Directiva 2013/39/EU: Nuevos Desafíos en el Análisis del Agua · Establece niveles máximos, Normas de Calidad Ambiental (NCA’s), para las Sustancias Prioritarias a nivel de la

Directiva 2013/39/EU:Nuevos Desafíos en el Análisis del AguaNuevos Desafíos en el Análisis del Agua

Compuestos Farmacéuticos & PCP’s PFASsCompuestos Farmacéuticos & PCP s, PFASsy Hormonas Esteroideas

Xavier Rodriguez Piró

P f ti l id d d d

©2014 Waters Corporation 1

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ívía– Si tienen preguntas las deben realizar por esta vía

La presentación durará unos 45 minutos. Al final habrá tiempo para comentar alguna pregunta


AgendaAgenda

Introducción

Desarrollo de métodos para análisis medioambiental LC Preparación de muestrasPreparación de muestras

Compuestos farmacéuticos

PFASs (PFOS, PFOA …)

Hormonas esteroideas – trabajo preliminar

Conclusiones


AgendaAgenda

Introducción





Conclusiones


MotivosMotivos parapara el el AnálisisAnálisisMedioambientalMedioambiental

Salud Pública– Sostenibilidad del abastecimiento de agua potableSostenibilidad del abastecimiento de agua potable– Minimización de los contaminantes vertidos al medio ambiente (agua de baño)– Calidad del aire– Impacto climático

Económicos– Responsabilidades legales– Costes de rectificación

Valor de la tierra/redesarrollo– Valor de la tierra/redesarrollo

Opinión pública / Cobertura mediática– Protección de la imagen de marca

Regulaciones– Directiva Marco del Agua (2000/60/EC)


– Directiva del Agua Potable (98/83/EC)

Directiva Marco del Agua Directiva Marco del Agua 2000/60/EC 2000/60/EC -- 2008/105/EC2008/105/EC

La Directiva 2000/60/EC constituye la primera versión de la DMA. La Directiva 2008/105/EC modifica la primera.

Objetivo: establecer un marco para la protección de las aguas superficiales

Aguas superficiales (sedimentos y biota) Aguas superficiales (sedimentos y biota)

Define una lista de Sustancias Prioritarias que deben ser monitorizadas (33): – Productos químicos, biocidas, productos fitosanitarios, metales, HAP’s y PBDE’s

Establece niveles máximos, Normas de Calidad Ambiental (NCA’s), para las Sustancias Prioritarias a nivel de la Comunidad y deja a criterio de los Sustancias Prioritarias a nivel de la Comunidad y deja a criterio de los estados miembros establecer, si lo consideran necesario, normas adicionales para el resto de contaminantes a escala nacional


Directiva 2013/39/EUDirectiva 2013/39/EU

Añade 12 nuevas sustancias a la lista de 33:Productos fitosanitarios: aclonifen bifenox cypermethrin dicofol* – Productos fitosanitarios: aclonifen, bifenox, cypermethrin, dicofol*, heptachlor*, quinoxyfen*

– Biocidas: cybutryne, dichlorvos, terbutryn– Productos químicos industriales: PFOS*, hexabromocyclododecane*

(HBCDD)– Subproductos de combustión: dioxinas* and dioxin-like PCB’s*

Lista de observación17 beta estradiol 17 alfa etinil estradiol diclofenaco– 17 beta-estradiol, 17 alfa-etinil estradiol, diclofenaco

Desarrollo de una estrategia específica para los compuestos farmacéuticos

Disminuye los valores de NCA’s establecidos para determinadas sustancias: – Brominated diphenyl ethers, fluoranteno, níquel y HAP’s


* Sustancias Peligrosas Prioritarias

Directiva 2013/39/EUDirectiva 2013/39/EUAnálisis de las 12 nuevas Sustancias Análisis de las 12 nuevas Sustancias PrioritariasPrioritariasPrioritariasPrioritarias

Substancia LCMSMS GCMS SPEAclonifen x xxx HLBx xxx HLBBifenox xx xx HLB

Cypermethrin x xxx HLBDicofol xxxx HLB

Heptachlor xxxx HLBQuinoxyfen xx xx HLBQuinoxyfen xx xx HLBCybutryne xx xx HLBDichlorvos x xxx HLBTerbutryn xx xx HLB

PFOS xxxx WAX (HLB)HBCDD HLB


HBCDD xxx x HLBDioxins xxxx -

AgendaAgenda

Introducción





Conclusiones


Desafíos científicos en el AnálisisMedioambiental y el Desarrollo de MétodosMétodos

Se requiere una alta Sensibilidad para identificar y cuantificarcorrectamente los distintos contaminantes en una grancorrectamente los distintos contaminantes en una granvariedad de matrices– Sustancias reguladas– Contaminantes Emergentes

