1
14
PERAN SEL MAST PADA REAKSI REVERSAL PASIEN KUSTA
Renni Yuniati
Bagian/SMF Ilmu Kesehatan Kulit dan Kelamin
RSUD Lukmonohadi, Kudus, Jawa TengahEmail: [email protected] : Reaksi reversal kusta adalah episode akut dalam perjalanan kronis penyakit kusta yang acapkali berkontribusi terhadap putusnya terapi dan terjadinya kecacatan. Secara klinis timbul keradangan akut pada lesi kulit disertai adanya oedem di sekitar tempat keradangan. Oedem ini menunjukkan adanya ekstravasasi cairan dari pembuluh darah yang mungkin merupakan efek dari histamin dan produk sel mast yang lain.
Tujuan :Tujuan penelitian ini adalah mengetahui keterlibatan sel mast dalam reaksi reversal penyakit kusta. Secara khusus meneliti kaitan Hsp70, TLR4, Histamin, TNF, IL6, IL8 pada jaringan.Metode:Dilakukan pengambilan biopsi jaringan dari 28 pasien reaksi reversal kusta dan 28 pasien non reaksi. Dilakukan pemeriksaan imunohistokimia untuk mengetahui ekspresi Hsp70, TLR4, Histamin, TNF, IL6, IL8 pada jaringan.Hasil:Didapatkan kadar Hsp70, TLR4, Histamin, TNF, IL6, IL8 dalam biopsi jaringan kulit lebih tinggi secara bermakna pada kelompok reaksi (p < 0,05).Pembahasan: Reaksi reversal adalah suatu rangkaian proses yang diawali dengan peningkatan Hsp70yang akan mengaktifkan TLR-4. Selanjutnya TLR-4 akan mengaktifkan sel mast memproduksi histamin, TNF, IL-6, IL-8. Secara klinis hal ini berkaitan dengan timbulnya oedem dan radang akut di daerah lesi reaksi reversal kusta.Kesimpulan:Temuan baru pada penelitian ini adalah ditemukannya jalur baru melalui Hsp70. Peran sel Mast cukup penting dalam terjadinya RR, namun tampaknya masih ada faktor lain yang juga ikut berperan dalam terjadinya RR, kemungkinan seperti capek, obat-obat imunomodulator, dan bakterisidal.
Kata kunci: reaksi reversal, sel mast, HSP70, TLR-4, histamin, TNF, IL-6, IL-8PENDAHULUAN
Indonesia merupakan salah satu negara endemis kusta dan menduduki peringkat ketiga jumlah pasien kusta terbanyak pada tahun 2009 setelah India dan Brazil dengan prevalensi 1,7 per 10.000 penduduk. Pada akhir tahun 2012, dilaporkan sebanyak 20.023 kasus kusta baru di Indonesia. Sekitar 80% dari kasus kusta baru merupakan kusta multibasiler, bentuk infeksius dari kusta yang belum diterapi; 10% dari kasus kusta baru terjadi pada anak-anak yang menunjukkan bahwa penyakit tersebut masih memiliki transmisi tinggi di masyarakat; dan hampir 8% pasienkasus kusta baru mengalami kecacatan yang signifikan.1Kusta merupakan penyakit infeksi kronik yang disebabkan oleh bakteri Mycobacterium leprae yang bersifat obligat intraseluler. Multiplikasi M. leprae bersifat sangat lambat menyebabkan inkubasi penyakit kusta cukup lama (5-7 tahun). Bakteri tersebut awalnya menyerang sel Schwann pada sistem saraf perifer, selanjutnya dapat menyerang kulit, mukosa, saluran pernapasan bagian atas, sistem retikulo-endothelial, mata, otot, tulang, hingga testis. Lesi pada sistem saraf perifer dapat menyebabkan kehilangan fungsi saraf meliputi sensorik, motorik, dan otonom. Lesi pada kulit menyebabkan gangguan integritas dan estetika kulit.2Peran sel mast terhadap proses imuno-inflamasi pada reaksi reversal belum pernah disimpulkan secara detail terkait dengan pemicu sel mast itu sendiri (Hsp70 dan TLR-4), mekanisme kerja, maupun mediator inflamasi yang diproduksi sel mast dalam reaksi reversal kusta. Penelitian lebih lanjut mengenai keterkaitan sel mast terhadap proses inflamasi pada reaksi reversal kusta menjanjikan pemahaman lebih lanjut mengenai reaksi reversal dan kemungkinan pencegahan maupun target terapi baru.
