Διπλωματική εργασία Τζάλη Ελένη - ΕΚΠΑ

Διπλωματική εργασία

Διερεύνηση μεσολαβητών της επίδρασης του δείκτη μάζας σώματος και του λόγου περιμέτρου μέσης προς περιμέτρο γοφών στον κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου του μαστού στις γυναίκες: μια ανάλυση Μενδελιανής τυχαιοποίησης

Τζάλη Ελένη

ΜΠΣ Βιοστατιστικής, ΕΚΠΑ Αθήνα, 2022

1

ΜΠΣ ΒΙΟΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ

ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ

ΤΜΗΜΑ ΜΑΘΗΜΑΤΙΚΩΝ

Δ Ι Π Λ Ω Μ Α Τ Ι Κ Η Ε Ρ Γ Α Σ Ι Α

ΤΖΑΛΗ ΕΛΕΝΗ

Διερεύνηση μεσολαβητών της επίδρασης του δείκτη μάζας σώματος και του λόγου περιμέτρου

μέσης προς περιμέτρο γοφών στον κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου του μαστού στις γυναίκες: μια

ανάλυση Μενδελιανής τυχαιοποίησης

ΑΘΗΝΑ, 2022

2

Η παρούσα διπλωματική εργασία εκπονήθηκε στο πλαίσιο των σπουδών για την απόκτηση

του Μεταπτυχιακού Διπλώματος Ειδίκευσης στη

ΒΙΟΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ

που απονέμει η Ιατρική Σχολή και το Τμήμα Μαθηματικών του Εθνικού & Καποδιστριακού

Πανεπιστημίου Αθηνών

Εγκρίθηκε την ../03/2022 από την εξεταστική επιτροπή:

ΟΝΟΜΑΤΕΠΩΝΥΜΟ ΒΑΘΜΙΔΑ YΠΟΓΡΑΦΗ

1. ΤΣΙΛΙΔΗΣ ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΣ

Αναπληρωτής

Καθηγητής

2. ΒΟΥΡΛΗ ΓΕΩΡΓΙΑ Διδάκτωρ

Βιοστατιστικής,

Επιστημονικός

συνεργάτης

ΕΚΠΑ

3. VERENA ZUBER

Lecturer

(Imperial

College London)

3

Π.Μ.Σ. ΒΙΟΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗΣ

Συμμετέχοντα Τμήματα:

Ιατρική Σχολή Πανεπιστημίου Αθηνών

Mαθηματικών Πανεπιστημίου Αθηνών

ΒΕΒΑΙΩΣΗ

H μεταπτυχιακή φοιτήτρια ΤΖΑΛΗ ΕΛΕΝΗ ολοκλήρωσε τη διπλωματική εργασία του με

τίτλο: “Διερεύνηση μεσολαβητών της επίδρασης του δείκτη μάζας σώματος και του λόγου περιμέτρου

μέσης προς περιμέτρο γοφών στον κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου του μαστού στις γυναίκες: μια ανάλυση

Μενδελιανής τυχαιοποίησης”

στα πλαίσια των σπουδών του για το Διατμηματικό Μεταπτυχιακό Δίπλωμα Ειδίκευσης στη

“Βιοστατιστική” των Τμημάτων Μαθηματικών και Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου

Αθηνών.

Την εργασία αυτή παρουσίασε σε δημόσια διάλεξη στις 31/01/2022 στο Τμήμα Βιοστατιστικής

του Πανεπιστημίου Αθηνών.

Μετά από προφορική εξέταση που ακολούθησε τη διάλεξη, η τριμελής εξεταστική επιτροπή,

ενέκρινε ομόφωνα τη διπλωματική αυτή εργασία.

Η Εξεταστική Επιτροπή

Ονοματεπώνυμο Βαθμίδα Υπογραφή

1 ΤΣΙΛΙΔΗΣ ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΣ

Αναπληρωτής

Καθηγητής

2 ΒΟΥΡΛΗ ΓΕΩΡΓΙΑ

Διδάκτωρ

Βιοστατιστικής,

Επιστημονικός

συνεργάτης

ΕΚΠΑ

3. VERENA ZUBER

Lecturer

(Imperial

College London)

4

Την παρούσα διπλωματική την αφιερώνω στη μητέρα και στον πατέρα μου, ευχαριστώντας

του για την πολύχρονη στήριξη και ενθάρρυνση

5

Ευχαριστώ θερμά τον επιβλέποντα καθηγητή μου Κων/νο Τσιλίδη, για την πολύτιμη βοήθεια και την

