DODATOK č. 2 ROZPOČTOVEJ KAPITOLY MINISTERSTVA … · 2020. 12. 11. · DODATOK č. 2 k ZMLUVE O POSKYTNUTÍ DOTÁCIE Z ROZPOČTOVEJ KAPITOLY MINISTERSTVA ZDRAVOTNÍCTVA SLOVENSKEJ

DODATOK č. 2 k ZMLUVE O POSKYTNUTÍ DOTÁCIE Z ROZPOČTOVEJ

KAPITOLY MINISTERSTVA ZDRAVOTNÍCTVA SLOVENSKEJ REPUBLIKY

č. 309/2019

uzatvorenej v zmysle § 2 ods. 1 písm. a) v spojení s § 5 ods. 4 zákona č. 525/2010 Z. z.

o poskytovaní dotácií v pôsobnosti Ministerstva zdravotníctva Slovenskej republiky v znení

neskorších predpisov a podľa § 51 zákona č. 40/1964 Zb. Občianskeho zákonníka

(ďalej len „dodatok č. 2“) medzi:

Zmluvné strany

Ministerstvo zdravotníctva Slovenskej republiky

Sídlo: Limbová 2, P.O. BOX 52, 837 52 Bratislava 37

Štatutárny orgán:

minister zdravotníctva

IČO: 00165565

IBAN:

(ďalej len „poskytovateľ“)

a

Názov: Chemický ústav Slovenskej akadémie vied

Sídlo: Dúbravská cesta 9, 845 38 Bratislava

Štatutárny orgán: riaditeľ

IČO: 00166618

IBAN:

Osoba zodpovedná za riešenie projektu v mene hlavného riešiteľa:

zodpovedný riešiteľ

(ďalej len „hlavný riešiteľ“)

a

Názov: Biomedicínske centrum Slovenskej akadémie vied Sídlo: Dúbravská cesta 9, 845 05 Bratislava

Štatutárny orgán: riaditeľka

IČO: 50073869

IBAN: (ďalej len „spoluriešiteľ“)

(„hlavný riešiteľ“ a „spoluriešiteľ“ ďalej ako „prijímateľ“)

Článok I

Predmet dodatku

1. Zmluvné strany uzatvárajú tento dodatok č. 2 v súlade s článkom VI bodom 10 a s článkom

XII bodom 5 Zmluvy o poskytnutí dotácie z rozpočtovej kapitoly Ministerstva

zdravotníctva Slovenskej republiky č. 309/2019 (ďalej len „zmluva“) zo dňa

13. novembra 2019 s prideleným registračným číslom projektu poskytovateľom

2019/68-CHÚSAV-1.

2. Zmluvné strany sa dohodli na zmene bodu 5 článku I zmluvy, ktorý po zmene znie:

„5. Dotácia je poskytnutá zo strany poskytovateľa na obdobie od nadobudnutia platnosti

a účinnosti tejto zmluvy do dátumu uvedeného v projekte, najneskôr však

do 31. marca 2023 a to aj v prípade poskytnutia finančných prostriedkov po 01. auguste

príslušného rozpočtového roka, na ktorých použitie sa vzťahuje ustanovenie § 8 ods. 4

a ods. 5 zákona č. 523/2004 Z. z. o rozpočtových pravidlách verejnej správy a o zmene

a doplnení niektorých zákonov v znení neskorších predpisov (ďalej len „zákon

č. 523/2004 Z. z.“) . Uvedené platí primerane aj pre článok XII bod 3 zmluvy.“

3. Zmluvné strany sa dohodli na doplnení bodu 2 článku III zmluvy. V predmetnom

ustanovení sa v druhej vete slová „a tretiu“ nahrádzajú slovami „, tretiu a štvrtú“.

4. Zmluvné strany sa dohodli na zmene Prílohy č. 1 – Vyplneného projektu (Projektového

formulára a Opisného formulára projektu), ktorá sa nahrádza novou Prílohou č. 1

Vyplnený projekt (Projektový formulár a Opisný formulár projektu)

a na zmene Prílohy č. 2 – Rozpočtu projektu (Celkového a podrobného rozpočtu

projektu) zmluvy, ktorá sa nahrádza novou Prílohou č 2 Rozpočet projektu (Celkový

a podrobný rozpočet projektu na 4 roky).

Článok II

Záverečné ustanovenia

1. Ustanovenia zmluvy, ktoré neboli dodatkom č. 2 dotknuté sa nemenia, zostávajú

zachované, účinné a v platnosti.

2. Tento dodatok č. 2 je neoddeliteľnou súčasťou zmluvy a vyhotovuje sa v piatich

rovnopisoch, pričom dva originály ostávajú u prijímateľa a hlavný riešiteľ

je zodpovedný za to, aby sa jeden rovnopis dostal do rúk spoluriešiteľa, a tri originály

ostávajú u poskytovateľa.

3. Tento dodatok č. 2 nadobúda platnosť dňom jeho podpísania všetkými zmluvnými

stranami a účinnosť dňom, ktorý nasleduje po dni jeho zverejnenia v Centrálnom registri

zmlúv.

4. Zmluvné strany si dodatok č. 2 prečítali, jeho obsahu, právam a povinnostiam

z neho vyplývajúcim porozumeli, pričom na znak súhlasu s jeho obsahom

ho slobodne, vážne, dobrovoľne a vlastnoručne podpisujú.

5. Neoddeliteľnou súčasťou dodatku č. 2 sú Príloha č. 1 – Vyplnený projekt (Projektový

formulár a Opisný formulára projektu) a Príloha č. 2 – Rozpočet projektu (Celkový

a podrobný rozpočet projektu na 4 roky), ktoré v plnom rozsahu nahrádzajú znenie

Prílohy č. 1 a Prílohy č. 2 zmluvy.

V Bratislave dňa V Bratislave dňa

..................................... .....................................

minister zdravotníctva riaditeľ

poskytovateľ hlavný riešiteľ

V Bratislave dňa

.....................................

riaditeľka

spoluriešiteľ

2019 Výskum a vývoj

(ONKO)

PROJEKTOVÝ FORMULÁR Príloha č. 3. 1. A. / SJ

VV-2019-P2.1-SJ Základné informácie o riešiteľskej organizácii

Žiadateľ

01 Názov organizácie Chemický ústav, Slovenská akadémia vied

VV-2019-P1-SJ 68Základné informácie o projekte

01 Identifikačné číslo projektu 2019/68-CHÚSAV-1

02 Názov projektu Glykoprofilácia proteínov prítomných v sére a v exozómoch pre včasnú diagnostiku rakoviny prostaty

03 Akronym projektu GlycoPro

04 Podporovaná oblasť zo schváleného zoznamu na daný rok

3. Karcinóm prsníka, pľúc a prostaty

05 Súhrnná informácia o projekte

V tomto projekte by sme chceli identifikovať nové glykánové biomarkery rakoviny prostaty (PCa) založené na špecifickom glykoprofilovaní vybraných proteínov buď prítomných v sére alebo v exozómoch. Budeme integrovať rôzne testovacie protokoly pre takéto glykoprofilácie pomocou formátu ELISA s využitím lektínov, magnetickej ELISA, „microarray“ s využitím protilátok a lektínov, elektrochémie, „Surface Plasmon Resonance“ (SPR) a LFA („Lateral Flow Assays“, testy podobné tehotenskému). Inovácie projektového zámeru je možné zhrnúť takto:

• Špecifická glykoprofilácia proteínov akými sú „zinc -glycoprotein” (ZAG) a „prostatic acid phosphatase” (PAP) prítomných v sére ako potenciálnych biomarkerov PCa;

• Použitie exozómov ako bohatého zdroja 5 glykoproteínov, ktoré budú glykoprofilované lektínmi;

• Aplikácia inovatívnych testovacích stratégií s rôznymi formátmi analýz; glykoproteíny/exozómy budú afinitne obohatené magnetickými časticami a celý komplex bez uvoľneného glykoproteínu/exozómu bude inkubovaný s povrchom modifikovaným lektínom;

• Použitie LFA na glykoprofiláciu proteínov, ktorá nebola použitá pri analýze reálnych vzoriek.

06 Ciele navrhovaného projektu

Ciele projektu možno zhrnúť takto:

• Cieľ 1) Špecifická glykoprofilácia niekoľkých sérových proteínov okrem PSA ako nových

biomarkerov PCa vrátane PAP a ZAG, čo ešte nebolo testované;

• Cieľ 2) Využitie exozómov ako nového zdroja biomarkerov PCa s využitím špecifickej

glykoprofilácie glykoproteínov obohatených v exozómoch uvoľnených z prostaty, ako sú

PSA, PAP, ZAG, „-1-acid glycoprotein” a „galectin-3 binding protein”, čo ešte nebolo testované;

• Cieľ 3) Klinické vyhodnotenie biomarkerov PCa prítomných v sére alebo izolovaných z

exozómov.

07 Žiadateľ Chemický ústav, Slovenská akadémia vied

08 Zodpovedný riešiteľ

09 Požadované finančné prostriedky z MZ SR (v EUR)

251 552

10 Spolufinancovanie projektu (v EUR)

207 071

11 Celkové náklady na projekt (v EUR)

458 623


(ONKO)

02 Adresa organizácie Dúbravská cesta 9, 845 38 Bratislava

03 IČO 00166618

04 Právna forma organizácie Príspevková organizácia

05 Sektor Štátny

06 Platca DPH Nie

07

Finančný manažér projektu

Telefón

E-mail

08

Oprávnená osoba na podpis zmluvy v mene žiadateľa

Telefón

E-mail

VV-2019-P2.2-SJ Základné informácie o zodpovednom riešiteľovi

01 Meno a priezvisko, Titul

02 Funkcia; pozícia Vedúci oddelenia

03 Telefón

E-mail

04

Zamestnávateľ Chemický ústav SAV

Adresa Dúbravská cesta 9, 845 38 Bratislava

Telefón

E-mail

05 Odborná špecializácia Glykomika

06 Najvýznamnejšie publikácie za posledných 5 rokov alebo ID výskumníka

1. Bertok, T.; Lorencova, L.; Hroncekova, S.; Gajdosova, V.; Jane, E.; Hires, M.; Kasak, P.; Kaman, O.; Sokol, R.; Bella, V.; Eckstein, A. A.; Mosnacek, J.; Vikartovska, A.; Tkac, J., Advanced impedimetric biosensor configuration and assay protocol for glycoprofiling of a prostate oncomarker using Au nanoshells with a magnetic core. Biosensors and Bioelectronics 2019, 131, 24. IF 9.518. Počet citácií: 0.

2. Dosekova, E.; Filip, J.; Bertok, T.; Both, P.; Kasak, P.; Tkac, J., Nanotechnology in glycomics: applications in diagnostics, therapy, imaging, and separation processes. Medicinal Research Reviews 2017, 37, 514. IF 9.791. Počet citácií: 18.

3. Lorencova, L.; Bertok, T.; Dosekova, E.; Holazova, A.; Paprckova, D.; Vikartovska, A.; Sasinkova, V.; Filip, J.; Kasak, P.; Jerigova, M., Electrochemical performance of Ti3C2Tx MXene in aqueous media: towards ultrasensitive H2O2 sensing. Electrochimica Acta 2017, 235, 471. IF 5.383. Počet citácií: 35.

4. Paleček, E.; Tkáč, J.; Bartošík, M.; Bertók, T. s.; Ostatná, V.; Paleček, J., Electrochemistry of Nonconjugated Proteins and Glycoproteins. Toward Sensors for Biomedicine and Glycomics. Chemical Reviews 2015, 115, 2045. IF 54.301. Počet citácií: 152.

