibrée à 20 °C sur cha-cun des spectromètres. Les séquences d’impulsions uti-lisées pour déterminer les valeurs des vitesses de relaxa-tion 15N RN(Nz) (R1), RN(Nxy) (R2), et de 15N{1H}NOEsont similaires à celles déjà décrites [2,3], et les para-mètres expérimentaux utilisés ainsi que le traitementdes données ont déjà été reportés en détail pour d’autresprotéines étudiées au laboratoire [13,18]. La vitesse derelaxation longitudinale 15N (RN(Nz)) a été obtenue àpartir de dix expériences d’inversion–récupération, avecdes délais de relaxation allant de 18 à 1026 ms. Lavitesse de relaxation transverse 15N (RN(Nxy)) a étéobtenue à partir de dix expériences CPMG, avec desdélais de relaxation allant de 16 à 144 ms. La valeur duNOE hétéronucléaire 15N{1H} a été déterminée à par-tir du rapport de deux expériences réalisées avec et sansprésaturation des protons. Les spectres RMN ont ététraités à l’aide du logiciel Gifa (version 4.4) [21]. Lerésultat de ces mesures expérimentales est reporté surla Fig. 2.

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3. Résultats

La Fig. 3 présente l’organigramme général du pro-gramme DYNAMOF. Le programme débute en deman-dant un suffixe (par exemple out), qui sera attribué àtous les fichiers de sortie (fichier out) créés lors de sonutilisation. Après avoir offert la possibilité de changeren cours d’utilisation certaines valeurs de constantesentrées en valeurs par défaut (Dr, valeurs de départ uti-lisées dans les procédures SIMPLEX...), l’utilisateurdoit entrer le type de noyau utilisé pour l’analyse (15Nou 13C), puis le nombre de champs magnétiques utili-sés. Après avoir laissé le choix entre l’analyse classi-que (Spectral density mapping) et celle récemment pro-posée par Roumestand et al. (Fast spectral densitymapping, soumis à publication) que nous ne dévelop-perons pas ici, l’utilisateur doit entrer les différentesfréquences de mesures protons en ordre croissant (400,500, puis 600) ainsi que le nom générique (gnam) desfichiers d’entrée correspondant à ces fréquences demesure. Ces fichiers d’entrée consistent en trois fichierstextes pour chaque fréquence de mesure (R1, R2 et NOE(I/I0)), correspondant aux fichiers directement obtenuspar l’analyse des données RMN par le module « Relaxa-tion » du programme de traitement des données Gifa 4[21]. Ces fichiers sont des tableaux à trois colonnes,chacune contenant respectivement le numéro du résidu(position dans la séquence), la valeur du paramètre derelaxation, et l’erreur mesurée sur ce paramètre. À cha-cun de ces fichiers, on attribue un suffixe (en général lafréquence de mesure) qui constituera son nom généri-que (par exemple : R1_400, R2_400 et NOE_400 cor-respondent aux mesures de relaxation effectuées surP13MTCP1 à 400 MHz (generic name = 400)). Pour cha-que fréquence, le programme calcule les valeurs desdensités spectrales réduites en utilisant l’équation (1)ainsi que les erreurs correspondantes, qui seront stoc-kées dans deux fichiers sortie différents (par exemple :J 400.out et dJ 400.out). Une sortie graphique repor-tant, pour chaque champ de mesure, les valeurs de den-sités spectrales réduites en fonction de la séquence dela protéine permet d’apprécier rapidement la qualité desdonnées (Fig. 4).

Fig. 1. Les valeurs de densité spectrale réduite reportées sur cettefigure ont été calculées pour cinq inductions de champ magnétiquedifférentes (correspondant à des fréquences protons de 400, 500, 600,700 et 800 MHz) avec le modèle de Lipari–Szabo étendu (équation[3] : sc = 10 ns, ss = 0,3 ns, sf = 3 ps, Sf = Ss = 0,5). Elles décrivent lemouvement complexe d’un vecteur tel que celui formé par exemplepar le groupement 15N–H d’un résidu dans une protéine en solutionanimée d’un mouvement Brownien global (sc = 10 ns, concevablepour une protéine d’environ 10 kDa), et porté par un segment pepti-dique animé d’un mouvement interne complexe (également diffu-sif), peu contraint (S2 = 0,25), et comprenant deux composantes carac-térisées par les temps de corrélation ss = 0,3 ns, sf = 3 ps. Cesdifférents mouvements sont répartis sur des échelles de temps trèsdifférentes et peuvent être considérés comme non corrélés. Seulesles valeurs à 600 MHz (a) ou la totalité de ces valeurs de densitéspectrale (b) ont été ajustées avec le modèle « sphère rigide »

(J(x) = 2/5{sc/(1 + (x sc)2}) (courbe noire), le modèle de Lipari–

Szabo [éq. (2)] et le modèle de Lipari–Szabo étendu [éq. (4)]. Si letemps de corrélation sc représente la variable ajustable dans le cas dumodèle rigide, sa valeur a été fixé à 10 ns lors des ajustements avecles différentes variantes du modèle de Lipari–Szabo.

