DRUGI DEO mol i fenot evolucija.pdf

PRINCIPI MOLEKULARNE I FENOTIPSKE EVOLUCIJE

Izvodi iz predavanja

BILJANA STOJKOVIĆ I NIKOLA TUCIĆ

2. DEO

EVOLUCIJA GENOMA

2.1. Uloga genetičkog drifta i prirodne selekcije u oblikovanju genoma 2.2. Mobilni genetički elementi kod eukariota 2.2.1. Domestikacija mobilnih genetičkih elemenata 2.2.2. Mobilni genetički elementi i retrogeni 2.2.3. Mobilni genetički elementi i specijacija 2.3. Duplikacije genoma i gena 2.3.1. Poliploidija 2.3.2. Duplikacije pojedinačnih gena 2.3.3. Mehanizmi nastanka novih gena 2.3.4. Duplikacije unutar gena 2.3.5. Postanak gena iz ncDNK 2.2.6. Postanak novih gena putem horizontalnog prenošenja 2.3.7. Gubitak gena 2.3.8. Stope sticanja i gubljenja gena 2.4. Evolucija genske regulacije kod eukariota 2.4.1. Evolucija transkripcione regulacije 2.4.2. Evolucija posttranskripcione regulacije 2.4.2.1. Alternativno iskrajanje 2.4.2.2. Mikro RNK 2.4.3. Evolucija drugih oblika genske regulacije 2.4.3.1. Poliadenilacija 2.4.3.2. Prerada RNK 2.4.3.3. Remodelovanje hromatina 2.4.4. Nasleđivanje genske ekspresije - epigenetika 2.4.4.1. Genomsko utiskivanje 2.4.4.2. Epigenetičke promene izazvane sredinskim činiocima

1

2. DEO

EVOLUCIJA GENOMA

Kada se uporede veličine genoma virusa, bakterija i eukariota, uočiće se da

postoji korelacija između veličine genoma i složenosti organizma. Po pravilu, virusni

genomi su manji od bakterijskih, a ovi su, opet, manji od genoma čak i

najjednostavnijih, jednoćelijskih eukariota. Analize većeg broja do danas proučenih

prokariota pokazale su da njihovi genomi variraju od 0,5 do oko 9 Mb, dok se broj

gena, koji kodiraju proteine, kod njih kreće između 350 i oko 8000. Višećelijske

životinje (Metazoa) i biljke (Metaphita) sadrže obično više od 13000 gena koji

kodiraju proteine, u genomima većim od 100 Mb. Pokazalo se takođe da kod DNK

virusa i prokariota između 80% i 95% nukleotidnih nizova čine kodirajući nizovi, dok

višećelijski eukarioti, čiji su genome veći i do 10 000 puta, imaju samo oko 100 puta

više kodirajućih nizova nukleotida.

Pored (funkcionalnih) gena, u genomima postoje DNK nizovi koji se po

genomu mogu širiti “zarad sopstvenog interesa“. To su različite klase mobilnih

genetičkih elemenata (ME) koji svoje ime duguju sposobnosti da “skaču“ kroz genom

(na engl. se često nazivaju jumping genes, što bi se moglo prevesti kao „skoči geni“) i

da na taj način povećavaju broj svojih kopija. Smatra se da ME predstavljaju glavnu

determinantu povećanja genoma kod eukariota. Na primer, oko 45% genoma čoveka

sačinjavaju raspršeni (nelokalizovani) ME, čiji broj kopija može varirati od nekoliko

stotina do nekoliko stotina hiljada. Kod nekih biljnih vrsta, i do 80% ukupne količine

DNK pripada mobilnim elementima, dok kod višećelijskih životinja njihova

zastupljenost u genomu varira od oko 3% do 53%.

2

Slika 2.1. Učešće kodirajuće DNK, intronske i međugenske DNK u veličini genoma različitih taksona (prema: Lynch, 2007).

Introni i intergenska DNK predstavljaju dve osnovne klase nekodirajuće DNK

(ncDNK). Kod prokariota, geni sa intronima su jako retki; na njih odlazi samo oko

0,2% ukupne DNK, i pripadaju isključivo klasi samoiskrajajućih introna. Kod

eukariota sa malim genomima, relativno su mali i intronski delovi gena. Veličine

genoma od oko 100 Mb uglavnom su praćene približno jednakim učešćem egzona i

introna u strukturi gena koji kodiraju proteine. Kada genomi dostignu veličinu od

preko 25000 Mb, kao što je slučaj sa sisarima, 95% ukupne DNK koja se nalazi u

okvirima gena čine intronski delovi! Slično je i sa nizovima nukleotida koji se nalaze

između gena koji kodiraju proteine (intergenska DNK); genomi manji od 1 Mb imaju

oko 20% intergenske DNK, dok je kod genoma od preko 10 Mb prosečno učešće ove

klase DNK preko 80%!

Na osnovu navedenih podataka mogli bismo reći da je tokom evolucije

postojala tendencija prema povećanju sledećih komponenti genoma:

1. veličine samog genoma,

2. broja gena koji kodiraju proteine,

3. broja mobilnih genetičkih elemenata,

3

4. broja i veličine introna,

5. veličine intergenske DNK.

2.1. Uloga genetičkog drifta i prirodne selekcije u oblikovanju genoma

Kako savremena teorija evolucije objašnjava ove trendove u evoluciji

genoma? Mada su još uvek brojni evolucioni biolozi koji smataju da se prirodnom

selekcijom mogu objasniti svi aspekti organizacije genoma, sve je veći broj onih koji

ukazuju da je to “veliko pojednostavljenje evolucionih procesa“ i da su mnoge

karakteristike genoma i gena nastajale delovanjem „semi-neutralnih procesa i vrlo

malim, ako ga je uopšte i bilo, direktnim učešćem pozitivne selekcije“ (Lynch, 2005,

str. 450). Obilje podataka, koje nam je o genomima prokariota i eukariota dala

molekularna biologija, pokazuje da način kako će se odvijati evolucija genoma nekog

taksona ne zavisi samo od različitih aspekata organizacije i funkcionisanja njegovih

ćelija, već i od ograničenja koje nameću procesi na nivou populacija. Prema

populaciono-genetičkoj teoriji, ključna determinanta ovih ograničenja jeste efektivna

veličina polulacije (Ne), jer od nje zavisi verovatnoća fiksacije ili eliminacije novih

genetičkih entiteta. Podsetimo se da, pored stvarnog broja jedinki neke populacije (N),

na efektivnu veličinu utiče mnoštvo faktora – od odnosa polova kod organizama sa

polnim razmnožavanjem, preko neslučajnih variranja u veličine porodice, do promena

brojnosti populacija tokom generacija. Takođe, dobro nam je poznato da je efikasnost

prirodne selekcije daleko veća u velikim nego u malim populacijama, jer slučajne

fluktuacije u učestalostima genskih alela (zbog genetičkog drifta) smanjuju uticaj

prirodne selekcije na dinamiku mutacija sa malim efektima na adaptivnu vrednost.

Matematički opis odnosa efekata prirodne selekcije i genetičkog drifta na

promene učestalosti genskih alela u populaciji kroz generacije, dala je genetičarka

Ohta (1972, 1977):

Nes

21

≤

gde je s koeficijent selekcije (kvantifikuje veličinu efekta prirodne selekcije na

promene učestalosti alela nekog gena u populaciji), i Ne je efektivna veličina

populacije (kvantifikuje efekat genetičkog drifta – slučajne promene učestalosti alela

nekog gena u populaciji). Ova formula na najbolji način opisuje međuzavisnost

efekata dva evoluciona mehanizma u populacijama različitih veličina. Pretpostavimo

4

da je varijabilnost na nekom genu “selektivno prepoznatljiva“, tj. da nosioci različitih

alela u svojim genotipovima imaju različite adaptivne vrednosti (stepen smanjenja

adaptivne vrednosti kod nosioca određene genske varijante iznosi s). Očekujemo da

će selekcija, na osnovu razlika u adaptivnim vrednostima, oblikovati

transgeneracijske promene učestalosti alela tog gena u populaciji. Međutim, ukoliko

je populacija mala, tj. ako su efekti drifta veliki, promene učestalosti alela mogu u

većoj meri zavisiti od stohastičkih procesa nego od pravaca delovanja prirodne

selekcije. Drugim rečima, po načinu promena, ovaj gen će se “ponašati“ kao da je

selektivno neutralan. Kako ukazuje kriterijum koji navodi Ohta, što su veći

koeficijenti selekcije, efektivna veličina populacije mora biti sve manja da bi

stohastičke promene “prevladale“ one selektivne. Uzimajući u obzir da koeficijenti

selekcije za različite genetičke varijante najčešće nisu veliki, možemo očekivati da će

u malim populacijama veliki broj mutacija biti efektivno neutralan.

Relativan doprinos stohastičkih procesa (mutacija i genetičkog drifta) i

prirodne selekcije u oblikovanju arhitekture gena i genoma neće biti isti kod

prokariota i eukariota. Stvarne (N) i efektivne (Ne) veličine populacija prokariota su

drastično veće u odnosu na eukariote. Samim tim, može se očekivati da se efikasnost

prirodne selekcije dramatično smanjuje od prokariota, preko jednoćelijskih eukariota

do višećelijskih eukariota. Ova pravilnost pokazana je u analizi velikog broja

empirijskih podataka koji se odnose na arhitekturu gena i genoma (Lynch, 2007).

Osnovni argument kojim se može objasniti gore navedena tendencija, Linč je

ilustrovao na sledećem primeru. Pretpostavimo da prirodna selekcija u nekoj

evolucionoj liniji favorizuje povećanje telesnih dimenzija. Iz ekologije nam je dobro

poznato da svako značajnije povećanje telesnih dimenzija dovodi do smanjenja broja

jedinki po jedinici površine. Svako smanjenje veličine populacije povećava šansu da

će se mutacije sa blagim štetnim efektima akumulirati u genomima, ali i smanjuje

sposobnost prirodne selekcije da promoviše neki proces koji će onemogućavati

akumulaciju tih mutacija. Drugim rečima, u takvoj situaciji može se očekivati da će

doći do povećanja veličine genoma i to ne zato što dati takson može da toleriše

povećanje količine DNK, ili zato što mu je iz nekog razloga potreban višak DNK, već

jednostavno zato što je prirodna selekcija manje efikasna u eliminaciji takvog

genetičkog materijala. Smanjenje veličine genoma, sa druge strane, može se očekivati

kod organizama kod kojih selekcija ide u smeru smanjenja telesnih dimenzija, i to ne

zato što bi postojala direktna selekcija prema bržoj replikaciji, već zato što bi

5

(“purifikujuća“) selekcija efikasnije odstranjivala mutacije sa blagim štetnim efektima

u većim populacijama. Imajući u vidu procenu da prosečna veličina savremenih

populacija prokariota iznosi oko 1023, uopšte nije neočekivano da su prokariotski

genomi relativno mali i da su kod njih relativno male razlike između najmanjih i

najvećih genoma1.

Prirodna selekcija je zaista osnovni evolucioni mehanizam koji određuje

veličinu i organizaciju genoma prokariota. Na primer, danas imamo niz

eksperimentalnih podataka o adaptivnom povećanju broja gena u genskim familijama

bakterija. Kod bakterija, tzv. “genska amplifikacija“, ili brza akumulacija dupliranih

gena (obično je posredovana sa aktivnošću mobilnih genetičkih elemenata), često je

indukovana različitim stresorima, kao što su toksične supstance, izloženost

antibioticima, ili sredinama sa malo hranljivih materija. Genskom amplifikacijom se

objašnjava, na primer, fenomen tzv. “adaptivne mutageneze“. Naime, empirijske

studije su pokazale da se neke mutacije pojavljuju češće nego što se to očekuje na

bazi slučajnosti, kada se bakterije odgajaju sredini u kojoj bi te mutacije bile korisne2.

U eksperimentima sa bakterijom E coli, koja je u laktoznom operonu imala mutirani

alel LacZ–, ali je ipak uspevala da raste na minimalnom medijumu sa laktozom

(bakterijski genetičari ovakve mutacije zovu leaky), pojavljivalo se više revertanata

(LacZ+) nego što se to očekuje po principu slučajnosti, tj. procenjenoj stopi mutacija.

Hendrickson i sar. (2002) pokazali su da se većina tih revertanata pojavljivala nakon

dužeg usporenog rasta i da je prvi korak u njihovom pojavljivanju bila značajna

amplifikacija LacZ– alela. To je omogućavalo bakterijama uspešno preživljavanje i

reprodukciju na laktozi zbog toga što je količina enzima, iako oštećenog, bila

povećana. Dakle, ekspanzija gena pružala je selektivnu prednost budući da je

amplificirana minimalna aktivnost LacZ– alela povećavala adaptivnu vrednost

bakterijama. Povećan broj kopija ovog alela, međutim, multiplicirao je verovatnoću

pojave mutacija koje su restarurirale punu aktivnost ovog gena, tj. pojavu LacZ+ alela.

Važno je takođe reći da je, nakon pojave LacZ+ alela u samo jednoj od kopija, došlo 1 Do ove procene se došlo podelom broja prokariota koji naseljavaju Zemlju (oko 1030) i procenjenog broja vrsta savremenih prokariota (107). 2 “Adaptivna mutageneza” zapravo je drugo ime za ono što su Lamark i Darvin nazivali “usmereni efekti životne sredine” ili “adaptivna reakcija organizama” (mada se ovaj fenomen vezuje za Lamarka, on ga je eksplicitno odbacivao, a Darvin je na njemu posebno insistirao). Pošto je savremena genetika nedvosmisleno pokazala da su mutacije slučajne u odnosu na “potrebe” organizama, problem adaptivne mutageneze dugo je bila nerešiva zagonetka za molekularne biologe.

6

do brze eliminacije svih kopija LacZ– alela iz populacije bakterija. Iz ovog podatka

možemo izvući zaključak da je amplifikacija gena kod bakterija reverzibilan proces,

što, opet, ukazuje da je prirodna selekcija kod taksona sa velikim populacijama, kao

što su bakterije, mehanizam koji može fino oblikovati veličinu genoma preko kontrole

broja kopija gena. Zanimljivo je da se kod bakterija češće amplifikuju horizontalno

prenešeni geni u odnosu na one koji se prenose uobičajenim vertikalnim putem.

Pretpostavlja se da razlog leži u tome što je prirodna selekcija mogla “testirati” ove

gene za obavljanje specifičnih “adaptivnih zahteva” pre nego što su oni dospeli u

nove ćelije domaćina.

Adaptivna amplifikacija gena se veoma retko sreće kod eukariota.

Najverovatniji razlog nisu razlike u stopama stvaranja i eliminacije dupliranih gena u

odnosu na prokariote, već manje efikasna selekcija u znatno manjim eukariotskim

populacijama. Na to upućuju i podaci da je, kod eukariota, učestalost adaptivne

amplifikacije gena u negativnoj korelaciji sa dimenzijama organizama, odnosno

pozitivno je korelisana sa veličinama njihovih populacija - daleko najčešće se javlja

kod jednoćelijskog kvasca, znatno ređe kod nekih insekata, a vrlo je retka ili potpuno

odsutna kod kičmenjaka.

2.2. Mobilni genetički elementi kod eukariota

Mobilni genetički elementi (ME) klasifikuju se u dve glavne grupe na osnovu

načina transpozicije. Prva grupa označava se kao klasa I (ili tip 2), ili

retrotransponzoni (retro-ME). Ovi ME se premeštaju u genomima posredstvom RNK

intermedijera. U okviru ove klase postoje autonomni elementi, koji poseduju gene za

reverznu transkriptazu (RT), kao što su endogeni retrovirusi (ERV), transpozoni sa

dugim terminalnim ponovcima (LTR-retrotranspozoni) i LINE nizovi (od eng. long

interspersed nuclear elements). Neautonomni retro-ME, kao što su SINE nizovi (od

eng. short interspersed nuclear elements), nemaju gene za RT, ali su ipak u stanju da

menjaju svoje u mesto uz pomoć LINE elemenata (slika 2.2)

Klasa II (ili tip 1) ili DNK transpozoni (DNK-ME) se premeštaju direktno i to

uz pomoć enzima transposaze ili korišćenjem nekog alternativnog mehanizma kao što

je tzv. kružna replikacija (engl. rolling-circle replication; unidirekcionalna replikacija

u kojoj se istovremeno sintetišu novi molekuli DNK ili RNK; prisutna je kod

plazmida, bakteriofaga i viroida).

7

Slika 2.2. Struktura klase I i klase II mobilnih genetičkih elemenata (prema: Zeh i sar. 2009)

ME se mogu naći u genomima svih tipova ćelija, od bakterija do sisara.

Njihova široka prisutnost posledica je njihove sposobnosti diseminacije kako unutar

genoma tako i širenja na druge genome. Neki ME mogu nastati spontano iz

nepremeštajućih nizova DNK u genomima (npr. SINE), dok se drugi mogu prenositi

horozontalno između različitih vrsta. Mnogi ME eukariota vuku poreklo od

prokariota; DNK transpozoni srodni su bakterijskim insercionim nizovima, a retro-

ME srodni su intronima grupe II bakterija. Neki ME su izgleda prisutni kod eukariota

od samog njihovog nastanka, tako da se može reći da su eukarioti koevoluirali sa

njima.

ME su vrlo mutageni zbog sposobnosti da se ugrade u egzone, promotore i

pojačavače i na taj način dovode do narušavanje normalnog okvira čitanja tokom

translacije, menjaju nivo ekspresije gena ili obrazac alternativnog iskrajanja. Osim

ovog aktivnog uticaja na ekspresiju gena, ME mogu i pasivno uticati na povećanje

stopa mutacija gena jer deluju kao homologni nizovi koji omogućavaju hromozomske

rearanžmane i duplikacije/delecije gena. Naime, ME se mogu ugraditi u nehomologne

delove genoma i omogućiti da se između tih delova odigra krosing-over uprkos

činjenici da su nehomologni. Ove nehomologne rekombinacije dovode, ponekad, do

stvaranja dupliranih gena ili drugih genomskih rearanžmana koji povećavaju

adaptivnu vrednost svojim nosiocima. Izgleda da se to desilo sa duplikacijom

8

kompletnog gena za hormon rasta u ranim fazama evolucije čoveka (preko Alu-Alu

rekombinacije), ili sa duplikacijom (uz pomoć L1 elemenata) koja je dovela do pojave

nekih globinskih gena. Najčešće, mobilni elementi, ipak, uslovljavaju pojavu štetnih

mutacija. Procenjuje se da je kod voćnih mušica oko 50% štetnih mutacija posledica

delovanja ME, kod miševa taj procenat je oko 10%, dok je kod čoveka manje od 0,2%

poznatih naslednih oboljenja uzrokovano inaktivacijama gena u koji su ugrađeni ME,

a oko 0,3% poremećaja posledica su delecija gena ili rearanžmana hromozoma zbog

pasivnih efekata ME.

Nesumnjivo je da ME značajno doprinose plastičnosti genoma. Na tu

činjenicu ukazuju nam i podaci da ME selektivno operišu u delovima genoma u

kojima se nalaze geni čija je varijabilnost često ključna za opstanak jedinki.

Povećanje brojnosti ME zapaža se, recimo, unutar ili oko gena za koje se zna da su

relativno brzo evoluirali i čije su uloge u metabolizmu takve da “zahtevaju“

fleksibilnost. U takvu grupu spadaju geni koji omogućavaju organizmima adekvatne

reakcije na promene u životnoj sredini (npr. geni koji učestvuju u imunskim

odgovorima ili signalnim putevima). Naravno, velika brojnost ME oko takvih gena

povećava i verovatnoću nehomolognih rekombinacija. Postoje čak i tvrdnje da su

regioni genoma bogati ME neka vrsta “genskih fabrika“, jer je uočeno da se ovde

ostvaruje relativno visok nivo nejednakog krosing-overa i, posledično, sadrže veći

broj multigenskih familija nego regioni koji su siromašni mobilnim elementima.

Suprotno, regioni genoma oko visoko konzervisanih gena, koji imaju ključne uloge u

oblikovanju struktura ćelija ili kontroli razvića, imaju veoma mali broj ME.

Najdrastičniji primer su kičmenjački Hox geni (deo 3.2) oko čijih jata praktično nema

ME (izutetak su, izgleda, neke grupe gmizavaca, videti deo 3.2.1). Značajno je

primetiti da beskičmenjaci, sa oko 30 filuma, pokazuju daleko veći diverzitet telesnih

sklopova nego kičmenjaci. Moguće je da je i ova razlika između beskičmenjaka i

kičmenjaka posledica činjenice da se u mnogim jatima Hox gena beskičmenjaka

mogu naći ME.

Većina insercija ME, ipak, ne izaziva štetne efekte u genomima domaćina; u

suprotnom, oni ne bi bili toliko zastupljeni kod eukariota. Tokom evolucije eukariota

nastao je veći broj mehanizama kontrole mutagenih efekata ME. Ovi zaštitni

mehanizmi posebno su efikasni u telesnim ćelijama, a znatno manje tokom stvaranja

gameta i, kod nekih organizama kao što su placentalni sisari, tokom ranih faza

embrionskog razvića. Filogenetske analize su pokazale da je primarna funkcija većine

9

osnovnih mehanizama tzv. epigenetičke regulacije genske aktivnosti (DNK metilacija,

modifikacije histona hromatinskih vlakana i RNK interferencija, videti deo 2.4.3.3)

odbrana genoma od mobilnih elemenata. Kod savremenih eukariota, ova odbrana se

odigrava kroz tri faze u kojima učestvuju male RNK (siRNK kod biljaka i kvasaca, i

piRNK, kod insekata i kičmenjaka). U ovim fazama male RNK se: 1) proizvode kao

odgovor na prisustvo ME, 2) selektivno amplificiraju na osnovu nizova nukleotida

koje imaju ME, i 3) inkorporiraju u komplekse sa Argonaut ili Pivi proteinima koji

inaktiviraju ME putem post-transkripcione degradacije ili izlažu mobilne elemente

DNK metilaciji (citozina u CpG dinukleotidima) i/ili modifikaciji histona

hromatinskih vlakana, što onemogućava transkripciju datog dela genoma. Takođe,

prema jednoj hipotezi (tzv. “odbrane domaćina“) genomsko utiskivanje kod

viviparnih sisara nastalo je kao nusproizvod mehanizama zaštite genoma od mobilnih

genetičkih elementa.

Pošto su ME primarni cilj metilacije citozina u CpG parovima, oni mogu

podvrći epigenetičkoj kontroli obližnje gene domaćina, doprineti inaktivaciji čitavih

hromozoma (kao u slučaju X hromozoma sisara) ili, pak, dovesti do genomskog

utiskivanja pojedinih gena. Dakle, ME ne samo da dovode do povećanja genetičke

varijabilnosti populacija na osnovu kojih može doći do stvaranja novih adaptacija, već

su uslovili i pojavu epigenetičke kontrole regulacije aktivnosti gena kod eukariota.

Pošto aktivni ME poseduju brojne regulatorne signale koji su, inače, komponente

kontrole ekspresije gena ćelija domaćina, kao što su POL II ili POL III promotori,

pojačavači, mesta za vezivanje transkripcionih faktora, signali za poliadenilaciju, itd.,

oni mogu značajno promeniti obrasce ekspresije gena u genomima domaćina. Na

primer, na osnovu prisustva ME nizova (pretežno SINE familije) u promotorima gena

ljudi, procenjuje se da više od 1000 naših gena ima cis elemente nastale od ME. Osim

učešća u regulaciji aktivnosti gena na nivou transkripcije, ME su bili prisutni i u

postanku i evoluciji nekih posttranskripcionih mehanizama regulacije aktivnosti gena.

Ta njihova uloga posebno je vidljiva u slučaju miRNK, kratkih nekodirajućih

molekula RNK, koji regulišu ekspresiju gena tako što degradiraju iRNK ili im

onemogućavaju translaciju, vezujući se za 3’ krajeve obrađene iRNK (videti deo

2.4.2.2). Procenjuje se, na primer, da oko 12% miRNK kod ljudi potiče od ME.

Imajući u vidu da pojedinačni miRNK gen može izvršiti represiju brojnih iRNK,

procenjuje se da miRNK izvedene iz ME regulišu aktivnost hiljade gena u genomima

ljudi. Takođe, pokazalo se da SINE RNK mogu da učestvuju u regulaciji transkripcije

10

vezujući se za kompleks RNK polimeraze II. Dodatno, mogu stupiti u interakciju sa

proteinskom kinazom R (PKR; enzim koji fosforiliše jedan od eukariotskih

inicijacionih faktora dovodeći do prekida translacije) i tako učestvovati u regulaciji

translacije. Vezivanjem jedne SINE RNK kod čoveka (pod oznakom BC200, sintetiše

se samo u mozgu) za protein koji dovodi do sindroma lomljivog X hromozoma

(FMRP), ona može da posreduje između FMRP i informacionih RNK koje su mete

ovih proteina. Postoje podaci koji ukazuju da SINE RNK iz mozga mogu dovesti do

supresije translacije i drugih proteina.

Nekontrolisana transpozicija ME u telesnim ćelijama Metazoa uglavnom je

štetna za jedinke (kao što je pokazano u slučaju pojave kancera posle ugrađivanja ME

u blizini onkogena) i ne doprinosi genetičkoj varijabilnosti populacije. Tek

ostvarivanje mutagenih efekata ME tokom gametogeneze višećelijskih organizama

može doprineti evolucionoj plastičnosti populacije (tj. njenoj evolvabilnosti).

Pokazalo se da je kod sisara upravo to slučaj. Do globalne demetilacije DNK kod

sisara dolazi tokom ranih stupnjeva razvića polnih ćelija, kada se “resetuju“

metilacioni markeri neophodni za genomsko utiskivanje. To otvara mogućnost za

transpoziciju retro-ME i, posledično, stvaranje novih mutacija u gametima koje mogu

obogatiti populacije novim varijantama gena. Kod placentalnih sisara postoji još jedna

faza razvića u kojoj se mutageni efekti ME mogu ispoljiti zbog drastičnog smanjenja

metilacije DNK. To je faza preimplantacione embriogeneze, kada, ponovo, dolazi do

velike demetilacije DNK i kada su retro-ME transkripciono vrlo aktivni. Kako su

pokazali eksperimenti na oocitama i preimplantacionim embrionima miševa,

demetilacija u ovoj fazi ima za posledicu izuzetno visoku aktivnost enzima reverzne

transkriptaze. Osim transpozicije samih ME elemenata, povećava se i reverzna

transkripcija RNK onih gena koji su aktivni u germinativnoj liniji i preimplantacionoj

embriogenezi, pri čemu nastaju retro-kopije gena ugrađene u genome (videti deo

2.2.2). Na primer, za neke LINE mobilne elemente placentalnih sisara (kao što je L1

potfamilija) pokazano je da mogu stvarati reverzne transkriptaze sa endonukleaznom

aktivnošću koje prepoznaju bilo koju RNK sa poli(A) repićima (retro-ME sa sličnim

karakteristikama nađene su kod voćnih mušica i nekih biljaka). Imajući u vidu da

tokom ovih ranih faza razvića tek otpočinje odvajanje ćelija koje će učestvovati u

formiranju reproduktivnih organa i budućih gameta (“germinativna ćelijska linija“),

navedene promene mogu biti prenete u narednu generaciju i postati deo polimorfizma

populacije. Veoma malo prisustvo retrokopija kod drugih kičmenjaka (npr. kod ptica,

11

koje inače imaju vrlo male genome), objašnjava se odsustvom retrotranspozona, kao

što je L1 potfamilija.

Daleko najveći broj eukariota vrši supresiju, a ne eliminaciju ME. Da bi se

razumeli razlozi za ovakvu evolucionu strategiju, moramo proučiti primer gljive

Neurospora crassa. Ona je u stanju da potpuno zaštiti sebe od ME pomoću jednog

mehanizma, poznatog pod skraćenicom RIP (od engl. repeat-induced point mutation),

koji ne samo da eliminše ME, već i svaku novoformiranu gensku kopiju. Dakle, N.

crassa, štiteći genom od ME uz pomoć RIPa, smanjila je evolucioni potencijal svojih

populacija na dva načina – odsustvom eventualno korisnih mutacija do kojih mogu

dovesti ME, i odsustvom dupliranih gena, koji, kako ćemo kasnije videti,

predstavljaju jedan od osnovnih načina nastanka novih gena. Ovaj primer pokazuje da

bi delovanje prirodne selekcije u smeru evolucije mehanizama za potpunu eliminaciju

ME, najverovatnije, dovodilo do drastičnog smanjenja varijabilnosti populacija, što

bi, opet, uzrokovalo odsustvo fenotipskih promena u vrlo dugim intervalima vremena3

i, konačno, u nestabilnim životnim sredinama do izumiranja taksona sa takvim

mehanizmima zaštite. Dakle, “stavljanje pod kontrolu“ mobilnih elemenata putem

različitih mehanizama supresije njihovog širenja, umesto njihove potpune eliminacije

iz genoma, predstavljalo bi adaptivnu evolucionu strategiju na duže staze.

Za većinu evolucionih biologa, relativno stabilne životne sredine u veoma

dugim vremenskim periodima predstavlju razlog za pojavu vrsta koje je Darvin

nazivao “živim fosilima“ - savremene vrste koje se morfološki uopšte ne razlikuju, ili

se razlikuju veoma malo, od svojih predaka koji su živeli milionima godina ranije.

Analize SINE nizova kod dve vrste živih fosila, ribe Latimeria (L. menadoensis i L.

chalumnae), pokazale su veoma malu promenu tokom 400 miliona godina, tj. od

vremena kada su otkriveni najstariji fosili ovih životinja. Slična situacija je i kod

tuatara (Sphenodon punctata i S. guntheri) sa Novog Zelanda, koje su ostale relativno

nepromenjene tokom 220 miliona godina. U genomima savremenih tuatara postoji

svega 0,11% SINE nizova i 2,59% LINE nizova (setimo se da u ljudskom genomu

postoji oko 13% SINE i oko 21% LINE nizova). Dakle, izgleda da se “evolucione

staze“ mogu povezati sa malom aktivnoću mobilnih elemenata.

3 Fenomen odsustva značajnijih evolucionih promena nekog taksona tokom dugog perioda vremena označava se kao “evoluciona staza“.

12

2.2.1. Domestikacija mobilnih genetičkih elemenata

Osim što preko svojih regulatornih signala učestvuju u regulaciji aktivnosti

gena, ME se mogu ugrađivati u kodirajuće delove gena i na taj način doprinositi

pojavi novih gena domaćina. Ovaj proces često se označava kao “molekularna

domestikacija“. Kod ljudi, kako je procenjeno, u oko 4% gena koji kodiraju proteine,

nalaze se neki od mobilnih elemenata. Ovaj podatak, međutim, ne znači da se u

funkcionalnim proteinima, koje kodiraju ti geni, nalaze fragmenti (“kasete“) poreklom

od mobilnih elemenata (eukariotske ćelije poseduju više mehanizama kontrole

kvaliteta proteina – od degradacije promenjenih iRNK do degradacije polipeptida

posle translacije). Savremene procene ukazuju da svega 0,1 % funkcionalnih proteina

čoveka ima fragmente poreklom od mobilnih elemenata. Jedan od njih je PTPN1 (ili

PTP1B) protein koji pripada velikoj familiji proteinskih tirozinskih fosfataza

(katalizuju defosforilizaciju proteina). U ovom proteinu nalazi se fragment koji je

poreklom od evoluciono vrlo starog LINE elementa (L3).