5. Jolly, P.; Formisano, N.; Tkáč, J.; Kasák, P.; Frost, C. G.; Estrela, P., Label-Free Impedimetric Aptasensor with Antifouling Surface Chemistry: A Prostate Specific


(ONKO)

Antigen Case Study. Sensors and Actuators, B: Chemical 2015, 209, 306. IF 6.393. Počet citácií: 64.

https://scholar.google.sk/citations?user=jfkqa18AAAAJ&hl=sk&oi=ao

07 Prehľad projektov zodpovedného riešiteľa v oblasti výskumu a vývoja v doméne zdravotníctva

Pre popis riešených projektov pozrite časť J in Prílohe 3.1.B. Zoznam projektov, v ktorých

bol/je zodpovedný riešiteľ tohto projektového zámeru zodpovedný riešiteľ za projekt alebo za partnerskú organizáciu:

1. Projekt APVV Názov projektu: Príprava nanoštruktúrovaných povrchov, ich integrácia s bioelementmi a následné využitie Číslo projektu: APVV-0282-11 Zodpovedný riešiteľ: Trvanie: 07/12 – 12/15 Rozpočet: 193 000 Eur

2. ITN project/projekt – FP7: FP7-PEOPLE-2012-ITN, Názov projektu: Diagnostika rakoviny: Paralelná detekcia biomarkerov rakoviny prostaty Číslo projektu: 317420

Zodpovedný riešiteľ na ChU SAV: Trvanie: 10/12 – 09/16 Rozpočet: Celkovo 4 006 852 Eur, pre ChU SAV 429 653 Eur 3. ERC Starting projekt – FP7 projekt, FP7-IDEAS-ERC Názov projektu: Elektrochemické lektínové a glykánové biočipy integrované s nanoštruktúrami Číslo projektu: 311532

Zodpovedný riešiteľ: Trvanie: 01/13 - 12/17 Rozpočet: 1 155 940 Eur 4. Qatar Science Foundation projekt Názov projektu: Príprava, charakterizácia a aplikácie lektínových biočipov v diagnostike rakoviny a v objave biomarkerov rakoviny Číslo projektu: #NPRP-6-381-1-078 Zodpovedný riešiteľ na ChU SAV: Trvanie: 01/14 - 02/17 Rozpočet: Celkovo 1 015 915 USD, pre ChU SAV 354 740 USD 5. APVV projekt

Názov projektu: Glykánové bionanosenzory a bioanalytické zariadenia – ich príprava, validácia a aplikácia v diagnostike rakoviny Číslo projektu: APVV-17-0300 Zodpovedný riešiteľ: Trvanie: 08/18 – 06/22 Rozpočet: 248 000 Eur 6. Proof of concept projekt (ERC) Názov projektu: Nový detekčný protokol pre spoľahlivú diagnostiku rakoviny prostaty

Číslo projektu: 825586 Zodpovedný riešiteľ: Trvanie: 10/18 – 09/19 Rozpočet: 149 500 Eur

7. Projekt ITN - FP7-PEOPLE-2012-ITN Názov projektu: Syntetická biológia proteínov viažucich sacharidy: inžinierske interakcie proteín-sacharid pre diagnostiku a bunkové zacielenie Číslo projektu: 814029 Zodpovedný riešiteľ: Trvanie: 10/18 - 09/22 Rozpočet: 429 000 €

8. Projekt H2020-EIC-SMEInst-2018-2020: SME Instrument 1

Názov projektu: Inovatívna analýza založená na glykánoch pre diagnostiku rakoviny Číslo projektu: 855423 Zodpovedný riešiteľ:

https://scholar.google.sk/citations?user=jfkqa18AAAAJ&hl=sk&oi=ao


(ONKO)

Trvanie: 02/19 - 07/19 Rozpočet: 50 000 €

9. Projekt Ministerstva zdravotníctva Slovenskej republiky

Názov projektu: Včasná diagnostika kolorektálneho a testikulárneho karcinómu glykoprofiláciou Číslo projektu: 2018/23-SAV-1 Zodpovedný riešiteľ: Trvanie: 12/18 - 12/20 Rozpočet: 299 824 €

08

Počet – Projekty zodpovedného riešiteľa realizované v priebehu posledných 5 rokov

12

09 Celková citovanosť v SCI / ISI 3202 (Scopus)

VV-2019-P2.3-SJ Základné informácie o spoluriešiteľskej organizácii

Spoluriešiteľská organizácia

01 Názov organizácie Biomedicínske centrum Slovenskej akadémie vied

02 Adresa organizácie Dúbravská cesta 9, 845 05 Bratislava

03 IČO 50073869

04 Právna forma organizácie Príspevková organizácia

05 Sektor Štátny

06 Platca DPH Nie

07

Oprávnená osoba na podpis zmluvy v mene žiadateľa

Telefón

E-mail

V-2019-P2.4.1-SJ Zoznam riešiteľov

01 Zoznam zamestnancov priamo podieľajúcich sa na riešení projektu

Meno a priezvisko Tituly Pracovné zaradenie IČO organizácie Počet hodín

Ing. DrSc. Vedúci oddelenia 00166618 2550

Ing., PhD. Samostatný vedecký pracovník 00166618 2550






Labornatka 00166618 2050

RNDr., CSc. Samostatný vedecký pracovník 50073869 450

Mgr., PhD. Vedúca oddelenia 50073869 450


(ONKO)

RNDr., PhD. Samostatný vedecký pracovník 50073869 450

RNDr., PhD. Samostatný vedecký pracovník 50073869 450

Ing. PhD. študent 00166618 1000



Mgr. PhD. študent 00166618 2000

VV-2019-P2.5-SJ Projektový manažér / Vedúci projektu

(Kontaktná osoba, ak je iná ako zodpovedný riešiteľ, poverená štatutárnym zástupcom žiadateľa vykonávať administratívne vedenie projektu.)

01

Meno a priezvisko, Tituly

Telefón

Email

VV-2019-P2.6-SJ

Existujúca infraštruktúra (Opíšte existujúcu infraštruktúru, v členení podľa jednotlivých zapojených organizácií,

ktorá sa bude využívať pre prácu na projekte.)

Oba ústavy sú vybavené alebo majú prístup k infraštruktúre, ktorá sa použije na prípravu a následnú charakterizáciu biaoanalytických zariadení a na kultiváciu a následnú charakterizáciu viacerých bunkových línií. Infraštruktúra zahŕňa potenciostaty vybavené modulmi EIS a QCM; prístroj na nanášanie tenkých vrstiev s reguláciou hrúbky - filmový aplikátor a nanášací stroj. V rámci projektu CE MACHINA II boli zakúpené prístroje na meranie pomocou fluorescenčných biočipov. V rámci CE pre bielo-zelenú biotechnológiu bola získaná čítačka biočipov, umožňujúca detekciu fluorescencie na základe princípu rovinných vodivých vĺn. V rámci CE priemyselnej biotechnológie sa získala čítačka pre ELISA doštičky s možnosťou UV/VIS, detekcie fluorescencie a chemiluminiscencie. Prístup k zariadeniam, ako sú SEM (Skenovacia Elektrónová Mikroscopia) alebo XPS (Röntgenová fotoelektrónová spektroskopia), je zaručený partnerstvom v CE MACHINE. K dispozícii je tiež analytický systém HPLC Shimadzu s detektormi UV-VIS a RI, plynová chromatografia s detektorom FID, polarimetrom, prietokovým kalorimetrom a spektrofotometrom. V rámci CE Glycomics bola získaná infraštruktúra svetovej triedy pre analýzu MS (ULTRAFLEX MALDI TOF/TOF, LTQ Orbitrap, LC-MS/MS). NMR a FTIR spektrometre poskytne analytické oddelenie. Nové NMR spektrometre (400 MHz pre 1H a 600 MHz pre 1H, 150 MHz pre 13C) sú špičkové prístroje Centra pre biomolekulové štúdie na ChU. Oba výskumné tímy sú plne kompetentné z

hľadiska kapacity personálu a prístrojového vybavenia na splnenie cieľov projektu.

V-2019-P2.4.2-SJ Zoznam riešiteľov

02 Ostatní zamestnanci

Celkový počet ostatných osôb 2

Súhrnná kapacita ostatných osôb v hodinách 500

03 Spolu Celkový počet zamestnancov 18

Súhrnná kapacita zamestnancov v hodinách 26700

2019 Výskum a vývoj (ONKO)

OPISNÝ FORMULÁR PROJEKTU Príloha č. 3. 1. B. / SJ

VV-2019-R-SJ Vecný zámer projektu

Identifikačné číslo projektu 2019/68-CHÚSAV-1

Názov projektu Glykoprofilácia proteínov prítomných v sére a v exozómoch pre včasnú diagnostiku rakoviny prostaty

Akronym projektu GlycoPro

VV-2019-R-SJ Vecný zámer projektu

A Východisková situácia

Rakovina je hlavnou príčinou úmrtí v rozvojových aj rozvinutých krajinách [1]. V roku 2012 bolo na celom svete 14,1 milióna nových prípadov rakoviny a 8,2 milióna úmrtí súvisiacich s rakovinou [2].

Rakovina prostaty (PCa) je najčastejšou rakovinou u mužov v rozvinutejších krajinách. Na celom svete bolo 1,6 milióna nových prípadov rakoviny prostaty (PCa) s 366 000 úmrtiami ročne [3]. Nové biomarkery PCa sú skutočne potrebné, pretože najlepší súčasný biomarker PCa (hladina prostatického špecifického antigénu (PSA) v sére) nemá vysokú špecificitu pre diagnostiku PCa a nemá dostatočnú presnosť na identifikáciu pacientov s klinicky významnou PCa. Falošne pozitívna miera pri stanovení PSA je ~ 75% [4] a existuje významná prevalencia PCa u mužov s normálnymi hladinami PSA [5]. Na účely predbežného skríningu sa test PSA aplikuje spolu s digitálnym rektálnym vyšetrením. Ak sú tieto výsledky podozrivé, pacientom sa odporúča, aby podstúpili biopsiu na potvrdenie PCa. Iba v 26% prípadov biopsia potvrdzuje PCa, teda 74% biopsií je zbytočných, čo predstavuje značnú záťaž pre spoločnosť, pacientov, ale i pre systém zdravotnej starostlivosti.

V 19. storočí bola PCa opísaná ako „veľmi zriedkavé ochorenie“, ale v 21. storočí sa stala hlavným karcinómom diagnostikovaným u mužov s predpokladaným zvýšením výskytu na 2,1 milióna do roku 2035 s až 633 328 úmrtiami súvisiacimi s PCa [6]. Miera prežitia je úmerná štádiu ochorenia v čase diagnostiky, preto kľúčom k zníženiu úmrtnosti je včasná diagnostika pomocou účinných diagnostických nástrojov.

Hladina PSA v sére je nízka u zdravých mužov, so zvýšenou hladinou pozorovanou po narušení bazálnej membrány prostaty (t.j. v dôsledku PCa alebo iných ochorení). Hladina PSA do 4 ng/ml sa považuje za „normálnu“ [7]. Hladina PSA v rozsahu 4 - 10 ng/ml (tiež často definovaná ako šedá zóna) sa považuje za „stredne rizikovú“, pričom rakovina je prítomná u 30 - 35% pacientov [7]. Hladina PSA nad 10 ng/ml sa považuje za „vysokú“ so 67% pravdepodobnosťou prítomnosti pokročilého ochorenia [7]. Patológ Richard Ablin, objaviteľ PSA, napísal príspevok “The Great Prostate Hoax: How big medicine hijacked the PSA test and caused a public health disaster”’. Uviedol v ňom nasledujúce hlavné obavy týkajúce sa použitia PSA ako diagnostického PCa biomarkera [8,9]: A) PSA sa špecificky uvoľňuje z prostaty, ale nie je PCa špecifický, preto nemôže byť použitý na diagnostiku PCa; B) hladina PSA v sére neposkytuje informáciu, či je PCa v indolentnej alebo agresívnej fáze; C) PSA by sa mala používať len ako indikátor na monitorovanie PCa.

Kontroverziu používania PSA pre diagnostiku PCa je možné zdokumentovať nasledujúcimi faktami: D) the US Food and Drug Administration (FDA) schválila testy PSA spolu s digitálnym rektálnym vyšetrením (DRE) pre diagnostiku PCa v roku 1994 [6]; E) v dôsledku nadmernej diagnózy PCa, zverejnila the US Preventative Services Task Force (USPSTF) odporúčanie proti používaniu PSA na diagnostiku PCa v roku 2012 [10]; F) od zverejnenia tohto odporúčania boli diagnostikované prípady agresívnejších foriem PCa s vyšším podielom nádorov vyššieho stupňa a štádia [11], preto v roku 2017 USPSTF odporučil selektívne použitie PSA testov pre mužov vo veku od 55 do 70 rokov [12, 13].