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À partir de cette étape, le programme propose decorriger les valeurs de J(0) d’une éventuelle contribu-tion d’échange. Si l’utilisateur accepte ce choix, le fac-teur d’échange φ sera calculé par régression linéaireen utilisant l’équation [5] : un affichage graphique desdonnées pour chaque résidu est proposé (Fig. 5a), puisle programme va afficher la valeur de φ en fonction dela séquence (Fig. 5b) et créer deux fichiers (PHI_R.outet Rex_R.out), correspondant l’un aux valeurs de φ parrésidu, l’autre aux valeurs de Réch calculées à partir deφ [éq. (6)] pour chaque champ de mesure. Les erreurssur φ seront calculées par une procédure Monte-Carlo(nombre d’itérations choisies par l’utilisateur). Lefichier PHI_R.out contient également les valeurs corri-gées de J(0) (et dJ(0)) : ces valeurs sont introduites dansdeux nouveaux fichiers, contenant les valeurs de den-sités spectrales et les erreurs correspondantes : J_gnam-corR.out et dJ_gnamcorR.out (ex J_400corR.out etdJ_400corR.out pour la fréquence 400 MHz). Ce sontdès lors ces fichiers qui seront utilisés par défaut pourl’ajustement avec les différents modèles de mouve-ment.

Cette étape de calcul (et éventuellement de correc-tion) des fonctions densités spectrales effectuées, le pro-gramme va débuter l’ajustement des données avec lesdifférents modèles de mouvement décrits dans la par-tie Matériel et méthodes. En premier lieu, le pro-gramme va demander à l’utilisateur de choisir entre unajustement « local » (un sc par résidu) ou « global » (lemême sc pour tous les résidus de la protéine) des don-nées : l’ajustement local des données peut s’avérer judi-cieux lorsque la protéine présente des domaines avecdes comportements dynamiques très différents, ou lors-que la réorientation de la protéine en solution ne peutplus être considérée comme isotrope [11,19,20].• Ajustement Local (une valeur de sc par résidu).

Avant de démarrer la procédure d’optimisation, leprogramme offre encore à l’utilisateur la possibilitéd’ajuster la contribution d’échange (φ: Eq. (8)) si lacorrection proposée à l’étape précédente n’a pas été

Fig. 2. Vitesses de relaxation hétéronucléaire 15N (de haut en bas)R2, R1 et {1H,15N}NOE (I/I0) en fonction de la séquence de la pro-téine P13MTCP1. Ces paramètres de relaxation ont été mesurés à 400(symboles noirs), 500 (symboles rouges) et 600 MHz (symbolesbleus). Les valeurs de R1 et R2 ont été obtenues pour chaque acideaminé à partir de la décroissance mono-exponentielle de l’intensitédu pic de corrélation 1H–15N correspondant sur les expériences hété-ronucléaires 2D classiques (voir § Matériel et méthodes).

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réalisée : les paramètres sc, sf, S2 et éventuellementφ seront alors obtenus résidu après résidu par ajus-tement des 2 n + 1 (n étant le nombre de champsmagnétiques utilisés) valeurs expérimentales de den-sité spectrale (J(0), J(40), J(50), J(60), < J(400) >,< J(500) > et < J(600) > dans le cas de p13MTCP1)par le modèle de Lipari–Szabo (Eq. (2), légèrementmodifiée : la contribution haute fréquence au mou-vement est supposée indépendante de la fréquenceet, de ce fait, x s négligé [11]). Une sortie graphi-que est proposée pour chaque résidu, permettantd’apprécier la qualité de chacun des ajustements.Deux fichiers sont créés à la fin de la procédure,contenant le résultat de chacun des ajustements(LOCAL.out, optimisation de sc, sf et S2–LOCA-LREX.out, optimisation de sc, sf, S2 et φ). Un v2

expérimental est calculée pour chaque modèle etpour chaque résidu, dont le résultat est égalementcontenu dans le fichier correspondant : ces valeursde v2 pourront être utilisées pour sélectionner lemodèle optimum grâce à une analyse statistique.Enfin, un calcul de type Monte-Carlo va permettrede déterminer les erreurs sur chacune des variables(nombre d’itérations choisi par l’utilisateur) : ces

erreurs seront contenues dans deux fichiers « défi-nitifs », à côté des valeurs des variables sc, sf, S2 etφ (LOCAL_MC.out et LOCALREX_MC.out).Cette étape crée également deux fichiers supplémen-taires contenant pour chaque résidu les valeurs de v2

obtenues après chaque itération et ce pour chacundes deux modèles (v2_CAN_MC.out et v2_CAN-REX_MC.out). Ces fichiers pourront être utiliséspour une analyse statistique plus poussée (en coursd’implémentation dans le programme).