Smatra se da su ME imali vrlo važnu ulogu i u organizaciji eukariotskih

hromozoma. Na primer, telomere, koje su kod većine vrsta sastavljene od tandemskih

ponovaka, dodaju se na krajeve hromozoma uz pomoć enzima telomeraze - jedne

reverzne transkriptaze koja, koristeći RNK matricu, deluje na način koji podseća na

integraciju retrotransponzona bez LTR u genome domaćina. Zanimljivo je da različite

vrste voćnih mušica nemaju telomerazu pa njenu funkciju preuzimaju dva specifična

retrotranspozona koji se smeštaju na krajeve hromozoma. S obzirom na ulogu

telomera u procesu ćelijske deobe, izgleda da su mobilni elementi imali veliki značaj

za evoluciju specifičnih mehanizama kontrole deobe ćelija.

Različite analize su pokazale da je domestikacija kodirajućih delova ME bila

ključna u evoluciji placente kod obe grupe viviparnih sisara (Theria), koja uključuje

Eutheria (placentalne sisare) i Methateria (torbare). Theria su se odvojili od

evolucione linije koja je vodila prema savremenim monotrematama (grupi sisara koja

polaže jaja), pre oko 210 miliona godina. Kod torbara, placenta je strukturno vrlo

jednostavan organ kratkog trajanja, čija pojava zavisi od aktivnosti gena Peg10, koji

je izveden od gag gena jednog retrotransposona (kod retrovirusa ovaj gen kodira

proteine viriona). Kako se pokazalo, kod obe grupe viviparnih sisara ispoljavaju se

samo aleli očeva usled genomskog utiskivanja Peg10 gena. Evolucija znatno složenije

placente, koja se javlja samo kod euterija, zavisi od aktivnosti još jednog gena, Peg11

(označava se i kao Rtl1), koji je takođe izveden iz gag gena jedne druge familije

13

retrotranspozona. I kod ovog gena, za kog se smatra da uslovljava održavanje

embrionskih kapilara tokom kasnijih stupnjeva embrionskog razvića, postoji

genomsko utiskivanje sa ispoljavanjem samo očevih alela4.

Pored ovih gena, euterija imaju još dva značajna gena za formiranje placente i

oba su, takođe, izvedena od retroelemenata. Kod primata oni se označavaju kao

sincicin-1 i sincicin-2, a kod glodara kao sincicin A i B. Ovi geni su nezavisno nastali

od env gena endogenih retrovirusa (ERV)5. Retrovirusni donor sincicijskih gena

euterija kontroliše sintezu glukoproteina pomoću koga retrovirus ostvaruje tri

funkcije: 1) prepoznaje receptore ćelija koje inficira, 2) ostvaruje fuziju virusnog

omotača sa membranom ćelije domaćina, 3) preko jedne transmembranske oblasti

ovog glukoproteina stiče imunosupresorske sposobnosti. Sve te tri funkcije

(prepoznavanje ćelija, fuzija ćelija i imunosupresija) zadržavaju i sincicijski proteini

placente euterija. Placentalni sincicijum, nastao fuzijom ćelija, ograničava razmenu

migratornih ćelija između embriona i tela majke, a preko imunosupresivnih svojstava

ovog proteina obezbeđuje se zaštita embriona od imunskog sistema majke. Dakle,

evolucija složene placente kod Eutheria zavisila je od domestikacije gag i env gena

retrotranspozona, a pošto u ovu grupu spada oko 94% svih danas živih sisara, mogli

bismo reći da su ME “ključ“ za adaptivnu radijaciju sisara.

V(D)J rekombinacija u imunskom sistemu kičmenjaka sa vilicom, verovatno

predstavlja najbolji primer uloge koju su ME imali u procesima adaptivne evolucije.

Tokom V(D)J rekombinacija u B i T ćelijama imunskog sistema, tri grupe

razdvojenih genskih segmenata (egzona) – V (varijabilni), D (diversifikujući) i J

(vezujući) – se spajaju gradeći gene koji sintetišu ogroman broj površinskih receptora

T ćelija i imunoglobulina neohodnih za prepoznavanje različitih patogena. Ove

rekombinacije zavise od prisustva tzv. rekombinacionih signalnih nizovi (RSS, engl.

recombination signal sequences), koji opkoljavaju svaki genski segment, i dva

proteina kodirana genima RAG1 i RAG2 (Slika 2.3). RSS se sastoje od kratkih

4U genomima sisara je otkriveno čak 85 gena koji su izvedeni iz gag gena različitih familija retrotransopozona. 5 Smatra se da su ERV varijante nekada bili autonomni egzovirusi, koji su se, infekcijom germinativnih ćelija, permanentno integrisani u genome ćelija domaćina. Tokom trudnoće kod nekih viviparnih sisara (npr. glodara), ERV se aktiviraju i proizvode u velikom broju. Humani endogeni retrovirusi (HERV) čine oko 8% genoma savremenih ljudi. Smatra se da je u našoj evolucionoj liniji, posle razdvajanja od zajedničkog pretka sa šimpanzama, bila aktivna samo jedna familija, HERV-K (HML2) - na koju otpada oko 1% HERVa, dok su sve ostale familije inaktivirane.

14

invertovanih ponovaka dugih 12 ili 23 nukleotida (oni su analogni terminalnim

invertovanim ponovcima DNK transpozona (slika 2.3a). RAG geni (engl.,

recombination activating genes), koji su odgovorni za formiranje jedinstvenog gena

(po principu “iseci i zalepi“; engl. cut-and-paste) nemaju introne i predstavljaju

imobilizirane autonomne verzije Transcib familije DNK transpozona (u osnovi, ovi

proteini su enzimi transpozaze). Mesto gde će se odigrati rekombinacija određuje se

vezivanjem RAG1 za RSS. Kompleksi koje formiraju RAG1 i RAG2, vezuju se za

različite kombinacije RSS nizova u svakoj od prekursorskih B i T ćelija i isecaju

unutrašnji region, što se može smatrati analognim sa izbacivanjem neautonomnih

transpozona (Slika 2.3b). Posle isecanja uz pomoć RAG proteina, stvoren je

imunoglobulinski gen sa kodirajućim regionima koji predstavljaju različite

kombinacije elemenata (egzona) koji su postojali pre procesa V(D)J rekombinacije

(Slika 2.3c).

Slika 2.3. Postanak V(D)J rekombinacije uz pomoć mobilnih genetičkih elemenata (prema: Slotkin i Martienssen 2007).

Nove funkcije gena mogu nastati i putem fuzije gena, tj. spajanjem dva

prethodno odvojena gena u jednu transkripcionu jedinicu (videti deo 2.3.4). Fuzija

retrokopija nekih gena u postojeće gene domaćina može dovesti do pojave vrlo

značajnih funkcija. Jedan od najzanimljivijih takvih primera odnosi se na ubacivanje

retrokopije CypA gena (kodira protein koji se može vezivati za kapside retrovirusa) u

TRIM5 gen, koji je deo odbramenih mehanizama nekih eukariota od virusa.

Zanimljivo je da je do ove fuzije došlo nezavisno kod majmuna tzv. novog i starog

sveta. U oba slučaja, retrokopija CypA zamenila je originalne egzone TRIM5 gena koji

su kontrolisali domene proteina odgovorne za vezivanje za kapside virusa. Protein

15

nastao posle TRIM5-CypA fuzije daleko je efikasnije eliminisao HIV-1 i druge

retroviruse u poređenju sa proteinom koji je stvarao samo TRIM5 gen. Ovaj primer

konvergentne evolucije, najverovatnije je rezultat izuzetno visoke stope

retrotranspozicije CypA gena tokom gametogeneze majmuna. Fiksacija TRIM5-CypA

fuzije u populacijama ovih majmuna posledica je, opet, daleko veće otpornosti prema

retrovirusima kod jedinki koje imaju ovu fuziju.

2.2.2. Mobilni genetički elementi i retrogeni

Osnovni mehanizam nastanka novih kopija gena jeste nejednak krosing-over

između homolognih hromozoma (videti deo 2.3.2). Međutim, nove kopije gena mogu

nastati i reverznom transkripcijom iRNK postojećih gena. Kao što smo ranije istakli,

retrotranspozicija značajna za evoluciju mora se odigrati u germinativnoj liniji, tj. u

procesima stvaranja gameta. Pored enzima koji obezbeđuju reverznu transkripciju, u

ovom procesu moraju biti aktivni i geni sa čijih se iRNK vrši formiranje cDNK

kopija. Smatra se, kako smo već rekli, da, kod svih viviparnih sisara i čoveka, L1

element iz LINE familije obezbeđuje enzime neophodne za retrotranspoziciju. Ključni

enzim je reverzna transkriptaza sa endonukleaznom aktivnošću, koja je u stanju da

prepozna svaku iRNK sa 3’poli(A) repićem. Pošto se reverzna transkripcija obavlja na

obrađenim iRNK (iz kojih su uklonjeni introni), u tako nastalim kopijama gena, tj.

retrokopijama, neće biti prisutni introni, iako ih originalni gen ima. Dugo se smatralo

da su sve kopije gena nastale na ovaj način nefunkcionalne (tj. da predstavljaju

retropseudogene), i to kako zbog velikog broja mutacija koje se pojavljuju tokom

aktivnosti enzima reverzne transkriptaze, tako i zbog odsustva cis-regulatora u

obrađenim iRNK. Međutim, poslednjih godina, kod različitih vrsta sisara (i drozofile),

otkriven je veliki broj funkcionalnih retrogena, koji su “pozajmili“ cis-regulatore od

susednih gena. Kod sisara, retrogeni se često mogu naći u intronima drugih gena, a

transkribuju se samo sa egzonima najbližim 5’ kraju tih gena, kao jedna od iskrojenih

varijanti iRNK.

Retrogen kod paradajza (Solanum lycopersicum) koji je uslovio pojavu novog

oblika ploda (vretenastog od predačkog okruglog), nastao je uz pomoć specifičnog

retrotranspozona u dva koraka. U prvom koraku, retrotranspozon sličan copia

elementima, greškom je prepisao fragment genoma domaćina dužine oko 25 kb, u

kome se nalazila i kodirajuća oblast IQD12 gena; ovaj gen inače učestvuje u

oblikovanju ploda kod paradajza. U drugom koraku, retrotranspozon je ovaj gen, bez

16

regulatornih elemenata, ugradio u drugi hromozom stvarajući novu kopiju (SUN).

Ovako stvorena kopija sintetisala je potpuno identičan protein, jer je bila ugrađena uz

5’ regulatorne elemente drugog gena. Nova pozicija i novi cis-regulatorni elementi

uslovili su, međutim, da se SUN gen sintetiše u znatno većoj količini tokom ranih faza

razvića ploda, a to je rezultovalo vretenastim umesto okruglim oblikom.

Za razliku od konvencionalne duplikacije gena, prilikom retrotranspozicije

kopije gena se obično ubacuju na neki drugi hromozom u odnosu na “roditeljski gen“.

Od svih hromozoma u kariotipovima sisara, na X hromozomu se nalazi najveći broj

retrogena poreklom od autozomnih gena. Genomsko utiskivanje kroz koje prolaze

“kopije“ ili “originali“, smatra se načinom za smanjenje potencijalne štete do koje

mogu dovesti povećane količine proteina dupliranih gena.

Pošto retrogeni obično nemaju introne, to je jedan od načina za uklanjanje

introna iz gena. Uporedne analize genoma različitih vrsta eukariota pokazale su da

tokom evolucije češće dolazi do gubitaka nego dobitaka introna. Kod sisara, na

primer, nije zabeležen nijedan slučaj gena u koga su ugrađeni novi introni, dok je kod

više od 100 gena zabeležen gubitak introna, verovatno kao rezultat reverzne

transkripcije. Potrebno je takođe istaći da čak i retropseudogeni, koji se daleko češće

javljaju nego retrogeni, ne moraju predstavljati nefunkcionalne delove genoma.

Postoje podaci da neki retropseudogeni kod sisara često stvaraju siRNK, koje regulišu

aktivnost gena od kojih potiču.

Pokazalo se da retrogeni imaju važne funkcije u muškoj germinativnoj liniji,

ali i da su neki od njih vrlo značajni u zaštiti od virusnih infekcija, metabolizmu

hormona i feromona, kao i funkcionisanju mozga. Procenjuje se da je prosečna stopa

nastanka retrogena kod primata 1 retrogen na milion godina, a da u ljudskom genomu

najmanje 120 retrokopija predstavljaju funkcionalne gene. Najpoznatiji primer

retrogena kod čoveka kontroliše sintezu enzima glutamat dehidrogenza 2 (GLUD2),

koji u mozgu degradira neurotransmiter glutamat (enzim je aktivan isključivo u

mitohondrijama). Ovaj gen se nalazi na 10. hromozomu (region 10q23), a nastao je

pre oko 18 do 25 miliona godina reverznom transkripcijom od obrađene iRNK gena

GLUD1 gena sa X hromozoma (Xq24, aktivnost je vezana kako za mitohondrije tako

i citoplazmu). GLUD2 retrogen je u našoj evolucionoj liniji stekao dve značajne

mutacije koje su povećale njegovu enzimsku aktivnost, što je, izgleda, imalo za

posledicu i veću aktivnost neurona.

17

Fosfogliceratna kinaza (PGK) je metabolički enzim koji konvertuje glukozu u

piruvat. Kod sisara postoje dva funkcionalna gena koji kontrolišu sintezu PGK: PGK-

1 se nalazi na X hromozomu i ispoljava se u svim telesnim ćelijama, PGK-2 je

autozomni gen i ispoljava se samo u testisima tokom poslednjih stupnjeva

spermatogeneze. Kod ljudi, PGK-1 se sastoji od 11 egzona i 10 introna. Autozomni

homolog (PKG-2) tog gena je neobičan po tome što nema introne i na 3’ kraju ima

ostatke poli(A) repića, što sve ukazuje da je nastao procesom reverzne transkripcije.

Zadržavanje iste funkcije i ispoljavanje retrogena PGK-2 u specifičnom tkivu

objašnjava se kao kompenzatorni odgovor na inaktivaciju PGK-1 gena na X

hromozomima u spermatogenim ćelijama pre mejoze. Prisustvo autozomnog PGK-2

omogućuje zrelim spermatozoidima da koriste fruktozu iz semene tečnosti. Dakle,

ekspresija ovog retrogena u specifičnim tkivima je, očigledno, razlog njegovog

opstanka sa nepromenjenom funkcijom.

Slično PGK-2, postoji još primera autozomnih retrogena kod sisara (i kod

voćnih mušica) koji predstavljaju retrokopije roditeljskih gena na X-hromozomu, a

ispoljavaju se isključivo u testisima mužjaka. Smatra se da je najverovatniji razlog za

ovu pojavu inaktivacija polnih hromozoma tokom i posle mejotičkog stupnja

spermatogeneze (MSCI, od engl. meiotic sex chromosome inactivation). Prema ovoj

hipotezi, ekspresija autozomnih retrogena, koji potiču sa X hromozoma, je tokom

evolucije “usmeravana“ prema germinativnoj liniji mužjaka, jer na taj način dolazi do

nadomeštanja proizvoda roditeljskih gena koje je inaktivirao MSCI. Zanimljivo je da

su skorašnja proučavanja “mladih“ retrogena primata pokazala da prirodna selekcija i

dalje favorizuje “izvoz“ gena sa X hromozoma. Takođe, analize predstavnika tri

glavne grupe sisara ukazuju da je do selektivnog usmeravanja retrogena sa X

hromozoma na autozome došlo tek posle razdvajanja viviparnih sisara od

monotremata (pre oko 210 miliona godina). Ovaj podatak je značajan i zbog toga što

upućuje na mogućnost da su naši polni hromozomi nastali od autozoma znatno kasnije

nego što smo to do skoro mislili (prema prethodnim procenama, proces nastanka X i

Y hromozoma poklapa se sa vremenom nastanka sisara, tj. pre 310 do 240 miliona

godina). Naime, pošto MSCI pojačava “rekombinacionu barijeru“ između X i Y

hromozoma tokom evolucije, neki autori su zaključili da su se polni hromozomi

pojavili tek kod zajedničkih predaka marsupialnih i euternih sisara. Ovu hipotezu

podržava i skorašnja analiza genoma kljunara, koja je otkrila da su polni hromozomi

18

monotremata homologni sa onim kod ptica, a ne sa X i Y hromozomima torbara i

placentalnih sisara.

2.2.3. Mobilni genetički elementi i specijacija

Barbara McClintock, dobitnica Nobelove nagrade za otkriće mobilnih

genetičkih elemenata, sugerisala je, još 1984. godine, da ME mogu igrati značajnu

ulogu u procesima nastanka novih vrsta. Ova ideja nije naišla na širu podršku

evolucionih biologa, pre svega zbog odsustva empirijskih podataka o prisustvu ME

kod većeg broja taksona. Pošto danas raspolažemo mnoštvom informacija o ME kod

većeg broja prokariotskih i eukariotskih organizama, više se ne može zanemarivati

njihova uloga u specijaciji. Uporedne analize su, na primer, pokazale da evolucione

linije kičmenjaka sa velikim brojem vrsta, poseduju i mobilne elemente sa višom

aktivnošću. Ovi podaci ukazuju da bi povećana plastičnost genoma, zbog više

aktivnosti ME, mogla biti jedan od činilaca intenzivnije specijacije (“adaptivne

radijacije“) takvih grupa. Aktivno ili pasivno, mutagene aktivnosti mobilnih

elemenata obogaćivale su populacije neophodnom genetičkom varijabilnošću.

Sisarski red Chiroptera (ljiljci), posebno podred Michrochiroptera, čija je

specijacija počela pre 55 do 44 miliona godina, dobar je primer adaptivne radijacije

koja je mogla biti povezana sa aktivnošću ME. Ljiljci danas čine više od 22% svih

sisarskih vrsta, a najviše vrsta ima rod Myotis sa čak 103 vrste. Analize genoma

predstavnika ovog roda otkrile su izuzetno bogatstvo i visoku aktivnost ME, i to kako

retro-ME tako i DNK-ME. Posebno je interesantna aktivnost DNK-ME, jer se do

ovog otkrića smatralo da su oni kod sisara inaktivirani poslednjih 37 miliona godina

(veruje se da ova klasa ME ima posebno značajnu ulogu u duplikaciji gena i

kombinovanju egzona u genomima domaćina). Slični nalazi postoje i kod drugog

velikog reda sisara - glodara (Rodentia), koji je danas zastupljen sa oko 1814 vrsta.

Kod glodara su vrlo prisutni i aktivni različiti tipovi retro-ME uključujući i endogene

retroviruse (ERV), koji su, recimo, kod čoveka potpuno neaktivni.

Brojni mobilni genetički elementi bili su aktivni i tokom evolucije Primata. Na

osnovu procene starosti različitih tipova ME u genomima savremenih primata, moglo

se zaključiti da su tokom evolucione istorije ove grupe postojali periodi vrlo

intenzivnog stvaranja ME i da su se ovi periodi poklapali sa pojavom većeg broja

novih vrsta. Na primer, DNK transpozoni bili su veoma aktivni u vreme nastanka

primata – u periodu od pre 80 do 65 miliona godina. Procenjuje se da između 74000 i

19

98300 DNK transpozona primata, koji su fiksirani i u genomu čoveka, potiče iz tog

perioda. Aktivnost DNK transpozona prestaje pre oko 40 miliona godina, ali ne i

drugih familija ME, posebno tzv. Alu familije SINE elemenata, koja je specifična za

primate6. Smatra se da su se prvi Alu nizovi (tzv. AluJ elementi) pojavili pre oko 65

miliona godina, u periodu razdvajanja polumajmuna (Prosimii) i majmuna. Posle tog

razdvajanja, pre oko 45 miliona godina, došlo je do ekspanzije AluS elemenata, što

koincidira sa pojavom tzv. majmuna novog sveta (Ceboidea ili Plathyrrhini). Pre oko

30 miliona godina, pojavljuju se AluY elementi, što se poklapa s vremenom

razdvajanja tzv. majmuna starog sveta (Cercopethecoidea ili Catarrhini) i

Hominoidea.

Možda najbolji primer uloge koju ME mogu imati u procesima nastanka novih

vrsta, odnosi se ribe iz familije Cichlidae iz velikih jezera u Africi. Cihlide su jedna

od najvećih familija kičmenjaka, sa oko 3000 vrsta. Interesantno je da su prvi

predstavnici ove familije nastali pre 121 do 165 miliona godina, ali je pre samo pet

miliona godina, u jezerima Taganjika, Malavi i Viktorija, nastalo između 1000 i 2000

novih vrsta. Oko 2000 vrsta koje danas naseljavaju ta jezera, pokazuje veliki

diverzitet u morfologiji, načinu ishrane i ponašanju, ali vrlo mali genetički diverzitet.

Recimo, u analizi više od 32000 tačkastih polimorfizama (SNP, single nucleotide

polimorphism) kod pet vrsta iz jezera Malavi, nije nađena nijedna fiksirana razlika

između vrsta. Pokazalo se, međutim, da je sklonost ka diverzifikaciji bila najizraženija

kod linije cihlida koja je evoluirala u jezeru Tanganjika, a zatim kolonizirala jezera

Malavi i Viktorija. Analiza 75 SINE elemenata kod ovih riba ukazala je na višestruke

cikluse insercija specifičnih SINE elemenata za kojima su sledile pojave većeg broja

vrsta. Dodatno, geološki podaci pokazuju da je taj deo Afrike, poslednjih 2,5 do 3

miliona godina, prolazio kroz drastične periode suše i, u poslednjih 1,1 milion godina,

kroz ekstremne fluktuacije nivoa vode od nekoliko stotina metara.

Podaci o drastičnim promenama životne sredine, pri kojima je došlo do

pojačavanja aktivnosti ME kod cihlida, potvrđuju da stresni uslovi mogu predstavljati

okidač za povećanu aktivnost ME. Ovo, kako smo u više navrata isticali, može

dovesti do povećanja genetičke varijabilnosti populacija i, naravno, povećati

6U genomu čoveka najzastupljeniji i jedini aktivan tip SINE niza je Alu familija koja čini oko 10% genoma (ime potiče otuda što ovi nizovi sadrže i mesta za restrikcioni enzim pod nazivom AluI). Članovi ove familije, Alu elementi, su nizovi dužine oko 300 bp zastupljeni sa oko milion kopija u genomima ljudi.

20

verovatnoću pojave novih vrsta. Odgovor ME na stres odigrava se na dva načina: 1)

stres direktno aktivira ME i njihovu mutagenost, ili 2) stres inhibira mehanizme

zaštite genoma od ME. Da stres stvarno može povećati aktivnost ME pokazali su

brojni eksperimenti kod niza taksona, kao što su gljive, biljke, insekti, rakovi i sisari.

Različiti stresori (npr. temperaturni ekstremi, oksidativni stres, ili virusne infekcije),

dovodili su do aktivacije različitih ME – posebno SINE elemenata. Takvim stresorima

može biti izložena svaka vrsta koja migrira u neko novo stanište, ili u čijem se staništu

odigraju velike klimatske ili geološke promene.

2.3. Duplikacije genoma i gena

Povećanje broja gena u genomima tokom evolucije odvijalo se na više načina -

od duplikacije jednog ili manjih grupa gena, koja često nastaje tokom replikacije i

rekombinacije DNK, do duplikacija čitavih genoma (poliploidije). Za evolucione

genetičare, jedan od najznačajnih rezultata sekvenciranja genoma velikog broja vrsta

jeste mogućnost identifikacije dupliranih gena i analize karakteristika gena koje

omogućavaju njihovim kopijama da budu fiksirane ili eliminisane iz populacija. Na

primer, funkcionalne klase dupliranih gena, koje su zadržane u genomima savremenih

organizama nakon poliploidije, pokazivale su neobično veliku sličnost između vrlo

različitih taksona. U genomima kvasca Sacharomyces cerevisiae, biljke Arabidopsis

thaliana i Paramecium sp., posle poliploidije koja se odigrala kod njihovih drevnih

predaka (paleopoliploidija), najučestalije zadržane kopije gena su one koje kodiraju za

sintezu ribozomskih proteina, proteinskih kinaza i različitih transkripcionih faktora.

Kod A. thaliana i kvasca uočene su različite evolucione tendencije različitih

funkcionalnih klasa gena – u nekim klasama postoji tendencija da se zadrže kopije

nastale duplikacijama pojedinačnih gena, ali ne i kopije nastale poliploidijom, dok

druge funkcionalne klase imaju obrnutu tendenciju. Takođe, proteini dupliranih gena

posle poliploidije izgleda da stupaju u više interakcija sa drugim proteinima nego

proteini gena nastalih duplikacijama pojedinačnih gena. Postoje i podaci koji ukazuju

da je nivo ekspresije dupliranih gena posle poliploidije znatno viši nego kod gena

nastalih pojedinačnim duplikacijama.

Veliki broj savremenih evolucionih biologa smatra da poliploidija ima veoma

značajnu ulogu u specijaciji i nastanku evolucionih novina (videti deo 3.5). U

poređenju sa duplikacijama pojedinačnih gena, pokazalo se da se veći broj kopija

21

gena nastalih poliploidijom ne transformiše u pseudogene. Ovaj podatak u velikoj

meri podržava hipotezu po kojoj su potpune duplikacije genoma imale vrlo značajnu

ulogu u evoluciji eukariota. Naravno, nameće se i pitanje: zašto bi se razlikovale

sudbine pojedinačno dupliranih gena i kopija gena nastalih duplikacijama čitavog

genoma?

Naime, u slučaju pojedinačno dupliranih gena, proizvodi oba duplikona

interaguju sa istim (nedupliranim) genskim partnerima; to može umanjiti šansu

sticanja novih funkcija i povećati verovatnoću transformacije, jednog od njih, u

pseudogen. S druge strane, prilikom duplikacije čitavih genoma, odigrava se

simultana duplikacija svih gena koji međusobno interaguju, čime se značajno

povećava verovatnoća da čitavo “duplirano partnerstvo“ prođe kroz zajedničke

evolucione promene (koevoluira) i da, eventualno, neki od njih steknu nove funkcije.

Dakle, na ovaj način bi se stekli uslovi za nastanak i evoluciju potpuno novih osobina.

Ovakvi evolucioni događaji mogu se ilustrovati na primeru hormona i njihovih

receptora, gde se funkcionalnost proteina koji čine taj sistem stiče njihovim

međusobnim vezivanjem. Ako bi se duplirali samo geni koji kontrolišu sintezu

hormona, došlo bi do kompeticije proizvoda tih gena za isti receptor. Verovatnoća

sticanja nove funkcije (pa, prema tome, i šansa da neki od njih neće postati

pseudogen) povećava se ako su duplirani i geni za hormonski receptor. Navedeni

primer pokazuje da poliploidija može biti mehanizam evolucione diverzifikacije.

Međutim, treba imati u vidu da mnogi drugi činioci, kao što je, na primer, prisustvo

diferenciranih polnih hromozoma, određuju da li do poliploidije uopšte može doći.

2.3.1. Poliploidija

Do potpune duplikacije genoma može doći putem autopoliploidije, kada se

dupliraju skoro identični genomi, ili putem alopoliploidije, kada se genomi različitih

vrsta nađu u istim ćelijama. Ako ne bi bilo štetnih efekata koji često prate

polipoloidiju, to bi mogao biti najplodotvorniji način povećanja genoma tokom

evolucije, budući da se na taj način odmah udvostručuje veličina genoma. Na primer,

ako bi poliploidija bila jedini način povećanja genoma, tada bi bilo potrebno svega 10

ciklusa duplikacija da se od organizama sličnih savremenim bakterijama postigne

1000 puta veća količina DNK u ćelijama sisara (210 ≈ 1.000). Poređenjem veličina

genoma savremenih organizama, od bakterija do sisara, i uzimajući u obzir da se

22

bakterijska ćelijska organizacija pojavila pre oko 3 × 109 godina, procenjeno je da su

se poliploidije mogle pojavljivati, u proseku, svakih 300 miliona godina. Naravno,

ova procena bi mogla biti validna kada potpune duplikacije genoma ne bi često

dovodile do velikih smanjenja adaptivne vrednosti organizama. Otuda je pravo pitanje

− koliko je poliploidija stvarno doprinela povećanju genoma tokom evolucije?

Delimičan odgovor na ovo pitanje dale su analize kariotipskih promena tokom

procesa specijacije. Kod nekih biljnih taksona, poliploidija se često odigravala, dok je

kod životinja ovaj način povećanja genoma relativno redak događaj. Na osnovu

činjenice da je većina biljnih familija gena vrlo stara i visoko konzervisana, zaključuje

se da je većina genoma suvozemnih biljaka izgrađena na ostacima vrlo starih

udvostručenja genoma (Soltis i sar., 2009). U analizama fosilnih angiospermi,

korišćenjem podatka da je veličina ćelije u korelaciji sa brojem hromozomskih

garnitura, dobijena je procena da je predački haploidni broj hromozoma bio 7 ili 9, i

da bar 70% cvetnica ima poliploidnu specijaciju u svojoj evolucionoj prošlosti. Kod

mahovina i paprati ovi procenti se kreću i do 95%. Kod novijih specijacija, procenjuje

se da je između 2% i 4% novih vrsta cvetnica nastalo poliploidijom (uglavnom

alopoliploidijom)7.

Na osnovu analize paranoma, tj. kolekcije dupliranih gena, u oko 7000

multigenskih familija kod biljke Arabidopsis thaliana (danas spada u diploidne vrste)

izveden je zaključak da je kod njenih predaka došlo do potpune duplikacije genoma u

tri navrata (ovi događaji se označavaju kao 1R, 2R i 3R; R potiče od engl. round)

tokom poslednjih 250 miliona godina. Takođe, načinjen je evolucioni model pomoću

kog je simulirana populaciona dinamika dupliranih gena u različitim funkcionalnim

klasama. Model se zasniva na raspodeli sinonimnih zamena po mestu u genomu

(Maere i sar., 2005)8. Ova analaza je pokazala da su se posle tri poliploidna događaja

7 Alopoliploidna specijacija je češća od autopoliploidne. Naime, kod hibrida dve vrste, tj. jedinki u kojima su prisutni genomi dve vrste, empirijski podaci su pokazali da je verovatnoća nerazdvajanja hromozoma u gametogenezi 50 puta veća nego kod pripadnika svake od vrsta. Autopoliploidija nastaje kada tokom gametogeneze kod jedinki jedne vrste ne dođe do razdvajanja hromozoma usled čega se formiraju diploidni gameti, a spajanjem takvih gameta dobija se tetraploidno potomstvo. 8 Pošto sinonimne zamene nukleotida ne dovode do aminokiselinskih zamena u proteinima, očekuje se da njihove stope budu relativno konstantne kod različitih proteina i da zavise samo od stopa mutacija. U tom slučaju može se primeniti molekulski sat i proceniti vreme (T) potrebno za divergenciju dva nukleotna niza u kojima su se javljale sinonimne mutacije (KS), T = KS/2λ, gde je λ prosečna stopa sinonimnih zamena (Maere sar., 2005 su uzimali dve λ vrednosti: 1,5 × 10-8 zamena po mestu po godini, i 6,1 × 10-9 zamena po mestu po godini). Na osnovu KS paranoma arabidopsisa, procene starosti vremena kada su se odigrale tri poliploidije u evoluciji angiospermi bile su sledeće: 1R = 101-168 miliona godina, 2R = 66-109 mil. god., 3R = 24-40 mil. god.

