Dr inż. Barbara Sokołowska IBPRS
Dr inż. Barbara Sokołowska IBPRS
Praca w „systemie jakości” /akredytacji od 1996
Współpraca z PCA od 2000
Współpraca z firmami szkoleniowymi: Omex, CE2, GFW, bioMerieux, Argenta, Merck
2005 Sympozjum Klubu POLLAB, Referat:
Porównania międzylaboratoryjne jako element zapewnienia jakości w badaniach mikrobiologicznych żywności (dot. walidacji metod oznaczania/wykrywania patogenów)
Przewodnik sterowania jakością badań, walidacji i szacowania niepewności mikrobiologicznych metod badania żywności. Wyd. Argenta Sp. z o.o., Warszawa, 2005
2005-2006 trzy częściowy cykl artykułów: Statystyka w mikrobiologii żywności, Laboratoria Aparatura Badania LAB
Walidacja metod mikrobiologicznych badania żywności. Wyd. Argenta Sp. z o.o., Warszawa, 2007
Niechęć laboratoriów do badania próbek
naturalnie zanieczyszczonych na etapie
walidacji/potwierdzenia
Dobór matryc
Dobór szczepów
Dobór poziomu kontaminacji
Nieznajomość norm/opisów metod badawczych
Niechęć do współpracy z pożywkarniami/
„lekceważenie” znaczenia jakości
i „możliwości analitycznych” pożywek
Zbytnie skupienie się na niepewności wyników
Badano świeży ser, mięso i suszony proszek jajeczny, na 4 różnych poziomach kontaminacji:
próbki negatywne, nie zawierające S. aureus
niski poziom 103 jtk S. aureus
średni poziom od 104 do 105 jtk S. aureus
wysoki poziom od 105 do 106 jtk S. aureus
RM około 5000 jtk S. aureus przygotowany przez RIVM (Holenderski Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego).
Dodatkowo próbki zawierały taki sam poziom S. epidermidis lub innych koagulazo-ujemnych szczepów Staphylococcus spp. Próbki zawierały naturalną mikroflorę.
parametr metoda r R
Ogólna liczba
drobnoustrojów
PN-EN ISO-
4833:2004 0,25 0,45
Liczba gronkowców
koagulazo-dodatnich
PN-EN ISO 6888-
1:2001 +A1:2004 0,28 0,43
Liczba gronkowców
koagulazo-dodatnich
PN-EN ISO 6888-
2:2001 +A1:2004 0,22 0,33
Liczba Bacillus cereus PN-EN ISO
7932:2005 0,29 0,42
Liczba Clostridium
perfringens
PN-EN ISO
7937:2005 0,21
0,25
0,26÷0,65
0,29÷0,72
Badano świeży ser, mięso i suszony proszek
jajeczny, o różnym poziomie zanieczyszczenia:
0 jtk L. monocytogenes w 25g
5-10 jtk L. monocytogenes w 25g
50-100 jtk L. monocytogenes w 25g
Każda badana próbka zawierała naturalną
mikroflorę oraz dodatkowo 50 – 100 jtk
L. innocua w 25 g
Parametr Wartości średnie
Specyficzność 97,4%
Czułość 85,2%
Powtarzalność 88,7%
Odtwarzalność 84,4%
Selektywność to zdolność metody alternatywnej do wykrycia
drobnoustroju docelowego spośród szerokiej gamy szczepów
Nieselektywność to brak zakłóceń ze strony odpowiednich
szczepów nie będących docelowymi w metodzie alternatywnej
Badania selektywności i nieselektywności wykonuje się dla
czystych szczepów bez dodatku próbek żywności
Należy wyselekcjonować co najmniej 50 szczepów z próbek żywności (30 w przypadku Salmonella)
Wykonać badania metodą alternatywną przy poziomie zanieczyszczenia 10-100 razy większym niż minimalny względny poziom wykrywalności metodą alternatywną
Należy wyselekcjonować co najmniej 30 szczepów powodujących zakłócenia ze szczepem docelowym i naturalnie występujących w materiałach żywnościowych włączonych w proces walidacji
Wykonać badania metodą alternatywną przy poziomie podobnym do największego oczekiwanego w użytych do walidacji kategoriach żywności; do hodowli można stosować pożywkę nieselektywną
Badać próbki naturalnie zanieczyszczone ewentualnie kontaminować na poziomie naturalnego zanieczyszczenia (najlepiej przez dodatek próbki naturalnie zanieczyszczonej)
Walidacja/potwierdzenie to proces
zakończony wystawieniem dokumentu
potwierdzającego przydatność metody do
danego/konkretnego zastosowania
Walidacja/potwierdzenie to także proces
ciągły
do laboratorium trafiają różne, nieznane próbki
zmienia się personel
niektóre metodyki wymagają stałego stosowania
szczepów odniesienia (np. w wykrywaniu
Campylobacter) lub walidacji (w badaniach
kosmetyków)
Metoda znormalizowana IFU No 12
Wymaga stosowania szczepów odniesienia Alicyclobacillus acidoterrestris (psujący soki) i Alicyclobacillus acidocaldarius (niepsujący) w każdej serii badań
Plusy stosowania Łatwe wykrycie efektu hamowania przez nową
matrycę (np. potwierdzenie wykonano pierwotnie dla zagęszczonego soku jabłkowego a do laboratorium trafia zagęszczony sok wiśniowy)
Minusy Koszty
Metoda znormalizowana PN-EN ISO 6579:2003
Stosunek masy próbki do pożywki namnażającej - zwp 1:10 ale w przypadku hamowania stosować większe rozcieńczenia – nawet 1:1000 (wg. PN-EN ISO 6887-4:2005)
P. 9.1.2.2 Uwaga: odczyn pH produktów żywnościowych kwaśnych i ukwaszanych jest bardziej stabilny jeżeli stosowana jest zwp o podwójnym stężeniu składników
Plusy stosowania szczepów odniesienia w serii badań Łatwe wykrycie efektu hamowania przez nową matrycę (np.