• Ajustement global (une valeur de sc commune àtous les résidus). Dans une première étape, le pro-gramme va tenter de déterminer la valeur communedu sc en ajustant résidu par résidu les valeurs desdensités spectrales expérimentales par le modèle deLipari–Szabo [Eq. (2)] et en tentant d’optimiser pourchaque résidu les valeurs de sc, sf et S2. Une sortiegraphique est proposée pour chaque résidu, permet-tant d’apprécier la qualité de l’ajustement (Fig. 6a).En fin de procédure, un fichier LS3.out est créé,contenant les résultats de l’ajustement pour chaquerésidu. La terminologie LS3 signifie que ce fichier aété obtenu à partir du modèle de Lipari–Szabo (LS),en optimisant trois paramètres : sc, sf et S2. Une sor-

Fig. 3. Organigramme général du programme DYNAMOF.

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tie graphique présente les valeurs de sc en fonctionde la séquence et propose une valeur moyenne (± 2r)utilisable comme valeur de sc « global » (Fig. 6b).Cette valeur de sc pourra être alors utilisée commeconstante dans le reste de la procédure qui va consis-ter à ajuster les 2 n + 1 valeurs expérimentales dedensités spectrales avec le modèle de Lipari–Szabosimple [Eq. (2)] (LS2, deux variables à optimiser :sf et S2), le modèle de Lipari-Szabo simple avec

contribution d’échange [Eq. (2) et (8)] (LSREX, troisvariables à optimiser : sf, S2 et φ), et les modèles deLipari–Szabo étendus [Eq. (3) et (4)] (LSE3, troisvariables à optimiser : S2

s, S2f et ss – LSE4, quatre

variables à optimiser : S2s, S2

f, ss et sf). Comme pré-cédemment, une sortie graphique est proposée résidupar résidu, permettant de juger la qualité de l’ajus-tement par chaque modèle (Fig. 7). Quatre fichierssont alors créés (LS2.out, LSREX.out, LSE3.out etLSE4.out), contenant les résultats obtenus avec lesmodèles respectifs. Tout comme pour l’approche« locale », un v2 expérimental est calculée pour cha-que modèle et pour chaque résidu, dont le résultatest également contenu dans le fichier correspon-dant : ces valeurs de v2 pourront être utilisées poursélectionner le modèle optimum grâce à une ana-lyse statistique. De même, les erreurs sur chacun desparamètres peuvent alors être calculées par une pro-cédure Monte-Carlo (l’utilisateur choisit le nombred’itérations) : cette étape conduira à la création dequatre nouveaux fichiers contenant à la fois lesvaleurs des paramètres optimisés et les erreurs cal-culées sur ces paramètres (LS2_MC.out,LSREX_MC.out, LSE3_MC.out et LSE4_MC.out).De même, quatre fichiers (correspondant aux quatremodèles) seront créés contenant les valeurs de v2

Fig. 4. Représentation graphique du résultat du calcul des densitésspectrales à partir des données de relaxation R1, R2 et NOE obtenuesà 400 MHz (gnam : 401) sur la protéine P13MTCP1 [Eq. (1)].

Fig. 5. (a) Obtention du facteur d’échange φ par régression linéaireà partir de l’équation [5] (résidu 97). (b) Facteur d’échange φ enfonction de la séquence de la protéine P13MTCP1.

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obtenues à chaque itération du calcul de Monte-Carlo pour chaque résidu (v2_LS2_MC.out,v2_LSREX_MC.out, v2_LSE3_MC.out,v2_LSE4.out) : ces derniers seront utilisés pour uneanalyse statistique plus poussée qui est en coursd’implémentation dans le programme.On notera que chaque fois qu’un ajustement par un

modèle est effectué, que ce soit dans la procédure« locale » ou « globale », un fichier contenant les valeursdes densités spectrales théoriques (et, après un calculMonte-Carlo, un fichier contenant les erreurs sur lesdensités spectrales théoriques) est créé, du type Jtheo-_nomdumodèle.out (ou jtheo_nomdumodele_MC.out,

dJtheo_nomdumodele_MC.out). Ces fichiers pourrontêtre également utilisés dans une analyse statistique.

