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KRISTINE CUFFLEY
DÉVELOPPEMENT PAR GÉNIE TISSULAIRE D 'UN MODÈLE D'ÉTUDE IN VITRO DES VOIES DE SIGNALISATION DES CELLULES SOUCHES DU FOLLICULE
PILEUX
Mémoire présenté à la Faculté des études supérieures de l'Université Laval
dans le cadre du programme de maîtrise en biologie cellulaire et moléculaire pour l'obtention du grade de maître ès sciences (M.Sc.)
Résumé .................................................................................................................................... II
Avant-propos .......................................................................................................................... III
Tables des matières ................................................................................................................ I V
Listes des figures et tableaux................................................................................................. VI
Liste des abréviations ............................................................................................................ VII Chapitre 1 Introduction générale ................................................................ 1
3.1 Apparence macroscopique de la peau reconstruite in vitro .............................. 42
3.2. Histologie des peaux reconstruites ....................................................................... 42
3.3 Immunomarquage des peaux reconstruites ........................................................ 44 3.3.1 Analyse de la prolifération cellulaire .......................................................... 44 3.3.2 Détection de la membrane basilaire de la peau .......................................... 45 3.3.3 Analyse de la différenciation épidermique ................................................. 48 3.3.4 Analyse de la différenciation folliculaire ................................................... 50 3.3.5 Détection de la phosphatase alcaline endogène .......................................... 51 3.3.6 Analyse de la voie de signalisation Wnt. .................................................... 52
3.3.6.1 Détection par immunofluorescence ........................................................... 52 3.3.6.2 Détection par gel de rétention (EMSA) ..................................................... 55
Chapitre 4 Discussion et Conclusion ......................................................... 59
4.1 Discussion ............................................................................................................... 60 4.1.1 Le génie tissulaire ....................................................................................... 60 4.1.2 Les peaux reconstruites par la méthode d'auto-assemblage ....................... 60 4.1.3 Caractérisation des peaux reconstruites ........... ........................................... 61
Chapitre 1 Figure 1-1: La peau .................................................. ..................................................... ........ .. .. 3 Figure 1-2: Un mélanocyte ....... ...................................... ............................................... ..... ... ... . 6 Figure 1-3: Une cellule de Merkel ............................................................... ................ ....... .... .. 6 Figure 1-4: La morphogenèse du follicule pileux ........................................................ .. ......... 11 Figure 1-5: Le follicule pileux ............................................................................... ....... .. .. ... .... 13 Figure 1-6: Le cycle du poil ........................................ .... ............ .. .................................. .... .... 14 Figure 1-7: Organisation structurale de la p-caténine ...................................................... .. .. . 16 Figure 1-8: La voie de signalisation Wnt .................................... .. .............. ................. .......... . 18 Figure 1-9: Organisation structurale de la famille Lef-1ITcf .............. ................................... 20 Figure 1-10: Schématisation des différentes lignées cellulaires dérivant d'une cellule souche
dupoil ............... ..................... ............ .................................. ............................... ......... .... 21 Figure 1-11: Schématisation du processus de différenciation épidermique à partir d'une
cellule souche ............................................................................... .. ................................. 22 Figure 1-12: Concept de niche des cellules souches ...................................................... ..... .... 22 Figure 1-13: La différenciation épidermique ..... .......................................................... ....... .... 25
Chapitre 2 Figure 2-1: Follicules pileux immatures ................................................... ................. ........ .. .. . 31 Figure 2-2: Extraction des kératinocytes et des follicules pileux immatures et production des
