DÉVELOPPEMENT DE NOUVELLES MÉTHODOLOGIES PAR …

4

analyse par spectromeacutetrie de masse Les agents pontants permettent dobtenir des informations

de topologie du complexe initial en creacuteant des liaisons covalentes entre des acides amineacutes

proches dans la structure tertiaire Une derniegravere technique consiste agrave effectuer un marquage de

la surface accessible du complexe qui peut ecirctre soit permanent par l‟utilisation de reacuteactifs

chimiques particuliers ou par l‟exposition aux radicaux hydroxyles soit labile Dans ce

dernier cas les eacutechanges isotopiques hydrogegravenedeuteacuterium sont geacuteneacuteralement utiliseacutes La

vitesse deacutechange des hydrogegravenes damide dun squelette polypeptidique deacutepend de

l‟accessibiliteacute au solvant mais eacutegalement de la stabiliteacute de la structure locale Ainsi les

hydrogegravenes d‟amide situeacutes dans les reacutegions flexibles ou non structureacutees de la proteacuteine telles

que les boucles et les coudes ou dans les reacutegions accessibles au solvant ont des vitesses

d‟eacutechange rapides identiques agrave celles observeacutees dans le cas d‟un peptide non structureacute Au

contraire ceux qui sont impliqueacutes dans des structures secondaires stables comme les heacutelices

α et les feuillets β ainsi que ceux enfouis dans le cœur hydrophobe des proteacuteines s‟eacutechangent

plus lentement car ils sont proteacutegeacutes La mesure des vitesses deacutechange permet donc de sonder

localement la structure dune proteacuteine ou dun complexe L‟avantage majeur de cette approche

est qu‟elle ne modifie pas la structure tridimensionnelle du complexe ce qui n‟est pas

toujours le cas avec des marquages covalents De plus elle permet de sinteacuteresser agrave des

complexes de tregraves haut poids moleacuteculaire En revanche le fait que le marquage soit labile

impose des conditions expeacuterimentales strictes agrave respecter pour eacuteviter le deacutemarquage et

davantage de contraintes au niveau de la rapiditeacute de l‟analyse Malgreacute ces limitations

l‟association des eacutechanges isotopiques hydrogegravenedeuteacuterium et de la spectromeacutetrie de masse

(HDXMS) est devenue une meacutethode largement employeacutee pour l‟eacutetude structurale et

dynamique des proteacuteines et complexes proteacuteiques

L‟analyse par spectromeacutetrie de masse des proteacuteines marqueacutees au deuteacuterium est

classiquement reacutealiseacutee par une approche laquo bottom-up raquo Cette derniegravere consiste agrave analyser des

peptides obtenus par digestion enzymatique de la proteacuteine dinteacuterecirct Chaque hydrogegravene

remplaceacute par un deuteacuterium conduit agrave un increacutement en masse de 1 Da facilement deacutetectable par

spectromeacutetrie de masse Pour chaque peptide une cineacutetique d‟eacutechange hydrogegravenedeuteacuterium

peut donc ecirctre obtenue Si cette approche a montreacute tout son inteacuterecirct mecircme pour des systegravemes

tregraves grands l‟inconveacutenient majeur en est la reacutesolution qui est limiteacutee par la taille des peptides

geacuteneacutereacutes (en moyenne 5-10 acides amineacutes) Une alternative qui sest deacuteveloppeacutee ces derniegraveres

anneacutees est celle qui consiste agrave introduire la proteacuteine intacte en phase gazeuse (approche laquo top-

down raquo) et agrave la fragmenter par capture ou transfert dun eacutelectron En effet contrairement aux

approches de fragmentation classiques par CID (laquo Collision Induced Dissociation raquo) qui

conduisent agrave une redistribution aleacuteatoire des deuteacuteriums dans la seacutequence ces approches ECD