23

kod predaka, u genomu arabidopsisa preferencijalno zadržavali geni odgovorni za

transkripcione faktore, transdukciju signala i razviće; preko 90% tih gena stvoreno je

tokom 250000 godina, posebno u periodima koji su sledili dve najstarije polipolidije

(1R i 2R).

Analiza paranoma kod aradopsisa je takođe pokazala da se geni uključeni u

sekundarni metabolizam ili odgovore angiospermi na napade patogena ili herbivora

(biotički stresori) zadržavaju u genomima bez obzira na to kako su nastali –

poliploidijom ili duplikacijama pojedinačnih gena. Zanimljivo je, međutim, da su se

geni uključeni u odbranu biljaka od abiotičkih stresora, kao što su suša, niske

temperature ili slanost zemljišta, pretežno zadržavali posle poliploidija. Ovi podaci se

mogu povezati sa velikim fizičkim promenama abiotičke sredine u vreme velikih

duplikacija genoma - procenjeno vreme za 1R i 2R poklapa se sa velikim tektonskim

poremećajima i porastom CO2 u atmosferi (npr. u periodu pre 120 i 80 miliona godina

došlo je do raspada superkontinenta Pangee).

Studije na genomima drugih angiospermi, koje su urađene nakon analize

paranoma A. thaliana, nisu potvrdile sve gore navedene nalaze. Pored A. thaliana,

poznati su kompletni genomi sledećih cvetnica (Soltis i sar., 2009): Oryza sativa

(pirinač), Populus trichocarpa (kalifornijska topola), Vitis vingifera (vinova loza),

Carica papaya (papaja). Analize genoma ovih vrsta ukazale su da je tokom evolucije

angiospermi stvarno dolazilo do poliploidija, ali je njihov broj varirao od vrste do

vrste tako da se ne može sa sigurnošću reći koliko je tačno bilo paleopoliploidija kod

biljaka cvetnica. Kod drugih biljaka sa semenom, izuzev Gnatales, postoji veoma

malo podataka o drevnim poliploidijama.

Duplikacije nekoliko gena sa MADS blokovima (to su različite klase

transkripcionih faktora), koji imaju značajnu ulogu u razviću cveta, takođe ukazuju na

polipolidiju tokom rane evolucione istorije angiospermi9. Na primer, gimnosperme

imaju aktivnu samo jednu B-funkciju, dok angiosperme imaju dve, koje su se, 9 Obrazac ekspresije gena sa MADS blokovima poznat je pod nazivom ABC model determinacije organa cveta. Prema ovom modelu, odgovarajuća diferencijacija četiri cvetna organa (krunice, čašice, prašnika i karpela) tipičnog biseksualnog (hermafroditnog) cveta, predstavlja rezultat delovanja tri transkripciona faktora (A, B, i C), čije se aktivnosti delimično preklapaju, a koje su zasnovane na različitim brojevima MADS gena. Aktivnost isključivo faktora A, određuje čašične listiće; A plus B faktori daju krunične listiće; A plus C faktori određuju prašnike, a aktivnost samo C faktora daće karpele. Zanimljivo je, takođe, da narušavanje normalne funkcije ABC proizvoda dovodi do pojave cvetova, koji zadržavaju svoj osnovni oblik, ali imaju niz karakteristika lista − biljnog organa čijom su transformacijom tokom evolucije i nastali. Dodatna zanimljost je da je poznati nemački pesnik Gete prvi govorio o cvetu kao “metaformoziranom listu”.

24

najverovatnije, pojavile pre njihovog nastanka (starost tih duplikacija se procenjuje na

oko 260 miliona godina). Slično je i sa C-funkcijom. Kod angiospermi, za razliku od

gimnospermi, postoje dve grupe tih gena, jedna koja ima ulogu u razviću prašnika i

karpele i druga sa ključnom ulogom u formiranju ovula. Pošto su duplikacije nekih od

gena sa MADS blokovima vrlo stare, dok su druge znatno mlađe, ti podaci, opet,

ukazuju da je tokom evolucije angiospermi bilo nekoliko poliploidija.

Najubedljiviji pokazatelji potpunih duplikacija genoma tokom filogenije

kičmenjaka odnose se na skupove (“jata“) tzv. Hox gena (deo 3.2.2). Amphioxus

(Cephalochordata) ima jedan skup Hox gena, kolouste imaju dva do tri, a kičmenjaci

sa vilicom, od riba do čoveka, imaju najmanje četiri odvojene grupe Hox gena, koji se

nalaze na različitim hromozomima. Na osnovu uporedne analize Hox gena

postavljena je hipoteza prema kojoj su se, tokom filogenije kičmenjaka, odigrale dve

velike duplikacije gena (1R i 2R). Ranije se pretpostavljalo da se prva duplikacija

desila u liniji koja se odvojila od cefalohordata, a druga nakon divergencije predaka

savremenih kičmenjaka sa vilicom (pre 395 do 345 miliona godina). Prema toj

hipotezi, prva duplikacija obuhvatala je čitav genom, dok bi se druga odnosila na

višestruke tandemske duplikacije gena. Nedavno obavljena analiza na 55 genskih

familija (sa ukupno 150 gena koji su se nalazili na 22 autozoma i X hromozomu), gde

su, pored gena sa homeo domenima, uključene i druge familije čiji se bar jedan član

(gen) nalazi i kod kolousta, potvrdile su da su svi kičmenjaci, uključujući i ribe

kolouste, doživeli dve runde (1R i 2R) potpune duplikaciju genoma (Kuraku i sar.,

2009). Prisustvo “primitivnih“ morfoloških osobina kod kolousta (Agnatha)

objašnjava se sekundarnim modifikacijama njihovih genetičkih arhitektura. U

evolucionoj liniji košljoriba (Teleostei) pojavila se još jedna runda potpune

duplikacije genoma (3R), koja se odigrala pre 236 do 350 mil. godina, približno u

vreme masovnog izumiranja na granici Perma i Trijasa (250 mil. god.). Savremene

procene 2R potpune duplikacije genoma vertebrata kreću se od 520 do 550 mil.

godina, što je početak tzv. kambrijske eksplozije (videti i deo 3.5.2). Mnogi

istraživači smatraju da je poslednja potpuna duplikacija genoma razlog za vrlo

intenzivnu specijaciju košljoriba; u ovu grupu se svrstava preko 20000 danas živih

vrsta. Samo u okviru roda Barbus, filogenetska analiza pokazuje da je poliploidija

inicirala specijaciju najmanje 3 puta. Jedan od mogućih razloga za povećanje

diverziteta vrsta košljoriba mogao je biti gubitak različitih kopija gena u odvojenim

populacijama (to se često naziva “recipročnim gubitkom gena“, RGL, engl. reciprocal

25

gene loss). Naime, u izolovanim populacijama povećava se verovatnoća da će među

hiljadama dupliranih gena i regulatornih RNK doći do diferencijalnog gubitka

njihovih kopija. U tom slučaju, ako se jedinke različitih populacija eventualno ukrste,

postoji velika verovatnoća da, zbog genetičke inkompatibilnosti, iz takvog ukrštanja

neće nastati vijabilno i fertilno potomstvo. Drugim rečima, dolazi do uspostavljanja

post-zigotske reproduktivne izolacije. Da je RGL stvarno mogao biti uzrok

specijacije, pokazuje i poređenje genoma dve vrste košljoriba Tetraodon nigroviridis i

Danio rerio (zebrica), kod kojih je oko 1700 (ili 8%) predačkih gena doživelo

recipročni gubitak (Semon i Wolfe, 2007).

Takođe, poliploidne klade biljaka cvetnica znatno su bogatije vrstama u

poređenju sa kladama kod kojih se ne javlja poliploidija. Kod trava (Poacaee), koje

danas imaju 658 rodova sa oko 10000 vrsta, procenjuje se da je do potpune

duplikacija genoma došlo u periodu od pre 70 do 50 miliona godina, što je blizu

vremena kada su, najverovatnije, trave i nastale (najstariji fosili ove grupe datiraju se

na oko 55 miliona godina). Pretpostavlja se da je kod leguminoza (Fabaceae) do

poliploidije došlo neposredno pre adaptivne radijacije koja je dovela do pojave oko

19000 vrsta. Takođe, kod Solanaceae (koje su nastale pre 49 do 68 mil. god.)

poliploidija se datira na vreme od pre 50 do 52 miliona godina.

Proučavanje ostrvske flore, posebno one koju nalazimo na vulkanskim

ostvima, može nam pomoći u razumevanju razloga koji su doveli do poliploidije za

kojom je sledila adaptivna radijacija niza cvetnica. Disperzija na vulkanske arhipelage

podrazumeva naseljavanje novih staništa koja su drastično drugačija i dinamično se

menjaju u relativno kratkom vremenu. Ciklusi velike nestabilnosti u ovakvim

životnim sredinama mogu se ponavljati s pojavom svakog novog ostrva u arhipelagu.

Smatra se da su i preci savremenih angiospermi naseljavali takve životne sredine na

prelazu iz Krede u Tercijar (pre oko 65 mil. god.).

Jedna od najbolje proučenih flora smeštena je u havajskom aripelagu,

udaljenom od Južne Amerike oko 3500 km. Ostrva ovog arhipelaga pokazuju

gradijent starosti od zapada prema istoku (najstarije ostvo je Kauai – 5 mil. god., a

najmlađe je Havaji – 500000 god.). Cvetnice koje naseljavaju Havajska ostrva imaju

najveću učestalost poliploidije, pri čemu najveći broj havajskih vrsta predstavlja

paleopoliploide – pre naseljavanja ovih ostrva njihovi preci su već bili poliploidni. Na

primer, endemične metlice sa ovih ostrva (svrstavaju se u tri roda i 60 vrsta) su

poliploidne (2n = 64, 66), i sve vode poreklo od roda Stachus sa pacifičke obale

26

Severne Amerike. Ovaj rod je alopoliploid nastao ukrštanjem dve vrste – jedne sa

cvetovima koje su oprašivale ptice i druge koje su oprašivali insekti. Morfološka i

ekološka diverzifikacija metlica na Havajima je izuzetno velika – nalaze se na velikim

visinama, ali i u kišnim šumama, sa cvetovima koje oprašuju ptice ili insekti.

Molekularno biološka istraživanja su pokazala da ovako velikoj evolucionoj

plastičnosti jesu doprinosili veliki intergenomski rearanžmani, promene načina

regulacije aktivnosti gena i, kod alopoliploida, veliki broj fiksirani heterozigota.

Heteroza i brze genetičke i epigenetičke promene predstavljaju osnovu

prilagođavanja poliploida na ekstremne uslove životne sredine. Kod poliploida,

posebno alopoliploida, povećanje heterozigotnosti gena može dovesti do porasta

varijabilnosti u ekspresiji gena i regulatornim vezama, što, kao posledicu, može imati

povećanje vijabilnosti i bržih adaptacija na nove uslove. Nekoliko studija na

cvetnicama je pokazalo da su poliploidne forme tolerantnije na širi spektar sredinskih

uslova nego diploidne forme, kao i da su poliploidi znantno invazivniji i mogu

kolonizovati životne sredine u kojima diplodi uopšte ne uspevaju. Poliploidni insekti

takođe imaju širu geografsku raspodelu nego njihovi diploidni preci. Relativno novo

nastala tetraploidna žaba, Xenopus laevis, je vrlo invazivna vrsta i često naseljava

staništa koje je čovek narušio. Ova vrsta žaba je daleko otpornija na slanost staništa,

sušu, hladnoću, izgladnjivanje i niz patogena i parazita od svog diploidnog srodnika,

žabe Silurana tropicalis.

Biljka Arabidopsis thaliana ne samo da je paleopoliploid već je, zajedno sa

vrstom A. arenosa, uključena u stvaranje relativno novog prirodnog aloploida

Arabidopsis suecica (Ni i sar., 2009). Pošto se ovaj prirodni aloploid može iznova

napraviti u laboratoriji, moguće je analizirati genetičke i fenotipske promene koje se

javljaju u prvim generacijama posle formiranja alopoliploida. Jedna od osobenosti

ovog aloploida, kao i mnogih drugih do sada analiziranih, jeste njegova veća biomasa

u odnosu na obe roditeljske vrste. Istraživanje uzroka povećanja biomase pokazalo je

da je od 128 gena sa povećanom ekspresijom kod aloploida, 67% je pokazivalo

povezanost sa dva gena (CCA1 i LHY) koji regulišu cirkadijalni ritam (oba gena su

odgovorna za supresiju fiksacije ugljen dioksida preko noći). Zanimljivo je takođe da

su oba gena kod alopoliploida bili epigenetički suprimirani i da je ta supresija bila u

korelaciji sa povećanom sintezom skroba i sadržaja hlorofila. Ovaj eksperiment je

značajan jer pokazuje da bitna fenotipska promena, koja sledi posle alopolipolidije,

nije posledica genetičkih već epigenetičkih promena, koje se odigravaju u

27

vremenskom pomaku u ekspresiji regulatornih gena. Eksperiment sa neopoliploidijom

kod arabidopsisa u skladu je i sa jednim principom koji je uočen kada su analizirane

genetičke promene nakon potpune duplikacije genoma. Prema tom principu, duplirani

geni najčešće divergiraju u mehanizmima genske regulacije, a najređe u svojim

biohemijskim funkcijama.

2.3.2. Duplikacije pojedinačnih gena

Osnovni mehanizam dupliranja pojedinačnih gena jeste nejednak krosing-

over. Nejednak krosing-over nastaje kao posledica pogrešnog postavljanja delova

homolognih hromozoma i njihove rekombinacije. Rekombinacija između pogrešno

“sparenih“ regiona dovodi, s jedne strane, do delecije, a s druge strane, do duplikacije

određenih delova homolognih hromozoma. Ako duplirani nizovi DNK zadrže isti

smer (to se naziva “glava-rep“ vezivanjem), dobijaju se tandemski ponovci. Na

osnovu analize paralognih gena većeg broja eukariota, procenjena stopa pojave novih

kopija gena iznosi od 0,001 do 0,017 po genu na milion godina (Lynch i Conery,

2003).

Prva značajna posledica tandemskih duplikacija jeste dodatno povećanje

verovatnoće nejednakog krosing-overa sa porastom broja tandemskih kopija budući

da se kopija gena jednog lanca može sparivati sa bilo kojom kopijom na drugom lancu

DNK. Na ovaj način može doći do brze ekspanzije tandemskih ponovaka, odnosno do

formiranja velikih familija gena. Druga značajna posledica je homogenizacija članova

multigenske familije i usporavanje njihove divergencije usled čestog odigravanja

krosing-overa. Ova tendencija gena unutar multigenskih familija da evoluiraju na

sličan način naziva se zajedničkom evolucijom (sin. horizontalna ili koincidentna

evolucija; engl. concerted evolution). Pored nejednakog krosing-overa, drugi

mehanizam koji obezbeđuje horizontalno premeštanje mutacija između članova jedne

multigenske familije jeste konverzija gena - proces jednosmernog transfera DNK

informacije sa jednog gena na drugi. Konverzija gena se najčešće odigrava tako što

neki alel, ili njegov deo, dobije niz nukleotida od drugog alela istog gena (intraalelska

ili intralokusna konverzija). Taj proces se najčešće odvija tokom rekombinacije i

reparacije pogrešno vezanih baza (engl. DNA mismatch repair). U klasičnom primeru,

u procesu rekombinacije, nastali heterodupleks može sadržati jednu ili više pogrešno

vezanih baza. Mehanizmi reparacije popravljaju pogrešno sparene baze, pri čemu kao

28

matricu za popravku mogu koristiti lanac sa drugog DNK molekula što dovodi do

zamene jedne sekvence drugom (slika 2.4).

Slika 2.4. Poreklo genske konverzije. a) Shematski prikaz razmenjenih delova u heterodupleksu. b) Genska konverzija: niz označen sa e koristi se kao matrica za reparaciju pogrešno vezanih baza (e’ je niz suprotnog pravca). Posledica ovog procesa je odstupanje od očekivanih “mendelovskih“ proporcija u potomstvu. c) Popravka bez genske konverzije: obe DNK koriste svoje sekvence kao matricu za popravku pogrešno vezanih baza.

Interlokusna genska konverzija (konverzija između lokusa na istom ili

različitim hromozomima) odvija se između nizova sa visokim stepenom sličnosti, kao

što su paralogni nizovi (npr. članovi MGF) ili pseudogeni. I u ovom slučaju, pogrešno

sparivanje sličnih nizova i korišćenje jedne matrice rezultuje nerecipročnim

transferom između “donorske“ i “primajuće“ sekvence (slika 2.5). Takođe, kako se

pokazalo, do ovog fenomena može doći i u procesu popravke prekida duplog heliksa;

pokazano je da postoji veći stepen genske konverzije nakon izlaganja organizama

nekim mutagenim agensima koji izazivaju prekid DNK – npr. radijacija. U širem

smislu, i ugradnja retrotranskipata na druga mesta u genomu, može se smatrati

genskom konverzijom.

Slika 2.5. Genska konverzija između članova multigenske familije. Donorski niz, koji se prepisuje u familiji gena, obeležen je crvenom bojom.

29

Važno je još jednom naglasiti da navedeni mehanizmi ne dovode do

usporavanja evolucionih promena paralognih nizova, već povećavaju verovatnoću da

će se oni menjati na sličan način. Ovaj fenomen pokazan je u uporednim analizama

multigenskih familija kod pripadnika iste vrste i između različitih vrsta. Ustanovljeno

je da su paralogni članovi mnogih multigenskih familija međusobno vrlo slični unutar

vrste, ali da se između vrsta, čak i srodnih, ortologni članovi iste familije gena često

bitno razlikuju. Ako je genetički drift bio populacioni mehanizam fiksacija sličnih

promena članova multigenskih familija, onda se to naziva molekulskim vođenjem

(engl. molecular drive).

Dakle, sve dok su duplirani geni blisko vezani jedan uz drugi i sve dok su

njihovi nizovi dovoljno slični, oni će evoluirati na sličan način. U tom, obično ranom,

periodu postojanja multigenskih familija, divergencija njenih članova je usporena što,

opet, smanjuje verovatnoću da se kopije gena transformišu u pseudogene. Savremeni

podaci opovrgli su ranija očekivanja molekularnih biologa da preko 99% dupliranih

gena evoluira u pseudogene. Na primer, procenjuje se da je oko 8% dupliranih gena

kod kvasca, ostalo funkcionalno u periodu od preko 100 miliona godina; kod

kukuruza, žaba iz roda Xenopus i salamandri, taj procenat prevazilazi 70% za vreme

koje varira od oko 11 do 100 miliona godina.

Osim gore opisanih mehanizama zajedničke evolucije, sličnim evolucionim

promenama paralognih gena mogu doprineti i neki oblici prirodne selekcije. Na

primer, ukoliko duplirani geni zajednički kodiraju proteine sa većim brojem domena,

štetna mutacija u jednoj kopiji gena (koja kodira za jedan domen) može dovesti do

sinteze nefunkcionalnog proteina u interakcijama sa domenima drugih gena. U takvoj

situaciji, selekcija će eliminisati štetne mutacije i održavati multidomenski protein

(odnosno multigensku familiju) u funkcionalnom stanju. Takođe, duplirani geni mogu

zadržavati svoju funkcionalnost ukoliko postoji selektivna prednost visokog nivoa

njihove ekspresije. Takva situacija uočena je, na primer, kod niza enzima koji

učestvuju u zaštiti insekata od različitih insekticida. U slučaju pojave mutacija u

promotorskim regionima gena, koje dovode do divergencije članova multigenske

familije u odnosu na vreme i/ili tkivo u kome se oni ispoljavaju, a ukoliko su takve

promene ekspresije povoljne, selekcija može dovesti do njihovog održavanja u

funkcionalnom stanju.

30

Od 9990 analiziranih genskih familija sisara (čovek, šimpanza, miš, pacov i

pas), 164 (tj. 1, 6%) familije su pokazivale brže promene u broju članova nego što se

očekuje u neutralnoj evoluciji (Demuth i Hahn, 2009). Drugim rečima, kod ovih

familija, promene u broju članova najverovatnije se nalaze pod kontrolom prirodne

selekcije. U ovu grupu spadaju familije gena koji učestvuju u imunskim odgovorima,

transkripciji, translaciji, razviću neurona i mozga, međućelijskoj komunikaciji i

transportu, reprodukciji i hemorecepciji. Kod velikog broja eukariotskih genoma

postoje velike multigenske familije za rRNK, tRNK i histone, sa desetinama

identičnih kopija gena (npr. kod čoveka postoji po 50 do 70 kopija gena za različite

rRNK na 5 hromozoma: 13, 14, 15, 21, 22). Ovim masivnim duplikacijama gena

obezbeđuje se sinteza ogromnih količina proizvoda koji su neophodni prilikom

intenzivnih deoba ćelija (npr. tokom ranih faza razvića embriona). Smatra se da

ovakve duplikacije gena predstavljaju evoluciono stariji način povećanja količine

važnih proteina u poređenju sa regulacijom ekspresije pojedinačnih kopija gena koja,

takođe, može obezbediti visoku produkciju određenih proteina u specijalizovanim

ćelijama. Analize nekih genskih familija pokazale su da ekspanzije njihovog broja

mogu biti specifične za evolucionu liniju – kod sisara, od ukupnog broja familija gena

koje pokazuju promene u veličini, u oko 56% promene se uočavaju u samo jednoj

evolucionoj liniji.

Mada, kako smo ranije rekli (deo 2…), broj gena koji kodiraju proteine u

genomima nije nužno u korelaciji sa složenošću eukariotskih organizama, broj kopija

gena u genskim familija pokazuje tendenciju da se povećava sa povećanjem

složenosti organizma. Recimo, analiza 1219 superfamilija gena 38 eukariotskih vrsta

pokazala je pozitivnu korelaciju između broja gena unutar superfamija i broja tipova

ćelija koje organizmi imaju (Vogel i Chothia, 2006). Dobar primer za ovu tendenciju

su geni za transkripcione faktore, koji kontrolišu razviće različitih morfoloških

osobina. U genomu čoveka, superfamilija gena za transkripcione faktore sa

homeodomenima ima više od 200 gena koji se svrstavaju u 49 familija, a kod biljke A.

thaliana u superfamiliji ovih gena postoji oko 80 gena.

2.3.3. Mehanizmi nastanka novih gena

Do divergencije nizova nukleotida u sastavu gena koji kodiraju proteine,

odnosno do pojave novih funkcija, može doći i bez duplikacije gena. Tokom

evolucije, ortologni geni u različitim taksonima akumuliraju različite mutacije. Ovaj

31

proces može uzrokovati promenu funkcije gena, tj. pojavu da geni sa zajedničkim

poreklom kodiraju za proteine sa različitom aktivnošću kod različitih organizama. To

se posebno odnosi na gene čije funkcije nisu deo osnovnih metaboličkih procesa.

Ukoliko prirodna selekcija favorizuje neke od tih mutacija, fiksiraće se divergentne

varijante ortolognih gena kod različitih vrsta.

Među brojnim primerima ovog procesa, navešćemo nekoliko koji se odnose na

globinske gene i ilustruju kako određene mutacije u ovim genima mogu dovesti do

adaptacija životinja na specifične uslove životne sredine. Kod nekih životinja koje

mogu živeti pod hipoksičnim uslovima (na visokim nadmorskim visinama), kao što su

lame (Lama glama), alpake (L. pacos), guanake (L. guannacoe) i vikunje (L.

vicugna), na drugom mestu β lanca hemoglobina nalazi se asparaginska kiselina

umesto histidina. Histidin se inače nalazi kod kamila, najbližih srodnika lama.

Potpuno ista zamena aminokiselina postoji i kod indijskih i afričkih slonova, koji

mogu da se penju i do 4500 m nadmorske visine. Ovakva široka prisutnost iste

mutacije kod različitih vrsta, a koja je u svakoj od ovih evolucionih linija

favorizovana prirodnom selekcijom zbog delovanja istih “selekcionih režima“ (tj.

života pod hipoksičnim uslovima) predstavlja primer konvergentne evolucije. Kod

dve vrste gusaka, takođe je utvrđeno da samo jedna zamena aminokiselina u

hemoglobinskim lancima može promeniti njihov afinitet prema kiseoniku. Kod guske

Anser indicus, koja leto provodi na Tibetanskim jezerima (4 000 do 6 000 m

nadmorske visine) i koja tokom svojih zimskih migracija preleće Mont Everest (9200

m n.v.), zamena alanina prolinom na 119 mestu α lanca odgovorna je za visok afinitet

hemoglobina prema kiseoniku. Kod andske guske (Chloephaga melanoptera), koja

stalno živi na nadmorskim visinama od 5.000 do 6.000 m, adaptacija hemoglobina na

hipoksične uslove postignuta je zamenom leucina serinom na 55 mestu β lanca.

Stariji modeli koji su se bavili nastankom novih funkcija gena, uglavnom su

pretpostavljali da se nove funkcije u okviru jedne evolucione linije mogu pojaviti

nakon nastanka nove kopije, tj. posle potpune duplikacije pojedinačnih gena. Prema

tzv. klasičnom modelu, koji je dat još sedamdesetih godina XX veka (Ohno, 1970;

Kimura i Ota, 1974), duplikacija gena je neutralan događaj tako da kopija nekog gena

akumulira mutacije bez “nadzora“ prirodne selekcije. Slučajno nastale mutacije mogu

pod određenim okolnostima (promenom životne sredine ili novim interakcijama sa

proizvodima drugih gena) dovesti do nove funkcije, koju, naravno, počinje da

32

“prepoznaje“ prirodna selekcija. Ovaj model, međutim, nije danas široko prihvaćen

budući da su empirijska istraživanja pokazala da geni koji evoluiraju samo putem

genetičkog drifta, najčešće akumuliraju tzv. destabilizujuće mutacije, koje dovode do

agregacije proteina, što, opet, smanjuje adaptivnu vrednost organizama (tj. nisu

neutralne). Takođe, često su obe kopije gena izložene delovanju tzv. purifikujuće

selekcije – selekcije koja eliminiše mutacije koje destabilizuju biohemijske puteve u

kojima dati geni učestvuju. Najveći problem sa klasičnim modelom nastanka novih

gena jeste to što se model zasniva na ideji jedan gen (jedna struktura) – jedna

funkcija. Ova koncepcija o genima (tj. njihovim proteinima) kao specijalistima, je u

savremenoj biologiji potpuno odbačena. Danas postoje različiti modeli nastanka novih

funkcija gena, koji se zasnivaju na tzv. “zajedničkim genima“ (engl. gene sharing),

odnosno na ideji da geni i njihovi proteini uglavnom obavljaju više od jedne funkcije.

Ideja da se geni mogu tretirati kao generalisti inspirisana je otkrićima prvih

zajedničkih gena kod nekih proteina (kristalina) iz sočiva oka kičmenjaka. Ovi

proteini imaju identičnu, ili skoro identičnu, strukturu nekim metaboličkim

enzimima10. Posle kristalina otkriveni su brojni primeri “vrbovanja“ gena da obavljaju

više funkcija, bez promena aminokiselinskog sastava proteina ili duplikacije samog

gena. Dakle, pokazano je da se isti polipeptid može koristiti i kao enzim i kao

strukturni protein, naravno u različitim tkivima. Mnogi proteini obavljaju funkcije za

koje nisu tokom evolucije bili “pripremani“. Ta tzv. funkcionalna plejotropija zasniva

se, između ostalog, na postojanju različitih proteinskih konformacija na osnovu istog

niza aminokiselina. Ova plastičnost proteina može biti polazište za evoluciju novih

funkcija, odnosno novih gena koji će ih kontrolisati. Do pojave “kooptiranja“ gena za

nove funkcije, može doći kada mutacije u regulatornim elementima dovode gen pod

kontrolu transkripcionih faktora specifičnih za određena tkiva (fenomen poznat pod

nazivom “genetička piraterija“). Na primer, BMP familije gena kod kičmenjaka imaju

mnoštvo funkcija u procesu razvića različitih organa (npr. BMP4 učestvuje u

formiranju očnog sočiva, razviću skeleta i dorzalnog CNSa, apoptozi čvorišta zubne

gleđi, itd). Zanimljiv je primer BMP2 gena koji se, zajedno sa Shh genom, u novom

kontekstu razvića u evolucionoj liniji ptica eksprimira u distalnom epitelu pupoljka

10 Na primer, kristalin δ (nalazi se kod nekih ptica i gmizavaca) i enzim argininosukcinat lijaza (ASL, katalizuje konverziju argininosukcinata u aminokiselinu arginin) imaju identične nizove aminokiselina i kodirani su istim genom! Inače, kod različitih vrsta kičmenjaka nađeno je desetak gena koji istovremeno kodiraju različite kristaline i enzime.

33

pera. Ovi geni, koji imaju svoje ortologe i kod beskičmenjaka, i učestvuju u razviću

brojnih tkiva kičmenjaka, kooptirani su za funkciju razvića pera kod ptica.

Postoji mogućnost da tokom evolucije dođe do “sukoba interesa“ dve funkcije

istog gena. Takav scenario se može očekivati kada određeni alel nekog gena daje

svojim nosiocima višu adaptivnu vrednost zbog njegove efikasnije, na primer,

strukturne uloge, ali istovremeno uslovljava manju aktivnost enzima. U takvoj

situaciji, duplikacija gena za kojom sledi funkcionalna specijalizacija nastalih kopija

predstavlja jedno od mogućih rešenja. Ovaj proces je poznat pod imenom

“izbegavanje adaptivnog sukoba“ (EAC; engl. escape from adaptive conflict). Da je

tokom evolucije dolazilo do izbegavanja adaptivnog sukoba pokazuju geni za enzim

argininosukcinat lijazu (ASL) i δ kristaline. Jedan od dva blisko locirana ASL/δ gena

za kristalin kod kokošaka, δ1, specijalizovan je za sočivo oka (proizvodi više od 95%

δ kristalinske iRNK) a drugi, δ2 gen, kodira pretežno enzimski aktivan ASL u drugim

tkivima. Interesantan primer je i duplikacija gena za alkoholnu dehidrogenazu (ADH)

kod kvasca S. cerevisiae. Ovde, jedna kopija gena je uključena u konverziju

acetaldehida u etanol, a druga u obrnutu reakciju. Rekonstrukcijom predačke funkcije

Adh gena pokazano je da je prva funkcija predačka (Thomson i sar., 2005). Takođe je

pokazano da je proizvodnja etanola prvobitno bila korišćena za regeneraciju

enzimskih kofaktora kada se kvasac nalazio u sredinama sa malo kiseonika, a da je

duplikacija Adh gena omogućila pojavu novog fenotipa – unošenje umesto

izbacivanja etanola.