Chapitre 3 Figure 3-1: Peaux reconstruite in vitro: Apparence macroscopique ...................................... 42 Figure 3-2: Histologie comparative des peaux reconstruites ...................... ........................... 44 Figure 3-3: Analyse de la prolifération cellulaire: Ki67 ............................................. .. .... .... 45 Figure 3-4: Détection de la membrane basilaire: Laminine 5 et collagène IV ............ ........... 50 Figure 3-5: Analyse de la différenciation épidermique: Loricrine ........................................ 49 Figure 3-6: Analyse de la kinase DLK .......................................................................... ....... ... 50 Figure 3-7: Analyse de la différenciation folliculaire: K6IRS1 ............................................. 51 Figure 3-8: Détection de la phosphatase alcaline endogène .................................................. 52 Figure 3-9: Analyse de la voie de signalisation Wnt (p-caténine et Lef1): expression dans la
peau de souris ....................... ........................................................................................... 53 Figure 3-10: Analyse de la voie de signalisation Wnt (p-caténine et Lef-1): expression dans
la peau reconstruite .......................................... ............................................................ ... 54 Figure 3-11: Rétention en gel d'extraits provenant de peaux de souris âgées de 7 jours .... .. 56 Figure 3-12: Rétention en gel d'extraits provenant de peaux reconstruites ........................... 58
Chapitre 4 Figure 4-1: Modèle suggérant que les différents niveaux d'expression des BMPs contrôlent
l'expression du complexe Lef11p-caténine au cours de la différenciation des lignées cellulaires dérivant des cellules souches du follicule pileux ........................................... 63
cellulaire (pore de 30 J.lm) (Falcon). Les FPls ont été récupérés sur le filtre. Finalement, les
FPls (figure 2-1 B) ont été ensemencés dans un anneau d'ensemencement mesurant 2,25 cm
de diamètre sur les dermes reconstruits, soit l'équivalent d'un 1/2 derme de souris, dans un
milieu DME-HAM complet en présence d'acide ascorbique (figure 2-2).
Figure 2-1 : Follicules pileux immatures
Coupe histologique colorée au trichrome de Masson de peau de souris de 1 jour (A). Micrographie en contraste de phase des follicules pileux immatures (FPls) fraîchement
extraits (B). Barre de mesure 50 f..Dl1.
Souriceaux ~ ~ Fibroblastes dermiques
35 jours acide ascorbique
nouveau-nés~ ~ ~ ~ Épiderme dissocié:
~ Centrifugation Iympholite M
Trypsine 0 Q 8 16 heures ~ Superposition
",. b / ,~ ~~~ ___ d~e 2 feuillets
Séparation ~ derme-épiderme
Derme: Digestion collagénase
Ensemencement des cellules épithéliales
..... -FPI ~ Centrifugations différen tieUes
Culture à l'interface Air-liquide
Figure 2-2: Extraction des kératinocytes et des follicules pileux immatures et production des peaux reconstruites
2.2 CULTURE CELLULAIRE
Les fibroblastes humains utilisés lors de ces expériences proviennent d'une lignée
cellulaire déjà établie dans le laboratoire. Ils ont été extraits d'une biopsie de peau normale
humaine prélevée lors d'une réduction mammaire. Pour ce qui est des fibroblastes murins
utilisés, ils ont été extraits de peaux de souris nouveau-nés âgées de 2 jours. Brièvement les
3.1 ApPARENCE MACROSCOPIQUE DE LA PEAU RECONSTRUITE IN VITRO
Environ 50 jours de culture sont nécessaires pour produire les peaux reconstruites.
Comme il a été mentionné auparavant, les feuillets de fibroblastes utilisés pour reconstruire la
portion dermique sont obtenus en 30 jours en moyenne. Lors de leur superposition, les
feuillets de fibroblastes sont transparents, minces et ils possèdent une certaine rigidité. En
effet, malgré les forces mécaniques exercées sur les feuillets lors de leur étalement nécessaire
à leur superposition, ceux-ci ne déchirent pratiquement pas. Après 7 jours additionnels de
culture, les kératinocytes murins ainsi que les follicules pileux immatures (FPls) sont
ensemencés sur les dermes reconstruits. Puis, les peaux reconstruites immergées dans le
milieu de culture sont cultivées pendant une semaine afm de permettre la prolifération des
kératinocytes. Les peaux reconstruites sont ensuite positionnées à l'interface air-liquide pour
permettre la différenciation des cellules épidermiques. Au fur et à mesure que la maturation
des peaux reconstruites progresse, plusieurs couches de kératinocytes s'organisent et la
différenciation des coméocytes contribue à la formation de l'opacité des peaux reconstruites
(Figure 3-1 A). Cependant, dans les peaux reconstruites ayant les FPls, des plages de lyse
apparaissent dans le tissu lors du processus de maturation en interface air-liquide (Figure 3-1
B). Puisque lors de la formation des follicules pileux, des enzymes sont sécrétées afin que le
follicule pileux pénètre dans le derme (Hardy, 1992), il est possible que les interactions entre
les FPls et le derme reconstruit dans notre modèle mènent à la production d'enzymes digérant
le derme, ce qui pourrait avoir contribué à la formation des plages de lyse.
