DNA Replication
Replicazione e ricombinazione del DNA
La replicazione semiconservativa Tre modelli proposti per la replicazione del DNA
La replicazione è semiconservativa: ogni frammento di DNA serve da stampo per la sintesi di una nuova molecola di DNA
Esperimento di Meselson e Stahl - centrifugazione in gradiente di densità all’equilibrio per distinguere DNA contenente 14N pesante e DNA 15N più leggero
DEFINIZIONI e TERMINOLOGIA:
Replicone= unità di replicazione con propria origine di replicazione. Origine di replicazione=zona specifica del cromosoma dove le doppia elica si denatura in singoli filamenti, esponendo le basi per la sintesi di nuove eliche. Bolla di replicazione:regione del cromosoma dove il DNA è a singole elica e dal quale la replicazione procede in modo bidirezionale.
Le modalità di replicazione 1. La replicazione teta
Comune in E.Coli e in altri organismi con DNA circolare
3. La replicazione lineare negli eucarioti Requisiti per la replicazione: -stampo di DNA a singolo filamento -substrati da assemblare nel filamento di neoformazione -enzimi e altre proteine che “leggono” lo stampo e assemblano i substrati
La replicazione del DNA batterico - L’INIZIO In E.coli la replicazione ha inizio quando le proteine iniziatrici si legano a oriC, l’origine di replicazione, provocando lo svolgimento di un breve tratto di DNA.
- LO SVOLGIMENTO La DNA elicasi svolge il DNA legandosi al filamento ritardato che funge da stampo a livello di ogni forcella di replicazione e muovendosi in direzione 5’ 3’ lungo il filamento.
- GLI INNESCHI e L’ALLUNGAMENTO La primasi sintetizza brevi tratti nucleotidici di RNA, fornendo un gruppo 3’-OH a cui la DNA polimerasi può aggiungere nucleotidi di DNA.
DNA Polymerase III The "real" polymerase in E. coli
• At least 10 different subunits • "Core" enzyme has three subunits - α, ε, and θ • Alpha subunit is polymerase • Epsilon subunit is 3'-exonuclease • Theta function is unknown • The beta subunit dimer forms a ring around
DNA • Enormous processivity - 5 million bases!
DNA Polymerase I Replication occurs 5' to 3'
• Nucleotides are added at the 3'-end of the strand • Pol I catalyzes about 20 cycles of polymerization before the
new strand dissociates from template • 20 cycles constitutes moderate "processivity" • Pol I from E. coli is 928 aa (109 kD) monomer • In addition to 5'-3' polymerase, it also has 3'-5' exonuclease
and 5'-3' exonuclease activities
- La DNA LIGASI La DNA ligasi chiude l’interruzione lasciata dalla DNA polimerasi I nello scheletro di zucchero-fosfato dopo che quest’ultima ha aggiunto il nucleotide finale.
- LA FORCELLA DI REPLICAZIONE
Modello di replicazione del DNA in E.coli:
le due unità della DNA pol III sono connesse e il filamento ritardato che funge da stampo forma un anello tale che la replicazione possa avere luogo sui due filamenti di DNA antiparalleli.
- LA FEDELTA’ DELLA REPLICAZIONE DEL DNA -selezione dei nucleotidi -correzione di bozze -riparazione dei malappaiamenti
Other Proteins That Assist DNA Replication
• Helicase, topoisomerase, single-strand binding protein
Table 16.1
La replicazione del DNA negli eucarioti
Microfotografia elettronica di DNA eucariotico durante il processo della replicazione: il DNA neosintetizzato è già coperto da nucleosomi
Polimerasi nei Procarioti I Procarioti possiedono cinque tipi di DNA Polimerasi:
• DNA Polimerasi I: implicata nella riparazione del DNA e nella rimozione degli inneschi dei frammenti di Okazaki. Possiede attività esonucleasica sia in direzione 5'->3', sia in direzione 3'->5' • DNA Polimerasi II: indotta da danni al DNA per riparazione incline all'errore (error-prone). Ha attività polimerasica 5'->3' ed esonucleasica 3'->5' • DNA Polimerasi III: l'enzima principale per la replicazione, con attività polimerasica 5'->3' ed esonucleasica (nella correzione di bozze, o proofreading) 3'->5'. Attiva sia nella sintesi del filamento leading, sia in quella dei frammenti di Okazaki. • DNA Polimerasi IV-V: anch'esse coinvolte nella riparazione incline all'errore
Polimerasi negli Eucarioti
Le Polimerasi degli Eucarioti sono costituite invece da:
• DNA Polimerasi α: è una primasi (enzima che sintetizza i primer di RNA) e procede inoltre all'allungamento dei primer con alcune centinaia di deossiribonucleotidi.
• DNA Polimerasi δ: l'enzima principale della replicazione eucariotica. Sintetizza sia il filamento leading, sia il filamento lagging. Riempie inoltre le interruzioni tra i frammenti di Okazaki.
• DNA Polimerasi β: coinvolta nella riparazione del DNA
• DNA Polimerasi γ: replica il DNA mitocondriale
• DNA Polimerasi ε: stessa funzione della Polimerasi δ.
Prokaryotes Eukaryotes 5 polymerases (I, II, III, IV,V) 5 polymerases--α,β,γ,δ,ε I--excision repair, removal of RNA primers α--polymerization
II-repair β--repair γ--mitochondrial
III-main enzyme δ-main enzyme IV,V-repair, special conditions ε--unknown polymerases also exonucleases not all exonucleases 1 Origin of replication many origins
Okazaki fragments 1000-2000 nuc. Okazaki fragments 150-200 nuc.
no proteins on DNA histones
Tipo di organismo Nome scientifico Ripetizione telomerica (direzione 5' -> 3')
Vertebrati Homo sapiens, Mus musculus, Xenopus laevis TTAGGG
Funghi Neurospora crassa, Physarum, Didymium TTAGGG
Protisti Dictyostelium discoideum AG(1-8) Kinetoplastea (protozoi) Trypanosoma, Crithidia TTAGGG
protozoi ciliati
Tetrahymena, Glaucoma TTGGGG Paramecium TTGGG(T/G)
Oxytricha, Stylonychia, Euplotes TTTTGGGG
Apicomplexa Plasmodium TTAGGG(T/C) Piante superiori Arabidopsis thaliana TTTAGGG Alghe verdi Chlamydomonas TTTTAGGG Insetti Bombyx mori TTAGG Anellidi Ascaris lumbricoides TTAGGC Lieviti a scissione binaria Schizosaccharomyces pombe TTAC(A)(C)G(1-8)
Lieviti gemmanti
Saccharomyces cerevisiae TGTGGGTGTGGTG (da stampo RNA) o G(2-3)(TG)(1-6)T (sequenza consenso)
Candida glabrata GGGGTCTGGGTGCTG Candida albicans GGTGTACGGATGTCTAACTTCTT
Candida tropicalis GGTGTA[C/A]GGATGTCACGATCATT
Candida maltosa GGTGTACGGATGCAGACTCGCTT
Candida guillermondii GGTGTAC
Candida pseudotropicalis GGTGTACGGATTTGATTAGTTATGT
Kluyveromyces lactis GGTGTACGGATTTGATTAGGTATGT