κατανόηση του, σε όλη τη διάρκεια πραγματοποίησης της παρούσας εργασίας

6

Περιεχόμενα

Σελίδα

Κεφάλαιο 1ο: Εισαγωγή

1.1 Καρκίνος του μαστού 9

1.1.1 Καρκίνος μαστού και φύλο 11

1.1.2 Καρκίνος του μαστού και κοινωνικοοικονομική ανάπτυξη 12

1.1.3 Υπότυποι καρκίνου του μαστού και μοριακή ταξινόμηση 14

1.1.4 Παράγοντες κινδύνου για την εμφάνιση του καρκίνου του μαστού 15

1.2. Παχυσαρκία

1.2.1 Ο δείκτης μάζας σώματος (BMI) - Γενική παχυσαρκία 16

1.2.2 Ο Λόγος περιμέτρου μέσης / γοφών (waist to hip ratio, WHR) -

Κεντρική παχυσαρκία

16

1.2.3 Παχυσαρκία στον παγκόσμιο πληθυσμό: οι γυναίκες στο μικροσκόπιο 17 1.2.5 Παγκόσμιο φορτίο νόσου οφειλόμενο σε παράγοντες κινδύνου που

οφείλονται σε μη μεταδιδόμενες ασθένειες

19

1.2.4 Παχυσαρκία ως αυτοτελής νόσος 20

1.2.4.1 Παχυσαρκία και καρκίνος μαστού, μια τυπική και μια παράδοξη σχέση 21

1.3 Μενδελιανή τυχαιοποίηση (Mendelian Ranodmization, MR) 23

1.3.1 Μενδελιανή τυχαιοποίηση δύο δειγμάτων 26

(Two-sample Mendelian Randomization, 2-sample MR, 2SMR)

1.3.2. Ευρογονιδιωματικές μελέτες συσχέτισης

(Genome-Wide Association Studies, GWAS)

27

1.3.3 Μέθοδος εκτίμησης της αιτιακής επίδρασης σε περιληπτικά δεδομένα

μέσω της Μενδελιανής τυχαιοποίησης

27

1.3.3.1 Μέθοδος σταθμισμένης αντίστροφης διακύμανσης

(Inverse weighting-variant method, IVW)

27

1.3.4 Αξιολόγηση των παραδοχών των βοηθητικών μεταβλητών - Αναλύσεις

ευαισθησίας

29

1.3.4.1. Το στατιστικό F 29

1.3.4.2. Το στατιστικό 30

1.3.4.3. Ανάλυση Παλινδρόμησης MR-Egger (MR-Egger regression analysis) 30

1.3.4.4. Εκτιμητής σταθμισμένης διαμέσου, (Weighted Median estimator, WM) 30

1.3.4.5. MR-PRESSO (Mendelian Randomization Pleiotropy Residual Sum and

Outlier Test)

31

1.3.5 Πολυπαραγοντική Μενδελιανή τυχαιοποίηση

(Multivariable Mendelian Randomization, MVMR)

31

1.3.5.1 Έλεγχος των προϋποθέσεων της MVMR 32

1.3.5.2 Σχέσεις των εκθέσεων μεταξύ τους σε πολυπαραγοντικό μοντέλο

Μενδελιανής τυχαιοποίησης

32

1.3.5.3 Μέθοδος εκτίμησης της αιτιακής επίδρασης σε περιληπτικά δεδομένα

σε πολυ-παραγοντική μενδελιανή τυχαιοποίηση

34

1.3.5.4 Αξιολόγηση της εγκυρότητας και της ισχύος των μεταβλητών σε πολύ-

παραγοντική Μενδελιανή τυχαιοποίηση περιληπτικών δεδομένων

34

1.3.5.5. Έλεγχος πλειοτροπίας σε MVMR - Multivariable MR Egger regression 35

7

1.3.5.7. Ευρυ-γονιδιωματικές αναλύσεις, παχυσαρκία και καρκίνος του

μαστού: η μενδελιανή προσέγγιση

35

1.4 Σκοπός της μελέτης 36

Κεφάλαιο 2ο: Μέθοδοι

2.0. Άντληση γονοτυπικών δεδομένων 37

2.1 Συσχέτιση των SNP με τον κίνδυνο εμφάνισης του καρκίνου του μαστού

(μελετώμενη έκβαση)

37

2.1.1. Προοπτικές μελέτες που συμμετέχουν στην έρευνα για τον καρκίνο του

μαστού

38

2.1.1.1. BCAC - Breast Cancer Association Consortium 38

2.1.1.2. CIMBA - Consortium of Investigators of Modifiers of BRCA1/2 38

2.1.1.3 Δημοσιευμένοι πίνακες (arrays) γενετικών μεταβλητών (SNPs )