Es necesario un alto rendimiento (high throughput)– Cientos de muestras

Pl d t d lt d d id– Plazos de entrega de resultados reducidos

Métodos robustos y fiables– La coelución de productos endógenos puede provocar unaLa coelución de productos endógenos puede provocar una

disminución de la precisión del ensayo

La Calidad de los datos se debe mantener


– Mejores decisiones

DesarrolloDesarrollo de de MétodosMétodos en en MedioambienteMedioambienteAnálisisAnálisis multiresiduomultiresiduo vsvs análisisanálisis específicoespecíficopp

Multi-Residuo/Multi-Clase EspecíficoMulti Clase

Proceso completo(preparación de muestrasy método analítico)

Cubre un amplio rango de compuestos

Específico para un compuestoo un tipo de compuestos

Protocolo de preparaciónde muestra Máxima simplicidad Varias etapas

Velocidad Maximizar recuperaciones y

Objetivo de la preparaciónde muestra Compromiso entre

recuperaciones y limpieza vs. gran número de analitos

limpieza

Minimizar interferencias / supresión iónica

Grado de limpieza Mínimo/moderado Máximo

Té i d d t ió T d MS Ti f Fli htTandem MS, Single quad MS,

UV FLR ELS GC* (FID


Técnicas de detección Tandem MS, Time-of-Flight UV, FLR, ELS, GC* (FID or MS)

* Habitualmente la GC requiere un grado superior de limpieza

Desarrollo de métodos en LCMejora de la Resolución con Selectividadescomplementariasp

11

kkNRs

1k4

Maximizados en UPLC mediante:

Rango de químicas de columna

Maximizados en UPLC mediante:

sistema de muy baja dispersión Rango de químicas de columnaMultiples partículas distintas Amplio pH de trabajo [BEH]Mayor retención [HSS] Amplio rango de selectividades [CSH]

sistema de muy baja dispersión partículas pequeñas [< 2 µm] Posibilidad de trabajar a presiones máselevadas Columnas perfectamente diseñadas Amplio rango de selectividades [CSH] Columnas perfectamente diseñadas

Impacto en Resolución % Mejora


Doblar NDoblar k Doblar α

20 – 40%15 – 20%> 400%

FactoresFactores QuímicosQuímicos queque influyeninfluyen en en la la SelectividadSelectividad

FaseEstacionaria

Selectividad[α]

ModificadorOrgánico

pH de la Fase Móvil


QuímicaQuímica de la de la PartículaPartícula de Base de Base QQ

TecnologíaTecnologíaSolidSolid--CoreCoreCORTECS CORTECS

TecnologíaTecnología BEH BEH TecnologíaTecnología HSSHSS TecnologíaTecnología CSHCSH

Mayor eficacia y resolución

Rendimiento másalto

Primera partículaACQUITY UPLC

Amplio rango de pH y temperatura

Mayor retención

Selectividad de partícula y ligando

Diseñada para la selectividad

Mejor forma de picopara compuestos alto

2013

pH y temperatura

2004

partícula y ligando

2006

para compuestosbásicos a pH bajo

2010


Amplio rangode pH

Amplio rango de selectividades Eficaciaelevada/Capacidad

de pico

No No todastodas laslas columnascolumnas CC18 18 son son igualesiguales ……

311.

1

295.

1

313.

128

.1

55.1

70.1

AU 0.05

18 18 gg

348.

9 32 35 37A

0.00

311.

0

295.

1

28.1

28.1 31

3.1

70.2

55.1

CSH C18

Más picosresueltos

349.

132

8.0

349.

232 32 37 35

AU

0.00

0.0531

1.0

5.1

8.1 3.1

CORTECS™ C18+resueltos

295

311.

1

328

31

370.

235

5.1

AU

0.00

0.05

11.1

.1 8.1

.1 0.1

CSH Phenyl Hexyl

31

295

349.

031

2.7

328

313. 37

0

355.

1

AU

0.00

0.05

1 80 2 00 2 20 2 40 2 60 2 80 3 00 3 20 3 40 3 60 3 80 4 00 4 20 4 40 4 60 4 80 5 00 5 20 5 40 5 60

HSS PFP Pruebe diferentescolumnas, ligandosy partículas para

identificar la mejor


Minutes1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40 4.60 4.80 5.00 5.20 5.40 5.60identificar la mejor

separación cuantoantes!

SelectividadSelectividad de de solventesolvente::

100

A t it il

Analitos:C: CiprofloxacinE: Enrofloxacin

T ACQUITY CSH C18, pH 10

%

Acetonitrilo E: EnrofloxacinEr: Erythromycin O: OxytetracyclineT: TetracyclineS1: SulfamerazineS2: SulfamethazineO

S2 E

Er

0 T

S1 C

100

0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.500

Metanol

T

E

Er El Metanol es un solvente de eluciónmás débil que el

%

S1

S2C T

qacetonitrilo, que tiendea dar tiempos de retención máselevados para todos los analitos

©2014 Waters Corporation 22Time

0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.500

COT analitos.