Diskusia o klinickej hodnote testovania PSA stále pokračuje kvôli vyššie uvedeným dôvodom aj kvôli tomu, že „normálna“ hladina PSA do 4 ng/ml nie je zárukou zdravia [14]. Výsledkom suboptimálneho klinického využitia PSA testov je, že v súčasnosti sa vyvíjajú mnohé ďalšie testy na diagnostiku PCa alebo ich už schválili regulačné úrady, ako napríklad PHI a 4K score [6,7,15-17].

V článku nedávno publikovanom v časopise Science sa uvádza, že pre spoľahlivú a presnú diagnostiku nádorov v ranom štádiu je potrebné vykonať analýzu viacerých analytov/biomarkerov v krvi, t.j. analýzu hladín niekoľkých proteínov a voľne cirkulujúcej DNA v sére [18]. Avšak v priekopníckej štúdii publikovanej v časopise Science [18] nebola pre diagnostiku rakoviny zahrnutá analýza glykánov. V nedávnej štúdii bol využitý integrovaný prístup využívajúci analýzu 6 typov biomarkerov, t.j. klinické údaje, metyláciu DNA, kódujúce a nekódujúce transkripty, proteíny a glykány (komplexné cukry pripojené k proteínom/lipidom), teda vrátane glykánov (t.j. glykánov uvoľňovaných z glykoproteínov enzýmami) po prvýkrát na rozlíšenie neagresívnej lokalizovanej PCa od agresívnej nelokalizovanej PCa [19]. Analýzou 61 rôznych biomolekúl vrátane 4 klinických parametrov bolo možné rozlíšiť neagresívnu formu PCa od agresívnej formy PCa s AUC


= 0,91 (AUC = plocha pod krivkou „receiver-operating characteristic“ (ROC)). Vyhodnotenie klinických údajov s použitím iba 4 klinických parametrov (vek, hladina PSA, Gleason score (GS) a výsledky DRE) pokytli oveľa nižšiu AUC = 0,67 [19].

Glykány sú nevyhnutné pre všetky organizmy [20-22]. Glykány sa efektívne zúčastňujú na viacerých interakciách (bunka-biomolekula, bunka-bunka, hostiteľ-patogén), ako aj rôznych bunkových procesov akými sú bunková signalizácia, vznik, progresia rakovinového ochorenia alebo vznik metastáz [20-22]. Zmeny glykozylácie sú charakteristické pre malígnu transformáciu a progresiu nádorov [23]. Tri kľúčové atribúty sú zodpovedné za zmeny glykozylácie súvisiace s rakovinou: G) nedostatočná/nadmerná expresia glykozyltransferáz (predĺženie glykánov) a glykozidáz (skracovanie reťazcov glykánov); H) zmenená glykánová štruktúra ako výsledok zmenenej terciárnej štruktúry proteínov; I) dostupnosť rôznych akceptorových substrátov, glykánových nukleotidových donorov a kofaktorov [23]. Typické zmeny glykozylácie spojené s rakovinou zahŕňajú zmenenú sialyláciu (najmä 2,3-sialyláciu), fukozyláciu (najmä „core“ fukozyláciu = fukózu pridanú k sacharidu v bezprostrednej blízkosti kostry proteínu), rozvetvenie glykánov, prítomnosť kyseliny polysialovej atď. [23-25]. Typy glykánov a rozsah glykozylácie sa líšia medzi bunkami z rovnakého tkaniva ako aj medzi orgánmi [26]. Zmeny profilu glykánov sa často uvádzajú ako „znak rakoviny“ [27].

Glykány ako biomarkery PCa boli nedávno zosumarizované v dvoch našich prehľadových článkoch [28,29], keď bola špecifická glykoprofilácia proteínov s využitím lektínov uvedená ako sľubný diagnostický a prognostický biomarker PCa. Z prieskumu literatúry je zrejmé, že na tieto účely sa úspešne použila najmä glykoprofilácia PSA (Tabuľka 1) [28].

Tabuľka 1. Klinické charakteristiky glykoprofilácie PSA vo vzorkách sér ako diagnostický PCa biomarker (Tabuľka prevzatá z nášho prehľadového článku [28]).

PCa, pacienti s rakovinou prostaty; BPH, pacienti s benígnou hyperpláziou prostaty; AUC, plocha pod krivkou ROC („Receiver-operating characteristic“); sens., citlivosť; spec., špecificita; i, nie šedá zóna, ale hodnota tPSA bola menej ako 13 ng/ml; ii, %fPSA v rozsahu 10–20%; PHI, „prostate health index“; SA, kyselina sialová; ND, nestanovené, SNA, Sambucus nigra aglutinín; MAA, Maackia amurensis aglutinín; iii, tréningový test s použitím 100 vzoriek sér; iv, validačný test s použitím 314 vzoriek sér; HYB4 Ab, protilátka

špecifická voči kyseline -2,3 sialovej; WFA, Wisteria floribunda aglutinín; UEA-I, Ulex europaeus aglutinín I; Fuc, fukóza; zvýraznenie šedou farbou: štúdie so vzorkami sér, ktoré majú hladinu tPSA (celkový PSA) v šedej zóne.

Exozómy sú multi-vezikulárne častice (40 - 120 nm) pozostávajúce z lipidových membrán a sú vylučované bunkami do extracelulárnych tekutín [30]. Komunikácia bunka-bunka je nevyhnutná pre správnu funkciu mnohobunkových organizmov, čo je okrem zapojenia endokrinných systémov a proteínových rastových faktorov sprostredkované aj exozómami [31,32]. Pretože exozómy sú produkované zdravými bunkami a bunkami, ktoré sa podieľajú na patologických procesoch (neurodegeneratívne a nádorové ochorenia), sú nositeľmi biomarkerov použiteľných na diagnostiku. Teda molekuly prítomné v exozómoch predstavujú „odtlačok“ ich materskej bunky. Analýza obsahu exozómov predstavuje alternatívu k tkanivovým alebo kvapalným biopsiám a pomáha vyhnúť sa invazívnym chirurgickým zákrokom, ktoré spôsobujú značné nepohodlie pacientov. Skutočnosť, že exozómy sú považované za potenciálny zdroj biomarkerov rakoviny, je zaujímavou a horúcou témou s obrovským prísľubom pre objav biomarkerov [30].

Heterogénnosť exozómov bola prekážkou pre lepšie pochopenie ich biogenézy, molekulárneho zloženia, funkcií a distribúcie [33]. Ukázalo sa, že extracelulárne vezikuly môžu byť rozdelené do niekoľkých skupín s veľkosťou 90-120 nm (veľké exozómy), 60-80 nm (malé exozómy) a 35 nm (bezmembránové častice nazývané exoméry) (Obr. 1). Exoméry sú bohaté na obsah enzýmov a proteínov spojených s metabolizmom, hypoxiou, glykolýzou atď. [33]. Všetky tri typy exozómových subpopulácií majú odlišný glykozylačný, proteínový, lipidový, DNA a RNA profil a biofyzikálne vlastnosti [33]. To je dôvod, prečo sa expresia génov [34], mikroRNA [35], proteínov [36], lipidov a metabolitov [36-39] prítomných v exozómoch skúma ako možné biomarkery PCa.


Obr. 1: Transmisná elektrónová mikroskopická snímka exozómovej zmesi (vľavo) a frakcionovaných exomérov (ľavý stred), malých exozómov (pravý stred) a veľkých exozómov (vpravo). Obrázok prevzatý z nedávneho článku [33].

Nové dôkazy naznačujú zapojenie exozómov v procese vzniku rakoviny, vrátane tvorby pre-metastatických miest s následný vznikom metastáz [40,41]. Existujú už podporné dôkazy o zapájaní sa exozómov do bunkovej komunikácie (od rakovinových buniek smerom k nerakovinovým bunkám; od rakovinových buniek smerom k rakovinovým bunkám, od nerakovinových buniek smerom k rakovinovým bunkám) [40]. Tvorba pre-metastatických miest je tkanivovo špecifická sprostredkovaná integrínmi nachádzajúcimi sa na povrchu exozómov, ktoré môžu byť použité na afinitné interakcie počas izolácie exozómov [31]. Pri porovnaní glykánového zloženia exozómov s bunkami z ktorých boli exozómy uvoľnené, sa zistilo, že exozómy môžu byť obohatené niektorými typmi glykánov (Obr. 2) [31,42]. Ďalšia štúdia naznačuje, že glykoproteíny prítomné na exozómoch môžu mať odlišnú glykozyláciu v porovnaní s membránami produkujúcich buniek [43]. Tieto zmeny by sa mohli použiť na novú diagnostiku rakoviny, ale potenciál glykánov prítomných v exozómoch ako biomarkerov PCa sa v posledných prehľadových článkoch začína objavovať len okrajovo [28-30,38,44]. Význam exozomálnych glykánov môže byť dokumentované skutočnosťou, že odstránenie kyseliny sialovej z exozómov významne zmenilo ich biodistribúciu u myší [45].

Purifikácia exozómov sa zvyčajne uskutočňuje ultracentrifugáciou, selektívnym zrážaním a rôznymi komerčnými kitmi. Vďaka adherentným transmembránovým proteínom, ako je integrín, tetraspaníny CD9, CD37, CD53, CD63, CD81 a CD82, môžu byť exozómy izolované z telesných tekutín pomocou imunoseparácie. Exozómová purifikácia založená na afinitných interakciách začína byť populárna kvôli zjavným výhodám, akými sú rýchlosť a jednoduchosť protokolu [46]. Protilátky sú prvou voľbou pre afinitnú purifikáciu exozómov [46], ale iné biomolekuly, ako napríklad DNA aptaméry [47,48], lektíny (proteíny viažuce glykány) [46,49] a proteíny zacielené na exozomálne lipidy môžu byť tiež účinne aplikované [50,51]. Afinitná purifikácia exozómov s využitím lektínov je mimoriadne zaujímavá, pretože tento typ izolácie obohacuje exozómy s veľkosťou a medzifázovým obsahom odlišným od tých, ktoré sú založené na rozpoznávaní membránovych exozomálnych proteínov [49]. Je potrebné optimalizovať metódy izolácie exozómov [52], pretože významné rozdiely v zložení proteínov a glykánov boli potvrdené s použitím protilátok a lektínov ako afinitných sond [46].

Purifikácia exozómov uvoľnených prostatou sa účinne uskutočnila použitím proteínu PSMA („prostate specific membrane antigen“) ako cieľa [53,54]. Alternatívne by sa mohli použiť iné selektívne sondy na rovnaký účel v dôsledku ich prítomnosti na povrchu

exozómov: PSA [55,56], PAP („prostatic acid phosphatase”) [56,57] a ZAG („zinc -

glycoprotein“) [56]. Iné proteíny, ako napríklad ACG („-1-acid glycoprotein“) [56] a G3BP („galectin-3 binding protein“) [56] sú prítomné v exozómoch uvoľňovaných prostatou, ale nie je známe, či sú prítomné na povrchu.

Obr. 2: Exozómy môžu byť prednostne obohatené určitými glykánmi v porovnaní s produkujúcimi bunkovými membránami. Prebraté z Ref. [31].

B Ciele projektu Ciele projektu možno zhrnúť takto:

• Cieľ 1) Špecifická glykoprofilácia niekoľkých sérových proteínov okrem PSA ako nových biomarkerov PCa vrátane PAP a ZAG, čo ešte nebolo testované;


• Cieľ 2) Využitie exozómov ako nového zdroja biomarkerov PCa s využitím špecifickej glykoprofilácie glykoproteínov obohatených v exozómoch uvoľnených z prostaty, ako sú PSA, PAP, ZAG, ACG a G3BP, čo ešte nebolo testované;

• Cieľ 3) Klinické vyhodnotenie biomarkerov PCa prítomných v sére alebo izolovaných z exozómov.