σχετιζόμενων με τον κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου του μαστού

39

2.2.Συσχέτιση των SNPs με τις μελετώμενες εκθέσεις (exposures)

2.2.1 Κύριες Εκθέσεις - Μονοπαραγοντική two-sample MR (Univariate two-sample MR)

39

2.2.1.1 ΒΜΙ και WHR (προσαρμοσμένο στο BMI) 39

2.1.1.1. Προοπτικές μελέτες που αναφέρθηκαν παραπάνω: 40

- UK Biobank 40

- Genetic Investigation of Anthropometric Traits (GIANT) consortium 40

2.2.3 Μελετώμενοι μεσολαβητές (mediators) 41

2.2.3.1. CRP (C-reactive protein) , προσαρμοσμένη για το BMI 41

2.2.3.2. Γλυκαιμικά Χαρακτηριστικά 42

2.3.3.2.1 Ινσουλίνη Νηστείας - προσαρμοσμένα για τα ΒMI 42

2.3.3.2.2 Σακχαρώδης Διαβήτης 2 - (ΣΔ2 /T2DM) 42

2.3.3.2.3 IGF-1 (Insulin Growth Factor-1) 43

2.3.3.3. Λιπίδια (Λιποπρωτείνης Χαμηλής πυκνότητας - Low Density

Lipoprotein, Λιποπρωτείνη Υψηλής πυκνότητας - High Density Lipoprotein),

Τριγλυκερίδια)

44

2.3.3.4. Τεστοστερόνη 44

2.3.4. Διαμόρφωση τελικής λίστας των SNPs

44

2.3.5. Εναρμόνιση δεδομένων (Harmonization of Data)

44

2.3.6. Μενδελιανή τυχαιοποίηση 2 δειγμάτων 45

2.3.6.1 Ανάλυση ευαισθησίας 45

2.3.7. Πολυπαραγοντική Μεντελυανή τυχαιοποίηση περιληπτικών δεδομένων (3 και

παραπάνω δειγμάτων)

45

2.3.8. PhenoScanner 45

Κεφάλαιο 3ο: Αποτελέσματα

Μέρος 1ο

3.1 Γενική παχυσαρκία 47

3.1.1 Στρωματοποιημένη ανάλυση ανά υπότυπο του καρκίνου του μαστού:

ER/PR (+) όγκοι

49

8

3.1.2 Στρωματοποιημένη ανάλυση ανά υπότυπο του καρκίνου του μαστού:

ER/ PR (-) όγκοι

50

3.2. Κεντρική παχυσαρκία 51

3.2.1 Στρωματοποιημένη ανάλυση ανάλογα με τον υπότυπο του καρκίνου του

μαστού: ER/PR (+) όγκοι

53

3.2.2 Στρωματοποιημένη ανάλυση ανά υπότυπο του καρκίνου του μαστού:

ER/ PR (-) όγκοι

54

Μέρος 2ο

3.3. Πολυπαραγοντική Μενδελιανή τυχαιοποίηση -Ανάλυση μεσολάβησης (mediation)

Σχέση δευτερογενών φαινοτύπων με την έκβαση

58

Μέρος 3ο

3.3.1 Διερεύνησης σχέσης μεσολάβησης ΒΜΙ και δευτερογενών φαινοτύπων 58

3.3.2 Πολυπαραγοντική Μελέτη μενδελιανής τυχαιοποιησης : ΒΜΙ και δευτερεύοντες

φαινότυποι

59

3.4.1. 1 Διερεύνησης σχέσης μεσολάβησης WHR και δευτερογενών φαινοτύπων

61

3.4.2 Πολυπαραγοντική Μελέτη μενδελιανής τυχαιοποιησης : WHR και δευτερεύοντες

φαινότυποι

62

3.5 Συσχέτιση με δευτερογενή φαινοτυπικά χαρακτηριστικά 64

Κεφάλαιο 4ο: Συζήτηση 77

4.1 Σύγκριση με άλλες μελέτες 77

4.2 Πλεονεκτήματα και Περιορισμοί της μελέτης 86

4.3 Συμπεράσματα 88

5. Περίληψη 89

Summary 91

6. Βιβλιογρφία 93

9

Κεφάλαιο 1ο: Εισαγωγή 1.1 Καρκίνος του μαστού

Ο καρκίνος στον 21ο αιώνα πρωταγωνιστεί ως αιτία θανάτου παγκοσμίως, συνιστώντας

τροχοπέδη στην επιτέλεση του αυξημένου προσδόκιμου επιβίωσης το οποίο έχει επιτευχθεί μέσω