También aporta unaselectividad distinta.

Mapa de retención de Fase Reversa:Impacto del pH en el Desarrollo de Métodosp p

40

Zona de máximaretención de los

compuestos ácidos

Zona de máximaretención de los

compuestos básicos

30

35

40

(k) Ácido Neutros

Nota: la retención de los compuestos neutros no se ve afectada por el pH

20

25

de re

tención(

5

10

15

Facctor

pH

0

5

0 2 4 6 8 10 12

Base


Rango de pH para partículas de sílice

Rango de pH para partículas Híbridas

EfectoEfecto del pH en LC de del pH en LC de FaseFase InversaInversapp

1. Carbendazim2. Thiabendazole3. Imazalil

2.07

0.1% FAGradient:5% - 90% methanol in 5 min2pH 3

3. Imazalil4. Fenbuconazole5. Difenoconazole

(cis and trans)

%

1.80 3.94

5.29

1 3

4

5

0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.500

3.05

5.02

5.24

0.1% NH4OH1

23

5pH 10

Time

%

0

2.56

4.85

1

4

Time0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.500


Se puede maximizar la selectividad combinandodiferentes columnas, solventes orgánicos y pH’s

TécnicasTécnicas de de preparaciónpreparación de de muestrasmuestrasp pp p

Preparación de muestra – Simplificación de la matrizde muestra y concentración de los analitos de interésde muestra y concentración de los analitos de interés

Tipos de preparación de muestra:p p p– Dilución (simple, rápida, no limpia, no concentra)– Centrifugación (simple, rápida, limpia, no concentra)

Filt ió ( i l á id li i t )– Filtración (simple, rápida, limpia, no concentra)– Extracción Líquido/Líquido (limpia, concentra, engorrosa)

– Extracción en Fase Sólida (limpia, concentra)


¿¿CuándoCuándo utilizarutilizar la EFS en el la EFS en el AnálisisAnálisisde de AguasAguas??gg

Necesidad de concentrar– Niveles de detección de ppt’s o ppq’s (concentración de 10-1000X)– El tiempo de Evaporación y Reconstitución es inferior con EFS que con LLE

(3-5 mL vs. 100 mL)

Necesidad de limpiar– Efecto Matriz elevado (aguas residuales)– Disponibilidad de MS menos sensibles, GC, o detectores menos selectivos

(UV, FLR, ELS)

Antes de la limpieza

Despuésde la


limpiezacon EFS

de la limpiezacon EFS

FamiliaFamilia de de sorbentessorbentes OasisOasis®®::FaseFase RReversaeversa y y ModosModos MixtosMixtosyy


Oasis HLB:Oasis HLB:ImportanciaImportancia de la de la humectabilidadhumectabilidadpp

C18 (1cc/100mg) HLB (1cc/30mg)100 100

ProcainamideRanitidineE

Rec

over

y

60

80

60

80Acetaminophen(Polar)

Acetaminophen (polar)Ranitidine

PropranololDoxepin

% S

PE

20

40

20

40

00 4 8

Drying Time (minutes)

00 5 10

Drying Time (minutes)

Siílice C18: el secado del sorbente resulta en breakthrough en el paso de lavado = recuperaciones bajas en EFS

Oasis HLB: No se produce breakthrough = buenas recuperaciones en EFS

©2014 Waters Corporation 29Bouvier, Caparella

p g p

ProtocoloProtocolo típicotípico parapara EFS en EFS en FaseFaseReversaReversa

Acondicionamiento y Equilibrado– Solvente más fuerte primero (DCM,

MTBE acetato de etilo)Oasis® HLB

Protocolo de EFSMTBE, acetato de etilo)– a continuación el solvente intermedio

(metanol)– por último el solvente débil (agua) Preparar la muestra

Protocolo de EFS

Carga de la muestra– Muestra disuelta en un solvente débil

(agua 100% o contenido orgánico bajo)

Lavado

Acondicionamiento/Equilibrado1 mL metanol, 1 mL agua

Carga Lavado

– Utilizar el solvente más fuerte posiblesin eluir el analito (metanol/agua)

Elución

Lavado1 mL 5% metanol/agua

Elución– Utilizar un solvente fuerte*: metanol,

IPA,MTBE, DCM2 mL metanol

Evaporación, Reconstitución


*Oasis HLB – el solvente de elución debecontener como mínimo un 5% de metanol o IPA como modificador polar