Figure 3-1: Peaux reconstruite in vitro: Apparence macroscopique
Peaux reconstruites in vitro à partir de kératinocytes de souris (A) ou de FPls (B) après 14 jours de culture à l'interface air-liquide. Légende: FPls : follicules pileux immatures.
3.2. HISTOLOGIE DES PEAUX RECONSTRUITES
Les observations en microsopie optique des coupes histologiques des peaux
reconstruites à partir des kératinocytes de souris (Km) ont révélé un épiderme ayant les
Figure 3-2: Histologie comparative des peaux reconstruites
Coupes histologiques de peaux reconstruites à partir de fibroblastes murins (A et C) ou de fibroblastes humains (B, D et E) comprenant des kératinocytes (A et B) ou des FPls (C, D et E) après 7 jours de maturation à l 'interface air-liquide. Coloration au trichrome de Masson.
Barre de mesure: 50 f.1m excepté la figure E où 25 f.1m. Légende: Km : kératinocytes de souris, FPls : follicules pileux immatures.
3.3 IMMUNOMARQUAGE DES PEAUX RECONSTRUITES
3.3.1 Analyse de la prolifération cellulaire
Afin de vérifier l'état de prolifération au niveau des cellules des peaux reconstruites,
un marquage de la protéine Ki67 a été effectué. Effectivement, la protéine Ki67 a été
identifiée comme marqueur spécifique des cellules ayant une forte activité mitotique (Gerdes
et al. , 1983). Au niveau des peaux reconstruites ayant reçu les kératinocytes épidermiques de
souris, le marquage de la protéine Ki67 a été identifié au niveau de la couche basale de
l'épiderme démontrant que les cellules basales sont en prolifération active (Figures 3-3 A et
B). Dans les peaux reconstruites ayant reçu les FPls, Ki67 est aussi présent dans la couche
concentrique externe, représentant la couche basale (Figure 3-3 C et D). Dans les peaux
reconstruites FPI/Fh, la contre coloration à l'hématoxyline de Harris permet de discerner les
grains de kératohyaline de la couche granuleuse des kystes intradermiques (Figure 3-3 D
*astérisque) ainsi qu'une accumulation de matériel anucléé au centre des kystes représentant
probablement des cornéocytes desquamés (Figure 3-3 D étoile). Ces deux caractéristiques
morphologiques sont spécifiques à la différenciation épidermique. La présence de Ki67 au
niveau des noyaux des cellules de la couche basale des peaux reconstruites ayant des FPls,
suggère que l'échec de la folliculogénèse complète n'est pas dû à un défaut de prolifération
des kératinocytes formant les FPls mais plutôt à un défaut de différenciation des cellules.
Figure 3-3: Analyse de la prolifération cellulaire: Ki67
Immunomarquage du marqueur de prolifération cellulaire Ki67 dans les peaux reconstruites à partir defibroblastes murins (A et C) ou defibroblastes humains (B, D) comprenant des kératinocytes (A et B) ou des FPls (C et D) après 7 jours de maturation à l 'interface air-liquide. Barre de mesure: 50 f.1m (A et B) et 25 pm (C et D). Légende: Km : kératinocytes de souris, FPls : follicules pileux immatures, * :grains de kératohyaline, * :cornéocytes.
