Dopamina Beta Hidroxilasa PPT (EC 1.14.17.1)

5/13/2018 Dopamina Beta Hidroxilasa PPT (EC 1.14.17.1) - slidepdf.com

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Dopamina Beta Hidroxilasa●

Introducción: Generalidades. Reacción.● Papel Biológico. Rol de la Norepinefrina como NT.

● Descubrimiento y Medida de su actividad.

● Ensayo Actividad en Humanos.

● Mecanismo de Catálisis.

● Estructura

● Aplicaciones



INTRODUCCIÓNLa Dopamina Beta Hidroxilasa (EC 1.14.17.1) es una enzima básica de la ruta de las

catecolaminas.

Las catecolaminas son unas sustancias químicas

que se conocen así por la existencia de un grupocatecol (dihidroxifenol) unido a un grupo amino.

Actúan de 2 formas:Neurotransmisor , colaborando en la

transmisión sináptica.Hormona, regulando la fisiología corporal.



La reacción se hace en presencia deFUMARATOY requiere de Cu2+ para su desarrollo.



Papel Biológico

● Esta enzima está presente en numerosas especies, de las cuales destacamos 2 para estetrabajo:

Homo sapiens y Bos Taurus.

● Se localiza en diferentes tejidos.

Como NT se sintetiza en el soma deneuronas noradrenérgicas del “LocusCoeruleus” del Tronco Encefálico.Secreción Regulada.

Como Hormona se sintetiza en lascélulas cromafines de la médulasuprarrenal y de ahí se vierten altorrente sanguíneo.



Norepinefrina como NeuroTransmisor

A CONTINUACIÓN SE VERÁN UNA SERIE DE VÍDEOS QUE NOSEXPLICAN CÓMO, DONDE Y CÓMO ACTÚA LA NOREPINEFRINA



Descubrimiento y Medida de su Actividad



Descubrimiento y Medida de su Actividad● A partir de una hipótesis sobre la existencia de una enzima que regulase la creación de la dopamina como

parte de la cadena de las catecolaminas, los investigadores decidieron realizar un ensayo buscandosimplemente la demostración de la aparición del producto como prueba de la existencia de la enzima.

● DOPA+O2+Ascorbato= NOR+DHascorbato+H2O

● Crearon una mezcla inicial en la que figuraban los siguientes componentes:

1.Tampón de Fosfato Potásico con un pH de 6,4 y en una concentración de 100μM.

2.Ácido Ascórbico (6μM).

3.Ácido Fumárico (10μM).

4.ATP (12,5 μM)

5.Dopamina con un isótopo de C14, lo cual, provocaría que se mostrase dicho átomoen la norepinefrina formada. (1μM).

6.Glucosa Deshidrogenasa hasta completar el volumen para facilitar la reacción.7.(1-metil-2-fenil)etilhidrazina hidroclorida (1,3E-2 μM)

El volumen final de este preparado era de 0,68 mL, tras la adición de extracto de médula adrenal de Bos Taurusdicho volumen fue incubado a 35ºC mientras se le daba agitación en tubos de test abiertos.

Posteriormente, a esta mezcla inicial se le realizaban tres técnicas de trabajo ara determinar la aparición denorepinefrina.



Descubrimiento y Medida de su Actividad● Una vez hecho esto se sometió a esa mezcla inicial a 3 pruebas diferentes.

1. Ensayo Cromatográfico2. Ensayo Químico.

3. Ensayo Flurométrico.

● Con este trabajo se demostró la existencia de la enzima, si bien es cierto que la reacción quese planteó no era correcta (basada sólo en el oxígeno) se determinaron parámetros cinéticos para la enzima de la glándula adrenal de Bos Taurus (Km Ascorbato= 6,4e-4mM).

● Se demostró la estequiometría de la reacción 1 a 1.

● Posteriores trabajos ahondaron en la necesidad de fumarato, cobre y ácido ascórbico comocofactores. Así como su estudio en humanos.

● Se demostró así también la razón a la elevada concentración de ascorbato en las médulasadrenales de Bos Taurus.

● El fumarato es necesario, aparentemente como fuente de energía, es posible que esta reaccióndependa directamente del Ciclo de Krebs o esté asociada al metabolismo de aminoácidos.



Descubrimiento y Medida de su Actividad● Posteriores estudios consiguieron obtener la Kcat de esta enzima para Bos

Taurus:

● Esta enzima puede ser inhibida por 2 clases de componentes

1. Compuestos Quelantes, inhibidores muy fuertes que atacan al centro de cobre

impidiendo que se de la primera etapa de reacción.

1-alquil-2-mercaptoimidazol

2. Compuestos orgánicos,que actúan como inhibidores competitivos.

También hemos de incluir a los derivados del ácido fusárico, que además pueden resultar hepatotóxicos.

Feniloxamina y Fenilhidrazina.Dando lugar a un valor de KI en Bos Taurus de 4,6 (en presencia de 1-(3,4-Dihydroxybenzyl)imidazol.

Sustrato Dopamina Tyramina

Kcat 110s^-1 121s^-1



Ensayo de Actividad en Humanos



DBH Plasma Sanguíneo (Normal)

Km= 5,2*10^-4 mMOtros estudios establecen una Kmmucho mayor 0,8 para personas sanas,y sobre otras reacciones que cataliza laenzima, (tyramina), le dan un valor de2mM.Vmáx= 1,1*10^-4 mU.