potwierdzenie wykonano pierwotnie dla soków: marchwiowych, jabłkowych i z buraków a do laboratorium trafiają owoce goji lub zagęszczony sok z aronii)
Minusy Koszty
Możliwość zanieczyszczenia krzyżowego
PRZYKŁADY
Metoda znormalizowana PN-ISO 15214:2004
p. 9.3 Uwaga: Z powodu możliwości wzrostu na
pożywce MRS drobnoustrojów innych niż bakterie
fermentacji mlekowej, dla niektórych produktów
może być konieczne potwierdzenie kolonii
prostymi metodami: barwienie metodą Grama
lub test na wytwarzanie katalazy
bakterie fermentacji mlekowej są katalazo-ujemne
drożdże są katalazo-dodatnie
p. 5.3.2.2 Jeżeli zachodzi ryzyko silnego
zanieczyszczenia produktu drożdżami należy
dodać do pożywki kwas sorbowy
Metoda znormalizowana PN-EN ISO 11290-1:1999
+ A1:2004
p. 9.4.4.1 Uwaga 1: niektóre szczepy będące w
stanie stresu wykazują bardzo słabą strefę (lub
jej nie wykazują), zwłaszcza szczepy poddane
stresującemu działaniu kwasu
p. 9.4.4.1 Uwaga 2: Niektóre szczepy L.
monocytogenes charakteryzują się słabą
aktywnością PIPLC. Takie szczepy wykrywane są,
gdy całkowity okres inkubacji jest dłuższy niż
wskazano, na przykład 4 dni. Niektóre z tych
szczepów mogą być chorobotwórcze
Metoda znormalizowana PN-ISO 7889:2007 + Ap1:2007
Nadaje się do jogurtów tradycyjnych zawierających tylko Lactobacillus delbrücki subsp. bulgaricus i Streptococcus salivarus subsp. thermophilus
Pożywki kMRS i M17 nie są selektywne i rosną na nich inne bakterie fermentacji mlekowej np.: Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Leuconostoc mesenteroides, Pediococcus pentosaceus
Lactobacillus delbrücki subsp. bulgaricus nie rośnie na M17
Konieczne jest wykonywanie preparatów mikroskopowych dla rozróżnienia pałeczek od paciorkowców
Metoda znormalizowana PN-ISO 21527-2:2009
Zakres:
Do oznaczania liczby drożdży osmofilnych i
pleśni kserofilnych
Przykłady żywności:
- suszone owoce, ciastka, dżemy
- suszone mięsa i solone ryby
- ziarno zboża i produkty zbożowe, mąki
- orzechy, przyprawy i zioła
Zarówno pożywki jak i rozcieńczalniki
stosowane w oznaczaniu liczby drożdży
osmofilnych i pleśni kserofilnych powinny
mieć obniżoną aw
Wg PN-ISO 21527-2:2009 zaleca się stosować
rozcieńczalnik zawierający glicerol lub D-
glukozę w ilości 20% – 35% (stężenie masowe)
Jako baza 0,1% woda peptonowa (z
wyjątkiem przypadków określonego
przygotowania próbki)
Możliwy dodatek Tween 80
Dichloran (2,6-dichloro-4-nitroanilina)
Glicerol (18% objętościowo, 22% masowo)
Chloramfenikol
Opcjonalnie
Drugi antybiotyk: chlorowodorek
chlorotetracykliny
Sole mineralne: w celu wykształcenia
wszystkich cech morfologicznych
Posiew powierzchniowy
Jeżeli spodziewamy się obecności
Xeromyces bisporus czas inkubacji
wydłużamy do 10 dni
Wzrost w zakresie aw 0,96-0,61 z optimum 0,85
X. bisporus izolowano z lukrecji, suszonych
śliwek, tytoniu, suszonych daktyli, czekolady,
sosu czekoladowego, ciast zawierających
suszone owoce, pomadek, słodyczy z galaretką
Szczepy do oznaczania żyzności
Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763
Eurotium rubrum ATCC 42690
Wallemia sebi ATCC 42694
Aspergillus restrictus ATCC 42693
Pożywka referencyjna – zwalidowana
Sabouraud
Klienci porównują ceny analiz
Klienci oczekują, że znakiem akredytacji
potwierdzono prawidłowość wykonywania
badania
Laboratoria podejmują się badań
i wydają opinie na tematy na których się nie
znają
Auditorzy podejmują się ocen badań na
których się nie znają