3.3.2 Détection de la membrane basilaire de la peau
Dans la peau normale, les interactions entre le derme et l'épiderme permettent la
formation d'une membrane basilaire. Au niveau de la membrane basilaire, les laminines
jouent un rôle important dans la signalisation cellulaire. Elles transmettrent entre autres des
informations morphogénétiques aux cellules avoisinantes via les récepteurs de la famille des
intégrines (Rousselle and Garrone, 1998). Afin de s'assurer de la présence de la membrane
basilaire dans les peaux reconstruites, le marquage de la laminine 5 et le marquage du
collagène IV, une autre composante de la membrane basilaire, ont été réalisés. Dans les
peaux reconstruites ayant reçu les kératinocytes, les marquages de la laminine 5 (Figure 3-4
A et B) et du collagène IV (Figure 3-4 E et F) ont été retrouvés tout au long de la jonction
dermo-épidermique. Dans les peaux reconstruites ayant reçu les FPIs, les marquages ont
Figure 3-4: Détection de la membrane basilaire: Laminine 5 et Collagène IV
Immunomarquage de la protéine laminine 5 (A, B, C, D) et du collagène IV (E, F, G, H) dans les peaux reconstruites à partir de fibroblastes murins (A,C, E et G) ou defibroblastes humains (B, D, F et H) comprenant des kératinocytes (A, B, E et F) ou des
FP Is (C, D, G et H) après 7 jours de maturation à l'interface air-liquide. Barre de mesure: 50 J1m. Légende: Km : kératinocytes de souris, FPIs : follicules pileux immatures, Fm : Derme reconstruit à partir de fibroblastes
murins, Fh : Derme reconstruit à partir de fibroblastes humains.
3.3.3 Analyse de la différenciation épidermique
Dans la peau normale humaine et la peau de souris, la loricrine est exprimée par les
cellules de la couche granuleuse. Les peaux reconstruites à partir des kératinocytes
épidermiques de souris développent un épiderme possédant les caractéristiques histologiques
de l ' épiderme mais en plus, qui présente les marqueurs spécifiques à la différenciation
épidermique. En effet, la loricrine a été retrouvée au niveau de la dernière couche nucléée soit
la couche granuleuse de l'épiderme (Figure 3-5 A et B). La contre coloration au Hoechst
(Bleu), qui permet de colorer le noyau des cellules, a montré que les cellules basales nucléées
n'étaient pas marquées à la loricrine. Dans les peaux reconstruites FPVFh, le marquage de la
loricrine au niveau des kystes intradermiques a été retrouvé au niveau des couches
concentriques les plus internes des kystes. Le stade de différenciation de ces cellules
correspond probablement à celui des cellules de la couche granuleuse de l'épiderme. Dans les
kystes intradermiques des peaux reconstruites FPI/Fm, aucun marquage de la loricrine n ' a été
détecté suggérant que les kératinocytes ne prennent pas la voie de la différenciation
épidermique terminale (Figure 3-5 C). Par la suite, un marquage de la kinase DLK a été
réalisé au niveau des kératinocytes formant les kystes intradermiques dans les peaux
reconstruites FPVFh et FPIlFm. La kinase DLK est impliquée dans le contrôle du processus
de la différenciation terminale des kératinocytes épidermiques (Germain et al. , 2000;
Robitaille et al., 2005). Tel qu'attendu, le marquage de la kinase DLK a été détecté au niveau
de la couche granuleuse des kystes intradermiques dans les peaux reconstruites FPI/Fh
(Figure 3-6 B). La kinase DLK est également retrouvée au niveau de la gaine folliculaire
interne du follicule pileux (Germain et al., 2000). Cependant, les kératinocytes de la gaine
folliculaire interne ont des caractéristiques morphologiques très différentes des kératinocytes
épidermiques (Voir section 1.2.3.2) et morphologiquement, les kératinocytes exprimant DLK
dans les kystes des peaux reconstruites FPIIFh présentent plutôt l'aspect histologique des
cellules de la couche granuleuse de l'épiderme. Donc, le marquage retrouvé au niveau des
kystes représente probablement une activation du processus de différenciation terminal des
kératinocytes de l'épiderme et pas une activation de la différenciation de la gaine folliculaire
interne, tandis qu'aucun marquage n'a été décelé dans les peaux reconstruites FPVFm (Figure
3-6 A). Alternativement, l'absence d'expression de la DLK dans les couches plus internes
des kystes des peaux reconstruites FPI/Fm, en plus de faire état de la non-activation de la
cascade de signalisation impliquant DLK nécessaire à la différenciation de l ' épiderme,
suggère que la cascade impliquant DLK dans la différenciation de la gaine folliculaire interne
n'a également pas eu lieu.