Condiciones para cartuchos de 3 cc 60 mg

¿Por qué modos mixtos?q

Los Modos Mixtos extienden el pH de trabajo para una buenaretención de compuestos ácidos y básicos

La retención se puede producir por Fase Reversa, intercambio iónicoo ambos– Se puede escoger el mecanismo de retención ajustando el pH– El intercambio iónico permite una buena retención inclusop

trabajando con un alto contenido en orgánicoo Los ácidos pueden ser retenidos por intercambio aniónico

mientras que las bases y los neutros son eluídos con un solventeq yfuerte

o Las bases pueden ser retenidas por intercambio catiónicomientras que los ácidos y los neutros son eluídos con un


solvente fuerte

MapaMapa de de retenciónretención en en funciónfunción deldel pHpHFaseFase reversa vs. reversa vs. ModosModos MixtosMixtosFaseFase reversa vs. reversa vs. ModosModos MixtosMixtos

Oasis® HLB

k’ BAcids (HA)

Neutrals

B( pKa = 4.8 ) ( pKa = 9.0 )

Bases(BH+)

A-

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

(BH )


Mapa de retención en función del pHMapa de retención en función del pHFase reversa vs. Modos MixtosFase reversa vs. Modos Mixtos

Oasis® MCXOasis® HLB

Fase reversa vs. Modos MixtosFase reversa vs. Modos Mixtos

Oasis MCX

Bases (BH+)B

Oasis HLB

k’ BAcids (HA)

k’

Acids (HA)

NeutralB

Neutrals

B( pKa = 4.8 ) ( pKa = 9.0 )

A-Bases(BH+)

A-

pH

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

(BH )


Zona de pH de mayor retención para ácidos y bases

Método Oasis® 2x4:Protocolos de partida para los sorbentes de Modo Mixtosorbentes de Modo Mixto

Para Bases:pKa 2-10

Use Oasis® MCX

Para Ác. FuertespKa <1.0

Use Oasis® WAX

Para Bases FuertespKa >10

Use Oasis® WCX

Para ÁcidospKa 2-8

Use Oasis® MAX

P ió d M t

Protocolo 2

P ió d M t

Protocolo 1Preparación de Muestra

AcondicionamientoEquilibrado

Carga

Preparación de Muestra

AcondicionamientoEquilibrado

Carga Carga

Lavado:5% NH4OH

Elución 1:

Carga

Lavado:2% Ac. Fórmico

Elución 1:Neutros

Elución 1:100% MeOH

Elución 2:2% Ác.Fórmico en MeOH

Elución 1:100% MeOH

Elución 2:5% NH4OH en MeOH


4

Bases ÁcidosFuertes

Bases Fuertes Ácidos

AgendaAgenda

Introducción





Conclusiones


CompuestosCompuestos FarmacéuticosFarmacéuticos y y ProductosProductos de de HigieneHigiene PersonalPersonal

La presencia de PPCP’s en el aguarepresenta una preocupación creciente a

gg

representa una preocupación creciente a nivel mundial.

El impacto medioambiental y el efecto en El impacto medioambiental y el efecto en la salud humana aún no se conoce bien.

Muchas publicaciones han demostradoque los PPCP’s están presentes a nivelesde ppt en las aguas superficiales.

S i ét d li Se requieren métodos para cumplir con requisitos muy exigentes:– Detección a nivel de trazas– Diversidad química amplia


Diversidad química amplia– Muestras diversas y complejas

AnálisisAnálisis multiresiduomultiresiduo de PPCP’sde PPCP’sDesafíosDesafíos

Va iedad de Detección detrazas

Variedad deCompuestos

Distintos tipos


s os posde muestras

ParámetrosParámetros LCLC--MS MS

Sistema LC: Waters ACQUITY H-ClassColumna: ACQUITY UPLC HSS T3 2.1 x 100 mm, 1.8 µmQ , µTemp Columna: 60 ˚CFase Móvil A: 10mM formiato amónico (pH3.2) en aguaFase Móvil B: 10mM formiato amónico (pH3.2) en metanolTiempo de análisis: 8 minCaudal: 0 450ml/minCaudal: 0.450ml/minVolumen Inyección: 100 µL

Tabla de Gradiente:

Time Flow %A %B Curve0.0 0.45 95.0 5.0 61.0 0.45 95.0 5.0 65.0 0.45 5.0 95.0 66.0 0.45 5.0 95.0 66.5 0.45 95.0 5.0 67 0 0 45 95 0 5 0 6


7.0 0.45 95.0 5.0 6

CromatogramasCromatogramas ExtraídosExtraídos ––Forma de Forma de picopicopp

2.79 5.44 4.46

% % %

2.00 4.00 6.000

2.00 4.00 6.000 Time

2.00 4.00 6.000

Esteroides(Cortisone)