Slika 2.6. Različiti modeli nastanka gena, tj. nove funkcije (prema: Soskine i Tawfik, 2010).

34

Nastanak gena procesom izbegavanja adaptivnog sukoba teško se može

razlikovati od nastanka gena putem neofunkcionalizacije. U slučaju

neofunkcionalizacije, nova funkcija se stiče delovanjem direkcione selekcije na jednu

kopiju, dok se originalna funkcija zadržava u drugoj kopiji gena. Pošto je još uvek

teško u eksperimentima jasno razdvojiti efekte prirodne selekcije i genetičkog drifta

na fiksaciju novog oblika gena, ne postoje adekvatne procene relativnog značaja

adaptivnih i neutralnih procesa u nastanku novih gena posle potpune duplikacije (Des

Marais i Rausher, 2006). Primer funkcionalnih promena i direkcione selekcije na

jednu od kopija gena nalazimo kod himernog jingwei gena voćnih mušica, koji kodira

za enzim alkoholnu dehidrogenazu. Ovaj enzim pokazuje preferenciju prema

dugolančanim alkoholima, a smanjenu sposobnost katalize etanola – što je sasvim

suprotno od roditeljskog Adh gena (Zhang i sar., 2004)11. Smatra se da je familija

gena terpenske sintaze, koja je kod smrče (Picea abies) uključena je u modifikaciju

sekundarnih metabolita, prošla nekoliko rundi neofunkcionalizacije. Kod te familije,

mali broj ključnih aminokiselinskih zamena kod dupliranih gena dovodio je do

radikalno promenjene supstratne specifičnosti i terpenoidnog profila.

Neofunkcionalizacije putem ovakvih malih promena, veruje se takođe, dovele su kod

konifera do pojave širokog spektra sekundarnih metabolita, koji imaju ključnu

funkciju u zaštiti od patogena i herbivora.

U procesima koji se opisuju kao “duplikacija–degeneracija–komplementacija“

(DDC, engl. duplication, degradation, comlementation) dolazi do podele dve ili više

funkcija predačkog gena na novonastale kopije. U slučaju subfunkcionalizacije, kako

se još naziva ovaj fenomen, duplirani geni opstaju u genomu zbog mutacija koje u

svakoj kopiji inaktiviraju drugu originalnu funkciju. Svaka od tih mutacija je

neutralna, a ne štetna, jer nedostajuću funkciju jedne kopije nadoknađuje druga

kopija. Mnogi evolucioni genetičari smatraju da subfunkcionalizacija najbolje

objašnjava veliko prisustvo dupliranih gena kod eukariota, jer se ovde pretpostavlja

najmanji broj evolucionih događaja, tj. samo postojanje roditeljskog gena sa više od

jedne funkcije i malog broja “degenerativnih“ mutacija.

11 U kineskoj mitologiji, Jingwei je princeza koja se, posle davljenja u moru, reinkarnirala u pticu. U takvom obliku, ona je grančicama i kamenčićima pokušavala da zatrpa more u kome se udavila – praktično nemoguć zadatak koji je ona bila spremna da obavlja milionima godina. Drozofilski jingwei gen je, poput princeze, “reinkarniran” sa novom strukturom i funkcijom.

35

2.3.4. Duplikacije unutar gena

Proizvodi mnogih gena su proteini sa većim brojem domena ili oblasti.

Proteinski domen ili oblast (engl. domain, oblast, područje, domen) predstavlja dobro

definisan region unutar proteina, koji ili obavlja specifičnu funkciju, kao što je

vezivanje liganda, ili konstituiše kompaktnu strukturnu jedinicu koja se može jasno

razlikovati od drugih delova proteina. Ako oblast obavlja specifičnu funkciju, tada se

naziva funkcionalni domen, a u drugom slučaju naziva se strukturni domen ili modul.

Određivanje granica funkcionalne oblasti često je veoma teško jer se funkcionalnost u

mnogim slučajevima zasniva na aminokiselinama koje se nalaze u različitim

regionima proteina. Strukturni modul, s druge strane, uvek je kontinualni odsečak niza

aminokiselina.

Navedeno razlikovanje je neophodno kada se razmatraju mogući evolucioni

mehanizmi postanka proteina sa većim brojem domena. Ako se funkcionalni domen

poklapa sa modulom, njegova duplikacija će povećati broj funkcionalnih segmenata.

U suprotnom, ako se funkcionalnost zasniva na aminokiselinama, koje su razbacane

po različitim modulima, duplikacija jednog modula ne mora uopšte biti funkcionalno

poželjna. Da je to tako, pokazuju analize mnogih proteina kod kojih se uočavaju

ponovci nizova aminokiselina; oni, po pravilu, odgovaraju ili strukturnom modulu, ili

je u pitanju funkcionalni domen unutar jednog modula. Kod nekih gena postoji,

manje-više, tačna podudarnost između egzona i strukturnih domena (na primer, kod

mnogih globularnih proteina). U takvim slučajevima, naravno, duplikacija egzona će

dovoditi do odgovarajućeg ponavljanja strukturnih oblasti. U mnogo većem broju

slučajeva, međutim, između proteinskih oblasti i egzona postoji složen odnos.

Donedavno, molekularni biolozi su, govoreći o nastanku različitih složenih

proteina putem kombinovanja modula, koristili izraz “kombinovanje egzona“ umesto

“kombinovanje domena“ (mi smo engl. shuffling, koje se ovde koristi u smislu

“mešanja“ (karata), preveli sa “kombinovanje“). Iz razloga koje smo naveli, danas se

sve više koristi izraz kombinovanje domena. Postoje dva tipa kombinovanja domena:

duplikacija domena i umetanje domena. Oba tipa kombinovanja domena imaju

značajnu ulogu u nastanku novih gena. Duplikacija domena odnosi se na

unutargensko udvajanje, koje dovodi po povećanja ili elongacije gena. Umetanje

domena, međutim, predstavlja proces u kom dolazi do razmene funkcionalnih ili

strukturnih oblasti proteina ili do ubacivanja određenih nizova nukleotida od strane

gena koji određuje dati protein, ili nekog drugog gena.

36

Savremene analize gena eukariotskih organizama pokazuju da su se

duplikacije nizova nukleotida unutar gena relativno često dešavale tokom evolucije.

Ovo je, naravno, dovodilo do povećanja veličine gena, ili tzv. elongacije gena. To je,

po svoj prilici, vrlo važan korak u stvaranju složenijih gena. Načelno, elongacija gena

se može ostvariti i tako što se neki od stop kodona preobrati u smislene kodone, ili

tako što se ubaci niz nukleotida u egzone ili pojavom mutacija koje će “izbrisati“

granične nizove introna (mesta iskrajanja). Međutim, ovakve promene će

najverovatnije dovesti do disfunkcija produženog gena budući da će dodati nizovi, po

pravilu, davati slučajan raspored aminokiselina u proteinskim molekulima. Dostupni

empirijski podaci pokazuju da je to stvarno tako; sve navedene promene su uvek

dovodile do patoloških manifestacija (Li, 1997). Duplikacije nukleotidnih nizova koji

određuju strukturne domene proteina su, izgleda, osnovni način elongacije gena.

Takve duplikacije mogu, katkad, pojačati funkciju datog proteina. Dobro je poznat

primer alela α2 haptoglobina kod čoveka, koji je nastao nehomolognim krosing-

overom unutar različitih introna dva α1 gena (α1F i α1S). Ova unutar-genska

duplikacija skoro je udvostručila dužinu polipeptidnog lanca (od 84 do 143

aminokiselina) i, po svoj prilici, povećala stabilnost kompleksa haptoglobin-

hemoglobin. Alel α2 je, izgleda, nastao posle razdvajanja linije koja je vodila od

šimpanze do ljudi (pre oko 4,5 miliona godina). Učestalost ovog genskog alela u

Evropi i delu Azije je između 30 i 70%.

Elogancijom gena nastao je a2 tip I [a2(I)] kolagenski gen. Smatra se da je

nastanak kolagena jedan od ključnih događaja u evoluciji višećelijskih životinja

(Metazoa). Na osnovu proučavanja strukture kolagena došlo se do zaključka da je

početni korak u stvaranju kolagena bila duplikacija jednog kratkog niza nukleotida za

kojom su sledile duplikacije blokova tih ponovaka. Naime, svaki pojedinačni molekul

kolagena sastoji se od jedne spiralizovane oblasti za kojom sledi veliki broj ponovaka

koje čine tri aminokiseline, glicin – X – prolin, gde X označava jednu od nekoliko

različitih aminokiselina. “Zreli“ molekuli kolagena se međusobno vezuju formirajući

fibrile kolagena. Kolagenski geni su sačinjeni od velikog broja egzona (njihov broj

varira od vrste do vrste) koji imaju, ili 54, ili 45 nukleotida. Poređenjem nukleotidnih

nizova gena fibrilarnih kolagena velikog broja Metazoa (od sunđera do sisara), može

se doći do predstave kakva je mogla biti struktura prethodnika familije fibrilarnih

kolagena. Taj prvobitni kolagen sadržavao bi 46 egzona veličine 54 nukleotida i

37

sedam egzona dužine 45 nukleotida, koji su, verovatno, nastali putem ilegitimne

rekombinacije od dužih egzona (od 54 nukleotida). Za dugačke egzone se smatra da

su nastali serijom duplikacija nizova nukleotida koji kodiraju aminokiselinski niz

glicina –X – prolina.

Bez potpune duplikacije gena nastali su, na primer, i antifrizni glikoproteini

(AFGP), koji onemogućavaju formiranje kristala leda u ćelijama. Kod antarktičkih

riba je pokazano da dodavanje samo desetak nukleotida u postojeći gen može potpuno

promeniti prvobitnu funkciju gena. Naime, ove ribe imaju AFGP dobijen od

predačkog gena za tripsinogen dodavanjem na 5’ i 3’ krajeve devet nukleotida koji

kodiraju tri nove aminokiseline (Thr-Ala-Ala)12.

Danas postoji relativno veliki broj proteina za koje se smatra da su nastali

umetanjem oblasti iz jednog gena u drugi. Ti proteini se često nazivaju “mozaični“ ili

“himerni“ proteini (Patthy, 1994). Jedan od najpoznatijih primera mozaičnih proteina

je aktivator tkivnog plazminogena (engl. tissue plasminogen activator, TPA).

Preobraćanje plazminogena u aktivni oblik – plazmin – koji razlaže fibrin (rastvorljivi

končasti protein u ugrušku krvi), vrši se uz pomoć TPA. Ova konverzija veoma je

ubrzana u prisustvu fibrina koji je, inače, “supstrat“ za plazmin, i to tako što fibrin za

sebe vezuje i plazminogen i TPA. Ovakav način molekulskog usmeravanja

omogućava da se stvaranje plazmina dešava isključivo u prisustvu fibrina.

Drugi jedan plazminogenski aktivator, urokinaza (UK), koji je aktivan u urinu,

nema afinitet prema fibrinu. Uporedne analize aminokiselinskog sastava TPA i UK

pokazale su da TPA ima 43 aminokiseline koje nema UK. Taj segment aminokiselina

formira strukturu koja je slična prstima i homologna je sličnoj formaciji jednog

drugog proteina – fibronektina (FN) – koji, takođe, vezuje fibrin (inače, fibronektin je

veliki glikoprotein u plazmi i na površini ćelija gde promoviše ćelijsku adheziju).

Najverovatnije objašnjenje prisustva prstastih struktura u TPA je kombinovanje

oblasti (u ovom slučaju egzona koji ih kodiraju) između TPA i FN (Li i Graur, 1991).

Međutim, priča o TPA nije ovim završena. TPA, takođe, sadrži niz aminokiselina koje

su homologne sa epidermalnim faktorom rasta (engl. epidermal growth factor, EGF) i

drugim regionima nekih proteina sličnih faktoru rasta, kao što su tzv. faktor IX i

12 Zanimljivo je da arktičke ribe imaju iste tripeptidne ponovke na svojim AFGP kao i tripsinogen, ali ostatak proteina ne pokazuje velike sličnosti sa tripsinogenom. Pokazalo se da tripeptidni ponovci osiguravaju odgovarajuće pozicioniranje disaharida koji onemogućavaju formiranje kristala leda. To je lep primer tzv. strukturne konvergencije proteina.

38

faktor X (enzimi uključeni u procese koagulacije krvi). Uz sve do sada navedeno,

jedan deo TPA ima i strukture koje su veoma slične strukturama samog plazminogena

(koji, ne zaboravimo, konvertuje u plazmin!).

Ukratko, izgleda da je tokom svoje evolucije TPA “pokupio“ bar četiri tipa

DNK nizova od najmanje tri različita gena: fibronektina, epidermalnog faktora rasta i

plazminogena. Da je to najverovatnije bilo tako, potvrđuje vrlo precizno poklapanje

između granica egzona i introna u TPA genu i tih jedinica u drugim genima. Pored

TPA, mozaična struktura je otkrivena kod tridesetak drugih proteina (Doolittle, 1995).

2.3.5. Postanak gena iz nekodirajuće DNK

U genetici je dugo vladalo uverenje da (funkcionalni) geni koji kodiraju

proteine mogu nastati samo od postojećih gena (Herman Miler je to 1936. godine

formulisao kao načelo omnis gena e gena), a ne i od nekodirajuće DNK (ncDNK).

Međutim, poslednjih godina, kod nekih vrsta drozofila i kvasca, pa čak i nekih vrsta

primata, otkriveno je da neki geni mogu, uz pomoć mobilnih genetičkih elemenata,

nastati de novo od ncDNK (Siepel, 2009). U genomu ljudi identifikovana su i

analizirana 3 gena za koje se, posle rigoroznih analiza, sa visokom pouzdanošću može

reći da su nastali od ncDNK, jer nemaju poznate homologne varijante kod vrsta čiji su

genomi do danas proučeni, niti su izvedeni iz poznatih mobilnih elemenata na već

opisane načine (Knowles i McLysaght, 2009). Dakle, za ta tri gena mogli bismo reći

da svojstveni samo za našu vrstu!

Sva tri de novo nastala gena imaju vrlo kratke otvorene okvire čitanja (ORF,

engl open reading frame), koji određuju položaj između 121 i 163 aminokisline u

polipeptidnim lancima. U kodirajućim regionima ovi geni nemaju introne, a njihovi

ORF se nalaze unutar introna poznatih gena, ali na DNK lancu koji ti geni ne koriste

(3’ netranslatirajući deo jednog od tih gena preklapa se sa nekoliko egzona i introna

drugog gena). Informacione RNK koje stvaraju ovi geni, nalaze se u većem broju

tkiva, ali funkcije njihovih proteina nisu do danas poznate. Procenjuje se da je 0,075%

gena koji kodiraju proteine, kod ljudi moglo da nastane od ncDNK. Ako se uzme da

čovek ima oko 24000 gena koji kodiraju proteine, mogli bismo očekivati da je 18

gena nastalo od ncDNK, i to posle razdvajanja naše evolucione linije od one koja je

vodila prema savremenim šimpanzama.

2.3.6. Postanak novih gena putem horizontalnog prenošenja

39

Horizontalni genski transfer (HGT) predstavlja prenošenje genetičke

informacije sa jednog genoma na drugi, koje, pri tome, ne uključuje nijedan poznat tip

odnosa “roditelji-potomstvo“ (u procesima bespolnog ili polnog razmnožavanja

odigrava se tzv. “vertikalno“, ili “normalno“, prenošenje gena). Dugo je već poznato

da kod eubakterija i arhebakterija HGT, ili horizontalno prenošenje gena, predstavlja

značajan izvor novih gena. Mnogi od tih gena, kao što su geni za otpornost prema

antibioticima, vrlo su značajni za opstanak bakterija. Na primer, horizontalno

prenošenje penA gena (omogućava rezistentnost prema penicilinu) primećeno je kod

nekoliko vrsta Gram-negativnih bakterija Neisseria; izgleda da su od vrste N.

flavescens druge vrste ovog roda – N. gonorrheae, N. meningitidis i N. lactamica

dobile penA gen. Poslednjih godina intenzivno se proučavaju bakterije koje

naseljavaju gastrointestinalni trakt ljudi. Procenjuje se da prosečna zdrava osoba u

svojim crevima ima između 1014 i 1015 bakterijskih ćelija, koje se svrstavaju u čak

40000 različitih vrsta (Rosenberg i Zilber-Rosenberg, 2011)13! Takođe, postoje podaci

koji ukazuju da je između crevnih bakterija čoveka vrlo visoka stopa HGT. Jedan od

najupečatljivijih primera jeste otkriće da česta bakterija ljudskih creva (Bacteroides

plebeius) može da hidrolizuje složene polisaharide koji se isključivo nalaze kod

morskih crvenih algi (Hehemann i sar., 2010). Bakterija iz ljudskih creva je gene koji

vrše ovu hidrolizu (to su enzimi porfiranaze i agaraze) najverovatnije dobila putem

HGT od morskih bakterija. Bakterije sa ovom sposobnošću su nađene isključivo među

Japancima, koji često koriste sirove morske alge u ishrani (nori u sušiju) i na taj način

unose morske bakterije u svoj organizam.

Videli smo, takođe, da su transferi gena između arhebakterija i eubakterija,

kao i uloga HGT u nastanku mitohondrija i plastida eukariota, predstavljali ključne

događaje u ranoj evoluciji ćelija (deo 1.9). Međutim, kada je u pitanju HGT između

eukariota, posebno višećelijskih eukariota, podataka je bilo veoma malo, na osnovu

čega se izvlačio zaključak da ovaj mehanizam uvođenja novih gena u genome nije bio

posebno značajan tokom evolucije eukariota. Ipak, danas postoji dosta primera

horizontalnog transfera gena između genoma različitih eukariotskih grupa. Stoga,

značajno je izmenjeno i viđenje uloge HGT u eukariotskoj evoluciji.

13 Nedavna analiza 3,3 miliona gena koji su se nalazili u crevnim bakterijama 124 čoveka pokazala je da bi oko 6000 bakterijskih gena moglo imati značajne funkcije u našem metabolizmu (Qin i sar., 2010).

40

Jedan od najvećih problema sa kojim se sreću istraživači uloge HGT u

evoluciji jeste traženje nespornih dokaza da se stvarno radi o horizontalnom

prenošenju gena. Danas je razvijeno nekoliko vrlo rigoroznih procedura koje se

koriste u ovu svrhu. Mnogi navodni slučajevi horizontalnog prenošenja gena su,

nakon primene tih testova, odbačeni (pregled tih metoda može se naći kod Keeling i

Palmer, 2008). To se, na primer, desilo sa nekim zaključcima iz prve grube skice

ljudskog genoma, iz 2001. godine, prema kojima se činilo da mi nosimo, zahvaljujući

HGT, nekoliko desetina bakterijskih gena. “Zlatni standard“ za identifikaciju HGT je

tzv. filogenetska nesaglasnost – nepoklapanje između filogenetskih stabala dobijenih

na osnovu jednog ili grupe gena, i filogenetskih stabala rekonstruisanih nekim

tradicionalnim metodama.

Jedna od vrlo značajnih karakteristika eukariotskih ćelija jeste njihova

sposobnost da, uz pomoć citoskeleta i endomembranskog sistema, aktivno uzimaju

hranu, koja često može biti i druga ćelija iz okruženja (ovaj proces se zove

endocitoza). Imajući u vidu da mnoge protozoe koriste druge mikroorganizme kao

izvore hrane, Doolittle (1998) je postavio hipotezu “ono si što jedeš“ (engl. you are

what you eat). Prema ovoj hipotezi, sticanje novih gena se dešava kada se DNK, posle

liziranja izvora hrane, inkorporira u genom domaćina putem rekombinacija. Naravno,

neki od mikroorganizama može se zadržati i kao endosimbiont. Da je to moguće

pokazuju brojni primeri endosimbiotskih partnerstava između različitih eukariotskih

domaćina i prokariotskih i eukariotskih organizama. Pošto endosimbioza stvara

daleko stabilniju fizičku vezu, povećava se i verovatnoća da partneri razmene i svoje

gene.

Dve najpoznatije endosimbioze u evoluciji eukariota – endosimbize koje su

dovele do nastanka mitohondrija i plastida (deo 1.9) – pokazuju je do prenošenja gena

između endosimbionata i domaćina stvarno dolazilo. Sve do sada urađene analize

genoma ovih organela, pokazale su da one sintetišu samo manji deo proteina

neophodnih za normalno (samostalno) funkcionisanje. U različitim taksonima, broj

gena u mitohondrijama se kreće od tri do 67 gena, a kod biljaka plastidi imaju samo

od 15 do 209 gena. Najveći broj proteina ovih organela kodiraju geni iz jedra, a, kako

je pokazano, ti geni su se našli u jedru nakon masovnog horizontalnog prenošenja

tokom evolucije mitohondrija i plastida. Dodatno, mnogi geni poreklom od organela

stvaraju danas proteine koji odlaze u druge delove ćelija eukariota. Sličnost u

strukturama gena, koji su ostali u mitohondrijama i plastidima, kod filogenetski vrlo

41

udaljenih grupa ukazuje da je do transfera gena iz ovih organela došlo veoma davno.

Brojni jedarni genomi sadrže velike nizove nukleotida poreklom od organela (u nekim

slučajevim u jedro je prebačen čitav genom organele), što ukazuje da jedarni genomi

relativno lako prihvataju strane molekule DNK, a to je, opet, uslov uspešnog transfera

gena.

Na osnovu analiza genoma mitohondrija i plastida zaključeno je da su kasnija

prebacivanja gena u jedro bila sporadična - sa čestim burnim transferima koji su

praćeni dugim stazama. Na primer, kod 280 analiziranih biljaka cvetnica, za 16 od 40

mitohondrijskih proteina ustanovljen je skorašnji masovni, paralelni i često

isprekidani transfer gena iz mitohondrija u jedro. Pokazano je i da se prebacivanje

mitohondrijskih gena u jedro kod cvetnica uglavnom odvija preko reverzne

transkripcije iRNK mitohondrijskih gena, što je verovatno i razlog veće učestalosti

ovih događaja kod biljaka. S druge strane, višećelijske životinje pokazuju dugu stazu

u sadržaju mitohondrijskih gena; nijedan slučaj funkcionalnog transfera gena iz

mitohondrija u jedro nije kod njih zabeležen za poslednjih 600 hiljada godina

(Keeling i Palmer, 2009)14.

Pored tzv. primarne endosimbioze sa cijanobakterijama, koja je rezultovala

pojavom prvih eukariota sa sposobnošću fotosinteze (glaukofita, crvenih algi i zelenih

biljaka), sekundarne i tercijarne embiosimbioze bile su prisutne kod mnogih

eukariotskih grupa (dinoflagelata, diatomea, euglenoida itd; boks 2.1). U skoro svim

situacijama kada je dolazilo do dužeg zadržavanja novih endosimbionata u

domaćinima, genomi ćelija domaćina preuzimali su gene koji vode poreklo ili od

plastida (zapravo cijanobakterija) ili algi (Sun i sar., 20010). Na primer, u genomu

vrste Monosiga brevicollis, jednoćelijskog organizma iz grupe hoanoflagelata koja se

smatra najbližim srodnikom višećelijskih životinja (videti deo 3.1), nedavno su

otkrivena 103 gena, najverovatnije, poreklom od algi (Sun i sar., 2010). Dodatno, oko

25% tih algalnih gena izgleda da je prokariotskog porekla. Pošto je M. brevicollis, kao

i sve druge hoanoflagelate, slobodno-živeći heterotrof koji naseljava slatke i slane

vode, prisustvo algalnih gena najverovatnije je posledica ishrane predaka ove vrste,

koja je sadržala bakterije i fitoplanktone.

14Često pominjani uzrok odsustva transfera funkcionalnih gena iz mitohondrija u jedro kod višećelijskih životinja jeste rano odvajanje germinativne od somatičke linije ćelija tokom razvića.

42

Boks 2.1. Sekundarna i tercijarna endosimboza plastida

Mada najveći broj podataka ide u prilog hipotezi da su plastidi samo jednom

nastali u evoluciji eukariota (još nije potpuno prihvaćeno da se to desilo i kod predaka

savremenog roda Paulinella), njihovo prisustvo kod vrlo različitih grupa eukariota

objašnjava se sekundarnom endosimbiozom između različitih vrsta jednoćelijskih

eukariota. U većini evolucionih linija algi, kod kojih je došlo do sekundarne

endosimbioze, svi plastidni geni drugog simbionta prebačeni su u jedro domaćina, pri

čemu je sam simbiont, osim u par slučajeva, izgubio i sopstveno jedro (vrlo

redukovano jedro sekundarnog simbionta naziva se nukleomorf). U najekstremnijim

poznatim slučajevim nekih dinoflagelata, postoji i treća runda endosimbioze; tu je

simbiont bila alga sa drugačijim sekundarnim plastidima. Dakle, brojni geni koji su

stečeni tokom primarne simbioze sa cijanobakterijama, tokom evolucije eukariota su

više puta su prebacivani u jedro - prvo od cijanobakterija od kojih su formirani

plastidi, a zatim sa jedra na jedro tokom sekundarne i tercijarne endosimbioze.

Osim primera drevnih HGT postoji i nekoliko zabeleženih slučajeva

skorašnjeg prebacivanja gena sa bakterija u genome eukariota. Najpoznatiji slučaj je

bakterija Wolbachia, čest intraćelijski endosimbiont insekata i nematoda. Kod nekih

vinskih mušica je čak uočeno da je kompletan genom ove bakterije prebačen u jedro i

da se oko 2% volbahijinih gena transkribuje (nije, ipak, poznato da li su ti transkripti i

funkcionalni).

Simbioze između insekata i bakterija, inače, nisu nimalo retke i mnogi

entomolozi smatraju da su insekti zahvaljujući bakterijama naselili mnoge ekološke

niše siromašne hranljivim sastojcima. Poslednjih godina otkriveno je nekoliko

proteobakterijskih endosimbionata u specijalizovanim ćelijama insekata, gde sintetišu

nutritiente neophodne za domaćine. Na primer, bakterije Buchnera aphidicola i

Blochmannia spp. sintetišu uglavnom aminokiseline neophodne domaćinima - biljnim

vašima i mravima, a Wigglesworthia glossiridia snabdeva ce-ce mušice B vitaminom

kog nema u uobičajenoj hrani (krv) ovih mušica. Većina endosimbionta pretrpela je

manja-ili-veća smanjenja genoma u odnosu na slobodno živeće srodnike, ali poseduju

sve neophodne gene za održavanje osnovnih ćelijskih funkcija. To međutim, nije

slučaj sa bakterijom Candidatus Carsonella ruddi, koja je primarni endosimbiont

biljne vaši Pachpsylla venusta (familija Psyllidae). Ovaj endosimbiont ima genom

43

velik 159662 bp i samo 182 gena koji kodiraju proteine (Tamames i sar., 2007). Pošto

je taj broj gena daleko ispod broja koji se smatra neophodnim za normalno

funkcionisanje bilo koje ćelije (ovom endosimbiontu, na primer, nedostaju geni za

replikacije DNK, transkripciju i translaciju), mogli bismo reći da je C. ruddi neka

vrsta “prelaznog oblika“ između ćelije i ćelijske organele! Još uvek se ne zna tačno

čije gene za esencijalne funkcije koristi C. ruddi – malo je verovatno da ih je

endoparazit premestio u genom domaćina pošto se taj (veliki) transfer morao odigrati

u reproduktivnim ćelijama, a to podrazumeva izuzetno dugu evoluciju. Moguće je

zbog toga da ovaj endosimbiont koristi neophodne proteine koje stvara mtDNK

domaćina.

Pored gena koji su premešteni u jedro eukariota iz plastida i mitohondrija,

postoji veliki broj bakterijskih gena drugačijeg porekla u jedrima nekih eukariota. Na

primer, većina analiziranih protista nose gene bakterijskog porekla. Cilijate koje

naseljavaju burag preživara, imaju oko 4% gena dobijenih putem HGT od bakterija. U

genomima tri vrste parazitskog roda bičara Tryipanosoma nađeno je ukupno 47 gena

bakterijskog porekla, od čega je samo 20 gena bilo zajedničko za sve tri vrste, a 21

specifično za svaku od vrsta. Kod zelene alge Ostreoococcus tauri izgleda da čitav

jedan hromozom nosi gene isključivo dobijene putem HGT od bakterija.

Važno je istaći da su geni poreklom od bakterija omogućili brojnim

eukariotima naseljavanje vrlo specifičnih ekoloških niša. Recimo, anaerobni paraziti

sa metabolizmom zavisnim od fermentacije, pokazuju tendenciju da u svojim

genomima nose bakterijske gene uključene u fermentaciju ili druge aspekte

anaerobnog metabolizma. Tako nešto je utvrđeno kod Giardia lamblia, Trichomonas

vaginalis, kao i kod Entamoeba histolytica, kod koje se većina od 96 prisutnih

bakterijskih gena odnosi na anaerobni metabolizam. Mogli bismo, dakle, zaključiti da

adaptacije na parazitski način života eukariota favorizuju HGT sa bakterijama.

Među (malobrojnim) primerima transfera gena iz jedne vrste eukariota u

drugu, najveći broj je uočen između različitih vrsta gljiva, ali i gljiva sa drugim

eukariotama. Jedan od najinteresantnijih primera HGT je prenošenje gena između

filamentoznih gljiva i oomiceta (Protista), dve filogenetski vrlo udaljene grupe

eukariota (gljive su sestrinska grupa sa višećelijskim životinjama, a oomicete sa

fotosintetskim algama iz grupe Chromalveolata). Uprkos filogenetskoj udaljenosti,

ovi organizmi su vrlo slični po spoljašnjem izgledu i načinu ishrane (oni takođe ulaze

u red velikih biljnih štetočina). Mreže hifa koje formiraju, proizvode enzime za

44

razlaganje složenih jedinjenja na jednostavne šećere i aminokiseline koje, zatim,

absorbuju osmotrofijom. Analize genoma ovih vrsta pokazale su da je 11 gena iz

filamentoznih gljiva prešlo u oomicete (Richards i sar., 2006). Pošto većina proteina

koje stvaraju ti geni ima važnu funkciju u osmotrofiji, HGT je očigledno imao ključnu

ulogu u konvergentnoj evoluciji ovih vrsta.