των επιστημονικών και τεχνολογικών εξελίξεων σήμερα. Η δημογραφική γήρανση και συνάμα η

αριθμητική αύξηση του πληθυσμού, οι θεραπευτικές και προληπτικές επιλογές για άλλα

εκφυλιστικά (αγγειακά εγκεφαλικά, στεφανιαία νόσο) και μεταδοτικά νοσήματα, ταυτόχρονα με

τη συγκριτική αποτυχία στην αντίστοιχη αποτελεσματική αντιμετώπιση του καρκίνου, έχουν

αναγάγει τις νεοπλασίες μεταξύ των δύο πρώτων αιτιών θνητότητας για τις ηλικίες κάτω των 70

ετών σε 112 από τις 183 χώρες του πλανήτη (στοιχεία του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας για

το 2019). Οι επιδημιολογικές καταγραφές αυξημένης επίπτωσης των καρκίνων φαίνεται να

συμπίπτουν με τις γεωγραφικές περιοχές αυξημένου Δείκτης Ανθρώπινης Ανάπτυξης (Human

Development Index) με βάση τις καταγραφές της GLOBOCAN για το παγκόσμιο επιδημιολογικό

φορτίο του καρκίνου για το 2020. Πρέπει να σημειωθεί πως τα δεδομένα της έκθεσης

(δημοσιευμένη το 02/2021) δε λαμβάνουν υπόψιν τον αντίκτυπο της πανδημίας του Covid-19

αφού έχουν προκύψει από παρεκτάσεις (extrapolations) επιδημιολογικών δεδομένων

προηγούμενων ετών. Οι ερευνητές Sung et al, σημειώνουν πως παρότι ακόμη άγνωστες, οι

επιδράσεις της πανδημίας φαίνεται να συντείνουν σε καθυστερημένη διάγνωση, σε διάγνωση σε

προχωρημένο στάδιο της νόσου και σε επακόλουθα μεγαλύτερη θνητότητα. Σύμφωνα με τη 10η

αναθεώρηση του διεθνούς συστήματος ταξινόμησης του ΠΟΥ (ICD-10) στον καρκίνο του

μαστού περιλαμβάνονται οι κωδικοί C-50, D-05 (τόσο για γυναίκες όσο και για άνδρες) , ενώ οι

κωδικού Z80 / Z85 περιγράφουν το θετικό οικογενειακό ιστορικό για τη νόσο.

Ο καρκίνος του μαστού, με τον οποίο θα ασχοληθούμε στην παρούσα μελέτη, παρότι όχι

αποκλειστικά, είναι ο προεξάρχων καρκίνος του γυναικείου φύλου. Με παγκόσμια επίπτωση για

το 2020 που ισούται με το 11.7% των συνολικών νεοδιαγνωσθέντων καρκίνων και για τα δύο

φύλα (2.261.419 νέες περιπτώσεις σε απόλυτο αριθμό) η μαζική νεοπλασία κατατάχθηκε για

πρώτη φορά, ως πρώτη κακοήθεια σε επίπτωση παγκοσμίως μεταξύ των καρκίνων,

ανεξαρτήτως φύλου, ακολουθούμενη από τον καρκίνο του πνεύμονα που επί σειρά ετών ηγείτο.

(Γράφημα 1.1) Από άποψη θνητότητας, ο καρκίνος του μαστού κατατάσσεται 5ος και για τα

δύο φύλα παγκοσμίως με αριθμό 684.996 θανάτων για το 2020 (6,9% των συνολικών θανάτων

οφειλόμενων σε καρκίνο), ακολουθώντας κατά φθίνουσα σειρά τον καρκίνο του πνεύμονα, τον

ορθοκολικό καρκίνο, τον καρκίνο του ήπατος και του στομάχου. (Γράφημα 1.2). Αναφορικά με

τα χρόνια-προσαρμοσμένα στην ανικανότητα ( Disability-Adjusted-Life-Years, DALYs)

αναφέρονται για το 2017 (Global Burden of Disease Cancer Collaboration) 17.4 εκατομμύρια

DALYs οφειλόμενα στο γυναικείο καρκίνο του μαστού.