V tomto projekte by sme chceli identifikovať nové glykánové PCa biomarkery založené na špecifickom glykoprofilovaní vybraných proteínov buď prítomných v sére alebo v exozómoch. Budeme integrovať rôzne testovacie protokoly pre takéto glykoprofilácie pomocou formátu ELISA s využitím lektínov, techniky MELLA, „microarray“ s využitím protilátok a lektínov, elektrochémie, „Surface Plasmon Resoanance“ (SPR) a LFA („Lateral Flow Assays“, testy podobné tehotenskému). Inovácie projektového zámeru je možné zhrnúť takto:

• Špecifická glykoprofilácia iných proteínov akými sú ZAG a PAP prítomných v sére ako potenciálnych biomarkerov PCa;

• Použitie exozómov ako bohatého zdroja glykoproteínov (PSA, PAP, ZAG, ACG a G3BP), ktoré majú byť glykoprofilované lektínmi; predbežné výsledky ukazujú, že konkrétny proteín prítomný v bunkách a v exozómoch má odlišné glykánové zloženie [43];

• Aplikácia inovatívnych testovacích stratégií s rôznymi formátmi analýzy, ako je znázornené na Obr. 4; glykoproteíny/exozómy môžu byť afinitne obohatené magnetickými časticami a celý komplex bez uvoľneného glykoproteínu/exozómu bude inkubovaný s povrchom modifikovaným lektínom;

• Použitie LFA na glykoprofiláciu proteínov, ktorá nebola použitá pri analýze reálnych vzoriek.

C Relevantnosť k oblastiam podporovaným v danom roku

Projekt je relevantný pre prioritu translačného a aplikovaného biomedicínskeho výskumu, ako je definované vo výzve na predkladanie projektov: „3. Karcinóm prsníkov, pľúc a prostaty“. Konkrétnejšie je projekt relevantný pre oblasť inovatívnych diagnostických postupov so zameraním na objavovanie biomarkerov pre PCa. Špecifická glykoprofilácia proteínov ako biomarkerov PCa sa intenzívne skúmala na proteíne PSA [28]. Keďže naša skupina bola v minulosti tiež intenzívne zapojená do glykoprofilácie PSA s použitím elektrochemických [58-61] alebo MELLA [62] formátov analýzy, v tejto práci by sme chceli systematicky skúmať potenciál glykoprofilácie PAP a ZAG ako PCa biomarkerov. Okrem toho by sme chceli preskúmať potenciál exozómov uvoľnených prostatou ako nového a bohatého zdroja glykoproteínov (PSA, PAP, ZAG, ACG a G3BP), ktoré budú glykoprofilované s použitím lektínov. Budeme skúmať klinický potenciál glykoprofilácie exozomálnych glykoproteínov ako potenciálnych biomarkerov PCa.

D Potenciálny dopad Vami dosiahnutých výsledkov na medicínsku prax

Naše predbežné výsledky založené na glykoprofilácii PSA naznačujú, že tento prístup je veľmi sľubný pre diagnostiku a prognózu PCa. Naše výsledky ukázali skutočný potenciál PSA glykoprofilácie pre PCa diagnostiku, ako sa ukázalo vo fáze technologickej validácie (n = 24; PSA hladina 0,7-136 ng/ml; presnosť 95+%, citlivosť 100%, špecificita 94%, AUC=0,95, pozri kombináciu 2 glykánových biomarkerov na Obr. 3); predklinická validačná fáza 1 (n = 37; hladina PSA 2,0 až 9,9 ng/ml; presnosť 88%, citlivosť 90%, špecificita 88%, AUC=0,89) a predklinická validačná fáza 2 (n = 140; úroveň PSA 2,0 - 10,0 ng/ml, presnosť 79%, citlivosť 76%, špecificita 82%, AUC=0,83) (zatiaľ nepublikované). Glykoprofilácia PSA ukázala svoj diskriminačný potenciál odlíšiť agresívnu formu PCa od neagresívnej [62]. Predklinická validačná fáza 2 je extrémne povzbudzujúca, pretože pomocou glykánovej analýzy bola získaná významne vyššia hodnota AUC=0,83 v porovnaní s AUC=0,52 v prípade merania hladiny tPSA v sére. Vzorky boli v tomto prípade vybrané zo „šedej zóny“ šedej zóny, pretože priemerná hladina PSA bola buď (5,5 ± 2,0) ng/ml pre pacientov s PCa (n = 70) alebo (5,4 ± 1,9) ng/ml pre kontrolnú skupinu (n = 70). Okrem toho sme pomocou algoritmov strojového učenia dokázali identifikovať 5 podozrivých vzoriek z kontrolnej skupiny a z týchto piatich vzoriek, v troch vzorkách bol potvrdený prekancerózny stupeň a v jednom prípade bola neskôr diagnostikovaná PCa (údaje ešte neboli publikované). Naše výsledky naznačujú, že s naším prístupom založeným na analýze glykánov chráneným PCT patentovou prihláškou sme v popredí prístupov na diagnostiku PCa (Tabuľka 1).

Obr. 3: Krivka (ROC) pre glykoprofiláciu PSA vo formáte magnetickej ELISA (ELISA = Enzyme-linked imunosorbent test) s využitím lektínov na stanovenie 2 glykánov ako biomarkerov verzus analýza hladiny PSA. V obidvoch prípadoch sa analyzovali vzorky benígnej prostatickej hyperplázie (BPH, t.j. zdravá kontrola) oproti sérovým vzorkám rakoviny prostaty (PCa). V obrázku sú uvedené hodnoty AUC (plocha pod krivkou) pre vybrané kombinácie biomarkerov.

V záverečnej fáze projektu identifikujeme sľubné biomarkery PCa založené na glykoprofilovaní proteínov prítomných v sére (PAP alebo ZAG) alebo prítomných v exozómoch uvoľnených z tkaniva/buniek prostaty (PSA,


PAP, ZAG, ACG a G3BP). Klinické parametre takýchto biomarkerov budú vyhodnotené (citlivosť testu a špecificita, presnosť a hodnota AUC) a následne kriticky porovnané s klinickými parametrami súčasných PCa diagnostických kitov, ako sú PHI, 4K score a PCA-3 [16].

E Vedecko-technologická excelentnosť

Analýza glykánov pre diagnostiku rôznych chorôb je novo vznikajúcou vedeckou disciplínou, ktorá môže viesť k objaveniu nových rakovinových biomarkerov. Tradičný analytický prístup analýzy glykánov integruje hmotnostnú spektrometriu kombinovanú s chromatografickými a/alebo elektroforetickými separačnými nástrojmi. Podľa nášho názoru nie sú prístupy založené na tomto princípe detekcie glykánov kompatibilné so súčasnou klinickou praxou, hoci poskytujú cenné informácie o presnej štruktúre glykánov prítomných v rôznych typoch vzoriek a sú schopné objasniť úlohu glykánov v mnohých fyziologických a patologických procesoch. Preto prístupy s využitím lektínov na detekciu zmien glykánov sú viac kompatibilné s klinickými požiadavkami (t.j. integráciou celého konceptu testu do testov podobných ELISA alebo Luminex) a využiteľné ako diagnostické a prognostické biomarkery PCa. V dôsledku nedostatku citlivosti meraní pomocou hmotnostnej spektrometrie (MS) alebo chromatografických metód [63] sa tento prístup len zriedka aplikuje na glykoprofiláciu PSA. Tieto techniky sa neustále vyvíjajú, s cieľom zvýšiť citlivosť meraní, čo je podrobne zhrnuté v nedávnej práci [64]. Krása používania lektínov spočíva v tom, že takéto proteíny môžu interagovať s glykánovou časťou proteínu v intaktnej forme alebo s glykánmi, ktoré sú neoddeliteľnou súčasťou intaktných buniek [65,66]. Takže s použitím lektínov nie je potrebné uvoľňovať glykány z glykoproteínov, čo významne zjednoduší meranie [58-61,67,68].

V skupine sme systematicky používali lektíny na analýzu glykánov vo vzorkách sér od pacientov s viacerými ochoreniami v rámci ERC Starting grantu č. 311532 (2013-2017, „Elektrochemické lektínové a glykánové biočipy integrované s NAnoštruktúrami“). Vedeckú a technologickú excelentnosť možno dokázať nasledujúcimi výsledkami:

• Konštrukcia elektrochemických lektínových biosenzorov s LOD (limit detekcie) až na úroveň aM (10-18 M) [69-71];

• Príprava imunosenzorov na báze lektínov s LOD = 4 aM v glykoprofilácii proteínov [72];

• Analýza vzoriek sér od pacientov s PCa imunosenzormi v kombinácii s lektínmi [60];

• Úspešná validácia biosenzorov pomocou inštrumentálnych techník [73];

• Príprava glykánových biosenzorov s LOD 1 aM [74,75] na detekciu autoprotilátok;

• Aplikácia DNA aptamérov na detekciu PSA [76,77];

• Príprava selektívnych elektrochemických 2D biosenzorov s použitím zwitteriónov [69,78,79];

• Príprava prepínateľných materiálov, ktoré sa môžu použiť na prekoncentráciu glykánov [80-84];

• Skúmanie elektrochemických vlastností nového 2D nanomateriálu MXénu, použiteľného v analýze glykánov [85-87];

• Príprava ultracitlivého elektrochemického biosenzora s imobilizovaným Tn antigénom (glykán prítomný vo viacerých typoch rakovinových ochorení) [88];

• Pokročilá glykoprofilácia HER2 pre možnú diagnostiku rakoviny prsníka [67];

• Inovatívna analýza 2 000 dátových bodov pomocou umelých neurónových sietí/strojového učenia [89];

• Pozvaný prehľadový článok „Glycan-modified interfaces in biosensing...“ (Curr. Opin. Electrochem.) [90];

• Pozvaný prehľadový článok „Electrochemical Impedance Spectroscopy...“ (ChemElectroChem) [91];

• Prehľad stavu poznania v analýze glykánov [66,92-96];

• Prehľad stavu techniky v oblasti detekcie PSA nanobiosenzormi [97];

• Rozsiahly a podrobný článok opisujúci možnosti využitia nanotechnológií v glykomike (Med. Res. Rev.) [21];

• Prehľadový článok sumarizujúci použitie elektrochemických biosenzorov v biomedicíne (Chem. Rev.).

Tím pracuje na diagnostike karcinómu prostaty v rámci grantu ERC Proof of Concept č. 825586 (2018-2020, „Nové protokoly detekcie pre diagnostiku rakoviny prostaty“) s nasledovnými výsledkami:

• Pozvaný prehľadový článok „Glycomics of prostate cancer: updates“ (Exp. Rev. Proteomics) [29];

• Pozvaný prehľadový článok „Prostate-specific antigen glycoprofiling as diagnostic …“ (Interface Focus) [28];

• Pozvaný prehľadový článok „2D MXenes as Perspective Immobilization Platforms for Design of Electrochemical Nanobiosensors“ (Electroanalysis) [98];

• Biosenzor pre glykoprofiláciu PSA s použitím magnetických častíc [61].

javascript:void(0)javascript:void(0)


V tomto projekte sa zameriame na vývoj elektrochemických biosenzorov na báze uhlíkových elektród, ktoré majú mnohé užitočné vlastnosti vrátane možnosti analýzy v multiplexnom formáte [99,100]. Povrch elektródy bude modifikovaný pomocou hydrogélových 3D vrstiev [101-103] odolných voči nešpecifickým interakciám proteínov z komplexných vzoriek, akými sú séra od zdravých jedincov a pacientov s PCa. Alternatívne sa glykoprofilácia proteínov uskutoční v iných formátoch, vrátane ELISA, MELLA, fluorescenčných „microarray“, SPR a LFA.