Analgésicos(acetaminophen)

AntibióticosFluoroquinones(S fl i )

5.88 3.03 3.95

(Sparfloxacin)

%

1

%

0 Time

%

0


2.00 4.00 6.001

2.00 4.00 6.000 Time

2.00 4.00 6.000

Bloqueantes(Salbutamol)

AntibióticosBeta Lactams(Dicloxacillin)

AntibióticosSulfonamides(Sulfamethoxazole)

EjemploEjemplo: : matrizmatriz dopadadopada a a nivelnivel de de 1ppt 1ppt vsvs Blanco de Blanco de MatrizMatrizpppp

10028: MRM of 2 Channels ES+

267.2 > 145.1 (atenolol)2.91

1 ppt Spike100

28: MRM of 2 Channels ES+ 267.2 > 145.1 (atenolol)

Blanco Agua Superficial1.36e6 1.01e4

%

0

pp pSuperficial

%

Blanco Agua Superficial

%

100

2.50 2.60 2.70 2.80 2.90 3.00 3.10 3.20 3.30 3.40 3.500

28: MRM of 2 Channels ES+ 267.2 > 145.1 (atenolol)2.93

1 ppt SpikePozo

%

100

2.75 2.80 2.85 2.90 2.95 3.00 3.05 3.10 3.15 3.200


Blanco Agua de pozo2.07e6 5.82e3

100

2.50 2.60 2.70 2.80 2.90 3.00 3.10 3.20 3.30 3.40 3.500

28: MRM of 2 Channels ES+ 267.2 > 145.1 (atenolol)2.92

1 ppt Spike 100

2.75 2.80 2.85 2.90 2.95 3.00 3.05 3.10 3.15 3.200


Bl A lid d UPLC1.52e6 1.49e3

%

1 ppt SpikeUPLC

%

Blanco Agua calidad UPLC 1.49e3


Time2.50 2.60 2.70 2.80 2.90 3.00 3.10 3.20 3.30 3.40 3.500

Time2.75 2.80 2.85 2.90 2.95 3.00 3.05 3.10 3.15 3.20

0

PreparaciónPreparación de de muestramuestrapp

Extracción mediante dos cartuchos en serie– Oasis 6cc MAX (Ácidos pKa 2-8)– Oasis 6cc MCX (Bases pKa 2-10)

Ofrece una triple posibilidad de retención de los analitos Ofrece una triple posibilidad de retención de los analitos, usando fase reversa, intercambio aniónico e intercambiocatiónico.

Diseñado para asegurar la retención del máximo número de analitos posibles, ácidos, básicos y neutros

Carga de 1L de muestra en los cartuchos en tándem, posterior separación de los dos cartuchos y elución. Combinar los


separación de los dos cartuchos y elución. Combinar los distintos eluatos, evaporar y reconstituir en 1mL (concentraciónde 1000x)

ProtocoloProtocolo de de ExtracciónExtracción

Asegura la retención porintercambio iónico

Neutros/Bases

Ácidos

Bases


Recuperaciones (1ppt)Recuperaciones (1ppt)p ( pp )p ( pp )


Nota de Nota de AplicaciónAplicación: 720004813en : 720004813en pp

Describe la extracción, separación y detección de 78 PPCP’s en aguas superficiales y de pozo.en aguas superficiales y de pozo.


Compuestos PerfluoradosInformación generalg

Los compuestos perfluorados se utilizan en la producción de fluoropolímeros y revestimientos plásticosp y p

Son potencialmente tóxicos, persistentes, ampliamentedistribuidos y bioacumulablesdistribuidos y bioacumulables.

Están presentes en el medio ambiente y se han encontrado en tejidos animales y humanos.

Riesgo potencial para la salud y el medio ambiente Riesgo potencial para la salud y el medio ambiente– Pueden alterar el metabolismo de los ácidos grasos– Afectan al sistema reproductivo– Degradación de la función hepática

PFOS


Degradación de la función hepática– Propiedades bioacumulativas

DesafíosDesafíos del del análisisanálisis de PFASsde PFASs

El ejemplo muestra distintas inyecciones de blancos después de realizar las operacionestípicas para disminuir la contaminación por

100

Inyecciones de blancoPFOA

típicas para disminuir la contaminación porPFASs. Como se puede apreciar reducen los niveles pero no consiguen lineas de base limpias libres de contaminación

2 00 2 50 3 00 3 50 4 00 4 50 5 00 5 50 6 00 6 50 7 00 7 50

%

0

100

PFNAPFDA

PFUnA

Antes de la limpieza del sistemaTIC

%

100

2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50

PFUnAPFOA

Después de la limpieza del sistemaTICPFNA PFDA

100

2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 7.500

PFOACambio de la fluídica de PTFE a PEEK


Time2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50

%

0

PFOATIC

DesafíosDesafíos del del AnálisisAnálisis de PFASs de PFASs

La cuantificación y el LOQ del método se venfuertemente impactados por la presencia de blancoscontaminados como se puede apreciar en los

100

contaminados, como se puede apreciar en los cromatogramas de la figura.