Otros factores a tener en cuentacomo el pH o la temperatura:

pH Tª

HomoSapiens

5(pI 5,8) 37ºC

Bos Taurus 6 50ºC



Mecanismo de la Reacción




Dopamina + O2+ Ascorbato Noradrenalina + Deshidroascorbato +Fumarato

2O

Esta enzima también puede trabajar sobre otrossustratos como la Tiramina o la Phe.

La reacción se da en 2 fases:

En la primera asistimos a la oxidación del ascorbato en dehidroascorbato y la reducción delCu2+ del centro activo a Cu+.




● En la segunda fase de la reacción, se produce la entrada en la enzima del oxígeno molecular yde la dopamina.

Errata, es el carbono beta.



Mecanismo de Reacción



Estructura



Estructura

Dopamine beta-hydroxylase OS=Homo sapiens GN=DBH PE=1 SV=3

MPALSRWASLPGPSMREAAFMYSTAVAIFLVILVAALQGSAPRESPLPYHIPLDPEGSLELSWNVSYTQEAIHFQLLVRRLKAGVLFGMSDRGELENADLVVLW

TDGDTAYFADAWSDQKGQIHLDPQQDYQLLQVQRTPEGLTLLFKRPFGTCDPKDYLIEDGTVHLVYGILEEPFRSLEAINGSGLQMGLQRVQLLKPNIPEPELPSDACTMEVQAPNIQIPSQETTYWCYIKELPKGFSRHHIIKYEPIVTKGNEALVHHMEVFQCAPEMDSVPHFSGPCDSKMKPDRLNYCRHVLAAWALGAKAFYYPEEAGLAFGGPGSSRYLRLEVHYHNPLVIEGRNDSSGIRLYYTAKLRRFNAGIMELGLVYTPVMAIPPRETAFILTGYCTDKCTQLALPPSGIHIFASQLHTHLTGRKVVTVLVRDGREWEIVNQDNHYSPHFQEIRMLKKVVSVHPGDVLITSCTYNTEDRELATVGGFGILEEMCVNYVHYYPQTQLELCKSAVDAGFLQKYFHLINRFNNEDVCTCPQASVSQQFTSVPWNSFNRDVLKALYSFAPISMHCNKSSAVRFQGEWNLQPLPKVISTLEEPTPQCPTSQGRSPAGPTVVSIGGGKG



Estructura



Estructura



Estructura



Estructura



Aplicaciones y Enfermedades

●

Diagnóstico traumas crónicos en personas con SSP y polimorfismo del gen DBH.● Diagnóstico de enfermedades relacionadas con el alcoholismo.

● Diagnóstico de enfermedades esquizofrenoides por elevada concentración de Dopamina,y por tanto baja actividad de la enzima.

● Diagnóstico de enfermedades sobre linfocitos T y NK.

●

● Enfermedad de Alzheimer.

● Drogadicción.

● Desórdenes multiorgánicos.



Referencias, Bibliografía y Agradecimientos● AGRADECIMIENTOS:

Dr. Rafael Luque Álvarez de Sotomayor, Dpto Química Orgánica, Facultad de

Ciencias, por su inestimable ayuda en el mecanismo catalítico.● REFERENCIAS:

“The enzymatic conversion of 3,4-Dihydroxyphenylethylamine to Norepinefrine”; Levin, Levenberg y Kaufman, Journal of Biological Chemistry,Febrero 1960.

“3,4-Dihydroxyphenylethylamine beta Hydroxylase: physical properties, copper content, and role of copper in the catalytic activity”: Firedman yKaufman, Journal of Biological Chemistry, Diciembre 1965.

“The primary structure of human dopamine-3-hydroxylase: insights into the relationship between the soluble and the membrane-bound forms of theenzyme”; Varios, The EMBO Journal, 1987.

“Reduced dopamine-beta-hydroxylase activity in Alzheimer's disease”; Varios, British Medical Journal, Enero 1981.

“The Copper-Enzyme Family of Dopamine Beta-Monooxygenase and Peptidylglycine Alfa

“Hydroxylating Monooxygenase: Resolving the Chemical Pathway for Substrate Hydroxylation”;Klinman, Journal of Biological Chemistry, Noviembre 2005.

“ Dopamine beta-hydroxylase deficiency ”; Senard, Rouet, Orphanet Journal of Rare Diseases, Marzo 2006.

“Dopamine-beta hydroxylase polymorphism and cocaine addiction ”; Varios, Behavourial and Brain Functions, Enero 2008.

“Human Plasma Dopamine Beta Hydroxylase”, Frigon y Stone, Journal of Biological Chemistry, Mayo 1978



Referencias, Bibliografía y Agradecimientos

●

WEBS CONSULTADAS:http://www.brenda-enzymes.org/php/result_flat.php4?ecno=1.14.17.1

http://www.cathdb.info/

http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=1ZHB

http://www.proteinmodelportal.org/?aid=getModelQualityAnalysis&sid=PMPSID-D56553F837D3BB12EA84D59927FE2C7F&queryfromto=0_617

www.wikipedia.org (artículos sobre DBH, Dopamina, Noradrenalina y Catecolaminas).

BIBLIOGRAFÍA:

“Fisiología Dinámica”, A. Córdova.

“Tema 9: Reacciones Bisustrato”, Manuel Tena, Jesús Jorrín Novo, Enzimología.

“Texto Atlas de Histología”, Gartner y Hiatt.

http://www.brenda-enzymes.org/php/result_flat.php4?ecno=1.14.17.1




http://www.wikipedia.org/

http://www.wikipedia.org/




http://www.brenda-enzymes.org/php/result_flat.php4?ecno=1.14.17.1

Dopamina Beta Hidroxilasa PPT (EC 1.14.17.1)

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