Događaji ubacivanja gena eukariota u prokariote još su ređi od razmene gena

između eukariota. U nekoliko slučajeva, iz eukariota u bakterije premeštani su geni

značajni za formiranje citoskeleta (tubulinski i aktinski geni), a kod cijanobakterije

Prochlorocuccus prebačen je eukariotski gen za enzim fruktoznu bifosfatnu aldolazu

(FBA), koji se u genomu nalazi tik uz bakterijski oblik FBA. Eukariotski FBA stigao

je u genom Prochlorocuccusa preko crvenih algi i ima, kako se veruje, ulogu u

fiksaciji ugljenika kod ove ekološki veoma značajne cijanobakterije (videti kasnije).

2.3.7. Gubitak gena

Nakon duplikacije gena, jedna od kopija može akumulirati mutacije i tako

postati nefunkcionalna, tj. pseudogen. Ovako nastali pseudogeni nazivaju se

“neobrađeni pseudogeni“; oni se razlikuju od tzv. “obrađenih pseudogena“, koji

nastaju sa obrađene iRNK uz pomoć reverzne transkriptaze.

Analize nekoliko globinskih pseudogena pokazale su veliki broj različitih

mutacija, kao što su mutacije promene okvira čitanja, prevremeni stop kodoni i sl.

Samo u par slučajeva bilo je moguće otkriti pravog “krivca“ za pojavu pseudogena.

Na primer, pseudogen globina kod ljudi ψξ 1 (čita se psi-zeta jedan; različiti geni

hemoglobina označavaju se grčkim slovima, a stavljanje grčkog slova ψ ispred imena

gena je uobičajen način razlikovanja pseudogena od njegovog funkcionalnog

parnjaka) ima samo jedno veliko oštećenje – mutaciju koja je dala stop kodon i tako,

najverovatnije, dovela do gubitka njegove funkcije. Takođe, primećeno je da su neki

pseudogeni, kao što su ψβx i ψβz u β-globinskoj familiji, nastali duplikacijama već

postojećih pseudogena.

Danas postoji veliki broj podataka da je tokom evolucije veoma često dolazilo

do stvaranja pseudogena. Pseudogeni su, na primer, prisutni praktično u svim

multigenskim familijama koje su detaljno analizirane, kao što su: 5S rRNK geni, α- i

β-globinski geni, imunoglobulinski geni. Stopa gubitka članova multigenske familije

(tj. stvaranja pseudogena) zavisi od efektivne veličine populacije (Ne) i stope

45

stvaranja nefunkcionalnih alela, što znači da je osnovni mehanizam fiksacije

pseudogena u populacijama genetički drift.

Kod multigenskih familija koje su uključene u kontrolu različitih fizioloških

procesa, razlike u broju genskih kopija između vrsta mogu biti vrlo velike (tabela 2..).

Kod kičmenjaka, na primer, broj funkcionalnih gena u genskoj familiji za olfaktorne

receptore (OR) kod miševa iznosi 1035 a kod čoveka 396, pri čemu čovek ima znatno

viši procenat pseudogena (oko 55%) nego miševi (oko 24%). Pas, za koga mislimo da

ima dobro razvijen miris, ima 811 funkcionalnih gena i 289 pseudogena u

olfaktorskoj familiji. Ubedljivo najmanji broj OR imaju kokoške – svega 82.

Zašto broj funkcionalnih gena i pseudogena toliko varira između različitih

vrsta kičmenjaka? I bez dublje analize obrazaca pseudogenizacije receptora za miris i

ukus jasno je da postoji korelacija između broja funkcionalnih članova familija i

tipova staništa i ishrane kod ovih taksona. To je, možda, najočiglednije kod

olfaktornih receptora ljudi i drugih primata koji su, u odnosu na glodare, doživeli

drastičnu pseudogenizaciju. Preostale aktivne kopije olfaktornih receptora pokazuju

promene nukleotidnog sastava specifično za našu vrstu, a kod nekih subfamilija

uočeno je čak i povećanje broja članova. Treba, takođe, istaći da se početak masivnog

gubitka olfaktornih receptora kod primata poklapa sa ekspanzijom opsinske familije

gena, koja je kod majmuna starog sveta uključena u kontrolu trihromatskog viđenja.

Potrebno je, međutim, uzeti u obzir da, osim OR, na sposobnost razlikovanja mirisa

utiče i način obrade ovih informacija u mozgu kičmenjaka. To znači da broj OR ne

mora biti u direktnoj korelaciji sa sposobnošću uspešne diskriminacije različitih

mirisa. Dakle, iako pas ima manje funkcionalnih OR i viši procenat pseudogena od

miševa, zbog relativno veće proporcije mozga koji učestvuje u obradi olfaktornih

informacija, njegovo čulo mirisa može biti i bolje razvijeno nego kod miševa.

Tabela 2.1. Brojevi funkcionalnih gena i pseudogena (u zagradama) za senzorne receptore kod različitih vrsta kičmenjaka (prema: Nei, 2007). Vrsta Olfaktorni receptori

(OR)

Feromoni (V1R) Receptori ukusa

(T2R)

Čovek 396 (425) 5 (115) 25 (11)

Miš 1035 (356) 187 (121) 34 (7)

Pas 811 (289) 8 (33) 14 (4)

Krava 970 (1159) 40 (45) 11 (13)

46

Oposum 1188 (304) 98 (30) 25 (6)

Kokoška 82 (476) 0 (0) 3 (0)

Žaba Xenopus 410 (478) 21 (2) 48 (5)

Riba zebrica 102 (35) 2 (0) 4 (0)

Razlozi zašto postoji tako veliko variranje za feromonske receptore, receptore

ukusa ili, na primer, receptore uključene u imunski sistem kičmenjaka, nisu uvek

sasvim jasni. Moguće je da, kada broj članova neke multigenske familije dostigne

neophodan funkcionalni minimum, broj kopija varira zbog slučajnih gubitaka i

duplikacija. Ovakve fluktuacije u broju kopija u multigenskim familijama se katkad

nazivaju, po analogiji sa genetičkim driftom u populacionoj genetici, “genomskim

driftom“ (Nei, 2007).

Veliki broj podataka ukazuje da su, u našoj evolucionoj liniji, mutacije koje

dovode do gubitka funkcija nekih gena sa ulogama u sintezi regulatornih, katalitičkih

i strukturnih proteina, mogle biti jedan od razloga za postojeće fenotipske razlike

između nas i šimpanzi (na primer, produženo postnatalno razviće, smanjena jačina

mišića, daleko manja dlakavost ljudi, itd). Mutacije koje dovode do gubitka funkcije

najčešće nisu delecije čitavih gena već zamene ili ubacivanje/izbacivanje

pojedinačnih nukleotida. Najveća prednost gubitka funkcije nekih gena vidi se u

mogućnosti da se odgovarajuće fenotipske promene odigraju u relativno kratkim

intervalima vremena. Smatra se malo verovatnim da su gubici gena odgovorni za

divergenciju u početnoj fazi nastanka nove evolucione linije; uloga gubitka gena

značajna je, verovatno, tek u kasnijim fazama evolucije novih vrsta.

Jedan od primera koji govori u prilog značaja gubitka gena u evolucionoj liniji

čoveka, odnosi se na nesposobnost ljudi da, za razliku od šimpanze i drugih

čovekolikih majmuna, sintetišu jedan oblik sijalinske kiseline (NANA) pod imenom

N-glikolilneuraminska kiselina (Neu5Gc)15. Posledica je, naravno, višak njenog

prekursora pod imenom N-acetilneuraminska kiselina (Neu5Ac). Sinteza Neu5Gc

zavisi od gena koji kontroliše jednu hidroksilazu (tzv. CMAH gen, čiji enzim

učestvuje u hidroksilaciji CMP-Neu5Ac). CMAH gen je kod ljudi inaktiviran

15Sijalinska kiselina (koja je poznata i pod imenom N-acetilneuraminska kiselina, ili NANA) često se nalazi na krajevima glikanskih lanaca glikoproteina i glikolipida na površini ćelija. Ona je, pod normalnim fiziološkim uslovima, negativno naelektrisana i značajna je za biofizičke karakteristike površina ćelija; NANU mogu da prepoznaju brojni endogeni i egzogeni receptori.

47

delecijom veličine 92 bp, koja se pojavila nakon razdvajanja naše evolucione linije od

zajedničkog pretka sa šimpanzama. Pretpostavlja se da je ova delecija nusproizvod

ugrađivanja novog Alu niza u CMAH gen. Proučavanje NANE kod neandertalskog

čoveka i poređenje Alu mobilnih elemenata kod drugih primata, ukazuju da se delecija

mogla pojaviti kod naših predaka pre oko 2,8 miliona godina. Većina istraživača

smatra da, u momentu nastanka, ova promena CMAH gena nije predstavljala

(selektivnu) prednost i da je razlog njenog održavanja u populacijama bio, kao i kod

većine danas poznatih inaktivacija gena, genetički drift. Naravno, delecija u CMAH

genu mogla je kasnije omogućiti pojavu novih adaptacija u našoj evolucionoj liniji.

Ipak, neki savremeni istraživači smatraju da je inaktivacija u CMAH genu od samog

početka bila adaptacija, a ne eksaptacija, odnosno da je prirodna selekcija bila

mehanizam njenog fiksiranja u populacijama. Naime, pošto se mnogi patogeni vezuju

za šećere na površinama ćelija, gubitak Neu5Gc mogao je davati prednost svojim

nosiocima zbog povećane otpornosti na patogene mikroorganizme. Eksperimenata ili

populaciono genetičkih analiza (npr. prisustvo tzv. “selekcionog čišćenja“ u okolini

ovog gena) koji nedvosmisleno ukazuju na prirodnu selekciju kao mehanizam

fiksacije delecije u CMAH genu u našoj evolucionoj liniji, još uvek nema. Drugi

selekcionistički scenario je još spekulativniji jer se zasniva samo na činjenici da se

gubitak Neu5Gc, najverovatnije, desio pre velikog povećanja mase mozga u našoj

evolucionoj liniji - pre oko 2,5 miliona godina.

Daleko najveći broj, od oko 20000 pseudogena u ljudskom genomu, ima svoje

funkcionalne “roditeljske“ gene. Međutim, u našem genomu postoje i jedinstveni

pseudogeni koji se razlikuju od dupliranih pseudogena po tome što u genomu ne

postoji njegova funkcionalna kopija. U evolucionoj liniji čoveka, posle divergencije

sa glodarima, koja se desila pre oko 75 miliona godina, pojavilo se 76 jedinstvenih

pseudogena (Zhang i sar., 2010). Stopa pseudogenizacije kod primata bila je relativno

uniformna, tj. inaktivacija ovih 76 jedinstvenih pseudogena kod čoveka desila se u

različitim periodima evolucione istorije primata. Takođe, pokazalo se da je 11

jedinstvenih pseudogena polimorfno u ljudskim populacijama, tj. da ima i

nefukcionalne i funkcionalne oblike. Zanimljivo je da su dva od tih 11 polimorfnih

pseudogena kod ljudi, potpuno nefunkcionalni kod drugih primata, što ukazuje da je

njihova funkcionalnost postignuta mutacijama koje su se odigrale samo tokom

filogenije čoveka.

48

Jedan od primera jedinstvenog pseudogena u genomu ljudi je MYH16, koji

sintetitiše miozinski teški lanac 16. Kod primata ovaj protein je prisutan isključivo u

mišićima za žvakanje, a ako ga nema, ti mišići su daleko slabiji. Procenjuje se da je

do inaktivacije MYH16 gena došlo pre 2,4 miliona godina, približno u vreme pojave

prvih predstavnika roda Homo. Smatra se da je ova pseudogenizacija dovela do

drastičnog smanjenja mišića za žvakanje, što je omogućilo povećanje kranijuma u

rodu Homo, ali i finiju kontrolu vilice koja je bila neophodna za pojavu govora.

Ljudi nisu u stanju da stvaraju vitamin C jer u svojim genomima imaju

jedinstveni pseudogen za enzim gulonolaktonsku oksidazu (GULO), koja prozvodi

prekursor vitamina C16. Procenjuje se da je do inaktivacije GULO došlo pre oko 63

miliona godina. Pošto je prisustvo vitamina C neophodno u nizu metaboličkih

aktivnosti organizma, smatra se da je inaktiviran GULO gen mogao biti fiksiran u

populacijama naših drevnih predaka (naravno, putem genetičkog drifta) koji su

koristili hranu bogatu ovim vitaminom.

Jedinstveni pseudogeni mogu se održavati u populacijama ljudi i delovanjem

prirodne selekcije. To je, na primer, slučaj gena Casp 12 (engl. caspase 12; gen koji

pripada familiji kaspaza – cisteinil aspartatnih proteinaza; imaju važnu ulogu u obradi

proteina upale i imunog odgovora na endotoksine), koji je kod najvećeg broja

savremenih ljudi inaktiviran jednom zamenom nukleotida (C→ T na 629 mestu

četvrtog egzona, što je dovelo je do pojave stop kodona). Učestalost alela T (tj.

inaktiviranog oblika Casp12 gena) u afričkim populacijama ljudi je oko 90%; kod

ostalih populacija ljudi prisutan je isključivo T alel (pored Casp 12 ljudi imaju još 11

aktivnih gena za kaspaze). Zanimljivo je da ostali sisari imaju isključivo aktivne

oblike Casp12 gena. Na osnovu zapažanja da savremeni ljudi sa T alelom imaju

smanjenu incidenciju i smrtnost od sepse, pretpostavlja se da je to bio razlog njegovog

brzog širenja u ljudskim populacijama poslednjih 100000 godina (procenjeno vreme

pojave C→ T zamene). Slična situacija je i sa genom za hemokinski receptor CCR5,

koji je kod nekih ljudi inaktiviran delecijom od 32 nukleotida. Homozigoti za ovaj

pseudogen su otporni na različite patogene, uključujući i HIV-1 (heterozigoti takođe

imaju određen stepen zaštite).

Budući da se kod prokariota mutacije, koje dovode do pojave pseudogena,

mogu brzo eliminisati iz populacija (o većoj ulozi prirodne selekcije u populacijama 16Osim kod ljudi, inaktivacija GULO pojavljuje se i kod drugih životinja, kao što su, recimo, zamorčići i sve vrste ljuljaka.

49

prokariota u odnosu na eukariote bilo je reči ranije), kod njih je broj pseudogena

veoma mali. Zbog toga je kod mnogih bakterija dolazilo do velikih smanjenja

genoma. Posebno izražen trend ka smanjenju genoma pokazuju obligatni paraziti i

endosimbionti, kao što su, na primer, bakterije iz rodova Mycoplasma, Rickettsia,

Chlamydia, Buchnera, Borrela. Ove bakterije gubile su, tokom evolucije, na stotine i

hiljade gena, što je mnogo više u poređenju sa neparazitskim srodnicima.

Najverovatnije objašnjenje ovog drastičnog smanjenja genoma jeste delovanje

genetičkog drifta. Naime, veličina njihovih populacija je mnogo manja od populacija

neparazitskih prokariota, budući da im je životni ciklus vezan za višećelijske

eukariotske organizme. U ovoj situaciji, dodatan uzrok gubljenja gena svakako je i

smanjenje intenziteta delovanja prirodne selekcije na gene koji su postajali “višak“

kada su bakterije prelazile na parazitski (ili simbiotski) način života.

Veliki gubitak gena odigrao se i kod nekih neparazitskih bakterija, kao što su

Prochlorococcus sp. i Pelagibacter ubique. Prochlorococcus je morska

cijanobakterija sa svega oko 2000 gena, koja je, kako se procenjuje, odgovorna za

stvaranje oko 20% kiseonika koji se nalazi u našoj atmosferi. P. ubique živi u slatkim

i slanim vodama, spada u grupu alfaproteobakterija i ima najmanji genom (1308759

bp) od svih slobodno živećih organizama. Ova bakterija ima glavna ulogu u reciklaži

organskog ugljenika na Zemlji. Smatra se da su dve navedene vrste najbrojni

organizmi na našoj planeti sa po oko 1027 do 1028 individualnih ćelija. Pošto su

njihove populacije izuzetno velike, veliko smanjenje genoma ne može se objasniti,

kao kod parazitskih bakterija, neefikasnom selekcijom. Najverovatnije objašnjenje

malih genoma u ovom slučaju jeste delovanje prirodne selekcije na brzinu replikacije

njihovih genoma – manji genomi, koji se brže replikuju, imali bi višu adaptivnu

vrednost.

2.3.8. Stope sticanja i gubljenja gena

Skorašnje poređenje proteina čoveka i miša (poslednji zajednički predak

glodara i primata se datira na vreme od pre 75 miliona godina ) pokazalo je da je

tokom evolucije primata izgubljeno 0,5% gena (Zhang i sar., 2010). Pošto mi u

odnosu na miševe imamo oko 4% novih gena, može se zaključiti da je sticanje novih

gena, više od gubitka gena, doprinelo evoluciji čoveka.

Analiza evolucije genskih familija kod kvasca, sisara i voćnih mušica

pokazala je da su kod ovih, filogenetski vrlo udaljenih, grupa stope sticanja i

50

gubljenja gena vrlo slične – od 0,0012 dobitak/gubitak gena/mil.god., kod voćnih

mušica do 0,0020 dobitak/gubitak gena/mil.god, kod kvasca (Demuth i Hahn, 2009).

Uprkos relativno ujednačenim (prosečnim) stopama sticanja/gubljena gena, u okviru

grupa postoje značajne razlike između evolucionih linija. Na primer, kod sisara ove

stope su skoro dvostruko više kod primata (0,0024 dobitak/gubitak gena/mil.god.)

nego kod evolucionih linija kojima pripadaju psi, miševi i pacovi (0,0014

dobitak/gubitak gena/mil.god.). Još više stope uočavamo kod hominida (0,0039

dobitak/gubitak gena/mil.god.); kod čoveka i šimpanze, ove stope su oko tri puta više

u poređenju sa sisarima koji ne pripadaju redu primata.

2.4. Evolucija genske regulacije kod eukariota

Imajući u vidu spektakularna otkrića o ulozi genske regulacije u razviću

višećelijskih eukariota, mnogi savremeni biolozi sa nevericom slušaju “priče“

istoričara evolucione biologije o velikom sukobu na početku XX veka između

genetičara i embriologa (videti deo 3.4). Uspon mendelističke genetike u kojoj su

geni, linearno raspoređeni na hromozomima, tretirani kao jedini činioci koji dovode

do pojave različitih osobina, praćen je velikim negodovanjem tadašnjih embriologa,

po čijem mišljenju su takva objašnjenja formiranja fenotipova bila, u najmanju ruku,

nepotpuna. Jedan od najjačih argumenta embriologa često se svodio na pitanje “ako

su geni jedino važni u formiranju fenotipova, kako onda objasniti diferencijaciju tkiva

kod genetički identičnih ćelija?“ U vreme kada su se ove rasprave vodile, metode koje

su stajale na raspolaganju biolozima nisu bile u stanju da pomognu u objašnjenju tog

paradoksa: 1) geni stvarno na neki vrlo važan način utiču na formiranje fenotipova, i

2) genetički identične ćelije u različitim tkivima stvaraju ogroman broj različitih

ćelijskih fenotipova. Ovaj “paradoks jedarne ekvivalencije“ (Sapp, 1987) naveo je

mnoge embriologe na zaključak da se u citoplazmi (nasuprot inertnim hromozomima)

nalaze ključni elementi koji dovode do embrionske diferencijacije17. Jedna od

posledica velike “shizme“ između genetike i embriologije jeste višedecenijsko

odstranjivanje biologije razvića iz (sintetičke) teorije evolucije.

17 Tomas Morgan, koji se smatra “ocem“ mendelističke genetike, a koji je po osnovnom obrazovanju bio embriolog, eksplicitno je zagovarao ovakav stav. “Konfuzija koja se katkada može sresti u literaturi posledica je nerazdvajanja nasleđivanja, koje se odnosi na transmisiju naslednih partikula, od fenomena embrionskog razvića koje se odigrava skoro isključivo promenama citoplazme“ (Morgan 1926, prema Emerson i Li, 2010, st. 2581).

51

Džon B. S. Holdejn (Haldane, 1932) i Sjuel Rajt (Wright, 1934) prvi su

ponudili moguće rešenje paradoksa jedarne ekvivalencije govoreći da prostorno-

vremensku aktivnost svakog gena na neki način kontrolišu drugi elementi. Slično je

govorila i Barbara MekKlintok (McClintock, 1956), koju danas znamo samo po

otkriću mobilnih genetičkih elemenata, kada je objašnjavala sistem “kontrolnih

elemenata“ kod kukuruza. Pažnja genetičara usmerena je na sistem regulacije

aktivnosti gena tek sa pojavom Žakob-Monoovog lac operona 1961. godine.

Jednostavnost operonskog modela, kog su predložila ova dva francuza na osnovu

eksperimenata na bakteriji Escherichia coli, uverili su genetičare u značaj poznavanja

mehanizama kontrole aktivnosti gena. Pošto lac operon ilustruje osnovne elemente

genske regulacije koje su potvrdila i savremena istraživanja - čak i kod eukariota,

ukratko ćemo opisati ovaj sistem.

Sistem uključuje tri neregulatorna gena (“strukturna gena“) koji se

transkribuju zajedno u obliku policistronske iRNK. Geni lac operona (lacZ, lacY i

lacA) kontrolišu sintezu enzima koji u odsustvu glukoze omogućavaju bakteriji da

koristi laktozu. Aktivnost ovih gena kontroliše dva para elemenata (slika 2.7). Svaki

par je sastavljen od niza nukleotida uzvodno od lac operona, pri čemu jedan par

deluje represorski na aktivnost gena. U situaciji kada se E. coli nalazi u sredini

bogatoj glukozom, protein koji stvara lacI vezuje se za nukleotidni niz (nazvan

operator) tik uz strukturne gene. Vezivanje ovog proteina za operator (represor)

sprečava RNK polimerazu da priđe promotoru. LacI se nalazi na oko 150 nukleotida

uzvodno od lac gena, a operator leži između tih gena i lacI. Ako je laktoza prisutna u

životnoj sredini bakterije, njeni molekuli se vezuju za represor što, opet, indukuje

njegovu konformacijsku promenu i dovodi do oslobađanje represora od promotora.

Na ovaj način, oslobađanjem promotora, omogućen je pristup RNK polimerazi i

otpočinje transkripcija lac gena.

Drugi tip regulacije lac gena kontroliše crp gen preko svog prozvoda CAP

proteina. CAP je regulatorni protein koji se vezuje za drugi niz nukleotida između lacI

i lac operona, u blizini lac promotora. Taj drugi par regulatora se razlikuje od

lacI/operator para po tome što se crp gen nalazi vrlo daleko od lac operona (oko 1,5

Mb) i što CAP deluje kao aktivator u prisustvu cikličnog AMP (cAMP je indikator

male koncentracije glukoze u sredini). Dakle, u prisustvu laktoze represor lacI je

inaktivan, a kada je glukoza odsutna, aktivator je u funkciji. Ovde je važno istaći da

52

CAP protein utiče na ekspresiju i drugih gena kod E. coli, dok je represor kog

sintetiše lacI, specifičan samo za lac operon.

(a)

(b)

Slika 2.7. Struktura i regulacija ekspresije gena lac operona E. coli. (a) Struktura lac operona – položaj gena lacZ, lacY i lacA, promotora i operatora; položaj regulatornog gena (represora) lacI. Ispod je prikazana policistronska iRNK. (b) Regulacija ekspresije lac gena putem dva para regulatornih elemenata – represorskog lacI/operator i aktivatorskog CAP/operatorski niz. CAP je oznaka za mesto vezivanja CAP aktivatorskog proteina koji je aktiviran prisustvom cAMP; P je promotorska sekvenca; O je operator za koji se vezuje lacI represor.

Na primeru lac operona može se videti da se regulatorni elementi mogu

klasifikovati na dva načina. Prvi kriterijum je način na koji deluju regulatorni

elementi. Ako je regulatorni element difuzibilan, kao u slučaju lacI prozvoda ili CAP

proteina, tada se takvi elementi nazivaju trans-regulatorima. S druge strane, ako se

regulatorni elementi nalaze vrlo blizu gena čiju aktivnost regulišu, poput operatora,

promotora ili nizova nukleotida za koje se vezuje CAP protein, onda se oni nazivaju

cis-regulatorima. Kada su u pitanju eukarioti, najčešće se koristi ovaj drugi sistem

klasifikacije regulatornih elemenata – prema poziciji koju zauzimaju u odnosu na

gene čiju aktivnost regulišu. Cis-regulatori bi kod eukariota bili specifični nizovi

53

DNK koji regulišu samo gene koji pripadaju istom molekulu DNK; mnogi se nalaze

neposredno uz mesto sa koga počinje transkripcija određenog gena. Nasuprot njima

trans-regulatori stvaraju regulatorne proteine (ili RNK), koji stupaju u interakcije sa

drugim genima na istom ili različitim hromozomima. Za trans-regulatore se često kaže

da se nalaze bilo gde u genomu osim uz gen koji se analizira.

Danas znamo da je regulacija aktivnosti gena koji kodiraju proteine vrlo

dinamična i da se može odigrati na svim nivoima ekspresije gena, tj. prenosa

genetičke informacije sa DNK do proteina. Osim regulacije na nivou transkripcije,

čije smo osnovne elemente ilustrovali na lac operonu E. coli, postoji niz drugih

posttranskripcionih mehanizama. Pojava i evolucija eukariota, a posebno višećelijskih

organizama, bili su omogućeni velikim povećanjem složenosti regulatornih

mehanizama. Pošto regulatorni geni regulišu aktivnost jedan drugog i pošto svaki

regulatorni gen odgovara na brojne signale tokom regulacije drugih gena, ove njihove

interakcije formiraju vrlo složene mreže (Davidson, 2006). Osnovnu strukturu takvih

mreža koje kontrolišu razviće višećelijskih organizama, čine: 1) regulatorni geni, koji

kodiraju transkripcione faktore, 2) signalni geni, koji kodiraju ligande i receptore za

međućelijsku komunikaciju, kao i 3) cis regulatorni nizovi, koji kontrolišu ekspresiju

svakog pojedinačnog gena. “Regulatorni genom“ (Erwin i Davidson, 2009) čine,

dakle, komponente koje potiču kako od kodirajućih tako i nekodirajućih nizova DNK.

Prema modelu koji je dao Dejvidson, regulatorna mreža u razviću životinja može se

raščlaniti na hijerarhijski organizovan niz mreža (ili modula) nižeg reda. Na vrhu

organizovane mreže bila bi visoko konzervisana “jezgra“ (engl. kernels), koja

specifikuju prostorne oblasti u čijim okvirima dolazi do razvića određenih delova tela.

Drugi nivo predstavljale bi mreže koje se nadodaju (engl. plug-in) kao signalne

transdukcione kasete, i koje se višekratno koriste tokom razvića. Prema ovom modelu,

tzv. “završne baterije gena diferencijacije“ (engl. terminal differentiation gene

batteries) bile bi sastavljene od svih gena koji “definišu“ određene tipove ćelija, dok

bi tzv. “ulazno-izlazni prekidači“ (engl. input-output switches), kao što su Hox geni,

dopuštali ili sprečavali ostvarenje određenih procesa razvića u specifičnim prostorno-

vremenskim kontekstima. Svaka od komponenti ovako oblikovane regulatorne mreže

dovodila bi do specifičnog skupa evolucionih ograničenja, a promene u tim

komponentama rezultovale bi u kvalitativno drugačijim fenotipskim promenama. Na

primer, postojanje jezgara, koja su “po definiciji“ najkonzervativnija komponenta

regulatorne mreže i poseduju najveći stepen plejotropnog delovanja, objašnjava

54

visoku postojanost telesnih sklopova svakog životinjskog filuma. Nasuprot njima,

terminalni skupovi diferencijacionih gena pokazivali bi najmanju plejotropiju, što bi

omogućavalo njihovu češću promenu tokom evolucije; njihove promene mogle bi

rezultovati u species-specifičnim fenotipskim promenama.

Slika 2.8. Osnovne komponente regulacione mreže u razviću životinja (prema: Erwin i Davidson, 2009).

Rane ideje o evolucionim ograničenjima, koje nalikuju savremenom

razumevanju hijerarhije organizacije osobina organizama kroz “regulacionu mrežu“,

dao je Rupert Riedl (1977, 1978). U svom modelu, Ridl formuliše koncepciju

“evolucionih opterećenja“. Prema ovom viđenju, što je osobina dublje ukorenjena u

uzročnoj mreži integrisanog organizma, tj. što je više osobina i funkcija sa kojima je

povezana, ona je više “evoluciono opterećena“ i manja je verovatnoća njene

evolucione promene. Drugim rečima, promene takvih osobina dovele bi do ozbiljnog

narušavanja integrisanosti sistema i do velikog pada adaptivne vrednosti, odnosno

takve promene bile bi eliminisane prirodnom selekcijom. Slično modelu Dejvidsona

(2006) i konzervativnim “jezgrima“ regulacione mreže, najveći stepen plejotropnog

delovanja definiše evoluciono najopterećenije osobine koje obezbeđuju postojanost

telesnih sklopova. Periferne pozicije osobina u hijerarhiji funkcije (“neopterećene

osobine“), omogućavaju brže i verovatnije promene (npr. mikroevolucione promene

ispod nivoa vrste). Uzimajući u obzir da u Ridlovoj koncepciji osobine mogu biti

kako morfo-anatomske karakteristike, tako i razvojno-epigenetički i genetički sistemi,

“hijerarhija ugnježđenih opterećenja“ u potpunosti odgovara “genskoj regulatornoj

mreži“ koju savremena genomika tek počinje da otkriva. O značaju Ridlove

55

koncepcije za razumevanje evolucije telesnih sklopova i nastanka evolucionih novina

biće reči kasnije (deo 3.)

2.4.1. Evolucija transkripcione regulacije

Ključni korak u kontroli ekspresije gena predstavljaju biohemijske interakcije

između traskripcionih faktora i cis-regulatornih nizova. Ove interakcije su

posredovane proteinskim domenima preko kojih se transkripcioni faktori vezuju za

specifične nizove nukleotida unutar cis-regulatora. Imajući ovo u vidu, može se

zaključiti da do evolucionih promena u ekspresiji gena može doći ili zbog mutacija u

transkripcionim faktorima ili mutacijama u cis-regulatornim nizovim. Dosadašnja

istraživanja na većem broj vrsta, od kvasaca i voćnih mušica do primata, ukazuju da

su mutacije koje menjaju aktivnost cis-regulatora češći uzrok razlika u ekspresiji gena

između vrsta (Wittkopp, 2010). Neki evolucioni biolozi, sasvim opravdano, ističu da

bi evolucija višećelijskih organizama bila skoro nemoguća u odsustvu cis-regulatora,

budući da upravo oni omogućavaju transkripcionu regulaciju zavisno od konteksta.