%

Estándar PFOA

PFOAAnalito

100

2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 7.500

Estándar PFOA100 ppt

%

In ección blanco

PFOAContaminación


Time2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 7.500

Inyección blanco

Fuentes de Fuentes de ContaminaciónContaminación de PFASs de PFASs

Las fuentes de contaminación principales son las fases móviles y los componentes de Teflon del instrumento.p

Fase MóvilA– Agua

– Metanol

Componentes de PTFE de un sistema LC– Mayormente pre-inyector– Lineas de solventesLineas de solventes– Desgasificador– Juntas de bombas


Kit Kit parapara PFASs en PFASs en sistemasistema ACQUITYACQUITYpp QQ

Tubos de PEEKPara lineas de solventessolventes

Tubo de acero inoxidablede longitud fija(de Isolator column al inyector)

Isolator Column

(de Isolator column al inyector)

Isolator Column

Solvent mixer

Tubo en espiral de Acero inoxidable


Acero inoxidableDel Mixer a la Isolator column

MejorasMejoras del kit de PFASs del kit de PFASs jj

La Isolator column, situada justo antes del inyector, permite separar en el tiempo la

ó f

1 0 0

PFOAAnalito

Estándar PFOA

contaminación de fondo de los picos de analito.

% Contaminación de fondo de PFOA

Estándar PFOA300 ppt

0.5min

1 0 0

2 .0 0 2 .5 0 3 .0 0 3 .5 0 4 .0 0 4 .5 0 5 .0 0 5 .5 0 6 .0 0 6 .5 0 7 .0 0 7 .5 0 8 .0 0 8 .5 0 9 .0 00

Contaminación de fondo de PFOAInyección de Blanco

min

%

Nok

Contaminación de fondo de PFOAInyección de Blanco


T im e2 .0 0 2 .5 0 3 .0 0 3 .5 0 4 .0 0 4 .5 0 5 .0 0 5 .5 0 6 .0 0 6 .5 0 7 .0 0 7 .5 0 8 .0 0 8 .5 0 9 .0 00

peaks

PreparaciónPreparación de de muestramuestra paraparaPFASs en AguaPFASs en Agua

AcidspKa 2-8

Use Oasis® MAX

gg

Ácidos fuertespKa <1.0

Use Oasis® WAX

Acondicionamiento/Equilibrado

Protocolo de EFS usando Oasis WAX (6 cc, 150 mg)PFOS PFOA

Carga de la muestra

Lavado 1

Caracterización de los analitos– Ácidos fuertes, pKa <1

Seleccionar el sorbente Oasis® apropiado Lavado 12% ácido fórmico en H2O

Lavado 2MeOH

Seleccionar el sorbente Oasis apropiado– Oasis WAX

Aplicar el protocolo de partida de WAX MeOH

Elución5% Hidróxido amónico en MeOH

– Optimizar si necesario en función de lasrecuperaciones y del efecto matriz

Oasis HLB es un sorbente alternativo


Evaporación/Reconstitución– Método con Oasis HLB disponible

MétodoMétodo optimizadooptimizado parapara Agua Agua SuperficialSuperficialpp

Protocolo EFS para Oasis WAX (6 cc, 150 mg)

Acondicionamiento/Equilibrado4ml 0.1% NH4OH/MeOH, 4ml MeOH, 4ml

H20

Muestras de agua guardadas a 4ºC antes de la extracción

M t filt d filt d Carga de la muestra

Lavado 14ml tampón acetato (0 025M)

Muestras filtradas con filtros de fibra de vidrio antes de la EFS

Sorbente Oasis WAX descrito en 4ml tampón acetato (0.025M)

Lavado 2MeOH

el método ISO 25101 -Determination of perfluorooctanesulfonate (PFOS) and perfluorooctanoate MeOH

Elución0 1% NH4OH en MeOH

(PFOS) and perfluorooctanoate (PFOA)

Recontitución de la muestra en


0.1% NH4OH en MeOH

Evaporación/Reconstitución

40:60 MeOH:H2O con 2mM acetatoamónico

ParámetrosParámetros LCLC

Sistema LC: Waters ACQUITY con kit PFASsColumna: ACQUITY UPLC BEH C18 2.1 x 50 mm, 1.7 µmQ , µTemp Columna: 50˚CFase Móvil A: 2mM acetato amónico:MeOH (98:2)Fase Móvil B: 2mM acetato amónico en MeOH Tiempo de Análisis: 8 minCaudal: 0 65ml/minCaudal: 0.65ml/minVolumen Inyección: 10 µL