TUJUAN : Tujuan penelitian ini adalah mengetahui keterlibatan sel mast dalam reaksi reversal penyakit kusta. Secara khusus meneliti kaitan Hsp70, TLR4, Histamin, TNF, IL6, IL8 pada jaringanMETODE : Penelitian ini merupakan jenis penelitian observasional analitik dengan rancangan cross sectional karena semua variabel diperiksa pada orang yang sama dan saat pemeriksaannya bersamaan yaitu pada lesi kulit pasien kusta yang sedang mengalami RR dan yang tidak mengalami RR (sebagai pembanding).
Penelitian dilakukan di Poliklinik Kulit dan Kelamin RS Donorojo dan Dinas Kesehatan Kabupaten Jepara mulai bulan Juni 2014 Agustus 2014. Pemeriksaan imunohistokimia dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi dan Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya.Target populasi pada pasien kusta usia 20-60 tahun, pasien kusta yang berkunjung ke Poliklinik Kulit di RS Donorojo Jepara. Sampel yang diteliti adalah mereka yang memenuhi kriteria inklusi dan eksklusi dan dipilih sampai jumlah sampel terpenuhi (consecutiv sampling) Perkiraan besar sampel berdasarkan pengujian hipotesis data kontinyu pada dua sampel 3:Pengambilan sampel biopsi jaringan kulit pada area lesi atau ektensor lengan bawah pasienkusta dilakukan disinfeksi dengan alkohol 70 %. Kemudian dilakukan anstesi lokal dengan Lidocaine 0,25 ml pada area subkutan yang akan dilakukan biopsi. Pada area yang telah dianatesi dilakukan biopsi dengan metode punch berdiameter 3 mm. Jaringan kulit hasil biopsi dimasukkan dalam eppendorf yang berisi larutan formalin 10 % . Pada kulit bekas luka biopsi dilakukan pembersihan dengan larutan NaCl 0,9 % , diberi antibiotika topikal asam fusidat dan ditutup dengan kasa steril Pengecatan Hematoxilen-Eosin sebagai konfirmasi struktural dilakukan dengan cara sebelumnya dilakukan pemrosesan jaringan (fiksasi dan parafinisasi), pemotongan jaringan dengan mikrotom dan kemudian pemulasan.
Pembuatan sediaan histopatologi Pembuatan sediaan parafin blok dengan cara Jaringan dicuci dengan PBS 3-5 x untuk membersihkan dari kontaminan. Kemudian difiksasi pada formalin 10%. Setelah itu dilakukan dehidrasi menggunakan alkohol bertingkat (30%, 50%, 70%, 80%, 96% dan absolut) masing-masing 60 menit. Dilakukan Clearing menggunakan xilol 2 kali masing-masing 60 menit. Kemudian dilakukan infiltrasi dengan parafin lunak selama 60 menit pada suhu 48oC. Kemudian dilakukan block dalam parafin keras pada cetakan dan didiamkan selama sehari. Keesokan harinya ditempelkan pada holder dan dilakukan pemotongan setebal 4-6um dengan rotary microtome. Dilakukan mounting pada gelas objek dengan gelatin 5%.
Proses Deparafinisasi dengan gelas obyek hasil parafin block direndam dalam xilol 2 kali masing-masing selama 5 menit. Setelah itu dilakukan rehidrasi menggunakan alkohol berseri (absolut, 96%, 80%, 70%, 50% dan 30%) masing-masing selama 5 menit. Kemudian dibilas dalam dH2O selama 5 menit.