Fibroblastes murins Fibroblastes humains
Km
FPI
Figure 3-5: Analyse de la différenciation épidermique: Loricrine
Immunomarquage de la loricrine dans les peaux reconstruites à partir de fibroblastes murins (A et C) ou de fibroblastes humains (B, D) comprenant des kératinocytes (A et B) ou des FPls
(C et D) après 7 jours de maturation à l'interface air-liquide.Barre de mesure: 50 f.1m. Légende: Km : kératinocytes de souris, FPIs : follicules pileux immatures, ligne pointillée:
Immunomarquage de DLK dans les peaux reconstruites à partir de fibroblastes murins (A) ou defibroblastes humains (B) comprenant des FPls après 7 jours de maturation à l'interface air-liquide. Barre de mesure: 50 f.1m. Légende: FPls : follicules pileux
immatures.
3.3.4 Analyse de la différenciation folliculaire
Les cellules de la gaine folliculaire interne du poil expriment certaines kératines
spécifiques. Afin de vérifier si les kératinocytes présents dans nos peaux reconstruites
démontraient des signes de différenciation de la gaine folliculaire interne, la présence de la
kératine K6IRS 1 a été évaluée par immunobuvardage (western blot) (Langbein et al., 2002).
Ainsi, contrairement aux peaux de souris âgées de 7 jours dont les poils sont matures et où la
gaine folliculaire interne est bien différenciée et dans laquelle la protéine K6IRS 1 a été
détectée à un niveau important, un très faible signal a été détecté dans les peaux reconstruites
cultivées, et ce, autant celles avec des kératinocytes épidermiques que celles avec des FPls
(Figure 3-7). L'immunobuvardage de l'actine a été effectué pour contrôler la quantité de
protéines chargées dans chaque puits et démontre qu'elle était équivalente (Figure 3-7).
- 208 ~ en E ~ E ~ -119 .~ 11. 11. 11. 11. - 99 ::1 :::::: :::::: ........ E 0 a. a. E en 11. 11. ~ ~
K6IRSI _52 Actine
-31
Figure 3-7: Analyse de la différenciation folliculaire: K6lRSl
l mmunobuvardage de la protéine K6lRSl de peau de souris âgées de 7 jours, de peaux reconstruites à partir de fibroblastes murins (Fm) ou de fibroblastes humains (Fh)
comprenant des kératinocytes ou des FPls après 7 jours de maturation à l 'interface airliquide. L ' actine est un contrôle de chargement des puits. Légende: Km : kératinocy tes de souris, FPls : follicules pileux immatures, Fm : Derme reconstruit à partir de fibroblastes
murins, Fh : Derme reconstruit à partir de fibroblastes humain.
3.3.5 Détection de la phosphata se alcaline endogène
La phosphatase alcaline est une enzyme retrouvée au niveau des fibroblastes de la
papille dermique (Handjiski et al., 1994). Afin de s'assurer que les FPIs dans les peaux
reconstruites possèdent les fibroblastes de la papille dermique, la détection de la phosphatase
alcaline endogène a été effectuée. L'activité de la phosphatase alcaline a été retrouvée au
niveau des deux types de peaux reconstruites à partir de FPIs (Figure 3-8 C et D). Ces
résultats suggèrent que l'échec d'une folliculogénèse complète au niveau des peaux
reconstruites à partir de FPIs n'est pas causé par l'absence des fibroblastes de la papille
dermique car ceux-ci sont présents au niveau des peaux reconstruites. Dans les peaux
reconstruites à partir de kératinocytes murins cultivées sur les dermes humains, la
phosphatase alcaline endogène n'a pas été détectée. Cependant dans les peaux reconstruites à
partir de kératinocytes murins cultivées sur derme murins la phosphatase alcaline a été
observée au niveau du derme et ce dû au fait que les fibroblastes proviennent de souris
nouveau-nés et que dans ces fibroblastes il y a probablement présence de fibroblastes de la
-Figure 3-8: Détection de la phosphatase alcaline endogène
Détection de la phosphatase alcaline endogène au niveau dans les peaux reconstruites à partir defibroblastes murins (A et C) ou defibroblastes humains (B et D) comprenant des kératinocytes (A et B) ou des FPls (C et D) après 7 jours de maturation à l 'interface airliquide. Barre de mesure: 50 pm. Légende :Km: kératinocytes de souris, FPls : follicules
pileux immatures.