Tabla Gradiente:

Time Flow %A %B Curve

0.0 0.65 75.0 25.0 6

0.5 0.65 75.0 25.0 6

5.0 0.65 15.0 85.0 6

5.1 0.65 0.0 100.0 6


6.6 0.65 0.0 100.0 6

6.7 0.65 95.0 5.0 6

CondicionesCondiciones MS & MRMMS & MRM


SuperposiciónSuperposición de MRMsde MRMsp pp p

ó á


Concentración: entre 1 y 2pg/µl en estándars

Límites de detección en aguas superficiales en el rango de ng/L

Nota de Nota de AplicaciónAplicación: 720003162en : 720003162en pp

Describe la extracción, separación y detección de compuestos perfluorados en agua y muestras biológicas.compuestos perfluorados en agua y muestras biológicas.


HormonasHormonas esteroideasesteroideasInformaciónInformación generalgeneralgg

17-alfa Etinil Estradiol se utiliza habitualmente en medicinacontraceptiva.

Es uno más de un cocktail de hormonas naturales y sintéticas que los humanos excretan al agua residual, entre los cuáles están estrógenos

l t l 17 b t t di lcomo la estrona y el 17-beta estradiol

Estas hormonas tienen un potente efecto biológico, incluso a nivelesbajos que puede causar la demasculinización de animales acuáticosbajos, que puede causar la demasculinización de animales acuáticos.

La Directiva 2013/39/EU establece la necesidad de crear una Lista de Observación en la cual el 17-alfa etinil estradiol y el 17-beta estradiolObservación en la cual el 17 alfa etinil estradiol y el 17 beta estradioldeben estar incluidas

Los niveles que se deberían conseguir estarían en el rango de las


q g gppq’s.

InformaciónInformación de los de los AnalitosAnalitos

17α Etinil Estradiol(EE)

17 β Estradiol (BE)• ácido débil

Estrona (E)• ácido débil

• ácido débil• pKa 10.33• pKb -1.7• Retención posible

• pKa 10.33• pKb -0.88• Retención posiblemediante RP, IEX y NP

• pKa 10.77• Retención posiblemediante RP, IEX y NP

mediante RP, IEX y NP


ParámetrosParámetros del del sistemasistema 2D 2D LC/MSMSLC/MSMS

Condiciones ACQUITY 2D Condiciones XEVO TQ-S

Columna EFS On-Line – Oasis HLB direct connect 20µm

Columna Analítica – 2.1x100mm ACQUITY

Modo ESI (-)

Transiciones MRMColumna Analítica 2.1x100mm ACQUITY BEH C18

Condiciones de Carga (BSM Pump A) V l d I ió 450 l t

Compound Precursor Product

Estrona 269.25 145

17 α Etinil 295.1 145– Volumen de Inyección: 450ul muestra– Fase móvil de carga: 2ml/min LCMS

water

Estradiol

17 β Estradiol 271.2 145

Elución/Condiciones Analíticas (BSM BombaB)– Fase móvil Elución, (A) 0.1% NH4OH (B)

0.1% NH4OH en MeCN


– Gradiente en 5 minutos 5%-95% (B)

Desarrollado en colaboración con Scottish Water

EstándarEstándar en en solventesolvente 100ppt100pptpppp


Cortesía de Scottish Water

PreparaciónPreparación de de muestramuestra paraparaHormonasHormonas EsteroideasEsteroideas en en aguaagua(Oasis HLB)(Oasis HLB)

AcidspKa 2-8

Use Oasis® MAX Caracterización de los analitos

(Oasis HLB)(Oasis HLB)

Oasis® HLB

Acondicionamiento/Equilibrado

Protocolo EFS con Oasis HLB(6 cc, 150 mg)

– Son ácidos débiles, pKa >10

Seleccionar el sorbente Oasis® apropiado

Carga de la muestra acidificada500ml

Lavado 1

– Oasis MAX o HLB– Pruebas preliminares con Oasis MAX muestran la

extracción de altos niveles de ácidos húmicos– Experiencia con Oasis HLB buenos resultados Lavado 1

40% MeOH en H2O

Lavado 210% MeOH 2% NH4OH en H2O

Optimización de las etapas de lavado paraobtener extractos más limpios

10% MeOH, 2% NH4OH en H2O

Elución10 MeOH:90% MtBE

– Lavado 1 – elimina las interferencias orgánicas– Lavado 2 – efectivo para la eliminación de

interferencias húmicas


Evaporación/Reconstitución500ul

Oasis HLB Oasis HLB Agua Agua MilliQMilliQ dopadadopada a 0.1ppta 0.1pptgg QQ pp pppp