4. Discussion

Le programme décrit dans ce manuscrit permetd’analyser des données de relaxation enregistrées à uneou plusieurs intensités de champ magnétique B0. Il aété écrit en langage MATLAB (version 4.2c.1) sur unordinateur MacIntosch (MacOS9) : la portabilité de celangage le rend utilisable sur tout autre type de plate-forme et système d’exploitation (MacOS X, Windows,Linux, UNIX). Une version en langage OCTAVE a ététesté notamment sur des données de relaxation mesu-rées à trois intensités de champ magnétique sur la pro-téine P13MTCP1 : les résultats de l’analyse dynamiquesont présentés sur la Fig. 8. Pour cette protéine relati-vement globulaire et de symétrie quasi-sphérique,l’approche « globale » (une valeur de sc commune àtous les résidus) est pertinente. Notre analyse nous apermis de déterminer un temps de corrélation globalde 10,4 ns, compatible avec la taille de la protéine(107 résidus, 13 kDa) et la température à laquelle ontété réalisées les mesures (20 °C). Elle montre égale-ment des mouvements internes relativement contraintsdans le tonneau b (modèle LS2), alors que la longueboucle, qui relie les deux motifs de feuillet b consti-

Fig. 6. (a) Ajustement des valeurs de densité spectrale obtenues pourle résidu 46 de la protéine P13MTCP1 par le modèle LS3 (voir texte) ;ces valeurs sont reportées sur un axe arithmétique (gauche) ou loga-rithmique (droite). (b) Valeurs de sc en fonction de la séquence. Laligne verte représente la valeur moyenne du sc calculée sur les rési-dus représentés en cercles verts (sc ± 2 r).

Fig. 7. Ajustement des valeurs de densité spectrale calculées pour lerésidu 39 de la protéine P13MTCP1 par les différents modèles propo-sés dans l’approche « globale » (LS2, LSREX, LSE3, et LSE4) (voirtexte) ; les valeurs de densité spectrale sont reportées sur un axe arith-métique (gauche) ou logarithmique (droite).

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tuant le tonneau, est animée par des mouvements inter-nes relativement complexes, avec des temps de corré-lation proches de la nanoseconde (modèle LSE3,l’utilisation du modèle LSE4 n’apportant pas une amé-lioration statistiquement significative de l’ajustement).De tels mouvements ont été également identifiés surl’une des deux boucles « plissées » qui émergent surune face du tonneau b. Comme le montrait déjà la rela-tive dispersion des valeurs de J(0), des contributionsd’échange significatives ont été mesurées pour de nom-breux résidus, répartis sur des zones bien particulièresde la protéine : une face du tonneau b, autour de l’héliceprésente dans la longue boucle, sur l’autre boucle « plis-sées » émergeant du tonneau b... Des valeurs similaires

pour ces contributions d’échange ont été obtenues parcorrection des valeurs de J(0) [17] ou par ajustementdirect des valeurs expérimentales (modèle LSREX).

Si des résultats similaires peuvent être obtenus enanalysant les données de relaxation obtenues à une seulefréquence de mesure (résultats non montrés), l’analyseà plusieurs fréquences permet une bien meilleure dis-crimination entre les différents modèles par les testsstatistiques utilisés, et augmente ainsi notre confiancedans les résultats de notre analyse dynamique.

Le programme DYNAMOF est téléchargeable à par-tir du serveur du Centre de biochimie structurale(ftp://ftp.cbs.cnrs.fr/pub/DYNAMOF_1.0.zip).

Fig. 8. Résultats de l’analyse dynamique des données de relaxation mesurées sur P13MTCP1 à trois intensités de champ magnétique. (a) paramè-tres dynamiques (S2, sf, ss et φ) obtenus en ajustant les données expérimentales avec les modèles LS2 (rouge), LSREX (orange) et LSE3 (jaune).(b) deux vues à 180° d’une représentation en ruban de la protéine P13MTCP1 montrant la restriction des mouvements internes : le ruban a étécolorée avec le même code de couleur qu’en (a).

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Remerciements

Le travail de Virginie Ropars est financé par unebourse de la Ligue contre le cancer. L’étude des protéi-nes oncogéniques de la famille TCL1 constitue un pro-jet du laboratoire soutenu par l’Association pour larecherche contre le cancer. La conversion des donnéesde relaxation en valeurs de densité spectrale utilise uneroutine MATLAB écrite par J.-F. Lefèvre : Philippe Bar-the et Christian Roumestand remercient cet ami, mal-heureusement trop tôt disparu, qui a su leur communi-quer sa passion pour l’étude de la dynamique internedes protéines et la relation entre les propriétés dynami-ques des protéines et leur activité.

Références

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