Kod eukariotskih gena, dva tipa cis-regulatora određuju koji će gen i u kojoj

ćeliji biti transkribovan. To su, naravno, promotori (tj. regulatorni elementi samih

gena) i pojačavači (engl. enhancers) koji su neophodni za punu aktivnost promotora u

genomu svih eukariotskih ćelija. Položaj ovih specifičnih nizova, kao i njihova

orijentacija u odnosu na mesta inicijacije transkripcije, veoma su varijabilni.

Pojačavači se najčešće nalaze uzvodno od gena, u okviru promotora, ali su ponekad

udaljeni od njega i po nekoliko hiljada nukleotida. U nekim slučajevima nalaze se i

unutar kodirajućeg regiona strukturnog gena, ili čak nizvodno od njega. Svi do sada

pronađeni pojačavači vezani su za gene koji su aktivni samo u pojedinim tkivima, pa

se zbog toga smatra da su ti elementi DNK najodgovorniji za diferencijalnu ekspresiju

gena. Iako se još uvek nedovoljno zna o mehanizmu delovanja ovih cis-aktivnih

elemenata, smatra se da pojačavače specifično prepoznaju inducibilni transkripcioni

faktori i da kao rezultat te interakcije dolazi do ubrzavanja transkripcije sa obližnjeg

promotora.18

18 Postoje podaci da se pojačivači mogu transkribovati u tkivima gde su aktivni. Mada se veruje da tako dobijeni molekuli RNK nisu funkcionalni već da predstavlaju pasivan nusproizvod transkripcionih događaja koji su neophodni da bi se pojačavač “otvorio”, u nekim eksperimentima je pokazano da te RNK mogu učestvuju u regulaciji aktivnosti nekih razvojnih gena. Takođe, za neke istraživače otvoreno je pitanje da li su ti molekuli RNK integralni delovi funkcije pojačavača.

56

Slika 2.9.. Shema tipičnog eukariotskog gena koji kodira proteine, i cis-regulatorne mutacije. A. Linije iznad egzona označavaju egzone koji se mogu alternativno iskrajati; obeleženi su i nekodirajući delovi (introni), 5' i 3' UTR sekvence, pojačavači i drugi nizovi važni za regulaciju ekspresije gena. B. Unutar gena se mogu razlikovati kodirajući delovi (egzoni), i cis-regulatorni nizovi koji se odnose na sve ostale nizove istog molekula DNK koji učestvuje u regulaciji ekspresije gena. Cis-regulatorni nizovi uključuju delove DNK koji regulišu transkripciju, RNK stabilnost i iskrajanje i translaciju. C. Mutacije u kodirajućim delovima gena dovode do zamene aminokiselina u proteinima ili do promena nukleotidnih nizova u zrelim molekulima RNK. D. Cis-regulatorne mutacije mogu se odigrati u bilo kom delu gena; važno je samo da dovode do promena u ekspresiji gena.

Jedan tip pojačavača su tzv. “negativni pojačavači“ ili utišavači (engl.

silencers). Kada se transkripcioni faktori vežu za utišavač, dolazi do represije

transkripcije cis-vezanog promotora (tj. promotora koji se nalazi na istom

hromozomu). Neki nizovi nukleotida mogu, zavisno od transkripcionih faktora koji se

nalaze u ćeliji, u nekim ćelijama funkcionisati kao pojačavači, a u drugim ćelijama

kao utišavači.

U cis-regulatore svrstavaju se i tzv. izolatori (engl insulators) – nizovi od

nekoliko desetina nukleotida DNK koji se mogu naći između pojačavača i promotora,

između utišavača i promotora ili između susednih gena ili grupe susednih gena.

Funkcija izolatora je onemogućavanje aktivacije ili represije transkripcije nekog gena

pod uticajem susednih gena.

Pojačavači su neophodni za regulaciju normalnog razvića i diferencijacije

ćelija iz sledećih razloga:

1. Njihovo prisustvo je neophodno za transkripciju većine gena.

2. Pojačavači su glavni determinatori vremenske i tkivno-specifične

transkripcije gena.

57

3. Prisustvo pojačavača na relativno velikim rastojanjima od promotora znači

da može postojati veći broj signala koji određuju da li će se dati gen transkribovati ili

ne. Određeni gen može imati više pojačavača i svaki od njih se može vezivati sa više

faktora (tip vezanog faktora može da reguliše da li će pojačavač stimulisati ili

inhibirati transkripciju).

4. Geni koji kontrolišu proteine specifične samo za određene tipove ćelija,

obično imaju relativno kratke i nestrukturirane pojačavače. Nasuprot njima,

pojačavači gena koji se svrstavaju u tzv. “osnovni alat“ (engl. toolkit) u kontroli

diferencijacije ćelija tokom razvića višećelijskih organizama, imaju obično vrlo

složenu arhitekturu, tj. sastavljeni su od manjeg ili većeg broja modula. Na primer,

pojačavač za protein žumanceta kod voćne mušice “konstruisan“ je tako da jedan

njegov deo omogućava ekspresiju gena u masnim telima, drugi u ovarijumima, a treći

se vezuje za polno-specifične proteine (tzv. “dvopolne proteine“; engl. doublesex

proteins) koji kod ženki stimulišu transkripciju, a kod mužjaka je sprečavaju. Na taj

način, gen za protein žumanceta je aktivan samo u masnim telima i ovarijumima.

Dobro je proučena i organizacija pojačavača eve gena kod drozofile (od engl even-

skipped; jedan od gena koji određuje segmentaciju životinja). Ovaj kompleksan

regulatorni element ima oko 20000 bp duž kojih postoje mesta za vezivanje više od 20

regulatornih proteina. Neki od tih proteina su aktivatori, dok su drugi represori

transkripcije. Ovi proteini se vezuju za regulatorne nizove nukleotida organizovane u

serije regulatornih modula, koji zajedno određuju tačan prostorni i vremenski obrazac

ekspresije gena. Modularna organizacija kontrolnih regiona gena obezbeđuje vrlo

visoku plastičnost u ekspresiji gena. Promena u jednom regulatornom modulu može

promenti jedan deo obrasca ekspresije gena, bez uticaja na njegove druge delove, ali i

bez promene u regulatornim proteinima (ako bi se oni menjali, to bi moglo imati

štetnih posledica na ekspresiju drugih gena u genotipu). Ovako složena organizacija

cis-regulatornih elemenata predstavlja jedan od ključnih momenata za stvaranje

složene organizacije višećelijskih biljaka i životinja. Takođe, ona omogućava

relativno nezavisne promene svakog dela organizma tokom evolucije (videti deo 3.3).

Većina segmentacionih gena, na primer, ima i druge značajne funkcije u kasnijim

periodima razvića drozofile. Pomenuti eve gen, recimo, ispoljava se u podgrupi

neurona, zatim, kod prekursora mišićnih ćelija i na različitim drugim mestima kada se

nalazi pod kontrolom dodatnih pojačavača. Dodavanjem novih modula uz regulatorne

regione gena, svaki gen može kooptirati, tokom evolucije, novu funkciju na novim

58

mestima i u drugom vremenu tokom razvića, a da to ne naruši ostale funkcije tog

gena.

U mendelističkoj genetici je uobičajeno da se za gene koji imaju višestruke

funkcije kaže da su plejotropni. U molekularnoj biologiji razvića, međutim, za gene

čiji proteini funkcionišu nezavisno u različitim ćelijskim tipovima, klicinim listovima,

delovima tela i stupnjevima razvića, koristi se termin mozaična plejotropija. Otkriće

da potpuno isti protein može učestvovati u oblikovanju mnoštva različitih struktura

jedno je od najvećih iznenađenja koje je iznedrila molekularna biologija razvića.

Važna implikacija postojanja mozaične plejotropije jeste mogućnost da se proširenja

funkcija gena tokom evolucije odvijaju i bez duplikacija gena.

Postoji nekoliko mehanizama koji dovode do evolucije složenih pojačavača:

1. Nove regulatorne veze i novi obrasci ekspresije gena mogu nastati putem

mutacija u postojećim modulima pojačavača. Za tako nastale module mogu se

vezivati, naravno, drugi transkripcioni faktori. Najednostavniji i, izgleda, najčešći

način “reprogramiranja“ regulatorne mreže jeste gubitak mesta vezivanja za

transkripcione faktore u pojačavačima (zbog delecija ili supstitucionih mutacija).

2. Regulatorni delovi mobilnih genetičkih elementa mogu biti kooptirani u

nove module postojećih pojačivača (o tome smo govorili u delu 2.2.1).

3. Do remodelovanja pojačavača može doći i promenom broja, afiniteta ili

topologije mesta vezivanja transkripcionih faktora za pojačavače.

Cis-regulatorni elementi, koji pojačavaju ili utišavaju aktivnost gena, često se

nalaze u evoluciono vrlo konzervisanim19 i nekodirajućim delovima genoma. Mesta

koja se malo menjaju tokom evolucije, tzv. CNC mesta (od engl. conserved non-

coding sites), nalaze se u regionima koji obuhvataju introne i netranslatujuće 5’ i 3’

delove samih gena20, kao i nukleotide na oko 5 kb uzvodno i nizvodno od mesta

početka i kraja transkripcije gena koji kodiraju proteine. Na primer, čovek i miš imaju

nekoliko stotina apsolutno identičnih nizova DNK čija veličina varira od 200 do 800

bp. Ti nizovi nalaze se u egzonima gena uključenih u obradu RNK, u intronima gena

koji su uključeni u DNK transkripciju ili su smešteni između gena, gde služe kao

pojačavači nekih gena značajnih za embrionsko razviće (npr Pax6 gena). Očigledno je

da ovi nizovi imaju suštinski značaj za funkcionisanje sisarskih gena, a visoka

konzervisanost CNC objašnjava se prisustvom cis-regulatora u njima (Bajerno i sar., 19 Evoluciono konzervisanim se nazivaju nukleotidni nizovi koji se ne menjaju mnogo tokom evolucije. 20 5’ i 3’ UTR sadrže signale koji, na primer, određuju gde će se u ćeliji akumulirati dati protein.

59

2004). Kod jednog broja CNC u genomu čoveka došlo je do nukleotidnih zamena, a

pošto kod šimpanze takve promene nisu viđene, ovi regioni se označavaju kao haCNC

(od engl. human accelerated CNC).

Ukoliko se u konzervisanim nekodirajućim mestima genoma zaista nalaze

važni cis-regulatori, onda delecije na tim mestima mogu dovesti do značajnih

promena u načinu regulacije odgovarajućih gena – najčešće ti geni postaju

nefunkcionalni. U genomu ljudi pronađeno je 510 delecija u regionima koji su kod

šimpanzi i drugih sisara visoko konzervisani (McLean i sar., 2011). Dakle, to su

delecije specifične samo za ljude (hCONDEL; engl. human CONserved DELetions).

Većina hCONDELa nalazi se u nekodirajućim delovima genoma (355 u intergenskim

regionima, a 154 u intronima gena). Dve od tih delecija su posebno interesantne - prva

se nalazi u blizini gena koji kodira jedan steroidni receptor, a druga u blizini gena

značajnog za funkcionisanje centralnog nervnog sistema.

Androgenski receptor (AR), u čijoj se blizini nalazi prva delecija, neophodan

je za odgovore sisarskih tkiva na androgenske hormone. Analiza ekspresije ovog gena

kod transgenih miševa, u koje je ubačen oko 5kb velik region šimpanze i miša sa

delecijom čoveka, pokazala je da se u tom regionu nalazi pojačavač za regulaciju

pojave AR u tkivu embriona. Aktivnost ovog gena odgovorna je za razviće facijalnih

(mirisnih) dlačica i keratiniziranih epidermskih čekinja na vrhu penisa, koje su

prisutne kod mnogih sisara, uključujući šimpanze (slika 2.10). Odsustvo pojačavača

koji kontroliše specifičnu tkivnu ekspresiju AR gena, uslovilo je nedostatak ovih

osobina kod čoveka.

60

Slika 2.10. Analiza ekspresije AR kod embriona transgenih miševa u koje je unešen šimpanzin i mišji AR pojačavač (prema: McLean i sar. 2011).

Imajući u vidu niz razlika u seksualnom ponašanju, koje se vezuju za

prisustvo/odsustvo čekinjastih struktura na penisu, delecija pojačavača AR mogla je

imati značajne posledice za evoluciju čoveka. Na primer, poznato je da su primate sa

manje čekinja pretežno monogamne, kao i da uklanjanje čekinja smanjuje taktilnu

osetljivost i produžava trajanje kopulacije. Zajedno sa drugim osobenostima u

morfologiji i seksualnom ponašanju, koje se uočavaju u našoj evolucionoj liniji,

gubitak pojačavača za AR mogao je značajno uticati na pojavu monogamnih veza i

povećanu brigu prema potomstvu oba roditelja.

Druga važna delecija odnosi se na pojačavač u blizini gena GADD45G, koji

kod šimpanze i drugih sisara zaustavlja ćelijski ciklus i aktivira apoptozu u

subventrikularnim zonama prednjeg mozga. Povećana proliferacija ćelija u tim

zonama, zbog delecije u regulatornom elementu, očigledno je mogla dovesti do

povećanja neokorteksa u našoj evolucionoj liniji.

61

Na osnovu poređenja mesta vezivanja istog transkripcionog faktora u

genomima različitih vrsta može se steći uvid u evoluciju cis-regulatora. Takva

istraživanja sprovedena su za tri transkripciona faktora različitih vrsta kvasaca, četiri

transkripciona faktora miševa i ljudi i šest transkripcionih faktora dve srodne vrste

Drosophila (D. melanogaster i D. yakuba; Bradley i sar., 2010). Procenat identičnih

mesta vezivanja u ovim vrstama varirao je kod kvasaca od 7% do 42%, u zavisnosti

od analiziranog transkripcionog faktora, dok se kod čoveka i miša taj procenat kretao

u rasponu od 11% do 59%. Kod voćnih mušica, međutim, skoro sva mesta vezivanja

(od 95% do 99%) bila su identična, što je ukazivalo na skorašnje razdvajanje D.

melanogaster i D. yakuba. Međutim, uprkos praktično identičnim mestima vezivanja

transkripcionih faktora, relativan afinitet njihovog vezivanja često se bitno razlikovao

između vrsta vinskih mušica. Na osnovu ovih rezultata, može se zaključiti da, izgleda,

promena intenziteta interakcija između transkripcionih faktora i njihovih mesta

vezivanja, a ne potpuna promena mesta vezivanja, predstavlja prvi korak u

evolucionoj divergenciji cis-regulatora.

Upoređivanjem fenotipskih efekata mutacija u kodirajućim delovima gena i

mutacija u cis-regulatorima, postavljena je hipoteza da one imaju „kvalitativno

drugačiji doprinos fenotipskoj evoluciji“ (Wray, 2007). Naime, prva pretpostavka

podrazumeva da se neki tipovi fenotipskih promena mogu lakše postići putem cis-

regulatornih mutacija nego mutacijama u kodirajućim sekvencama. U osnovi ovog

stava leži činjenica da je transkripcija vrlo dinamičan proces koji može biti vrlo “fino

moduliran“, što nije slučaj sa mutacijama u kodirajućim delovima gena. Brojni

aspekti fenotipova jedinki, kao što je reprodukcija, razviće, ponašanje, imunski

odgovori ili korišćenje resursa, budući da se tokom života individua moraju

prilagođavati uslovima životne sredine, “zahtevaju“ dinamične promene u funkcijama

gena. Dakle, vrlo je verovatno da cis-regulatorne mutacije, uključujući formiranje

modularne organizacije ovih elemenata, imaju vrlo važnu ulogu u evoluciji

kvantitativnih osobina, ali i evoluciji odgovora organizama na sredinske činioce koji

fluktuiraju tokom vremena, kao što su različiti stresori, resursi, patogeni i paraziti.

Jedan od najboljih primera koji ukazuje na značaj cis-regulatorne mutacije,

odnosi se na Duffy krvnu grupu kod ljudi (dobila ime po pacijentu kod kog je prvi put

otkrivena ova krvna grupa), hemokinski receptorni lokus (DARC, od engl. Duffy

antigen receptor chemokines; ranije ozačavan kao FY). Ovaj gen kodira za receptor

za kog se vezuju interleukin 8 (IL8) i drugi signalni molekuli imunog sistema. Pored

62

eritrocita, DARC gen se ispoljava i u drugim ćelijskim tipovima i tkivima (npr. nekim

epitelnim ćelijama, Purkinjevim neuronima, itd). Pošto je prisustvo ovog antigena na

eritrocitima neophodno za vezivanje malaričnog parazita Plasmodium vivax, ljudi kod

kojih se DARC gen ne eksprimira u eritrocitima, skoro su potpuno zaštićeni od

infekcije. U praktično svim supsaharskim populacijama, osobe koje su otporne na

oboljevanje od malarije zbog odsustva Duffy antigena na eritrocitima, nemaju

nikakve zdravstvene probleme zbog toga što je aktivnost DARC gena u drugim

tipovima ćelija potpuno normalna. Analize nukleotidnog sastava ovog gena pokazale

su da do navedenih efekata dovodi jedna zamena nukleotida (C → G) koja narušava

mesto vezivanja u promotoru za GATA1 eritroidni faktor (GATA transkripcioni

faktori uključeni su u kontrolu diferencijacije ćelija). Ovaj primer veoma dobro

ilustruje jedno od osnovnih karakteristika cis-regulatornih mutacija – ograničavanje

plejotropije. Efekat navedene mutacije ima fenotipske posledice samo u jednom tipu

ćelija organizma.

Cis-regulatorne mutacije doprinele su pojavi vrlo specifične osobenosti ljudi –

sposobnosti da koriste mleko u ishrani i kao odrasle osobe (ovo se često naziva

“laktazno istrajavanje“; engl. lactase persistence). Naime, kod sisara je normalno da

posle perioda odojaštva dolazi do smanjenja sinteze enzima laktaze, koja je

neophodna za digestiju šećera laktoze. Kod ljudi poreklom iz populacija koje nemaju

stočarsku tradiciju (to je oko 75% savremenog čovečanstva), sinteza laktaze se do

četvrte godine života smanjuje i do 90%. Učestalost osoba koje imaju smanjenu

aktivnost laktaze u Evropi varira od 5% na severu, do 70% na Siciliji. Neke

populacije iz istočne Afrike, koje imaju pastoralan način života poslednjih 3000

godina, takođe maju visok procenat osoba kod kojih je prisutno laktazno istrajavanje.

Genetičke analize su pokazale da laktazno istrajavanje uzrokuju mutacije u genu

MCMG6 (engl. mini-chromosome maintenence; ovaj gen sintetiše proteine za

replikaciju genoma eukariota) koji se nalazi uz 5' kraj laktaznog gena (LCT). Gen

MCMG6 ima 18 introna, a u dva od njih nalaze se pojačavači za LCT gen. Do sada su

otkrivene četiri mutacije u tim pojačavačima (jedna mutacija je specifična za

evropske, a tri za istočno-afričke populacije) koje pojačavaju trankripciju LCT gena21.

21Procenjuje se da se mutacija za evropsku varijantu laktaznog istrajavanja pojavila pre oko 7500 godina u srednjoj Evropi – to je vreme i mesto koje se poklapa sa tzv. Starčevačkom kulturom (naziv potiče od sela Starčeva u Vojvodini).

63

Značaj cis-regulatornih mutacija u morfološkoj evoluciji pokazan je kod male

ribe gregorca (Gasterosteus aculeatus). Slatkovodni gregorci evoluirali su od morskih

pre oko 12000 godina, krajem poslednjeg ledenog doba, kada su morski oblici

kolonizovali novoformirana jezera na Severnoj hemisferi. Morski gregorci imaju tri

trbušne bodlje pomoću kojih se štite od predatora. Ove bodlje su, međutim, odsutne

kod slatkovodnih oblika. Nestanak bodlji kod slatkovodnih gregoraca povezuje se se

odsustvom velikih predatora u jezerima. Genetičke analize su pokazale da se

prisustvo/odsustvo pelvičnih bodlji kod ovih riba može povezati sa genom koji

kontroliše transkripcioni faktor Pitx1 (engl. paired-like trascription factor 1). Ranije

sprovedeni eksperimenti na miševima pokazali su da se Pitx1 ispoljava tokom razvića

zadnjih udova (miševi kod kojih je ovaj gen potpuno inaktiviran imaju samo prednje

udove). Kada su istraživači uporedili aminokiselinski sastav Pitx1 proteina morskih i

slatkovodnih oblika gregoraca nisu pronašli nikakve razlike (Shapiro i sar., 2004).

Međutim, uporedjivanjem obrazaca ekspresije ovog proteina uočeno je da se kod obe

forme ovaj protein pojavljuje u prekursorskim ćelijama timusa, senzornih neurona i

nosa, ali kod morskih oblika bio je prisutan i u pelvičnom regionu. Kod slatkovodnih

ribica, Pitx1 protein je potpuno odsustvovao ili je bio prisutan u veoma maloj količini.

Jedino logično objašnjenje ovih rezultata jeste prisustvo mutacija u pojačavačima

Pitx1 gena u ćelijama koje učestvuju u razviću pelvičnih kostiju.

Na aktivnost cis-regulatora može uticati i nukleotidni sastav nekodirajuće

DNK u čijoj se blizini nalaze geni. Brojni su primeri promene aktivnosti cis-

regulatora uzrokovanih mutacijama “ponovaka jednostavnih nizova“ (SSR, engl.

simple sequence repeats, videti boks 2.2). Svaka SSR mutacija, tj. promena u broju

ponovaka, koja se nađe pored ili u cis-regulatornim regionima, nužno menja dužinu

DNK u tom regionu, a to, opet, dovodi do promena u prostornim odnosima

transkripcionih faktora koji se vezuju za cis-regulatore. Recimo, količina masti u

mleku goveda rase Holstein korelisana je sa brojem ponovaka od 18 nukleotida u

promotorskom regionu gena za enzim koji učestvuje u sintezi triglicerida.

Još jedan primer odnosi se na SSR koji se nalazi uz gen za jedan od

vazopresinskih receptora (avpr1a) kod nekih vrsta voluharica (Hamrock i Young,

2005). Prerijska voluharica (Microtus ochrogaster) ima socijalno ponašanje, a

mužjaci posle parenja ostaju u monogamnoj vezi sa ženkama. Planinska voluharica

(M. montanus) je, s druge strane, asocijalna sa poligamnim mužjacima. Pokazalo se

da ovi različiti obrasci ponašanja zavise od ekspresije avpr1a gena – viši nivo

64

ekspresije u ventralnom delu prednjeg mozga uočava se kod monogamne vrste. Uzrok

razlika u ekspresiji ne nalazi se u kodirajućim delovima avpr1a gena, već u prisustvu

dužeg SSRa uz njegov 5’ region kod monogamne vrste voluharica.

Boks 2.2. Ponovci jednostavnih nizova

Mikrosateliti i minisateliti se često objedinjuju pod zajedničkim imenom

“ponovci jednostavnih nizova“ (engl. simple sequence repeats, SSR). Broj mogućih

motiva (ili “tema“), kako se nazivaju specifični nizovi nikleotida koji se ponavljaju,

raste sa njihovom dužinom. Postoji šest različitih dinukleotidnih motiva (AA/TT,

AC/TG, AT/TA, CC/GG, CG/GC) i deset trinukleotidnih motiva. Raspodela motiva u

genomu nije slučajna; trinukleotidni ponovci, na primer, najčešće se sreću u

kodirajućim delovima gena i posebno su česti u genima koji kontrolišu sintezu

transkripcionih faktora.

Mikrosateliti se sastoje od kratkih motiva dužine 1 - 6 nukleotida koji se u

okviru mikrosatelitskih lokusa ponavljaju od 10 do 100 puta, pa su ovi lokusi

varijabilni po dužini (tzv. polimorfizam dužine). Mikrosateliti se nalaze rasuti po

čitavom genomu, što ih čini posebno pogodnim genetičkim markerima. Smatra se da

visoka stopa mikrosatelitskih “alela“, koji se razlikuju po broju ponovaka, nastaje

pretežno putem tzv. replikacionog iskliznuća (engl. recombination slippage). Naime,

tokom replikacije 3’ rastući lanac DNK može da se odvoji od matričnog lanca i da

formira petlju tako da se sledeći ponovak kopira sa matrice koja je već korišćena.

Veruje se, međutim, da ekstremno dugi mikrosatelitski aleli nastaju nejednakim

krosingoverom.

Minisateliti imaju duže motive, između 8 i 100 bp, koji se ponavljaju od 5 do

1000 puta. To nisu, međutim, samo nešto duži mikrosateliti već se od njih razlikuju

po lokacijama na hromozomima, stopama mutacija i varijabilnosti u populacijama.

Minisateliti ulaze u red najdinamičnijih delova genoma eukariota. Mnogi od

minisatelitskih lokusa pokazuju hipervarijabilnost, sa velikim brojem alela, i stopama

mutacija koje idu i do 14% po generaciji. Kao i mikrosateliti, većina minisatelita se ne

transkribuje, ali se neki od njih nalaze u genima koji kodiraju proteine.

Na početku ovog poglavlja istakli smo da mnogi evolucioni biolozi smatraju

da su mutacije u cis-regulatorima osnovi uzrok razlika u ekspresiji gena, koje postoje

65

između vrsta. Primeri koje smo naveli, kao i brojni drugi koji se mogu naći u

savremenoj literaturi (videti npr. Kod Wray, 2007, Prud'homme i sar., 2007) govore,

naravno, u prilog značaja cis-regulatornih mutacija. Međutim, naša znanja o ulozi svih

komponenti regulatorne mreže, kako je definiše Davidson (2006), još uvek su previše

rudimentarna da bismo mogli zaključiti da su cis-regulatorne mutacije primarni uzrok

fenotipske evolucije. Jedan od glavnih argumenata zagovornika “cis-regulatorne

paradigme“ (Wagner i Lynch, 2008) su male stope promena transkripcionih faktora –

druge ključne komponenta regulacije aktivnosti gena na nivou transkripcije – kod

filogenetski vrlo udaljenih grupa; mnogi transkripcioni faktori, dodatno, imaju veoma

slične uloge u razviću organizama sasvim nesrodnih grupa22. Spektakularni

eksperimenti poput onih sa Pax6 genom (engl. paired box 6), uključenim u razviće

očiju i prednjih delova nervnog sistema beskičmenjaka i kičmenjaka, stvarno ukazuju

na postojanje opšte sličnosti u funkcionisanju transkripcionih faktora. Ipak, pokazalo

se da kod mnogih transkripcionih faktora odsustvuje potpuna funkcionalna

ekvivalencija kada se porede različite grupe organizama. Na primer, iako oba gena,

tinman kod voćnih mušica, i Nkx2.5 kod kičmenjaka (oba pripadaju tzv. NK klasi

gena sa homeoblokovima, deo 3.2.2), učestvuju u razviću srca, ova dva transkripciona

faktora pokazuju samo delimičnu funkcionalnu ekvivalentnost. Ubacivanjem tinman

iRNK u voćne mušice čiji je tinman gen bio inaktiviran, potpuno je obnovljena

tinman funkcija. Međutim, kada je u takve mušice ubačen Nkx2.5 gen, tinman

funkcija je samo delimično restaurirana. Postojanje funkcionalne neekvivalentnosti

mnogih transkripcionih faktora vrlo je značajno jer pokazuje da mutacije u njihovim

kodirajućim delovima ne moraju nužno imati štetno plejotropno delovanje. Drugim

rečima, trans-regulatori mogu biti uključeni u fenotipsku evoluciju na sličan način kao

i cis-regulatori.

Jedan od razloga zašto se transkripcioni faktori tretiraju kao manje značajni

činioci u adaptivnoj fenotipskoj evoluciji jeste, kako ističe Stern (2000),

nerazlikovanje plejotropne funkcije gena od plejotropnog efekta mutacija tih gena.

Mutacije kod izrazito plejotropnih gena, tj. onih koji se ispoljavaju u mnogim tkivima

nekog višećelijskog organizma, ne moraju imati funkcionalne efekte u svakom od tih 22 U molekularnoj genetici je uobičajeno da termin “transkripcioni faktor“ označava trans-regulatore koji sintetišu proteine, a koji na različite načine kontrolišu transkripciju RNK. Transkripcioni faktori su često aktivni u različitim tipovima ćelija, gde regulišu ekspresiju brojnih gena putem vezivanja za cis-regulatore. Transkripcioni faktori se obično grupišu u familije na osnovu prisustva zajedničke oblasti vezivanja za cis-regulatore.

66

tkiva. Na primer, ako neka fukcija proteina X u jednim tkivima zavisi od kofaktora Y,

a u drugim tkivima od kofaktora Z, mutacija u proteinu X koja onemogućava

interakciju sa Y imaće efekte samo u tkivima gde se se ispoljava kofaktor Y.

Funkcija transkripcionih faktora, dakle, pored interakcije protein-DNK

uključuje i protein-protein interakcije, koje se ostvaruju preko sekundarnih strukturnih

motiva i velikih veza preko proteinskih domena. Danas ima sve više podataka da u

interakcijama između proteina važnu ulogu imaju tzv. kratki linearni motivi (SLiM,

od engl. Short Linear Motif). U njihov sastav ulazi vrlo malo aminokiselina, obično

između 3 i 10, pri čemu su svega 2 do 3 apsolutno neophodne za ostvarivanje

interakcija. Od posebne važnosti je podatak da se ovi motivi pretežno nalaze u tzv.

neuređenim regionima proteina, što znači da su relativno oslobođeni od strukturnih

ograničenja i da zbog toga mogu lako reagovati na različite funkcionalne potrebe.

Dodatno, pokazalo se da SLiMovi relativno lako evoluiraju. Recimo, postoje primeri

da samo jedna mutacija može preobraziti nefunkcionalni niz aminokiselina u

funkcionalni SLiM.

U genima koji kodiraju transkripcione faktore često se sreću i trinukleotidni

ponovci (Kashi i King, 2006). Naravno, variranja u broju ponovljenih kodona dovode

do razlika u dužini homopolimernih odsečaka aminokiselina, što, opet, utiče na neke

važne karakteristike trans-regulatornih proteina, kao što su fleksibilnost ili način

vezivanja za cis-regulatore. Trinukleotidni ponovci su jedna od klasa jednostavnih

nizova ponovaka (SSR), o kojima smo ranije govorili. Kao i SLiMovi i ova klasa

SSRa povećava evolucionu plastičnost transkripcionih faktora.