RecuperacionesCompuesto

RecuperacionesEFS %

17α etinilestradiol 96.04

17β estradiol 101.26

Estrona 92.7

(100ppq spike x1000 concentration)

©2014 Waters Corporation 72Cortesía de Scottish Water

PreparaciónPreparación de de muestrasmuestras en en aguaagua superficial superficial LLE + EFS con Silica, 0.1pptLLE + EFS con Silica, 0.1ppt, pp, pp

CompuestoRecuperaciones

%Efecto

Matriz %

17α 17α etinilestradiol 62.5 -29.6

17β estradiol 60.0 -33.9

Estrona 74 6 20 0

Extracción aún en proceso de optimización. Funciona bien paraagua potable (ver siguiente slide).

Estrona 74.6 -20.0

agua potable (ver siguiente slide).

Pendiente de probar la utilizaciónde EFS con Amino Propil y Alumina como alternativa.

La LLE es más efectiva a pH neutro. Pendiente de probar la EFS en Oasis en estas condiciones.


PreparaciónPreparación de de muestrasmuestras en en aguaagua potable potable LLE + EFS con Silica, 0.1pptLLE + EFS con Silica, 0.1ppt, pp, pp


AgendaAgenda

Introducción





Conclusiones


Conclusiones

La Directiva 2013/39/EU introduce nuevos desafíos en el análisismedioambiental:– Nuevas sustancias en la Lista de Prioritarias– Algunas NCA’s a niveles muy bajos

Desarrollo de métodos: necesidad de trabajar las distintas partes del proceso– LC– Preparación de muestra

Aplicaciones comentadas:– PPCP’s: análisis multiresiduo de 78 compuestos a niveles de trazas mediante

una única inyección– PFASs: método que elimina la contaminación, con EFS selectiva y análisis

mediante UPLCMSMS, que permite conseguir holgadamente límites de detección del orden de ng/L

– Hormonas esteroideas: aún en proceso de desarrollo de método con resultados


Hormonas esteroideas: aún en proceso de desarrollo de método, con resultados muy prometedores combinando LLE, EFS en fase normal y concentración on-line.

Soluciones para sus Ensayos Soluciones para sus Ensayos Interlaboratorios y CRM‘s con ERA


Soluciones para los laboratorios Soluciones para los laboratorios medioambientalesmedioambientales

ERA – acreditada con la ISO Guide 34 y ISO/IEC 17043

Soluciones variadas– Productos Radioquímicos

Para laboratorios acreditados (17025) que ...

q– Preparaciones a medida– EIL‘s bilaterales „QuikResponse“– Elección entre diferentes lotes de

– Tienen dificultades para encontrar los EIL‘s y CRM‘s requeridos

– Ya realizan EIL‘s pero necesitan CRM‘s pa a confi ma s s

CRMs

Algunos de los productos más habituales

CRM‘s para confirmar sus determinaciones

– Querrían pasar a un proveedor de EIL‘s que ofrezca estudios de

– CRM‘s para Aire y Emisiones– Preparaciones a medida para

Triacinas en sueloP d t id l

qmanera más regular para una audiencia a nivel mundial (80 países)

– Productos en aguas residuales

Oferta actual– Participación gratuita en un EIL de

agua para todo cliente nuevo


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E E ñ l di t ib id t i d d ERA En España el distribuidor autorizado de ERA es:

Aqua Consulting IngenierosC/Marqués de Ahumada, 11 1ºC28028 M d id28028 Madridwww.a-cing.com

Gemma Larrubia Álvarezglarrubia@a cing [email protected] : +34 91 636 28 04


GraciasGracias

A continuación de este webinario:– Recepciónp

o Presentación en PDF

o Cuaderno de Aplicaciones de Medio Ambientepo Brochure Oasis

o Oferta del 30% en todos los productos fungibleso Oferta del 30% en todos los productos fungibles

Para cualquier pregunta: Para cualquier pregunta: o Soporte Técnico Waters: 902 254 254o [email protected] Su Responsable de Ventas local


o Su Responsable de Ventas local

AgradecimientosAgradecimientosgg

Scottish Water, Trace Organics, Edinburgh

Angela Boag Hamish Todd Neil Gatward Kevin Snaddon Kevin Snaddon

MTM Research Centre, Orebro University, Sweden

Anna Karrman Anna Karrman Bert van Bavel

Waters Euan Ross Euan Ross Al Ramsay Michael S Young Kenneth Fountain


Jennifer Burgess Gareth Cleland Gary Mantha


Directiva 2013/39/EU: Nuevos Desafíos en el Análisis del Agua · Establece niveles máximos, Normas de Calidad Ambiental (NCA’s), para las Sustancias Prioritarias a nivel de la

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