3.3.6 Analyse de la voie de signalisation Wnt
3.3.6.1 Détection par immunofluorescence
Tel que décrit auparavant, la voie de signalisation Wnt joue un rôle primordial dans le
développement des follicules pileux. Dans les peaux reconstruites ayant les follicules pileux
immatures (FPIs), l'échec d'une folliculogénèse complète est peut-être la conséquence d'un
défaut de signalisation de la voie Wnt. Afin de vérifier cette hypothèse, la présence de deux
effecteurs de la voie Wnt a été évaluée par immunofluorescence, soit la f3-caténine et le
facteur de transcription Lef-l. Dans les noyaux des kératinocytes du bulbe des follicules
pileux de souris âgées de 7 jours, l'expression de Lef-l et de la f3-caténine a été identifiée
(Figure 3-9 A et B). La figure 3-9 C montre la colocalisation nucléaire de f3-caténine et de
52 COKristine Cuffley LOI:X
Lef-1 (marquage jaune) suggérant une activation de la voie Wnt. Dans les peaux reconstruites
à partir des kératinocytes ou des FPIs, le marquage nucléaire de ces molécules était absent
(Figure 3-10 A-L). Cependant la ~-caténine a été détectée au niveau des membranes
cellulaires, endroit où elle se retrouve dans le complexe des jonctions adhérentes (Akiyama,
2000). Ces résultats suggèrent que l ' absence d ' activation de la voie de signalisation Wnt
pourrait être la cause de l ' échec d'une folliculogénèse complète dans les peaux reconstruites
ayant des FPIs.
Figure 3-9: Analyse de la voie de signalisation Wnt (f3-caténine et Lei1): expression dans la peau de souris
Immunomarquage de Lei 1 (A) et de la f3-caténine (B) sur des coupes de follicules pileux de peaux d 'une souris âgées de 7 jours. Superposition du marquage de la f3-caténine et de Lei1
(C) démontrant la colocalisation Oaune) ainsi qu'une superposition du marquage Hoechst (D) (bleu) démontrant la position des cellules.
Figure 3-10: Analyse de la voie de signalisation Wnt (f3-caténine et Lef-l): expression dans la peau reconstruite
lmmunomarquage de Lef-l (A, D, G et J) et de la f3-caténine (B, E, H et K) de peaux reconstruites à partir de fibroblastes murins (A, B, C, G, H et 1) ou de fibroblastes humains (D, E, F, J, K et L) comprenant des kératinocytes (A B,C, D, E et F) ou des FPls (G, H, l, J,
K et L) après 7 jours de maturation à l'interface air-liquide. Superposition des marquages de Lef-l, f3-caténine et Hoechst des peaux reconstruites (C, F, l et L).
Barre de mesure : 50 J.1m. Légende: Km : kératinocytes de souris, FPls : follicules pileux immatures, Fm : Derme
reconstruit à partir de fibroblastes murins, Fh : Derme reconstruit à partir de fibroblastes humains.
Figure 3-11: Rétention en gel d'extraits provenant de peaux de souris âgées de 7 jours.
Les expériences de rétention en gel ont été réalisées à partir d'extraits nucléaires de peaux de souris âgées de 7 jours. Les échantillons des essais de compétitions ont été incubés avec
la sonde Lef-l marquée au 32 P ainsi que les sondes non-radioactives: Sp l, NF l, APl et Lef-1 (A). Les 2 flèches indiquent les bandes spécifiques à la sonde Lef-l (A). Pour les essais de
supershift 1 J.1g d'anticorps (Lef-l, fJ-caténine, IgG) a été ajouté aux échantillons (B).II y a eu supershift de la bande lors de l'ajout de l'anticorps Le!l et fJ-caténine. Aucun supershift n 'a
été détecté lors de l'ajout du sérum IgG de lapin (contrôle).