Excelentnosť práce v skupine možno dokumentovať úspešnou prácou na ERC Consolidator grant (2013-2017), ktorá bola zameraná na využití nanotechnológií v glykomike. Najlepšie výsledky získané počas riešenia ERC Consolidator grantu boli potom základom pre prípravu grantu ERC Proof of Concept (2018-2020) so zameraním na aplikáciu formátu testu MELLA pre glykoprofiláciu PSA. Takže excelentnosť projektu nie je opodstatnená len z národného hľadiska, ale z medzinárodného hľadiska, pretože agentúra ERC financuje iba návrhy projektov na rozhraní súčasných poznatkov.

F Inovatívnosť projektu

Pre vysoko robustnú a presnú diagnostiku rakoviny nebude postačovať uskutočniť analýzu len jedného typu biomolekúl, akými sú proteíny, ale bude potrebné kombinovať viacero typov analytov, napr. analýzu hladín viacerých proteínov v sére s analýzou voľne cirkulujúcej DNA [18]. Analýza glykánov sa stáva akceptovateľným biomarkerom rakoviny, čo je fakt zdokumentovaný v mnohých prácach [19,28,29]. Navyše jeden kit založený na

analýze glykánov t.j. frakcie -fetoproteínu (AFP) viažuceho sa na lektín Lens culinaris aglutinín (AFP-L3%) je už schválený FDA pre diagnostiku hepatocelulárneho karcinómu (https://www.fda.gov/media/71067/download). Okrem toho, ďalší kit na stanovenie glyko profilu pečene založený na elektroforetickej detekcii glykánov je dostupný ako nástroj na stratifikáciu rizika pre chronické ochorenia pečene.

Aj keď už existuje jedna firma Exosome Diagnostics zameraná na vývoj PCa diagnostiky s využitím DNA a RNA biomarkerov izolovaných z exozómov, náš prístup založený na špecifickom glykoprofilovaní proteínov izolovaných z exozómov je úplne unikátny.

V tomto projekte by sme chceli identifikovať nové glykánové PCa biomarkery založené na špecifickom glykoprofilovaní vybraných proteínov buď prítomných v sére alebo v exozómoch. Použijeme inovatívne detekčné stratégie s rôznymi formátmi analýzy, ako je znázornené na Obr. 4 - glykoproteín alebo exozóm môže byť afinitne obohatený magnetickými časticami a celý komplex bez uvoľneného glykoproteínu/exozómu bude inkubovaný s rozhraním modifikovaným lektínom; v našej nedávnej štúdii to viedlo k výraznému zvýšeniu citlivosti elektrochemického biosenzora, ale princíp môže byť aplikovaný aj na zvýšenie citlivosti optických signálov pomocou enzýmových značiek. Budeme integrovať rôzne meracie protokoly pre takéto glykoprofilácie pomocou ELISA s využitím lektínov, MELLA, „microarray“ techniky s integráciou protilátok a lektínov, elektrochémie, SPR a LFA (testy podobné tehotenskému, Obr. 5).

Obr. 4: Modifikácia Au elektródy (horný rad) s použitím derivátu karboxybetaínu (CB) a lektínu (SNA-I). V prvom kroku sa pomocou cyklickej voltametrie vytvorila SAM vrstva obsahujúca karboxybetaín a následne sa použila na kovalentnú imobilizáciu lektínu. Spodný riadok ukazuje MP@silika@Au (magnetické nanočastice pokryté tenkou vrstvou silica a nakoniec tenkou vrstvou zlata) kompozitom spontánne modifikovaným CB derivátom a následne protilátkou (Ab, anti-fPSA, chemicky derivatizovaná). Po obohatení fPSA (voľná PSA forma) z ľudskej vzorky s použitím MP@silika-Au/CB/Ab a permanentného magnetu bol pripravený sendvič a signál bol vyhodnotený elektrochemicky. Prevzaté z nášho článku [61].

Výsledky získané vo forme klinických parametrov sa budú porovnávať s najlepšími klinickými kitmi na diagnostiku PCa už schválenými FDA alebo ktoré sú v súčasnosti vo vývoji: Beckman Coulter (AUC=0,73; analýza proteínov PSA, fPSA, pro2PSA), OPKO Health (AUC=0,82, analýza proteínov tPSA, fPSA, iPSA, hK2), Hologic Inc. (AUC=0,72, analýza mRNA (PCA3)), Exosome Diagnostics (AUC=0,77; analýza DNA a RNA v exozómoch), University of Michigan (AUC=0,88; analýza PSA, PCA3, mRNA) a Chronix. Biomedical (AUC=0,86; sekvenovanie génov s použitím bezbunkovej DNA). Mnohé z týchto kitov sú zložité a drahé.

https://www.fda.gov/media/71067/downloadhttp://www.helena-biosciences.com/en/clinical-electrophoresis/v8-nexus/tests/glyco-liver-profile/http://www.helena-biosciences.com/en/clinical-electrophoresis/v8-nexus/tests/glyco-liver-profile/http://www.exosomedx.com/our-technology


Ambíciou projektu spolu so súčasne riešeným grantom ERC Proof of concept je ukázať značný klinický potenciál PCa biomarkerov na báze detekcie glykánov.

Obr. 5: Schéma zariadenia na imunoanalýzu vo formáte LFA (vľavo). a) Na vzorkovaciu podložku sa aplikuje vzorka, konjugačná podložka poskytuje činidlá a detekčné molekuly, zatiaľ čo inkubačná a detekčná zóna má testovacie a kontrolné zóny na detekciu analytu a na potvrdenie funkčnosti testu s poslednou absorpčnou podložkou, ktorá „ťahá“ kvapalinu naprieč celým zariadením). b) Test začína pridaním kvapalnej vzorky. c) Protilátky konjugované s farebnými nanočasticami sú potrebné na väzbu analytu. d) Protilátky konjugované s nanočasticami s naviazaným analytom sa dostanú na testovaciu líniu (pozitívny výsledok) a protilátky konjugované s nanočasticami sa viažu na kontrolnú líniu na potvrdenie funkčnosti zariadenia. Snímka prevzatá z Mark et al., 2010 [104]. Proces prípravy LFA testov v našom laboratóriu - montáž jednotlivých častí do plastovej kazety (uprostred) a úspešne aplikovaný test (vpravo).

G Pracovné činnosti (aktivity a časový harmonogram)

Tím Chemického ústavu SAV je zložený z jedného doktora vied (), 6 postdokov a samostatných vedeckých pracovníkov () a 4 Ph.D. študentov ()., zodpovedný riešiteľ projektu, získal titul Ph.D. v odbore biotechnológia na STU a DrSc. v oblasti analytickej chémie na Slovenskej akadémii vied za prácu na vývoji a aplikácii bioanalytických zariadení v biotechnológii, biomedicíne a v oblasti výskumu rakoviny. Je autorom 110+ dokumentov indexovaných v ISI s viac ako 3000 citáciami a h=31. Má viac ako 20-ročné odborné znalosti v oblasti využívania analytických techník a viac ako desaťročné skúsenosti s vývojom bioanalytických technológií pre biomedicínu a vo výskume rakoviny. Členovia tímu budú zapojení v projekte nasledovne: ...: koordinácia experimentálnej práce, návrh analytickej časti experimentov, príprava publikácií, školiteľ; (39 publikácií, 734 citácií h=16): zástupca zodpovedného riešiteľa, aplikácia formátu ELISA a biočipov pre lekársku diagnostiku, purifikácia exozómov a klinické hodnotenie biomarkerov PCa; ... (21 publikácií, 100+ citácií, h=5): pokročilé techniky elektrochemickej charakterizácie, návrh elektrochemických biosenzorov a rozhraní; ... (13 publikácií, 22 citácií, h=4): pokročilé spracovanie údajov pomocou neurónových sietí a strojového učenia; ... (5 publikácií, 5 citácií, h=2): formáty optických testov (SPR, ELISA, MELLA a LFA), ... (20 publikácií, 246 citácií, h=10): vývoj optických (LFA) a elektrochemických formátov; ... (50 publikácií, 650+ citácií, h=18): finančný manažér; lektínová glykoprofilácia rôznych proteínov a bunkových línií. ... (laboratórna manažérka) budú zodpovední za vykonávanie základných experimentov, prípravu a aplikáciu rôznych rozhraní v bioanalýze a pri príprave vzoriek.

Tím Biomedicínskeho centra SAV (BMC SAV) je tvorený: ... (29 publikácií, 1000 citácií, h=17) so 14-ročnými skúsenosťami v oblasti farmakológie, toxikológie, kardiovaskulárnej a renálnej fyziológie so zameraním na skúmanie vzťahu medzi fyzikálno-chemickými vlastnosťami nanočastíc a ich distribúciou, akumuláciou a biologickou odozvou vrátane nanotoxicity v živých organizmoch; ... (90 publikácií, 1035 citácií, h=15), vedúcou vedeckou pracovníčkou, ktorá má bohaté skúsenosti v oblasti bunkovej a molekulárnej biológie, genetickej toxikológie a nanotoxikológie, mutagenézy a karcinogenézy v štúdiách in vitro/ex vivo; ... (35 publikácií, 900 citácií, h=15), vedúcou vedeckou pracovníčkou, ktorá sa zaoberá štúdiom chemoprotektívnych a antioxidačných účinkov prírodných zlúčenín s ich potenciálnym využitím pri prevencii závažných ochorení, vrátane rakoviny, alebo ako prostriedok v liečbe rakoviny; a bezpečnosti nanomateriálov; ... (31 publikácií, 400 citácií, h=14), vedeckou pracovníčkou zameranou na intravitálne zobrazovanie ako nástroj na štúdium rôznych udalostí bunkovej biológie; na štúdium interakcií nano:bio v rôznych experimentálnych systémoch.

Výskumný tím je multidisciplinárny, má rozsiahle teoretické vedomosti a experimentálne zručnosti v oblasti materiálovej chémie, (bio)analytickej chémie, nanotechnológií, glykomiky, elektrochémie, imunoanalýz, proteomiky, glykoproteomiky, aplikácie metód založených na inštrumentálnej analýze (MS, elektroforéza, chromatografia), molekulárnej biológie, bunkových kultivácií a charakterizačných metód potrebných na medzifázové vyšetrovanie modifikovaných rozhraní (mikroskopia atómových síl (AFM), povrchová plazmová rezonancia (SPR), skenovacia elektrónová mikroskopia (SEM), Fourierova transformačná infračervená spektroskopia (FTIR), X-ray Fotoelektrónová spektroskopia (XPS), meranie kontaktného uhla, meranie zeta potenciálu, Ramanova spektroskopia a „Quartz Crystal Microbalance“ (QCM)). Všetci


členovia majú potrebné zručnosti na riešenie biochemických, medicínskych, chemických, biologických a analytických problémov týkajúcich sa riešenia predmetného projektu.

Plánujeme spoluprácu s najmenej dvoma klinickými partnermi, ktorí nám poskytnú vzorky čerstvého moču a vzoriek sér, ktoré budú okamžite po odobraní spracované na izoláciu exozómov, ktoré budú následne uskladnené. Každá vzorka séra sa rozdelí na dva alikvoty - jeden sa spracuje na získanie exozómov a druhý sa uskladní vo forme séra pri teplote -80 ° C na neskoršie použitie.

Aktivita 1 (M1-M12): Identifikácia protilátok a lektínov na glykoprofiláciu PAP a ZAG

Úlohy

• T1.1 Identifikácia protilátok na selektívnu izoláciu glykoproteínu (PAP, ZAG) zo séra získaného v spolupráci s klinickými partnermi na Slovensku (prof. Fillo - urológ z Fakultnej nemocnice UK) a prof. Švihra - urológ z Jesseniovej Lekárske fakulty v Martine) alebo v zahraničí;

• T1.2 Voľba lektínov a anti-glykánových protilátok so špecificitou voči glykánom

asociovaným s rakovinou, akými sú fukóza, „core“ fukóza, kyselina 2,6-sialová,

kyselina 2,3-sialová, rozvetvené glykány, atď.; v projekte použijeme nové lektíny produkované rekombinantnou technológiou skupiny prof. Wimmerovej (CEITEC Brno), Prof. Imberty (CERMAV-CNRS) a Prof. Wiltschi (Univerzita v Grazi);

• T1.3 Výber správnej kombinácie protilátka/lektín alebo protilátka/anti-glykánová protilátka párov pre PAP alebo ZAG prítomných v sére; To je dôležité, pretože protilátka sa môže viazať v blízkosti glykánového epitopu na povrchu glykoproteínu, čo môže následne kompromitovať väzbu lektínu.