U jednoj studiji na 92 rase pasa, u 17 gena, koji učestvuju u formiranju

različitih morfoloških osobina, primećena je velika među-rasna varijabilnost u broju

SSRa koji se u njima nalaze (Fondon i Garner, 2004). Na primer, u transkripcionom

faktoru Runx-2, koji je uključen u kontrolu transkripcije gena značajnih za

diferencijaciju osteoblasta i morfogenezu, nađena su dva susedna regiona koji nose

ponovljene nizove dve aminokiseline (u prvom regionu 18 do 20 glutamina, a u

drugom 12 do 17 alanina). Razlike u broju aminokiselina u ovim regionima bile su u

korelaciji sa facijalnim karakteristikama rasa pasa. Treba napomeniti da kod ljudi

CBFA1 gen, koji je ortologan sa Runx-2 genom, takođe utiče na kraniofacijalne

strukture i da ekspanzija broja alanina sa 17 na 27 dovodi kod ljudi do poremećaja

67

pod nazivom kleidokranijalna displazija23. U navedenom istraživanju pasa, takođe je

uočeno da je kod rase Pirinejski ovčar, koju karakteriše polidaktilija zadnjih nogu,

prisustvo prekobrojnog prsta povezano sa smanjenjem broja heksanukleotidnih

ponovaka (u proteinu to su ponovci aminokiselina glutamina i prolina) u

transkripcionom faktoru Alx-4. Ovaj oblik polidaktilije, inače, viđa se i kod miševa

kod kojih je inaktiviran Alx-4 gen. Eksperimenti na miševima su pokazali da

skraćenje glutamin-prolin lanaca aminokiselina sprečava vezivanje Alx-4 proteina sa

proteinom drugog transkripcionog faktora (Lef-1), što onemogućuje ekspresiju gena u

zamecima udova. Podaci koje smo naveli ukazuju da dužina SSRa u transkripcionim

faktorima ima funkcionalne posledice i da može izmeniti ekspresiju drugih gena

putem protein-protein interakcija između transkripcionih faktora.

Eksperimenti na cirkadijalnom genu pod nazivom period (per) kod Drosophile

melanogaster nedvosmisleno su pokazali da fenotipski efekti varijacija u veličini

SSRa utiču na adaptivnu vtrednost jedinki (Sawyer i sar., 1997). Protein koji kodira

ovaj gen (auto)reguliše sopstveni gen, ali i tri druga cirkadijalna gena voćnih mušica.

Centralni deo gena kodira dipeptidne ponovke treonina i glicina, čiji broj varira u

zavisnosti od temperature u staništima različitih populacija. Prvi od dva najčešća alela

per gena ima 17 dipeptidnih ponovaka i održava cirkadijalni ciklus od 24 časa samo

na višim temperaturama, dok je drugi alel, sa 20 dipeptidnih ponovaka, znatno bolji u

održavanju cirkadijalnog ciklusa na nižim temparaturama. U Evropi i Severnoj

Americi učestalost ovih aleli ima klinalnu raspodelu – u hladnijim regionima

učestalost alela sa većim brojem dipeptidnih ponovaka je viša nego u toplijim

regionima. Ovakvu raspodelu, koja je bazirana na diferencijalnoj temperaturnoj

osetljivosti ovih alela, naravno, oblikuje prirodna selekcija.

Regulacija aktivnosti gena tokom razvića višećelijskih organizama, kada je

važno da specifičan gen bude aktivan samo u određenoj fazi razvića i u ograničenom

broju ćelija, zavisi od interakcija niza cis- i trans- regulatornih elemenata, ali i od

dinamičkih hromatinskih promena. Mehanizmi tih interakcija vezuju se za delove

genoma koji se označavaju kao “lokusni kontrolni regioni“ (LCR; engl. Locus Control

Region). LCR su prvi put otkriveni kod osoba sa teškim anemijama koje izazivaju

različiti geni u β-globinskoj familiji. [Kod ljudi ova globinska familija se sastoji od 4 23Podaci dobijeni iz rekonstruisanog genoma neandertalaca sredinom 2010. godine ukazuju na mogućnost da su promene u Runx-2 mogle dovesti do nekih razlika u skeletu (npr. oblik lobanje i grudnog koša) koje se uočavaju između anatomski savremenih ljudi i neandertalaca.

68

gena - ε, γΑ, γG, δ ι β. Gen ε se ispoljava tokom ranih embrionskih stupnjeva, γΑ i γG se

pojavljuju u jetri fetusa, a δ i β su prisutni kod adulta.] Naime, uočeno je da neki ljudi

imaju gama, delta i beta talasemiju, a da pri tome odsustvuju mutacije u

pojačavačima, promotorima ili kodirajućim delovima tih gena. Svi oni su, međutim,

imali delecije u jednom regionu koji je bio vrlo udaljen od β-globinske familije. Taj

region nazvan je lokusnim kontrolnim regionom za β-globinsku familiju. Različite

komponente LCR interaguju sa regulatornim elementima svakog gena u β-globinskoj

familiji i određuju fazu razvića kada će se koji od članova te familije ispoljiti. Smatra

se da sličan LCR kontroliše i globalnu ekspresiju Hox gena (videti deo 3.2).

2.4.2. Evolucija posttranskripcione regulacije

Na ogromnu diverzifikaciju RNK transkripata utiču različiti mehanizmi, kao

što su alternativna mesta inicijacije transkripcije, alternativno iskrajanje, alternativna

poliadenilacija, RNK prerada i brojne posttranskripcione modifikacije

(pseudouridilacija, metilacija i nekanonička poliadenilacija i RNK terminalna

poliuridilacija). Aktivnosti tako stvorenih izoformi zrele iRNK dodatno su regulisane

mehanizmima koji uključuju regulaciju translacije putem miRNK i drugih

regulatornih faktora, korišćenje alternativnih mesta inicijacije translacije, itd. Pošto

alternativno iskrajanje mnogi smatraju primarnim pokretačem evolucije fenotipske

složenosti sisara (Wang i sar., 2008), na ovom mesto prvo ćemo se baviti ovim

mehanizmom diverzifikacije iRNK.

2.4.2.1. Alternativno iskrajanje

Alternativno iskrajanje (AS, engl. alternative splicing) je oblik

posttranskripcione regulacije gena sa intron/egzon stukturom u kome alternativna 5’ i

3’ mesta iskrajanja i/ili isključivanje/uključivanje nekih egzona dovode do stvaranja

brojnih iRNK sa istog gena. Dakle, ekspresija mnogih eukariotskih gena može biti

modulisana i brzinom i alternativnim načinima obrade primarnog transkripta. Kod

sisara, procenat gena koji se alternativno iskrajaju kreće se od 22% do 74% (Baek i

Green, 2005), dok je kod biljaka taj procenat nešto niži – 8% do 14% (Wang i

Brendel, 2006). Kod čoveka, najveći broj gena sa intron-egzon strukturom (preko

90%; Wang i sar., 2008) ima mogućnost alternativnog iskrajanja, što omogućava da

69

jedan gen može formirati različite proteine24. Jedan deo alternativnih transkripata se

degradira, ali veći deo AS transkripata dovodi do pojave funkcionalno različitih

izoformi proteina. Procenjuje se, na primer, da u proseku svaki naš gen stvara 2 do 3

različita proteina tako da, iako je kod čoveka identifikovano samo oko 20000 gena

koji kodiraju proteine (podatak iz marta 2010. godine), mi imamo bar 10 puta više

proteina od voćnih mušica. Važno je takođe reći da između 10% i 30% od ukupnog

broja alternativnih iskrajanja u našoj vrsti pripada individualnim varijacijama, tj.

različitim AS varijantama koje se javljaju kod pojedinačnih jedinki. Pošto AS dovodi

do pojave strukturno i funkcionalno različitih proteina sa istog gena, ovaj proces,

zajedno sa poznavanjem drugih promena u ekspresiji gena, pruža mogućnost da bolje

razumemo fenotipsku evoluciju i pojavu fenotipske plastičnosti organizama (videti

deo 4).

Različiti načini obrade transkripata su obično svojstveni određenim tkivima,

tako da se u ćelijama jednog tkiva mogu ukloniti nizovi nukleotida koji u ćelijama

drugog tkiva mogu poslužiti kao egzoni, te se kao rezultat transkripcije istog gena u

različitim tkivima mogu sintetisati različiti proteini. Suština alternativne obrade

primarnog transkripta svodi se na izbor mesta na kojima će se vršiti njegova obrada.

Ovaj izbor je strogo kontrolisan na tkivno specifičan način uz učešće niza regulatornih

proteina. Smatra se da ključnu ulogu u regulaciji alternativnog iskrajanja imaju tzv.

SR proteini (bogati su aminokiselinama serinom i argininom) koji, vezujući se za

kratke egzonske ili intronske nizove (od 4 do 18 bp), omogućavaju slobodnije

kombinovanje egzona u okviru splajsozoma. Pojava SR proteina vezuje se sa

nastankom višećelijske organizacije; kod jednoćelijskih eukariota postoji samo jedan

ili dva gena za ove proteine (pekarski kvasac uopšte nema SR proteine), a kod

višećelijskih životinja oni se svrstavaju u čak devet familija.

Egzoni koji se alternativno iskrajaju su, izgleda, manje konzervisani, u smislu

prisustva/odustva nego konstitutivni egzoni (Malko i sar., 2006). Analiza genoma

čoveka je pokazala da se u njemu nalaze i brojni obrađeni pseudogeni (tj. oni nastali

reverznom transkripcijom obrađene iRNK, videti deo 2.3.2) među kojima ima i onih

24Procenjuje se da oko 92% gena koji kod čoveka kodiraju proteine imaju, pored kodirajućih delova (egzona), i nekodirajuće nizove nukleotida (introne) koji se prilikom obrade uklanjaju iz iRNK molekula. Prosečan gen čoveka ima 4 egzona i daje proteine sačinjene, u proseku, od 450 aminokiselina. Najveći gen u genomu čoveka je titin (ili konektin) sa 363 egzona i proteinom od 38000 aminokiselina; ovaj protein je odgovoran za pasivnu elastičnost mišića.

70

koji su nastali od alternativnih transkripata ispoljenih kod naših davnih predaka, ali

koji se više ne formiraju u genomu čoveka (Shemesh i sar., 2006). Jedan takav slučaj

je pseudogen na hromozomu 1 nastao reverznom transkripcijom gena za serinsku

hidroksimetiltransferazu 1 (SHMT1) koji se nalazi na hromozomu 17. Kod ovog

pseudogena prvi egzon je veći za 23 nukleotida – što je varijanta koja ne postoji kod

aktivnog oblika SHMT1 gena. Kod orangutana, međutim, postoji cDNK sa tom

varijantom. Uz to, kod orangutana na poziciji +2 od 5’ mesta iskrajanja nalazi se C

umesto T, kao kod čoveka. Pošto i kod ljudskog ψSHMT1 gena imamo istu zamenu

nukleotida, to ukazuje da je duža varijanta egzona 1 ovog gena predačka, odnosno da

je C → T mutacija u našoj evolucionoj liniji stvorila 5’ mesto iskrajanja za kraći

egzon. Šimpanza kao i čovek ima ψSHMT1 i SHMT1gen, što, opet, znači da je do

navedene promene došlo pre razdvajanja naše evolucione linije od one koja je vodila

prema šimpanzama.

Da tokom evolucije dolazi do promena u obrascima alternativnog iskrajanja

pokazuje i poređenje ortolognih parova gena između čoveka i miša – između 80% i

90% alternativno iskrojenih transkripata imaju ili nove species-specifične egzone, ili

species-specifično iskrojene varijante (Wagner i Lynch, 2008). Procenjuje se da je

stopa pojave species-specifičnih egzona kod sisara vrlo visoka. Ta stopa kod glodara

je oko 2,72-3 po genu za mil. god., što je znatno više od procena koje se daju za

zamene pojedinačnih nukleotida ili stopa potpunih duplikacija gena. Ovi podaci

ukazuju da formiranje novih egzona ima vrlo značajnu ulogu u stvaranju fenotipskog

diverziteta.

Analize oko 13000 ortolognih gena koji se ispoljavaju u jetri na jedinkama oba

pola kod čoveka, šimpanze i makake pokazale su da oko 7% gena, između čoveka i

šimpanze, i oko 13% gena, između čoveka i makake, imaju različite obrasce

alternativnog iskrajanja (Blekhman i sar., 2010). Kada se uporede obrasci ekspresije

tih gena kod jedinki različitog pola sve tri vrste, uočava se da geni sa višom

ekspresijom kod ženki pretežno učestvuju u metabolizmu lipida i enzima koji

katalizuju razgradnju adenozina trifosfata (“ATPaze“). Pošto je poznato da polni

hormoni učestvuju u kontroli ATPazne aktivnosti, uočen polni dimorfizam je potpuno

očekivan. Među genima čija je ekspresija viša kod mužjaka nego kod ženki sve tri

vrste, najprisutniji su geni koji kontrolišu obradu RNK i RNK iskrajanje.

Mada AS stvara proteine sa drugačijom strukturnom arihitekturom, to,

najšešće, nije praćeno promenom funkcije tih proteina. Međutim, primera

71

funkcionalne različitosti alternativno iskrojenih proteina ima mnogo i njihov broj iz

dana u dan raste. To je, recimo, slučaj sa transkripcionim faktorom AML1 (reguliše

ekspresiju gena značajnih za hematopoezu), koji može da deluje kao aktivator ili

represor u zavisnosti od isofromne strukture (Lopez, 1995). Zanimljiv primer AS

nalazimo kod gena koji su uključeni u kontrolu determinacije pola kod Drosophila

melanogaster (Baker, 1989). U tri gena Sxl (sexlethal), tra (transformer) i dsx (double

sex) dolazi do različitog spajanja egzona kod jedinki ženskog i muškog pola. Gen dsx

ima 6 egzona, međutim, kod ženki se koriste samo egzoni 1, 2, 3 i 4, dok su kod

mužjaka to egzoni 1, 2, 3, 5 i 6. Geni Sxl (sa osam egzona) i tra (sa četiri egzona) daju

kod mužjaka, kroz alternativno iskrajanje egzona, transkripte koji nose u jednom

egzonu (broj 2 u slučaju tra gena, i egzon broj 3 u slučaju Sxl gena) prevremene stop

kodone. Ženke, međutim, prilikom povezivanja egzona u procesu obrade primarnog

transkripta, nemaju te egzone u iRNK.

Kod ptica, sposobnost učenja pevanja povezuje se, između ostalog, sa

alternativnim iskrajanjem gena za glutamatske receptore (Wada i sar., 2004). Kod

svih ptica koje mogu da nauče nove pesme, regioni mozga u kojima se nalaze centri

za vokalno učenje imaju drugačiji obrazac ekspresije receptorske superfamilije gena

za glutamat u odnosu na regione gde se ne nalaze ti centri. Golubovi, koji nemaju

sposobnost učenja pesama, ne pokazuju ove razlike u mozgu. Neki od gena iz ove

superfamilije imaju alternativno iskrajanje, a u jednoj od supfamilija koja se

alternativno iskraja, uočeno je da se samo specifično obrađene iRNK ispoljavaju u

centrima za učenje pesama. Pošto se zna da različito iskrajane iRNK stvaraju

receptore koji se razlikuju po tome koliko se brzo desenzitizuju posle otvaranja

kanala, to je moglo dovesti do velikih fenotipskih efekata koji su se odnosili i na

sposobnost vokalnog učenja.

Jedan broj naslednih bolesti kod ljudi posledica je mutacija koje utiču na AS.

Ove bolesti su verovatno samo ekstremi brojnih polimorfizama koji utiču na AS

mnogih gena, a koji, inače, dovode do finog oblikovanja fenotipova. Među takvim

genima nalaze se i oni čiji aleli mogu da menjaju način kako AS reaguje na varijacije

u životnoj sredini, odnosno predstavljaju gene za fenotipsku plastičnost. Jedan takav

primer je gen za acetilholinesterazu.

Holinergični sistem se sastoji od gena koji kontroliše sintezu neurotransmitera

acetilholina, i gena za acetilholinesterazu koji kodira enzim za hidrolizu acetilholina

po izvršenju njegove funkcije u pobuđivanju neurotransmisije u centralnom nervnom

72

sistemu (kod neurona povezanih sinapsama) i perifernom nervnom sistemu (na

neuromišićnim vezama). Acetilholinesteraza (AChE) na taj način utiče na ravnotežu

između prenošenja i okončanja prenosa nervnih signala. Svojstva AchE su

modifikovane u mnogim patološkim stanjima CNS, ali i mnogim nepatološkim

situacijama. Kod ljudi su do sada identifikovane četiri izoforme ovog enzima koje

nastaju putem alternativnog iskrajanja 3’kraja kodirajućeg regiona AChE gena

(Meshorer i Soreq, 2006). Prusustvom šestog egzona u obrađenoj iRNK dobija se

AChE-S (slika 2.11) čiji se protein polimerizuje kao tetramer koji se, zatim, vezuje za

sinaptičke membrane (otuda “S“; ova izoforma se obeleževa i kao AChE-T – od engl.

tail, repić). Izoforma AChE –E dobija se odstranjivanjem malog introna 4’ i direktnog

spajanja egzona 4 sa egzonom 5. Obrazovani dimer se ispoljava u krvi (zato oznaka

“E“ od eritrocit; ova izoforma označava se i kao AChE-H – gde “H“ označava da se

radi o hidrofobnom molekulu). Treća izoforma (AChE-E’), nedavno otkrivena u

nekim tumorskim ćelijama ljudi, dobija se sa iRNK kojoj nedostaje kriptični intron

unutar 5. egzona, tako da se dobija transkrip koji je 36 nukleotida kraći od AChE-E

transkripta. Četvrta izoforma, AChE-R (“R“ od engl. read-through), dobija se

izbacivanjem šestog egzona sa 3’ kraja i zadržavanjem malih introna u egzonima 4 i

5. Tako dobijena iRNK kodira monomerni protein koji se ne vezuje za sinapse već se

slobodno kreće kroz mozak i druge delove tela.

5’kraj 4’ 5’ 3’kraj ___▄▄▄____▄▄____▄_______▄▄▄▄____▄▄___________▄◘▄◙▄_ _ _▄▄___ E1e E1c E1a 2 3 4 5 6 ↓

AChE-S ↓ AChE-R

▄▄▄ ▄▄▄▄ ▄▄ ▄ ▄▄ ← → ▄▄▄ ▄▄▄▄ ▄▄ ▄◘▄◙▄ 1 2 3 4 6 1 2 3 4 4’ 5’ 5

Slika 2.11. Struktura gena za AchE kod čoveka. E1e, E1c i E1a predstavljaju verzije egzona1. Na slici su prikazane strukture iRNK dve najpoznatije izoforme. Izoforma AchE-S nastaje kombinovanjem 1, 2, 3, 4 i 6 egzona, a izoforma AChE-R kombinovanjem 1., 2., 3., 4., malog introna u egzonu 4 (4’) i 5. egzona. Forma AChE-R se pretešno nalazi kod osoba sa neurodegenerativnim oboljenjima i sindromima koji se povezuju sa stresom.

Akutni stres i farmakološka inhibicija AChE supresuju stvaranje

acetilholinesteraze, enzima koji učestvuje u stvaranju acetholina. Ova inhibicija je,

73

međutim, praćena naglim porastom sinteze AChE-R izoforme. Eksperimenti sa

transgenim miševima, kod kojih je povećana ekspresija AChE-S izoforme (TgS

miševi) ili AChE-R izoforme (TgR miševi), ukazali su na moguće uloge ove dve

izoforme. TgS miševi pokazivali su niz neuropatoloških promena koje se vezuju za

stres, kao što su ošetećenja neuromotornih funkcija, ranjivost na promene dnevno-

noćnog ciklusa, oštećena difuzija između barijera krvi i mozga, i sl. S druge strane,

TgR miševi su imali normalne neuromišićne funkcije i znatno manja neurološka

oštećenja u odnosu na TgS miševe ili kontrolnu grupu miševa. Ovi podaci pokazali su

da AChE-R izoforma ima zaštitnu ulogu tokom akutnog stresa. Potrebno je istaći da

egzoni na 5’ kraju (na slici 2.11 označeni kao E1e, E1c i E1a) mogu takođe da se

alternativno iskrajaju. Fenotipski efekti alternativnih transkripata 5’ kraja nisu

poznati. Kombinacije 5’ i 3’ alternativnih egzona mogu kod čoveka potencijalno

formirati čak 12 različitih AChE transkripata.

Pokazalo se da AChE-R, sintetisan tokom akutnog stresa, može u neuronima

da stupi u interakciju sa jednim gradivnim proteinom (RACK1) i preko njega da utiče

na protein kinazu CII koja je važan signalni molekul u uslovljavanju straha (Birikh i

sar., 2003). TgR miševi, kao i miševi izloženi akutnom stresu, pokazivali su

ponašanje koje ukazuje na strah (na primer, oklevanje da se iz kutija izađe u otvoreno

polje). Zanimljivo je da je u jednom uzorku zdravih ljudi uočena inverzna reakcija

između nivoa AChE-R u krvi i niza faktora kojima se meri anksioznost (Sklan i sar.,

2004)25. Izgleda, dakle, da je naša sposobnost da izađemo na kraj sa različitim

stumulansima koji dovode do anksioznosti povezana sa stvaranjem većih količina

AChE-R. Potrebno je, međutim, istaći da postoje podaci prema kojima prolongirani

višak AChE-R može biti jedan od činilaca u pojavi neurodegenerativnih oboljenja kao

što su Alzhajmerova i Parkinsonova bolest.

Danas se smatra da u procesu stvaranja AChE-R važnu ulogu ima jedan faktor

iskrajanja (SC35), dok drugi faktor iskrajanja, koji se označava kao ASF/SF2, dovodi

do pojave iRNK na osnovu koje se vrši sinteza AChE-S. Naime, ponovljeni fiziološki

stres kod miševa dovodio je, preko još uvek nepoznatog mehanizma, do produžene

prekomerne sinteze SC35 koji je, vezivanjem za specifične egzonske pojačavače

iskrajanja, omogućavao stvaranje AChE-R izoforme.

25 Stres može da indukuje strah; kada taj strah značajno nadilazi razlog za njegovu pojavu, u psihologiji i psihijatriji se to obično označava kao anksioznost. Inače, poremećaji povezani sa anksioznošću ulaze u red najčešćih psihijatrijskih poremećaja.

74

Jedan od najbolje proučenih primera regulacije alternativnog iskrajanja tokom

razvića odnosi se na alternativni egzon 5 kardiačnog troponinskog-t gena (cTnt; Ladd

i sar., 2005). Ovaj egzon se nalazi unutar kodirajućeg regiona koji, kada je uključen u

obrađenu iRNK, produžava protein cTnt gena za 10 aminokisleina. Miofibrili koji

sadrže ovu izoformu proteina osetljiviji su na kalcijum nego kraći miofobrili. Egzon 5

je pretežno prisutan u iRNK u srcu embriona, a druga izoforma u srcu adultnih

jedinki. Važno je istaći da je ovakav razvojni obrazac alternativnog iskrajanja prisutan

kod ljudi, miševa, pacova i kokošaka, što ukazuje da se mehanizmi alternativnog

iskrajanja egzona 5 nisu menjali tokom evolucije kičmenjaka.

Vezivanje faktora iskrajanja CUG-BP (od engl. CUG-binding protein) za

heksanukleotid CUGCUG koji se nalazi u intronu nizvodno od 5-tog egzona

troponinskog-t gena, dovodi do uključivanja ovog egzona u zrelu iRNK. Antagonisti

uključivanja egzona 5 u obrađenu iRNK su dva druga proteina – PTB (od engl.

polypyrimidine tract binding) i MBNL (engl. muscleblind-like). Vezivanje PTB i

MBNL proteina za introne koji se nalaze uzvodno i nizvodno od egzona 5 sprečava

njegovo uključivanje u obrađenu iRNK. CUG-BP prisutan je u jedru i citoplazmi u

ćelijama srčanog mišića samo tokom embriogeneze, dok se PTB i MBNL nalaze i u

srcu odraslih jedinki. Geni regulatora iskrajanja CUG-BP i PTB se i sami alternativno

iskrajaju, što znači da je ovaj put u regulaciji vrlo složen i da postoji veći broj mesta

na kojima je moguća njegova fina modulacija.

Zanimljivo je da MBNL RNK vezujući protein nije samo antagonist CUG-BP

proteinu u srcu, već je aktivan i kod gena za insulinski receptor kičmenjaka (Ho i sar.,

2004). Zbog ove koregulacije, sastav obrađenih iRNK za troponin-1 i insulinski

receptor kod kičmenjaka je visoko usaglašen. Ovo je značajna činjenica jer ukazuje da

je koregulacija alternativnog iskrajanja gena mišića, koji troše energiju, i insulinskog

receptora, koji utiče na unos energije, jedan od važnih mehanizama regulacije

energetskog balansa ćelija.

2.4.2.2. Mikro RNK

Danas postoji sve više podataka koji ukazuju da na ispojavanje genetičke

informacije sadržane u iRNK utiču i druge RNK koje deluju kao trans-regulatori. U

RNK trans-regulatore spadaju, na primer, mikro-RNK (miRNK), pivi-interagujuće

RNK (piRNK) i duge nekodirajuće RNK. Njihove uloge su da suprimiraju translaciju,

vrše zaštitu od mobilnih elemenata i posreduju u epigenetičkim promenama (boks

2.3). Trans-regulatorne RNK, dakle, predstavljaju jedan od važnih elemenata u

75

procesu diverzifikacije koju doživljavaju primarni proizvodi gena, tj. iRNK kod

eukariota. Na ovom mestu nešto ćemo reći o ulozi miRNK u evoluciji fenotipske

varijabilnosti.

Boks 2.3 Klase regulatornih RNK

Osim miRNK postoje i druge klase malih RNK koje imaju funkciju u

regulaciji aktivnosti gena.

1. piRNK (engl. piwi interacting RNA) u interakciji sa tzv. Argonaut proteinima

izgleda ima ulogu u utišavanju aktivnosti transpozona u germinativnim ćelijama.

Argonaut proteini su katalitički aktivne komponente tzv. “RNK interferencije“.

2. siRNK (engl. small interfering RNA), imaju oko 21 nukleotida, a izvedene su iz

savršeno komplementarnih dvolančanih RNK (tzv. sens/antisens dupleksa). Imaju

ulogu u epigenetičkoj regulaciji susednih lokusa ili to čine uz pomoć Argonaut

proteina, koji imaju endonukleaznu aktivnost usmerenu na iRNK molekule

komplementarne siRNK fragmentima.

3. Male RNK povezane sa promotorima (PASR; engl. promoter-associated RNA)

imaju između 20 i 200 nukleotida sa 5’ krajevima koji se poklapaju sa mestima

početka transkripcije gena.

4. tiRNK (engl. transcription initiation RNA) su velike oko 18 nukleotida, a izvedene

su iz nizova koji se nalaze neposredno nizvodno od mesta početka transkripcije.

Smatra se da imaju ulogu u pozicioniranju prvog nukleozoma hromatinskih vlakana.

5. Najmanje dve klase RNK, izvedene iz tzv. malih jedarnih RNK (snoRNK; engl.

small nucleolar RNA), verovatno imaju aktivnost sličnu aktivnosti miRNK:

- C/D boks snoRNK, veličine od 70 do 120 nukleotida, učestvuje u metilaciji

određenih RNK, i

- H/ACA snoRNK, veličine od 100 do 200 nukleotida, učestvuje u kontroli

pseudouridilacije RNK molekula.

Pored malih RNK molekula, značajnu regulatornu ulogu imaju i tzv. duge

nekodirajuće RNK (lncRNA; engl. long non-protein coding RNA). Njihova veličina

varira od više od 200 nukleotida do više od 1000 kb. Donja granica je arbitrarna –

uzeta je zbog toga da se isključi većina poznatih klasa malih RNK. Smatra se da

lncRNK igraju važnu ulogu u regulaciji diferencijacije ćelija i razvića sisara, preko

modulacije aktivnosti nekih gena glavnih kontrolora razvića (videti deo 3.2).

76

Funkcionalne (“zrele“) mikro RNK su kratki, oko 22 nukleotida, nekodirajući

molekuli koji dovode do represije transkribovane iRNK vezivanjem za

komplementarna mesta, nazvana miRNK mesta vezivanja. Kod biljaka, mesta

vezivanja se obično nalaze u kodirajućim delovima iRNK, dok su kod životinja

najčešće smeštena u 3’ krajevima zrele iRNK koja nije obuhvaćena translacijom (tzv.

3’UTR, engl. three prime untranslated region). Kod višećelijskih životinja

komplementarnost nizova nukleotida između miRNK i iRNK obično je vrlo mala; od

stepena komplementarnosti zavisi da li će iRNK biti degradirana ili će doći samo do

privremenog zaustavljanja procesa translacije. Iako je miRNK posredovana represija

aktivnosti gena relativno slaba u poređenju sa onom koju obezbeđuju transkripcioni

faktori, u odnosu na aktivaciju/inaktivaciju same transkripcije, aktivnost miRNK

obezbeđuje bržu promenu obrasca genske ekspresije.

Zrela miRNK se dobija iskrajanjem iz oko 70 nukleotida velike strukture u

obliku ukosnice, koja se zove prekursorska miRNK (pre-miRNK, slika 2.11).

Slika 2.11. Struktura nekoliko različitih prekursorskih miRNK. Ovi molekuli imaju veliki broj petlji i “mehurova“ koji se enzimski obrađuju da bi se dobile miRNK.

Ovaj proces obavlja enzim pod imenom “dajser“ (engl. dicer, kockar; u ovom

slučaju misli se na sredstvo koje vrši rezanje na kockice), endoribonukleaza iz

familije RNaza III, koja seče dvolančane RNK molekule. Pre-miRNK je dobijena

iskrajanjem iz tzv. primarne miRNK (pri-miRNK), koje vrši endoribonuklaza iz klase

2 RNaze III familije (ovaj enzim se zove drosha – droša, što je hebrejska reč za

propovednika). Transkripciju pri-miRNK pretežno vrši RNK polimeraza II. Smatra se

77

da pri-miRNK poseduje promotor i elemente pojačavača slične onima koje imaju geni

koji kodiraju proteine. Takođe, pri-miRNK može biti veoma duga, i nekoliko hiljada

nukleotida, iz kojih se može iskrojiti veći broj pre-miRNK. U nekim slučajevima, pri-

miRNK se nalazi u intronima gena koji kodiraju proteine i tada se iz njih iskraja

tokom obrade primarnog transkripta tih gena. Kod životinja, pre-miRNK odlaze u

citoplazmu gde se obrađuju, a kod biljaka, kompletna obrada miRNK se obavlja u

jedru (slika 2.12).

Regulatorna funkcija miRNK se pretežno obavlja preko represije

informacionih RNK i to tako što se sprečava translacija iRNK, seče iRNK, vrši iRNK

deadenilacija ili menja stabilnost iRNK. Kod životinja, miRNK retko seče iRNK, dok

je kod biljaka to dominatan način regulacije.

Slika 2.12. Stvaranje miRNK kod biljaka i životinja. Objašnjenje u tekstu. miRNK* = lanac koji se brzo razlaže i koji je komplementaran zreloj miRNK (prema: Chen i Rajewsky, 2007).