Au niveau des peaux reconstruites, les essais de compétitions ont révélé deux bandes
(indiquées par des flèches), qui disparaissent lors de l'ajout d'un excès de sonde Lef-l non
marquée, spécifiques à la sonde Lef-l (Figure 3-12 A). Cependant, aucun supershift n'a été
détecté lors de l'ajout de l'anticorps Lef-l au niveau des extraits nucléaires des peaux
reconstruites, suggérant l'absence de la protéine Lef-l au niveau des peaux reconstruites
(Figure 3-12 B couloir 3, 8, 12, 16). Ce n'est donc pas le facteur Lef-l qui se lie à la sonde
Lef-l. Afin d'élucider quelles protéines pourraient se lier à la sonde Lef-l, l'anticorps Tcf-
3/4 a été ajouté aux extraits nucléaires. Il y a eu alors un faible supershift au niveau des peaux
reconstruites à partir de fibroblastes humains comprenant des kératinocytes murins (K murins
IF humains) (Figure 3-12 B, couloir 4). Comme décrit auparavant, les protéines Tcf-3 et Tcf-
4 ont le même site de liaison à l'ADN que Lef-l (Zhou et al., 1995) mais jouent des rôles
Figure 3-12: Rétention en gel d'extraits provenant de peaux reconstruites
Les expériences de rétention en gel ont été réalisée à partir d'extraits de peaux reconstruites. Les échantillons des essais de compétitions ont été incubés avec la sonde Lef-l marquée au
32 P ainsi que les sonde non-radioactives: Sp 1, NF 1, APl et Lef-l (A). Les 2 flèches indiquent les bandes spécifiques à la sonde Lef-l (A). Pour les essais de supershift, 1 f.1g d'anticorps
(Lef-l , Tcf 3/4, IgG) a été ajouté aux échantillons (B).II y a eu supershift de la bande lors de l'ajout de l 'anticorps Tcf 3/4 ( couloir 4). Aucun supershift n'a été détecté lors de l 'ajout du sérum IgG de lapin (contrôle).Légende : K: kératinocytes de souris, FPls : follicules pileux
mutée pendant l'embryogenèse par la méthode Cre/loxP au niveau des follicules pileux et
dont les cellules souches adoptaient un destin de différenciation épidermique (Huelsken et al.,
2001). Cela supporte l'hypothèse qu'une absence d'activation de la voie Wnt dans les peaux
reconstruites des peaux FPIIFh est impliquée dans la formation des kystes à caractère
épidermique. Les kystes intradermiques retrouvés au niveau des peaux reconstruites FPIlFm
pour leur part, sont plutôt similaires aux kystes observés dans la peau des souris
transgéniques n'exprimant pas le récepteur BMP lA. En effet, une activation des récepteurs
BMP lA serait requise à la transcription des gènes régulés par le complexe p-caténinelLef-1
parce qu'en l'absence de ce récepteur, la différenciation des cellules de la matrice des
follicules pileux en cellules de la tige et de la gaine folliculaire interne n'a pas lieu (voir
Figure 4-1) (Kobielak et al., 2003). Dans les peaux reconstruites FPIlFm, il est possible que
les cellules souches du follicule pileux aient généré les kératinocytes de la gaine folliculaire
externe mais que le contrôle de la différenciation en gaine folliculaire interne et en tige,
orchestré entre autres par la voie Wnt, était inadéquat.
L'inhibition de BMPRla est requise pour l'expression du gene Lef-1
L'activation de BMPRla est requise pour l'acti.vation des gènes régulés par le complexe Lef-l/~-caténine via la signalisation de Wnt
Papille dermique L.ef1# ....
Figure 4-1: Modèle suggérant que les différents niveaux d'expression des BMPs contrôlent l'expression du complexe Lefl/fJ-caténine au cours de la différenciation des lignées
cellulaires dérivant des cellules souches du follicule pileux
Schéma tiré de Kobielak 2003 (Kobielak et al., 2003).
Akiyama, T. 2000. Wnt/beta-catenin signaling. Cytokine Growth Factor Rev. Il :273-82. Alonso, L. , and E. Fuchs. 2003a. Stem cells in the skin: waste not, Wnt not. Genes Dev.
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