Bude testovaných niekoľko typov protilátok s použitím proteínových štandardov pre schopnosť špecificky sa viazať na dva proteíny PAP a ZAG spôsobom, ktorý umožní následné naviazanie lektínov na takéto proteíny. Pre takéto experimenty sa použije povrchová plazmová rezonancia (SPR) alebo „Quartz Crystal Microbalance“ (QCM). Takéto techniky tiež umožnia detekciu afinitnej konštanty (pevnosť väzby) protilátky voči proteínom na selekciu protilátok s vysokou afinitou konštantou. Lektíny budú vybrané na základe preferencie viazať glykány, ktoré sú rozdielne exprimované u ľudí s rakovinou, ako je to definované v časti A. Prednostne sa použijú lektíny rastlinného pôvodu [105], ale aj rekombinantne exprimované lektíny alebo umelé lektíny pripravené s použitím nekanonických aminokyselín (pozri vyššie). Glykoprofilácia proteínov sa bude vykonávať s použitím elektrochémie, SPR, fluorescenčných mikročipov, LFA, ELISA na báze lektínov alebo vo formáte MELLA, ako je bližšie špecifikované v časti B. Sme oboznámení so všetkými týmito technikami a experimentálnymi postupmi, ako je opísané v zozname našich publikácií v časti E.

Už sme sa oboznámili s 3D štruktúrou troch hlavných glykoproteínov, ktoré majú byť glykoprofilované v projekte, s identifikáciou počtu glykozylačných miest pomocou informácií poskytnutých databázou PDB a databázou Uniprot (Obr. 6). Sme si vedomí, že v prípade ZAG proteínu obsahujúceho 4 N-glykozylačné miesta by bolo potrebné testovať niekoľko protilátok rozpoznávajúcich rôzne peptidové epitopy, aby sa umožnilo následné efektívne viazanie lektínu.

Obr. 6: 3D štruktúra kľúčových proteínov, ktoré budú glykoprofilované ako potenciálne PCa biomarkery: PSA s 261 aminokyselinami a obsahujúci 1 N-glykán (69) a 1 O-glykán (125) (vľavo); PAP s 386 aminokyselinami a obsahujúci 3 N-glykány (94, 220 a 333) (v strede) a ZAG s 298 aminokyselinami a obsahujúce 4 N-glykány (109, 112, 128 a 259) (vpravo). 3D obrázky proteínov boli pripravené z pdb súborov s použitím Swiss PDB Viewer [106]. V obrázku sú uvedené glykánové štruktúry.

Na efektívne a spoľahlivé spracovanie testovacích prúžkov LFA budeme potrebovať dávkovač/nanášač reagencií, ktorý bude zakúpený z projektu.

Aktivita 2 (M3-M24): Výber postupov obohatenia exozómov s použitím bunkových línií

Úlohy

• T2.1 Výber protokolov na purifikáciu exozómov s použitím tradičných metód, t.j. metód fyzickej separácie, ako je ultracentrifugácia, ultrafiltrácia, chromatografia, precipitácia atď. [52]; afinitné interakcie s biorozpoznávacími sondami, akými sú protilátky, DNA aptaméry, lektíny alebo proteíny rozpoznávajúce lipidy na povrchu exozómov [46-51], ktoré budú prednostne imobilizované na komerčných magnetických časticiach alebo hybridných nanomateriálov obsahujúcich magnetické častice pripravené spolupracujúcimi partnermi, ako je opísané v našej nedávnej publikácii [61];

https://www.zzz.sk/zariadenie/375-urologicka-ambulancia-doc-mudr-juraj-fillo-phdhttps://www.jfmed.uniba.sk/kontakt/?tx_unibausers_pi1%5Bperson%5D=svihra1https://www.jfmed.uniba.sk/kontakt/?tx_unibausers_pi1%5Bperson%5D=svihra1https://www.ceitec.eu/glycobiochemistry-michaela-wimmerova/rg20http://cvscience.aviesan.fr/cv/1829/anne-imbertyhttp://dk.uni-graz.at/index.php?item=supervisors_details&id=37https://www.rcsb.org/https://www.uniprot.org/


a rôzne komerčné separačné kity [46,51]; Identifikácia vhodných komerčných súprav na lýzu exozómov so separáciou membránovej a rozpustnej frakcie; Táto úloha sa bude vykonávať najmä prostredníctvom prieskumu literatúry;

• T2.2 Validácia metód purifikácie exozómov identifikovaných v T2.1 s použitím bunkových prostatických línií vrátane bunkových línií rakovinových buniek, akými sú bunkové línie LNCap, VCaP, PC-3, 22Rv1 a imortalizovaná bunková línia PNT1A normálneho epitelu prostaty; Táto úloha bude realizovaná v spolupráci so skupinou ... (Bomedicínske centrum SAV, BMC SAV). Plánujeme zakúpiť laminárny box a CO2 inkubátor na kultiváciu bunkových línií.

V prvej etape implementácie aktivity identifikujeme najsľubnejšie stratégie purifikácie exozómov založených na fyzikálnych separačných metódach a implementácii afinitných interakcií štúdiom literatúry. Najsľubnejšie budú testované na izoláciu exozómov z bunkových línií prostaty, ako sú LNCap, VCaP, PC-3, bunkové línie 22Rv1 a imortalizovanú bunkovú líniu v spolupráci s partnerom projektu - skupinou ... (Centrum biomedicínskeho výskumu SAV, BMC SAV). Táto skupina bude nielen kultivovať bunky, ale bude poskytovať rozsiahlu charakterizáciu buniek pomocou štandardných a pokročilých nástrojov molekulárnej biológie. Určíme veľkosť exozómov, zeta potenciál a počet exozómov s využitím „Nanosight Nanoparticle Tracking Analysis” (prístroj zakúpený v projekte), elektrónovej mikroskopie, mikroskopie atómových síl alebo prietokovej cytometrie, ako je diskutované v nedávnych prehľadových článkoch [107,108]. Budeme ich krížovo overovať a v ďalšej práci prijmeme metódu, ktorá je rýchla, spoľahlivá a nákladovo efektívna (s najväčšou pravdepodobnosťou Nanosight Nanoparticle Tracking Analysis, ako je to ukázané v nedávnej práci [46]). Exozómy budeme charakterizovať aj stanovením celkového obsahu proteínov.

Tiež budeme optimalizovať spôsob lýzy exozómov na produkciu membránových a rozpustných frakcií s použitím rôznych komerčne dostupných kitov. V súčasnosti už máme predbežné výsledky s charakterizáciou afinity intaktných prostatických exozómov (komerčne dostupných) voči protilátke rozpoznávajúcej exozomálny povrchový proteín pomocou SPR (Obr. 7).

Obr. 7: Imobilizácia protilátky interagujúcej s exozomálnym povrchovým proteínom na SPR čip (vľavo) a SPR senzorgram väzby exozómov na modifikovaný SPR čip (vpravo).

Aktivita 3 (M15-M40): Aplikácia optimálnych postupov obohacovania exozómov na ich izoláciu z moču a séra

Úlohy

• T2.3 Implementácia purifikácie exozómov z moču získaného s alebo bez masáže prostaty, pretože analýza v moči sa považuje za neinvazívny postup v spolupráci s klinickými partnermi (ktorí poskytnú čerstvé vzorky moču);

• T2.4 Izolácia exozómov zo vzoriek séra v spolupráci s klinickými partnermi (poskytnutím čerstvých vzoriek séra).

Aby sme dokončili túto aktivitu, budeme potrebovať schválenie Etickou komisiou, ktorá nám umožní realizovať takéto experimenty. V súčasnosti sme už nadviazali spoluprácu s doc. Fillom (urológ vo Fakultnej nemocnici UK) a prof. Švihrom (urológ Jesseniovej Lekárskej fakulty v Martine) a budeme hľadať podporu ďalších urológov hlavne v Bratislave, keďže budeme potrebovať veľmi rýchle spracovať vzorky moču a séra, aby sme izolovali exozómy v deň odberu vzoriek. Exozómy (alebo exozomálna membránová a rozpustná frakcia) sa budú skladovať pri teplote -80 ° C, kým nezhromaždíme počet vzoriek dostatočný na implementáciu aktivity 5.

Aktivita 4 (M13-M44): Glykoprofilácia proteínov zo séra + vyhodnotenie klinických parametrov

Úlohy

• T3.1 Glykoprofilácia PAP a ZAG v sérach, ktoré už máme k dispozícii alebo ktoré získame od klinických partnerov;

• T3.2 Hodnotenie klinických parametrov testov vykonaných v T3.1 vo forme ROC kriviek s určením citlivosti, špecificity, presnosti a AUC (plocha pod ROC krivkou) pre proteíny prítomné v sére (PAP a ZAG);

http://www.biomedcentrum.sav.sk/oddelenia/oddelenie-nanobiologie/#1511872381824-902b5256-2d98https://www.zzz.sk/zariadenie/375-urologicka-ambulancia-doc-mudr-juraj-fillo-phdhttps://www.jfmed.uniba.sk/kontakt/?tx_unibausers_pi1%5Bperson%5D=svihra1https://www.jfmed.uniba.sk/kontakt/?tx_unibausers_pi1%5Bperson%5D=svihra1


• T3.3 Kombinácia glykánových biomarkerov identifikovaných v T3.2 s/bez iných biomarkerov na báze proteínov, ako je hladina PSA, fPSA% (percento voľnej formy PSA), úroveň fPSA a identifikácia najlepších PCa biomarkerov pre včasnú diagnostiku PCa.

Najlepšie protilátky identifikované v aktivite 1 a vybrané lektíny budú aplikované na glykoprofiláciu proteínov (ZAG a PAP) prítomných vo vzorkách séra (až do 100 vzoriek) s použitím rôznych testovacích protokolov. Takéto testy sa použijú na nájdenie perspektívnych lektínov, ktoré budú schopné detegovať zmeny glykánov na proteínoch (PAP a ZAG) súvisiacich s rakovinou. Výsledkom tejto aktivity bude zoznam klinických parametrov, zadefinovaných v časti B pre každú kombináciu protilátka-proteín-lektín.

Aktivita 5 (M19-M48): Glykoprofilácia proteínov prítomných v exozómoch izolovaných z moču a sér + vyhodnotenie klinických parametrov

Úlohy

• T3.4 Glykoprofilácia proteínov z exozómov v spolupráci s klinickými partnermi (poskytnú čerstvé vzorky moču a séra); pre výber protilátok a lektínov pozri T1.1, T1.2 a T1.3;

• T3.5 Hodnotenie klinických parametrov z úlohy T3.4 vo forme ROC kriviek s identifikáciou citlivosti, špecificity, presnosti a AUC pre proteíny izolované z exozómov (PSA, PAP, ZAG, ACG a G3BP);

• T3.6 Kombinácia rôznych glykánových biomarkerov identifikovaných v úlohe T3.5 s/bez iných biomarkerov na báze proteínov, ako je hladina PSA, fPSA% (percento voľnej formy PSA), úroveň fPSA a identifikácia najlepších biomarkerov PCa pre včasnú PCa diagnostiku.

Viac informácii je uvedených v Aktivite 4, kde bude namiesto dvoch proteínov PAP a ZAG glykoprofilovaných päť rôznych proteínov izolovaných z exozómov (PSA, PAP, ZAG, ACG a G3BP), ako je uvedené v časti A.