Smatra se da miRNK imaju važnu ulogu u vremenskoj kontroli ekspresije

gena tokom razvića, u apoptozi, u kontroli rasta i oblika ćelija i kontroli adhezije

ćelija različitih tkiva. Takođe, izgleda da se za iRNK određenih transkripcionih

faktora vezuju različite miRNK. Procenjuje se da od ukupnog broja gena u genomima

životinja na miRNK gene odlazi od 0,5% do 1%. Oko 10% miRNK nalazi se u

okvirima introna nekih gena koji kodiraju proteine. Prema procenama, aktivnost oko

30% gena regulišu miRNK (Lim i sar, 2005).

78

Nizovi nukleotida nekih miRNK su potpuno identični kod filogenetski vrlo

udaljenih životinja. Kod svih do sada analiziranih životinja sa bilateralnom simetrijom

(Bilateria), od 18 do 30 familija miRNK pokazivalo veoma malu promenljivost (Chen

i Rajewsky, 2007)26. Na primer, familija miRNK pod imenom let-7, koja učestvuje u

kontroli diferencijacije ćelija, visoko je konzervisana kod svih bilaterija osim acelnih

pljosnatih crva. Tri visoko konzervisane familije nađene su i kod knidarija (u koje

spadaju meduze, korali i anemone), ali nijedna od tih miRNK familija nije nađena kod

sunđera. Zanimljivo je da je jedna od najviše konzervisanih familija kod knidarija,

miR-10, uključena u regulaciju jata Hox gena voćnih mušica i kičmenjaka (deo 3.2).

Značajno je istaći da neke miRNK, sa vrlo konzervisanom strukturom i

delovanjem u određenim tipovima ćelija, mogu tokom evolucije promeniti

regulatornu mrežu u kojoj učestvuju. To je slučaj, na primer, sa miR-1 koja je

zadržala svoju vezu sa mišićnim ćelijama, ali je promenila svoj odnos sa različitim

transkripcionim faktorima i mestima u ćeliji gde se ispoljava.

Pošto su miRNK prisutne u praktično svakom aspektu razvića nervnog sistema

višećelijskih životinja, smatra se da je nervni sistem jedan od osnovnih organa u kom

se odvija regulacija aktivnosti gena putem miRNK. Poslednjih godina je utvrđeno, na

primer, da miRNK imaju jednu od ključnih uloga u formiranju identiteta brojnih

tipova nervnih ćelija. Konačan identitet neurona, koji se obično zadržava tokom

njihovog čitavog životnog veka, kontrolišu miRNK tako što se direktno vezuju za

regulatorne regione tzv. terminalnih modula koji se sintetišu u postmitotičkim

ćelijama (Kosik, 2009). Takođe, do danas je utvrđeno da (najmanje) tri miRNK (miR-

132 miR-134 miR-138) imaju vrlo važnu ulogu u učenju i njegovom “ćelijskom

korelatu“, plastičnosti sinapsi.

Detaljna proučavanja kod nekih biljaka i životinja su pokazale da se povećanja

broja članova miRNK familija ostvaruju na isti način kao i kod gena koji kodiraju

proteine – potpunom duplikacijom genoma i duplikacijama pojedinačnih gena.

Pokazalo se takođe da su familije miRNK biljaka veće i sa većom sličnošću svojih

članova nego one kod životinja (Li i Mao, 2006). Izgleda da je kod biljaka glavni

efekat ekspanzije članova miRNK familija povećanje doze, a da kod životinja članovi

26Promene unutar nizova miRNK najčešće nastaju zamenama nukleotida izvan tzv. “semenskog“ regiona koga čine nukleotidi na pozicijama od 2 do 8 (seed, “seme“ je ime koje se koristi za najkonzervisaniji deo miRNK).

79

familija pokazuju tendenciju prema sinergističkim, ali funkcionalno različitim

ulogama.

Jedna od specifičnosti evolucije miRNK kod višećelijskih životinja jeste

kontinuirano povećanje broja familija koje su specifične za evolucione linije. Pošto

miRNK svoju regulatornu ulogu često ostvaruju preko transkripcionih faktora, čiji se

broj malo menjao tokom evolucije Metazoa, to znači da su se usložnjavali načini kako

transkripcioni faktori ostvaruju svoje regulatorne uloge. Da je to moglo biti tako

pokazuje i uočena korelacija između povećanja broja miRNK i morfološke složenosti

životinja (Kosik, 2009). Sunđeri imaju svega 8 miRNK familija, a knidarije 40, pri

čemu je jedna od njih ortologna sa familijom kičmenjaka. Kod Bilateria broj miRNK

familija drastično raste: Coenorabditis elegans (nematode) ima 155, Danio rerio

(ribe) 336, Mus musculus (glodari) 547, Pan troglodytes (primate) 594, i čovek čak

706 miRNK familija. Procenjuje se, takođe, da je oko 10% miRNK familija kod

beskičmenjaka potpuno identično i kod kičmenjaka.

U jednoj analizi koja je obuhvatila 447 miRNK čoveka, 59% njih bilo je

prisutno kod primata, oko 30% bile su familije karakteristične za sisare, oko 9% za

nesisarske kičmenjake, i oko 8% miRNK bilo je svojstveno samo za ljude (Berezikov

i sar., 2006). Slična raspodela miRNK uočena je i kod šimpanzi. Imajući u vidu da

samo jedna ili nekoliko zamena nukleotida u miRNK može dovesti do promena u

načinu regulacije, pojava relativno velikog broja novih miRNK kod ljudi ne

predstavlja iznenađenje. Takođe, zanimljivo je da je ekspresija novih miRNK vrlo

niska, kao i to da su te miRNK često grupisane u jata. Ovo navodi na zaključak da

prirodna selekcija deluje tako što proširuje broj iRNK čija se aktivnost (tj. ekspresija

njihovih gena) reguliše preko miRNK. Budući da nove miRNK regulacije mogu imati

kako pozitivne tako i negativne efekte na adaptivnu vrednost, povećanje ekspresije

onih miRNK sa pozitivnim efektima i eliminacija onih sa negativnim efektima,

predstavljalo bi jedan od mogućih evolucionih puteva koji su mogli imati značajnu

ulogu u evoluciji višećelijskih organizama i pojedinih organa, npr. našeg mozga

(Kosik, 2009).

2.4.3. Evolucija drugih oblika genske regulacija

2.4.3.1. Poliadenilacija

Jedan od osnovnih načina posttranskripcione regulacije gena zasniva se na

stabilnosti informacione RNK. Dodavanje većeg broja adenozin monofosfata na 3’-

80

kraj tek transkribovane iRNK važan je deo procesa sazrevanja iRNK kod eukariota.

Poliadenilacija može početi sa nekoliko različitih mesta, tako da se može dobiti više

od jednog transkripta sa istog gena. Ti različiti transkripti mogu imati 3’UTR različite

dužine, drugačija mesta za vezivanje miRNK, a u nekim slučajevima, ako je mesto za

vezivanje poli(A) repića unutar kodirajućih delova gena, transkripti će dati različite

poteinske proizvode.

Prisutvo poli(A) repića na iRNK je važno za njen transport u citoplazmu, utiče

na njenu stabilnost i proces translacije. Poli(A) repić na iRNK se tokom vremena

smanjuje i kada se dostigne kritičan broj ponovaka, iRNK se degradira. Osim

histonskih iRNK, sve eukariotske iRNK imaju poli(A) repiće. U nekim tipovima

ćelija eukariota, kao što su jajne ćelije posle oplođenja, ćelije u ranoj embriogenezi i

postsinaptičkim mestima nervnih ćelija, kod mnogih informacionih RNK sa kratkim

poli(A) repićima (često manje od 20 nukleotida) u citoplazmi dolazi do produženja

poli(A) repića (obično se produžava od 80 do 150 nukleotida), što omogućava tako

modifikovanim iRNK da otpočnu proces translacije i stvaranje odgovarajućih

proteina. Tako stvoreni proteini su neophodni za inicijaciju procesa aktivacije gena

novostvorenog zigota (kada su u pitanju oplođene jajne ćelije), ili, u slučaju nervnih

ćelija, za ostvarivanje procesa vezanih za učenje i memoriju.

Kod bakterija, poliadenilacija RNK dovodi do degradacije tih molekula, što se

dešava i kod skoro svih nekodirajućih RNK (npr. tRNK, rRNK, itd.) eukariota, izuzev

lncRNK kod kojih poliadenilacija ima značajnu ulogu u stabilizaciji.

Pošto je poliadenilacija prisutna u ćelijama sva tri domena (arhebakterija,

eubakterija i eukariota) smatra se da je poslednji zajednički predak (LUCA)

posedivao gene neophodne za realizaciju ovog procesa. Kod nekoliko vrsta bakterija

je, međutim, tokom evolucije došlo do gubitka sposobnosti poliadenilacije RNK.

2.4.3.2. Prerada RNK

Procesi modifikacije molekula iRNK, u koje ne spada sama obrada pre-iRNK,

ali koji menjaju nukleotidni sastav molekula, nazivaju se preradom RNK (engl RNA

editing). Mehanizmi prerade iRNK kod eukariota mogu biti različiti, od

delecija/insercija nukleotida, koje su prisutne u mithondrijama nekih protozoa, do

zamena nukleotida kod višećelijskih biljaka i životinja. Do sada najviše podataka

postoji o preradi iRNK putem nukleotidnih zamena, koja se ostvaruje putem

hemijskih modifikacija, kao što je dezaminacija citozina i adenina.

81

Jedan od najpoznatijih tipova prerade iRNK jeste tzv. “A-u-I prerada“, koja se

ostvaruje kroz hidrolitičku dezaminaciju adenina u iRNK pri čemu nastaje nukleotid

inozina (I). U procesima translacije inozin se interpretira kao guanin, što, ako se

zamena desila u kodirajućim delovima RNK, može rezultovati promenom kodona i

zamenom aminokiselina. Obično se neprerađeni i prerađeni proteini nalaze u istoj

ćeliji, ali, kako se pokazalo, udeo prerađenog proteina može iznositi i do 100% u

specifičnim delovima ćelija. Osim u kodirajućim delovima, do A-u-I prerade može

doći i u drugim regionima pre-iRNK transkripata. Recimo, ako do toga dođe u

adeninima koji se nalaze u još neiskrojenim intronima, može se formirati novo mesto

intronskog iskrajanja, što može eliminisati neke egzone iz zrele iRNK. Poslednjih

godina je otkriveno da do A-u-I prerade dolazi i kod miRNK; to može uzorkovati

promene u njihovoj biogenezi ili preusmeriti zrele miRNK na druge tipove iRNK.

Centralni nervni sistem sisara je mesto u kome se odigrava intenzivna prerada

iRNK i to pretežno onih gena koji su uključeni u formiranje i funkcionisanje jonskih

kanala specifičnih za mozak i neutransmiterskih receptora (Gommans i sar., 2009). Na

primer, prerada transkripta unutar kodirajućih delova gena za serotoninski receptor 5-

HT2C može da se odigra na pet različitih mesta. Različit stepen prerade može da

formira 25 različitih genskih transkripata na osnovu istog niza nukleotida u genu, a

kao posledica ovog procesa, nastaju receptori sa različitom osetljivošću na serotonin.

Značajno je istaći da se prerada transkripta ovog receptora kod sisara nalazi i pod

uticajima činilaca životne sredine. U eksperimentu na miševima, u čiju je hranu

ubacivan jedan inhibitor serotonina (fluoksetin), prerada transkripta receptora 5-HT2C

promenjena je na nekoliko mesta, što je dovelo do povećanja nivoa serotonina u

mozgu. Pošto se zna da prerada transkripta ovog receptora dovodi do smanjenja

njegove reakcije na serotonin, promena obrasca prerade je, po svoj prilici,

predstavljala neku vrstu kompenzacionog odgovora na prisustvo inhibitora ovog

neurotransmitera. Takođe, kod ljudi sa suicidalnom depresijom, za koju se veruje da

je praćena sniženjem nivoa serotonina u mozgu, primećena je promena obrasca

prerade transkripta receptora 5-HT2C (Gurevich i sar., 2002). Očigledno, regulacija

prerade iRNK transkripata može biti jedan od važnih elemenata u promeni ponašanja

sisara.

Prerada iRNK je vrlo značajan mehanizam i u stvaranju tzv. kriptične

varijabilnosti u populacijama višećelijskih eukariota, posebno sisara. Prerađeni

molekuli RNK obično proizvode samo mali udeo proteina sa nešto izmenjenim

82

funkcijama u ćelijama, tako da obično ne dovode do štetnih efekata. Takođe, pod

uobičajenim uslovima životne sredine za datu vrstu, malo je verovatno da prerađeni

proteini daju jedinkama bilo kakvu prednost. Međutim, kada dođe do promena u

životnim sredinama, prerađene RNK i njihovi proteinski produkti mogu se pokazati

kao vrlo korisni. Stoga se za preradu RNK može reći da predstavlja jedan od

mehanizama višećelijskih eukariota koji povećava evolvabilnost njihovih populacija.

Smatra se, čak, da je prerada RNK kod sisara predstavljala jedan od glavnih činilaca u

evoluciji fenotipske složenosti, posebno mozga (Gommans i sar., 2009).

2.4.3.3. Remodelovanje hromatina

Kod eukariotskih ćelija, proces normalnog odvijanja transkripcije zavisi od

(prethodnih) promena strukture hromatina. Budući da je hromatin kompaktna i

složena struktura, u oblasti gena koji treba da bude aktiviran mora doći do njegove

lokalne dekondenzacije, tj. “otvaranja“, kako bi se omogućilo da regulatorni proteini,

RNK polimeraze, i drugi enzimi koji učestvuju u transkripciji, priđu promotoru.

Promene u organizaciji hromatina koje prethode transkripciji obično se nazivaju

restrukturiranje ili remodelovanje hromatina. Do danas je identifikovan čitav niz

enzima koji učestvuju u ovim procesima (vrlo detaljan prikaz procesa remodelovanja

hromatina može se naći kod Savić-Pavičević i Matić, 2011, str. 89 - 98).

Boks 2.4. Nukleozomi

Pod elektronskim mikroskopom, nukleozomi izgledaju kao diskovi prečnika 11 nm

od kojih svaki sadrži DNK dužine oko 150 bp i osam molekula histona: po dva molekula

histona H2A, H2B, H3 i H4. Histonski oktamer formira jezgro oko kog je dvolančana DNK

namotana 1,8 puta kao levogira superzavojnica. Dužina dvolančane DNK između

nukleozomskih jezgara, tzv. vezne DNK, varira od 8 do 114 bp u zavisnosti od vrste

organizma i tkiva, a najčešće iznosi oko 55 bp.

Pakovanjem u nukleozome, DNK se prividno skraćuje oko sedam puta, ali taj stepen

skraćenja nije dovoljan za smeštanje eukariotske DNK u jedro. Sama po sebi, ta činjenica

ukazuje na postojanje dodatnih nivoa strukturne organizacije DNK u jedru, a nukleozomi bi

se mogli posmatrati tek kao sekundarna struktura hromatina. Sledeći nivo spiralizacije DNK

predstavljaju tzv. nukleozomski paketi sastavljeni od gusto spakovanih nukleozoma (slika

2.13). Oni grade hromatinsko vlakno debljine 30 nm. U odnosu na potpuno raspleten molekul

DNK, potpuno spakovano hromatinsko vlakno je kraće za oko jedan milion puta.

Za pakovanje nukleozoma u 30 nm hromatinsko vlakno odgovoran je histon H1.

Svaki molekul histona H1 sadrži oko 220 aminokiselina i ima centralni globularni region

83

(“telo“), kao i terminalne produžetke (“rep“). Za svaki nukleozom vezan je po jedan molekul

histona H1. Centralni deo ovog histona vezuje se za određeno mesto na svakom nukleozomu,

a produžeci interaguju sa veznom DNK pružajući se do narednog nukleozoma, gde se

ostvaruje njihova veza sa telom sledećeg histona H1. Na taj način histoni H1 povezuju

nukleozome i grade pravilne solenoidne strukture.

Slika 2.13. Strukturna organizacija hromatina u jedru eukariota.

Položaj nukleozoma u genomu ima uticaj na aktivnost gena. Kod kvasca S.

cerevisiae, oko 80% genoma je pokriveno jasno pozicioniranim nukleozomima, a kod

višećelijskih životinja procenat takvih nukleozoma je manji. Kod genoma koji su do

sada proučeni, nukleozomi pokazuju karakterističnu raspodelu oko gena. Mesta

početka transkripcije gena, koje čine regioni sa manje čvrsto upakovanim

nuklozomima (to su NDR regioni, engl. Nucleosome-Depleted Region), često su

okružena sa dva nukleozoma. Nukleozomi koji se nalaze na 5’ kraju transkribujućeg

regiona, pokazuju tendenciju preciznije lokalizacije, a na 3’ kraju katkada se može

naći još jedan NDR. Raspodela mesta na kojima se nalaze nukleozomi tokom života

ćelije zavisi od specifičnih nizova nukleotida na DNK za koje se nukleozomi vezuju,

ali i od aktivnosti kompleksa koji učestvuje u remodelovanju nukleozoma i

kompeticije između nukleozoma i proteina (kao što su transkripcioni faktori) koji

pokazuju afinitet za vezivanje za specifične nukleotidne nizove. Takođe, histonski

oktameri nukleozoma nemaju uvek isti sastav. Poznate su izovarijante histona H2A -

H2A.Z i histona H3 - H3.3. Ove varijante se ubacuju u hromatinska vlakna posle

uklanjanja standardnih nukleozomskih varijanti. U ćelijama kvasca, H2A.Z (kod ove

vrste ta varijanta se obeležava kao Htz1) uglavnom se nalazi na promotorima gena, a

84

H3.3 varijanta u kodirajućim delovima gena. Nukleozomi sa H2A.Z varijantom su

relativno stabilniji u odnosu na standardne varijante, a oni u kome su prisutne obe

izoforme pokazuju veću sklonost ka disocijacijama. Pošto se nestabilne varijante

nukleozoma često nalaze oko mesta inicijacije transkripcije, izgleda da su te varijante

jedan od važnih činilaca regulacije aktivnosti gena i tokom razvića višećelijskih

organizama. Veza između prisustva H2A.Z varijante nukleozoma i transkripcije je

vrlo složena i još uvek nedovoljno rasvetljena. Regulatorna uloga ove nukleozomske

varijante je izgleda species-specifična (Thakar i sar., 2010). Kod kvasca, na primer,

prisustvo H2A.Z sprečava transformaciju heterohromatina u euhromatin, dok je kod

drozofile i ljudi situacija potpuno obrnuta - povećano prisustvo ove varijante

nukleozoma je u pozitivnoj korelaciji sa intenzitetom transkripcije. Nedavno je

otkriveno da H2A.Z nukleozomi kod A. thaliana imaju važnu ulogu u reakciji biljke

na povećanje temperature u životnoj sredini (Kumar i Wigge, 2010). Značajno

smanjenje prisustva H2A.Z nukleozoma uočeno je kod svih 5334 analiziranih gena

kod biljčica starih 12 dana kada je ambijentalna temperatura povećana sa 120C na

270C. Među tim genima, 2454 gena (oko 46%) povećalo je za oko dva puta nivo

transkripcije, a preostalih 54% gena imalo je za oko dva puta smanjen nivo

transkripcije. Pošto su biljke vrlo osetljive na temperaturu (reaguju na temperaturne

razlike koje nisu veće od 10C), izgleda da ključnu ulogu u njihovim reakcijama na

temperaturne fluktuacije ima H2A.Z nukleozomska varijanta.

Posebnu ulogu u remodelovanju hromatina imaju brojne kovalentne

modifikacije histona nukleozoma. Do sada je uočeno osam različitih tipova

kovalentnih modifikacija histonskih proteina koje se pretežno odigravaju na nekim od

preko 60 aminokiselinskih ostataka duž N-krajeva krajeva (“repova“) koji izlaze iz

proteinskog jezgra nukleozoma. Kombinacije kovalentnih modifikacija različitih

histona i aminokiselina u njima oblikuju specifičan obrazac transkripcije određenog

regiona, koji se često naziva “histonskim kodom“.

Na primer, pokazalo se da postoje specifične jedarne acetilaze koje acetiluju

nukleozomske histone u regionima koji se pripremaju za transkripciju (to su histonske

acetiltransferaze – HAT; katalizuju prebacivanje acetilne grupe sa acetilkoenzima A

na aminokiselinu lizin u histonima). Hiperacetilovani histoni pokazuju smanjen

afinitet prema DNK, što dovodi do smanjenja stepena kondenzovanosti hromatina.

Identifikovano je preko 20 HATa, a otkriveno je i da mnogi transkripcioni faktori

poseduju HAT aktivnost. Kada transkripcija treba da se uspori, ili zaustavi, histoni

85

bivaju dezacetilovani delovanjem histonskih dezacetilaza (HDAC), čime se restauriše

transkripciono neaktivno stanje hromatina. Postoje tri klase HDACa (I, II i III), pri

čemu su prve dve najznačajnije kod sisara. Zanimljivo je da je kod sisara klasa I

akivna u većini tkiva, a klasa II se pretežno javlja u mišićima i mozgu27.

Dodavanje negativno naelektrisanih fosfatnih grupa na histone hromatina

može dovesti do neutralizacije njihovog baznog karaktera i na taj način smanjiti

afinitete histona prema DNK. Recimo, uočeno je da fosforilacija aminokiseline serina

na poziciji 10 u H3 histonu dovodi do aktivacije gena u ćelijama sisara tako što

povećava efikasnost HATa. Izgleda, takođe, da posle aktiviranja signalih puteva

uključenih u DNK reparaciju dolazi do fosforilacije H2A histona; na taj način DNK

biva dostupnija delovanju reparacionih enzima. Mada se još uvek ne poznaju do

detalja ovi mehanizmi, zna se da fosforilaciju histonskih proteina katalizuju

proteinske kinaze, a obrnut proces katalizuju fosfataze.

Za razliku od acetilacije i fosforilacije, metilacija histona, uz prisustvo

specifičnih histonskih metiltransveraza (HMT), može dovesti kako do aktivacije tako

i do inaktivacije hromatina. Metilacija lizina na poziciji 9 H3 histona dovodi do

heterohromatizacije (tj. do inaktivacije gena), ali ako je metilovana aminokiselina

lizin na poziciji 4 istog histona, to je jedan od signala za transkripciju gena (ova

metilacija se nalazi u promotorima aktivnih gena)28.

Postoje brojne interakcije između opisanih procesa hemijske modifikacije

histonskih proteina, koje dovode do različitih efekata na aktivnost gena. Na primer,

metilacije histona onemogućavaju dalju acetilaciju i fosforilaciju, histonska acetilacija

inhibira metilaciju histona, dok fosforilacija stimuliše acetilaciju. Danas je opisano još 27 Hemijsko jedinjenje pod imenom valproična kiselina često se koristi u kliničkom tretmanu epileptičkih napada, zatim kao stabilizator raspoloženja u slučajevima bipolarne i unipolarne depresije, kao lek za teške oblike migrene, itd. Smatra se da je valproična kiselina inhibitor histonskih dezacetilaza. Potomstvo trudnih ženki miševa i trudnica kod ljudi, koje su uzimale valproičnu kiselinu, često imaju niz kongenitalnih poremećaja vezanih za centralni nervni sistem. Uspeh na IQ testovima takve dece je niži za 10 do 20 poena u odnosu na njihovu rođenu braću i sestre. Epidemiološke studije su pokazale da oko 11% dece čije su majke tokom trudnoće koristile valproičnu kiselinu, ima neki oblik autizma. Osim ovog, valproična kiselina ima i druge teratogene efekte; npr. pokazalo se da ona blokira delovanje folata (ili vitamina B9), koji je neophodan za pravilno formiranje kičmenog stuba. 28 Danas se smatra da dva proteina, koji se tokom evolucije nisu mnogo promenili, imaju ključnu ulogu u formiranju heterohromatina. Prvi protein, metiltransferaza pod oznakom SU(VAR)3-9, specifično metiluje aminokiselinu lizin na poziji 9 histona H3 (H3K9me). Do kondezovanja hromatinskih niti i onemogućavanja transkripcije dolazi delovanjem HP1 (heteroproteinski protein 1), koji povezuje H3K9me u vidu dimera. Kod nekih organizama, u formiranju heterohromatina učestvuju i mali molekuli RNK. Zanimljivo je da se za lizin može vezati jedna, dve ili tri metil grupe. Postoje indikacije da je trimetilacija devetog lizina H3 histona povezana sa pojavom konstitutivnog heterohromatina, a mono- i dimetaliacija istog lizina sa fakultativnim heterohromatinom.

86

šest drugih kovalentnih modifikacija histona: histonska ubikvitinacija, sumoilacija,

ADP-ribozilacija, biotinilacija, dezaminacija i prolinska izomeracija. Mada

mehanizmi njihovog delovanja još uvek nisu dovoljno rasvetljeni, ipak je jasno da sve

kovalentne modifikacije histona poseduju potencijal za aktivaciju/inaktivaciju

transkripcije gena pod različitim uslovima. Histonske acetilacije, fosforilacije,

ubikvitinacije, dezaminacije i sumoilacija ispoljavaju svoje efekte u vrlo kratkim

vremenski intervalima (mere se minutima), a histonske metilacije se smatraju

najstabilnijim tipom kovalentnih modifikacija.

Osim modifikacija histona, važnu ulogu u diferencijalnoj aktivaciji gena ima i

metilacija DNK. U ovom procesu učestvuje tzv. “peta baza“ DNK - 5-metilcitozin,

koja kod nekih eukariota nastaje posle replikacije DNK enzimskim putem. Kod

životinja, transformacija citozina u 5-metilcitozin je moguća samo ako se u lancu

DNK iza citozina nalazi guanin, tj. kod CpG dimera. Kod biljaka, transformacija

zahteva triplet CpNpG, gde N označava bilo koji nukleotid. Ako se metilovan citozin

nalazi u okvirima cis-regulatora, transkripcioni faktori se neće vezivati za te regione i

gen neće biti aktiviran.

Kod sisara je oko 5% citozina konvertovano u 5-metilcitozin. Normalni

procesi metilacije kod sisara zavise od dve komponente: enzima DNK

metiltransferaza (DNMT), koji uspostavljaju i održavaju odgovarajući obrazac

metilacije, i proteina, kao što su MeCP2 i MBD1, koji imaju metil-CpG vezujući

domen (MBD; engl. methil-CpG binding domain) i uključeni su u “čitanje“

metilacionih markera.

Protein MeCP2, koji prepoznaje metilovan citozin, može, osim histonske

metiltransferaze, omogućiti vezivanje DNK metiltransferaze-3 (DNMT3) koja

metiluje prethodno nemetilovane citozine na DNK. Novo stvoreni obrazac metilacije

se tokom replikace DNK širi sa jednog lanca na drugi pomoću enzima DNK

metiltransferaza-1 (DNMT1), koja prepoznaje metil grupe jednog lanca DNK i

metiluje odgovarajuće citozine na novosintetisanom lancu DNK. Postoji i DNMT2

koja pokazuje nisku aktivnost za DNK, ali visok afinitet prema specifičnim tRNK

molekulima. Uloga DNMT2 u remodelovanju hromatina još uvek nije jasna.

Boks 2.5. Zašto neki organizmi imaju a drugi nemaju enzime za DNK metilaciju?

Kod voćnih mušica, D. melanogaster, i nematoda, C. elegans, DNK je vrlo malo

metilovana, što je navelo istraživače na zaključak da kod beskičmenjaka ovaj način regulacije

87

gena nema značajnu ulogu. Međutim, analize genoma drugih vrsta nematoda pokazale su da

kod njih postoje geni koji su srodni DNMT2 sisara, i da je taj gen relativno skoro izgubljen u

evolucionoj liniji C. elegans. Analize genoma različitih vrsta insekata pokazale su još

zanimljiviju sliku. Voćne mušice i komarci poseduju samo DNMT2 gene, svilena buba ima

DNMT1 i DNMT2, a medonosna pčela sva tri DNMT gena, čije su funkcije slične funkcijama

kod kičmenjaka. Ovi podaci ukazuju da je kompletan skup DNMT gena bio prisutan kod

zajedničkog pretka svi životinja sa bilateralnom simetrijom tela, ali da je u evolucionoj liniji

protostoma (Arthropoda, Annelides, Mollusca) u više navrata dolazilo do gubitika ovih gena.

Među deuterostomama (životinje čiji prvi embrionski otvor gradi anus; kod protostoma prvi

otvor kasnije gradi usta), morski ježevi, cefalohordate i scidije (spadaju u urohordate)

poseduju kompletan skup DNMT gena, dok grupa urohordata pod imenom larvace ima samo

DNMT2.

Zašto se, dakle, kod nekih životinja gubi čitav skup gena ili pojedinačni geni

neophodni za DNK metilaciju? Prema jednoj hipotezi, u grupi protostoma pod imenom

Ekdizoa, u koju se svrstavaju artropode i nematode, razviće je postalo nezavisno od regulacije

putem DNK metilacije, što je smanjilo “pritisak“ prirodne selekcije na DNMT gene. Kod

protostoma, DNK metilacioni mehanizmi više se ne koriste za regulaciju razvića već za neke

druge funkcije, kao što su genomsko utiskivanje ili složeno socijalno ponašanje (Wang i sar.,

2006). U drugoj hipotezi se pretpostavlja da su umesto DNMT gena razvijeni drugi

mehanizmi epigenetičke kontrole. Kod organizama koji koriste DNMT sistem gena, on se

verovatno održao zato što je uspostavljena tesna veza između ovog sistema koji reguliše

metilaciju DNK, i sistema koji vrši modifikaciju histona (Smallwood i sar., 2007).

Metilacija citozina je izuzetno stabilan proces, čija stabilnost izgleda da

prevashodno zavisi od sposobnosti tandemskih CpG ponovaka da formiraju specifične

sekundarne strukture DNK. Pozicija diferencijalno metilovanih regiona (DMR) gena

sa genomskim utiskivanjem kod miša i čoveka jeste konzervisana, ali broj CpG

ponovaka može da varira od 425 do 740 nukleotida. Ti nizovi poseduju sposobnost da

formiraju vrlo stabilne sekundarne strukture (na primer, u obliku ukosnica), koje su

vrlo slične i kod miša i kod čoveka. Zanimljivo je da te sekundarne strukture poseduju

karakteristike koje se inače viđaju kod telomera i centromera, i za koje se smatra da

predstavljaju mesta za vezivanje specifičnih proteina. Na ove detalje smo ukazali

zbog toga što se na taj način ostvaruje nasleđivanje metilacionog obrasca u

molekulima DNK. Opisane modifikacije histona, takođe, predstavljaju deo procesa

diferencijacije ćelija višećelijskih organizama. Acetilacija histona na specifičnim

88

mestima (ili njeno odsustvo) može se održavati tokom niza ćelijskih deoba i na taj

način “pamtiti program ekspresije“ gena karaterističan za ćelije određenog tkiva, tj.

može predstavljati deo tzv. epigenetičkog programa.

89