Proses Pewarnaan Hematoxilen-Eosin dengan Slide dicuci dengan PBS pH 7,4 selama 5 menit. Kemudian diwarnai dengan hematoxilen selam 10 menit.Setelah itu, direndam dalam tap water selama 10 menit. Kemudian dibilas dengan dH2O. Dilakukan dehidrasi dengan alcohol berseri 30% dan 50% masing-masing selama 5 menit. Kemudian diwarnai dengan larutan Eosin selama 3 menit. Setelah itu dibilas dengan alcohol 30%. Dicuci dengan dH2O selama 5 menit dan dikering anginkan. Kemudian dilakukan mounting dengan entelan dan tutup dengan cover glass.Analisisi data dilakukan setelah semua kelompok selesai dilakukan ELISA (pg/mL) dan imunohistokimia serta dihitung jumlah HSP 70, TLR4, sel Mast yang mengekspresikan HSP70, Histamine, IL6, IL8 dan TNFa. Analisis dilakukan menggunakan program spss 17 versi windows, dengan menguji: Uji Distribusi normal menggunakan Kolmogorov-Smirnov: untuk meyakinkan bahwa sampel berasal dari populasi yang terditribusi normal dan Uji Beda menggunakan uji t 2 sampel bebas : untuk meyakinkan bahwa terdapat perbedaan yang signifikan Antara kelompok reversal dan non-reversal.
HASIL : Penelitian ini mengkaji peran HSP70 dalam meregulasi aktivasi sel mast melalui ekspresi berbagai parameter inflamasi seperti Histamin, TNF alpha, IL6 dan IL8 melalui peningkatan ekspresi TLR4. Pengamatan ekspresi masing-masing parameter dilakukan dengan menggunakan teknik imunohistokimia, dengan menggunakan metode immunodoublestaining. Distribusi sel mast ditandai dengan reaksi positip terhadap anti tryptase antibody yang divisualisasi menggunakan DAB (ditunjukkan dengan warna coklat), sedang parameter yang diekspresikan ditandai dengan reaksi positip terhadap masing-masing parameter terkait (anti HSP70, anti Histamin, anti TLR4, anti TNF alpha, anti IL6 dan anti IL8) yang divisualisasi menggunakan fast red (ditunjukkan dengan warna merah). Tabel 1 Karakteristik sampel penelitian
KontrolReaksi Reversal
UmurN2828
Rata-rata ( Simpangan Baku41,00 ( 8,25542,43 ( 9,126
Jenis KelaminLaki-laki 15 (53,6%)12 (42,9%)
Perempuan13 (46,4%)16 (57,1%)
Dari tabel terlihat bahwa rata-rata usia hampir sama antara kelompok kontrol dan kelompok reaksi . Dari jenis kelaminnya terlihat seimbang antara laki laki dan perempuannya.1. Ekspresi Hsp70 pada jaringan
Gambar 1.1 Pada gambar ini menunjukkan sel mast yang memberikan reaksi positif terhadap anti Hsp 70 melalui pewarnaan imunohistokimia, x400, Gambar A kelompok non RR Gambar B kelompok RR . Tanda panah hitam menunjukkan double stain terhadap anti Hsp 70, tanda panah merah menunjukkan sel mast tidak menghasilkan reaksi positif.
Gambar 1.2 Gambaran histogram diatas menunjukkan peningkatan ekspresi Hsp 70 pada sel mast kelompok reaksi reversal dibandingkan dengan kelompok non reaksi reversal.
Tabel 1.1 Hasil uji beda data ekspresi HSP70 pada jaringan menggunakan uji t 2 sampel bebas
KelompoknRerata ( Simpangan bakup
Kontrol 282,54 ( 0,9220,000
Reaksi Reversal289,71 ( 2,432
Terdapat peningkatan yang signifikan (p