H Výsledky projektu

Očakávame, že budeme testovať niekoľko protilátok (2-5) v kombinácii s niekoľkými lektínmi (5-10) na glykoprofiláciu každého proteínu pomocou niekoľkých detekčných schém - elektrochemických, ELLA, MELLA, fluorescenčných mikročipov, SPR a LFA. Hlavným predpokladom pre výber vhodnej protilátky je mať protilátku, ktorá sa bude viazať na epitop na proteíne, ktorý je odlišný od glykánového epitopu, tak aby nebol kompromitovaný prístup lektínu pre väzbu s glykánom. Prvým výsledkom projektu budú informácie, ktoré protilátky možno kombinovať s lektínmi pre každý konkrétny proteín.

Druhým výsledkom projektu bude optimálny postup purifikácie exozómov na izoláciu exozómov bohatých na biomarkery na báze glykoproteínov súvisiacich s PCa.

Tretím projektovým výstupom bude klinická validácia s cieľom identifikovať, ktoré lektíny majú najlepší potenciál na identifikáciu zmien glykánov súvisiacich s rakovinou na všetkých skúmaných proteínoch v projekte. Takáto klinická validácia poskytne klinické parametre, akými sú citlivosť, špecificita, presnosť, AUC, atď. pre každú konkrétnu kombinovanú protilátku-proteín-lektín.

Výsledky riešenia projektu budú prezentované v priebežných projektových vedeckých odborných správach, na konferenciách/prezentáciách a vo vedeckých publikáciách. V dôsledku realizácie projektu sa predpokladá vytvorenie nasledujúcich výsledkov projektu:

1. odborné publikácie; cieľom je 3-6 publikácií vo vysoko impaktovaných/prestížnych časopisoch;

2. publikácie v zborníkoch konferencií; cieľom je šíriť výsledky akademickej komunite; cieľ je 5-10 príspevkov;

3. Knihy a knižné kapitoly; prezentovať výsledky výskumu v kontexte najmodernejších vedeckých prístupov aj pre vysokoškolských študentov; cieľom je 1-2 kníh alebo knižných kapitol;

4. Konferenčné prednášky; cieľom je šíriť výsledky z rôznych experimentov kolegom, ktorí pracujú v podobných disciplínach vo forme prednášok na konferenciách; cieľom je 3-6 ústnych konferenčných prednášok;

5. prezentácie posterov; cieľom je šíriť niektoré cenné výsledky tým, ktorí pracujú v podobných disciplínach prítomných na konferenciách; cieľom je prezentovať 5-10 posterov;

6. Dátové sady; prezentovať údaje vo forme elektronických podporných informácií (Electronic Supporting Material) pre konkrétny publikovaný článok.

I Prínosy projektu

Očakávané spoločenské a iné prínosy, komerčné využitie výsledkov projektu, udržateľnosť výsledkov projektu možno zhrnúť takto:

7. Patentové prihlášky, niektoré z najsofistikovanejších/nových výstupov počas práce na projekte budú obsiahnuté v patentovej prihláške/prihláškach; cieľom je 0-3 patentových prihlášok;

8. Tvorivé výstupy, t.j. prezentácia zrozumiteľná aj pre ne-odborníkov/verejnosť prostredníctvom webu Atlas of Science (http://atlasofscience.org/ultrasensitive-detection-and-glycan-analysis-of-a-prostate-cancer-biomarker/); cieľ:1-3 tvorivé práce;

http://atlasofscience.org/ultrasensitive-detection-and-glycan-analysis-of-a-prostate-cancer-biomarker/http://atlasofscience.org/ultrasensitive-detection-and-glycan-analysis-of-a-prostate-cancer-biomarker/


9. Verejne dostupná správa o dokončenom projekte; cieľom je šíriť výsledky pre grantovú agentúru a iné organizácie; cieľom je 1-2 verejné správy týkajúce sa dokončeného projektu a jeho výsledkov;

10. šírenie výsledkov v médiách; uľahčiť informovanosť verejnosti o výsledkoch získaných v projekte; cieľ je 1-3 výstupy pre médiá na šírenie výsledkov projektu;

11. Udržateľnosť projektu; pripraviť 1-2 národných/medzinárodných projektových návrhov na pokračovanie v práci začatom v tomto projekte;

12. Komercializácia výsledkov; budeme hľadať komerčný potenciál kitov na základe najlepších biomarkerov na báze analýzy glykánov pre PCa z hľadiska klinických parametrov prostredníctvom start-upu Glycanostics Ltd., ktorý má dohodu o spolupráci s ChU SAV.

13. Zapojenie študentov; plánujeme zapojiť do projektu niekoľko študentov počas ich práce v rámci bakalárskeho a magisterského stupňa štúdia, ako aj počas PhD. práce (v súčasnosti 4 doktorandi, ktorí sú uvedení v časti G).

J Iné realizované projekty v danej oblasti

1. Projekt APVV Názov projektu: Príprava nanoštruktúrovaných povrchov, ich integrácia s bioelementmi a následné využitie Číslo projektu: APVV-0282-11 Zodpovedný riešiteľ: Trvanie: 07/12 – 12/15 Rozpočet: 193 000 Eur Popis: Pripravili sme ultrasenzitívne lektínové biosenzory na analýzu sér zdravých ľudí, ako aj ľudí s reumatoidnou artritídou a systémovou sklerózou. Lektínové biosenzory boli tiež použité na analýzu intaktných buniek línií myšej leukémie. Niektoré z týchto biosenzorov sú stále medzi najcitlivejšími biosenzormi na analýzu glykoproteínov opísaných v literatúre s detekčným limitom (LOD) až na úroveň (10-18 M). 2. ITN project/projekt – FP7: FP7-PEOPLE-2012-ITN, Názov projektu: Diagnostika rakoviny: Paralelná detekcia biomarkerov rakoviny prostaty Číslo projektu: 317420 Zodpovedný riešiteľ na ChU SAV: Trvanie: 10/12 – 09/16 Rozpočet: Celkovo 4 006 852 Eur, pre ChU SAV 429 653 Eur Popis: Spolupráca s 8 inštitúciami v rámci EÚ na vývoj nových bioanalytických prístupov pre diagnostiku rakoviny prostaty. V projekte sme sa zamerali na vývoj špecifickej glykoprofilácie PSA, ktorý je PCa biomarkerom. Takýto prístup má potenciál v budúcnosti zvýšiť citlivosť aj špecifickosť diagnostiky rakoviny prostaty (v súčasnosti prebiehajú ďalšie štúdie). Spočiatku sme vyvinuli imunosenzory na báze lektínu s imobilizovanými protilátkami na selektívne viazanie PSA z komplexnej vzorky, ako je ľudské sérum, s konečnou inkubáciou imunosenzora s lektínmi (proteíny viažuce glykán). Vyvinutý elektrochemický biosenzor patrí k najcitlivejším biosenzorom PSA, ktorý sa doteraz vyvinul s LOD = 4 aM. Zároveň by sa mohla z takej nízkej koncentrácie PSA uskutočňovať glykoprofilácia PSA pomocou lektínov. 3. ERC Starting projekt – FP7 projekt, FP7-IDEAS-ERC Názov projektu: Elektrochemické lektínové a glykánové biočipy integrované s nanoštruktúrami Číslo projektu: 311532 Zodpovedný riešiteľ: Trvanie: 01/13 - 12/17 Rozpočet: 1 155 940 Eur Popis: Hlavným cieľom projektu bolo integrovať nanočastice pre vývoj rôznych lektínových biosenzorov a biočipov vrátane AuNP, grafénu, grafénového oxidu, MXénu, uhlíkových nanotrubičiek, kvantových bodiek, magnetických nanočastíc atď. Výsledky naznačujú, že aplikácia nanočastíc je veľmi dôležitá v oblasti glykomiky na stanovenie viacerých analytov (glykoproteíny, autoprotilátky, proteíny, vírusy chrípky atď.), na efektívne obohatenie analytov z komplexných vzoriek pomocou magnetických mikročastíc a na ultrazvukovú elektrochemickú detekciu redoxných molekúl (H2O2). Vyvinutý glykánový biosenzor patrí k najcitlivejším biosenzorom vyvinutým zatiaľ na detekciu hemaglutinínov izolovaných z chrípkových vírusov na analýzu inaktivovaných, ale nepoškodených chrípkových vírusov a protilátok proti aberantným glykánom. 4. Qatar Science Foundation projekt Názov projektu: Príprava, charakterizácia a aplikácie lektínových biočipov v diagnostike rakoviny a v objave biomarkerov rakoviny Číslo projektu: #NPRP-6-381-1-078 Zodpovedný riešiteľ na ChU SAV: Trvanie: 01/14 - 02/17 Rozpočet: Celkovo 1 015 915 USD, pre ChU SAV 354 740 USD Popis: V projekte sme sa zamerali na analýzu zmenenej glykánovej kompozície na prostatickom špecifickom antigéne (PSA), ktorý je biomarkerom rakoviny prostaty. Zaviedli

https://www.glycanostics.com/


sme bioanalytické prístupy na báze lektínov na glykoprofilovanie proteínov, ako je protokol na detekciu PSA a analýzu glykánového profilu PSA v ľudských sérach. 5. APVV projekt Názov projektu: Glykánové bionanosenzory a bioanalytické zariadenia – ich príprava, validácia a aplikácia v diagnostike rakoviny Číslo projektu: APVV-17-0300 Zodpovedný riešiteľ: Trvanie: 08/18 – 06/22 Rozpočet: 248 000 Eur Popis: V projekte navrhujeme prípravu ultracitlivých biosenzorov a bioanalytických prístrojov s použitím nanočastíc (NP) s imobilizovanými glykánmi založenými na ultracitlivých ampérometrických a optických transdukčných schémach. Analýza sa uskutoční v array formáte vyžadujúcom len malé množstvo reagencií/vzoriek. Zariadenia sa použijú na detekciu autoprotilátok proti aberantným glykánom prítomným v sére pacientov s rôznymi typmi rakoviny. Autoprotilátky proti aberantným glykánom sú prítomné v sérach predtým, než sa môžu zistiť tradičné biomarkery rakoviny a v sére sa vylučujú autoprotilátky pred prvými klinickými príznakmi rakoviny. Napriek rozsiahlemu výskumu v tejto oblasti neexistujú žiadne biomarkery na základe autoprotilátok schválených na diagnostiku rakoviny prsníka/prostaty. Budeme sa snažiť odhaliť skutočný potenciál ultracitlivých zariadení na diagnostiku niekoľkých druhov rakoviny. 6. Proof of concept projekt (ERC) Názov projektu: Nový detekčný protokol pre spoľahlivú diagnostiku rakoviny prostaty Číslo projektu: 825586 Zodpovedný riešiteľ: Trvanie: 10/18 – 09/19 Rozpočet: 149 500 Eur Popis: Tento PoC grant sa zameriava na: 1. predklinickú retrospektívnu validáciu biomarkerov skorého štádia rakoviny prostaty (PCa) a 2. komercializáciu diagnostických kitov pre PCa. Preklinická (60 vzoriek ľudských sér) prebieha a retrospektívna validácia (450 vzoriek ľudského séra) testu sa uskutoční štatistickou analýzou s využitím krivky ROC kriviek (receiver operating characteristic). PoC opisuje všetky kroky, ktoré boli doteraz vyvinuté, a všetky potrebné kroky, ktoré je potrebné vykonať pre retrospektívnu validačnú štúdiu a vývoj produktu. 7. Projekt ITN - FP7-PEOPLE-2012-ITN Názov projektu: Syntetická biológia proteínov viažucich sacharidy: inžinierske interakcie proteín-sacharid pre diagnostiku a bunkové zacielenie Číslo projektu: 814029 Zodpovedný riešiteľ: Trvanie: 10/18 - 09/22 Rozpočet: 429 000 € Popis: Cieľom iniciatívy „Initial Training Network“ je vyškoliť 15 začínajúcich výskumníkov v rozvíjajúcej sa oblasti syntetickej glykobiológie a vybaviť ich zručnosťami potrebnými pre budúcu kariéru v sektore zdravotníckych technológií. Každá živá bunka je pokrytá vrstvou komplexných sacharidov známych ako glykokalyx. Čokoľvek, čo sa blíži bunkovej membráne, musí najprv prejsť cez tento les sacharidov. Interakcie medzi sacharidmi a lektínmi (proteíny viažuce sacharidy) hrajú zásadnú úlohu v bunkovej adhézii a endocytóze. Naše rastúce chápanie glykobiológie a príchod metodík chemickej a syntetickej biológie predstavuje príležitosť na prepracovanie, syntézu a využívanie glykokalyxu a lektínových zložiek pre rôzne analytické, diagnostické a cielené terapeutické aplikácie: toto je oblasť syntetickej glykobiológie.

8. Projekt H2020-EIC-SMEInst-2018-2020: SME Instrument 1 Názov projektu: Inovatívna analýza založená na glykánoch pre diagnostiku rakoviny Číslo projektu: 855423 Zodpovedný riešiteľ: Trvanie: 02/19 - 07/19 Rozpočet: 50 000 € Popis: Výsledkom projektu bude štúdia uskutočniteľnosti a pre náš inovatívny prístup k diagnostike PCa s jasnou stratégiou komercializácie, vrátane vývoja produktov, marketingovej stratégie, interakcie s regulačnými orgánmi a „key opinion leaders“.

9. Projekt Ministerstva zdravotníctva Slovenskej republiky Názov projektu: Včasná diagnostika kolorektálneho a testikulárneho karcinómu glykoprofiláciou Číslo projektu: 2018/23-SAV-1 Zodpovedný riešiteľ: Trvanie: 12/18 - 12/20 Rozpočet: 299 824 € Popis: Hlavným cieľom projektu je nájsť a validovať nové diagnostické biomarkery pre diagnostiku ranných štádií rakoviny semenníkov a kolorektálneho karcinómu. Identifikovali sme proteíny, ktoré by mali mať zmenený glykozylačný stav v dôsledku ochorenia ako


možné diagnostické biomarkery pre oba typy ochorení. Tieto proteíny budú glykoprofilované použitím lektínov našou novo vyvinutou MELLA (magnetická ELISA s využitím lektínov) metódou zahŕňajúcou magnetické nanočastice. Technológia jednoduchým spôsobom s použitím len niekoľkých inkubačných krokov s minimálnou

požiadavkou na ľudské sérum (8 l) špecificky glykoprofiluje glykoproteíny. Okrem metódy MELLA použijeme rôzne techniky, ako napríklad elektrochemické a fluorescenčné biočipy na podporu analýzy vo formáte MELLA. Výsledkom projektu bude zoznam biomarkerov oboch ochorení na báze glykánov s ich klinickými charakteristikami (citlivosť, špecificita a presnosť meraní).

K Analýza rizík

Naša skupina má rozsiahle skúsenosti s realizáciou veľkých projektov a úspešným riešením problémov vznikajúcich pri realizácii projektov. Tím sa stretáva týždenne, keď jeden člen tímu prezentuje nedávny pokrok so zameraním na problémy, ktorým čelil. Táto stratégia umožňuje všetkým členom tímu podávať správy o pokroku/problémoch aspoň raz za 3 mesiace. Na konci stretnutia je navrhovaný akčný plán pre nadchádzajúce obdobie pre prezentujúceho člena tímu. Okrem toho sa budeme pravidelne stretávať s partnerom projektu a klinickými partnermi aspoň raz za 3 mesiace a ad hoc, ak bude potrebné vyriešiť niektoré pálčivé problémy.

V prípade potreby budú stanovené nové ciele na základe nových poznatkov v danej vedeckej disciplíne s dôrazom na dosiahnutie úspešného napredovania projektu. Okrem plánovaných stretnutí, členovia tímu sa budú stretávať so zodpovedným riešiteľom po ukončení navrhovaných experimentov alebo keď čelia akútnym problémom vo svojich experimentoch.

Projekt je rozdelený na niekoľko aktivít s príslušnými úlohami, ktoré sú nezávislé. Takýto prístup minimalizuje riziko, že ak niektorá úloha nebude úplne dokončená, negatívne to ovplyvní plnenie ďalších úloh. Stratégia so spätnou väzbou pri riešení úloh projektu napomôže včas splniť celkové ciele projektu a ušetriť tak vzácne chemikálie, materiály, ľudské zdroje a klinické vzorky. Okrem toho je riziko zmiernené možnosťou použitia mnohých rôznych formátov testov.

L Predpoklad vzniku patentov a stanovisko k otázke duševného vlastníctva

Predpokladáme prípravu patentových prihlášok, pretože PCa diagnostika založená na glykoprofilácii proteínov iných ako PSA je nová a aplikácia exozómov ako bohatého zdroja glykoproteínov je inovatívny prístup s obrovským potenciálom pre PCa diagnostiku. Rozsiahly prehľad literatúry (pozri časť A) skutočne naznačuje, že glykoprofilácia proteínov prítomných v sére alebo v exozómoch s využitím lektínov v kombinácii s naším nedávno vyvinutým formátom testu MELLA môže viesť k patentovateľným výsledkom. Sme pripravení predložiť patentovú prihlášku (prihlášky), pretože sme už nadviazali spoluprácu s nemeckou patentovou firmou Schiweck Weinzierl Koch (Najlepšia európska patentová právna firma - Nemecko & Excellence Award za nemecké patentové právo 2016, ktorá pripravila a podala našu PCT patentovú žiadosť [62].

Sme pripravení využiť najsľubnejšie výsledky, ktoré sme získali pri realizácii projektu prostredníctvom start-up firmy Glycanostics Ltd.

M Informovanosť

Radi by sme šírili výsledky projektu pre: 1. vedeckú obec vo forme recenzovaných publikácií, konferencií a posterových prezentácií; 2. verejnosť vo forme verejných prednášok prezentujúcich výsledky projektu spôsobom, ktorý je pre širokú verejnosť zrozumiteľný pri rôznych príležitostiach; 3. verejnosť v rôznych médiách, ako sú televízia, noviny, časopisy, webové stránky; 4. študentov buď prezentáciou na vysokých školách a stredných školách alebo pri príležitostiach, ako sú Noc výskumníkov a dni otvorených dverí na našom inštitúte; 5. zainteresované strany pôsobiace v oblasti biomedicíny alebo na podujatí organizovanom Ministerstvom zdravotníctva Slovenskej republiky.

Literatúra

(1) Torre, L. A. et al. CA: Cancer J. Clin. 2015, 65, 87. (2) Ferlay, J. et al. Int. J. Cancer 2015, 136, E359. (3) Global Burden of Disease Cancer, C. JAMA Oncol. 2017, 3, 524. (4) Thompson, J. et al. BJU Int. 2013, 112, 6. (5) Boesen, L. et al. Eur. Radiol. 2015, 25, 1776. (6) O’Reilly, J.-A. et al. J. Cancer Treat. Diagnosis 2017, 2, 18. (7) Rodríguez, J. Z. et al. Asian Hosp. Healthc. Manag. 2017, 18. (8) Ablin, R. J. et al. The Great Prostate Hoax: How big medicine hijacked the PSA test

and caused a public health disaster; Palgrave McMillian: United States, 2014. (9) Ablin, R. J. In The Scientist (internet version):

https://www.newscientist.com/article/mg22129564-400-prostate-cancer-test-has-been-misused-for-money/), 2014.

(10) Moyer, V. A. Ann. Intern. Med. 2012, 157, 120. (11) Fleshner, K. et al. Nat. Rev. Urol. 2017, 14, 26. (12) Van Der Kwast, T. H. et al. Nat. Rev. Urol. 2017, 14, 457. (13) Grossman, D. C. et al. JAMA 2018, 319, 1901. (14) Garnick, M. B. et al. Harvard Medical School 2018 Annual Report on Prostate

Diseases; Harvard Health Publishing: Boston, 2018. (15) Umberto, A. et al. Curr. Med. Chem. 2018, 25, 1. (16) Sharma, S. et al. Biotechnol. Adv. 2017, 35, 135.

http://www.ip-matters.de/https://www.glycanostics.com/https://www.newscientist.com/article/mg22129564-400-prostate-cancer-test-has-been-misused-for-money/https://www.newscientist.com/article/mg22129564-400-prostate-cancer-test-has-been-misused-for-money/


(17) Hatakeyama, S. et al. Int. J. Clin. Oncol. 2017, 22, 214. (18) Cohen, J. D. et al. Science 2018, eaar3247. (19) Murphy, K. et al. Mol. Oncol. 2018, 12, 1513. (20) Dalziel, M. et al. Science 2014, 343, 1235681. (21) Dosekova, E. et al. Med. Res. Rev. 2017, 37, 514. (22) Paleček, E. et al. Chem. Rev. 2015, 115, 2045. (23) Pinho, S. S. et al. Nat. Rev. Cancer 2015, 15, 540. (24) Teoh, S. T. et al. Front. Oncol. 2018, 8, 174. (25) Blanas, A. et al. Front. Oncol. 2018, 8, 39. (26) Kailemia, M. J. et al. Anal. Chem. 2018, 90, 208. (27) Munkley, J. et al. Oncotarget 2016, 7, 35478. (28) Tkac, J. et al. Interface Focus 2019, 9, 20180077. (29) Tkac, J. et al. Exp. Rev. Proteomics. 2019, 16, 65. (30) Gerlach, J. Q. et al. Mol. Biosystems 2016, 12, 1071. (31) Williams, C. et al. J. Extracel. Vesicles 2018, 7, 1442985. (32) van Niel, G. et al. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2018, 19, 213. (33) Zhang, H. et al. Nat. Cell Biol. 2018, 20, 332. (34) McKiernan, J. et al. Eur. Urol. 2018, 74, 731. (35) Fredsøe, J. et al. Clin. Chem. 2019, 65, 540. (36) Dong, L. et al. Biochim. Biophys. Acta Rev. Cancer 2019, 1871, 342. (37) Bu, H. et al. ChemBioChem 2019, 20, 451. (38) Vlaeminck-Guillem, V. Front. Oncol. 2018, 8, DOI: 10.3389/fonc.2018.00222. (39) Pegtel, D. M. et al. Annu. Rev. Biochem 2019, 88, 487. (40) Xu, R. et al. Nat. Rev. Clin. Oncol. 2018, 15, 617. (41) Wortzel, I. et al. Developmental Cell 2019, 49, 347. (42) Batista, B. S. et al. J. Proteome Res. 2011, 10, 4624. (43) Liu, T. et al. Int. J. Oncol. 2014, 44, 918. (44) Dhondt, B. et al. Int. J. Biochem. Cell Biol. 2018, 99, 236. (45) Royo, F. et al. Nanoscale 2019, 11, 1531. (46) Freitas, D. et al. J. Extracell. Vesicles 2019, 8, 1621131. (47) Li, P. et al. ACS Sensors 2019, 4, 1433. (48) Cheng, N. et al. Trends Biotechnol. 2019, DOI: 10.1016/j.tibtech.2019.04.008. (49) Gerlach, J. Q. et al. Nanomedicine 2017, 12, 1217. (50) Wang, W. et al. Adv. Health. Mater. 2018, 7, e1800484. (51) Saito, S. et al. Sci. Rep. 2018, 8, 3997. (52) Chen, B. Y. et al. Clin. Chim. Acta 2019, 493, 14. (53) Wu, A. Y. T. et al. Proteomics 2019, 19, 1800162. (54) Padda, R. S. et al. Prostate 2019, 79, 592. (55) Logozzi, M. et al. Cancer Lett. 2017, 403, 318. (56) Kovak, M. R. et al. Andrology 2013, 1, 682. (57) Nyalwidhe, J. O. et al. PROTEOMICS-Clin. Appl. 2013, 7, 677. (58) Pihikova, D. et al. Anal. Chim. Acta 2016, 934, 72. (59) Pihikova, D. et al. Proteomics 2016, 16, 3085. (60) Pihikova, D. et al. Anal.

DODATOK č. 2 ROZPOČTOVEJ KAPITOLY MINISTERSTVA … · 2020. 12. 11. · DODATOK č. 2 k ZMLUVE O POSKYTNUTÍ DOTÁCIE Z ROZPOČTOVEJ KAPITOLY MINISTERSTVA ZDRAVOTNÍCTVA SLOVENSKEJ

Documents