10

11

1.1.1 Καρκίνος μαστού και φύλο

Το επιδημιολογικό φορτίο της νόσος είναι μη συγκρίσιμο μεταξύ των δύο φύλων, με την

πιθανότητα δια βίου ένας άνδρας να παρουσιάσει καρκίνο μαστού να ανέρχεται σε 1 ανά 833

άνδρες, την ίδια στιγμή που μια γυναίκα κινδυνεύει με πιθανότητα ίση με 1 στις 10 γυναίκες.

Λιγότερο από 1% των ολικών καρκίνων του μαστού εμφανίζονται στους άνδρες, ερμηνεύοντας

τη νεοπλασία του μαστού ως μία κατεξοχήν γυναικεία κακοήθεια. Στο γυναικείο φύλο, υπάρχουν

δύο επικρατούσες νεοπλασίας: ο καρκίνος του μαστού, που προηγείται σε επίπτωση σε 159 από

τις 185 χώρες της υφηλίου (στοιχεία Global Scan Observatory για το 2020) και ο καρκίνος του

τραχήλου της μήτρας που ηγείται σε 23 από τις υπόλοιπες (Εικόνα 1.3). Από άποψη θνητότητας,

αυτοί οι δυο καρκίνοι φέρουν και το βάρος των περισσότερων θανάτων για τις γυναίκες ώστε ο

καρκίνος του μαστού να προκαλεί τους περισσότερους θανάτους σε 110 από τις 185 χώρες που

μελετήθηκαν και εκείνος της μήτρας τους περισσότερους σε 36 από τις 185 χώρες (Εικόνα 1.4)

12

1.1.2 Καρκίνος του μαστού και κοινωνικοοικονομική ανάπτυξη

Η διάγνωση και η θνησιμότητα του καρκίνου του μαστού αφορά με βάση τα παραπάνω

επιδημιολογικά στοιχεία τις γυναίκες όλου του πλανήτη (Γράφημα 1.3). Ποικιλότητα διακρίνεται

ωστόσο στο μέγεθος της επίπτωσης και της συνεπακόλουθης θνητότητας γεωγραφικά, μια

κατανομή που διαφοροποείται ανάλογα με το Δείκτη Ανθρώπινης Ανάπτυξης (Human

Devlopment Index) σε κάθε γεωγραφική περιοχή. Η επίπτωση της εμφάνισης του καρκίνου του

μαστού ξεπερνά εκείνη άλλων καρκίνων τόσο στις χώρες που έχουν υποστεί

μετάβαση/“transitioned” (όρος αλλιώς γνωστός ως “αναπτυγμένες”) και αφορούν το 1ο (“πολύ

υψηλό”) και 2ο (“υψηλό”) τεταρτημόριο στο Δείκτη Ανθρώπινης Ανάπτυξης με 55.9 νέες

περιπτώσεις μαστικού καρκίνου ανά 100.000 γυναίκες/ανά έτος), όσο και στις χώρες υπό

οικονομική μετάβαση/“transitioning” (γνωστές και ως “αναπτυσσόμενες”) με Δείκτη Ανθρώπινης

Ανάπτυξης στο 3ο (“μέτριο”) και 4ο (“χαμηλό”) τεταρτημόριο με 29.7 νέες περιπτώσεις ανά

100.000 γυναίκες/έτος. Ο ρυθμός επίπτωσης είναι 88% υψηλότερος στις αναπτυγμένες σε σχέση

με τις αναπτυσσόμενες χώρες. Η θνητότητα στις αντίστοιχες αυτές δύο κατηγορίες ωστόσο

αντιστρέφεται καθώς στις χώρες που ανήκουν στα δύο πρώτα τεταρτημόρια ανθρώπινης

ανάπτυξης, η επίπτωση των θανάτων είναι 12.8% για κάθε 100.000 γυναίκες για το έτος 2020,

ενώ στις χώρες υπό μετάβαση είναι 15% ανά 100.000 γυναίκες/για το έτος 2020, δηλαδή

μεγαλύτερη παρά τα χαμηλότερα ποσοστά διάγνωσης. Ο μεγαλύτερος ρυθμός θνητότητας

ανευρίσκεται στη Μελανησία, στη Δυτική Αφρική, στη Μικρονησία/Πολυνησία, και στην

Καραϊβική , με τα νησιά Barbados να εμφανίζουν την υψηλότερη θνητότητα παγκοσμίως.

Η αυξημένη επίπτωση στις αναπτυγμένες χώρες αντικατοπτρίζει τον υψηλότερο επιπολασμό

αναγνωρισμένων αναπαραγωγικών και ορμονικών παραγόντων κινδύνου, όπως τη νεότερη

ηλικία εμμηναρχής, την προχωρημένη ηλικία εμμηνόπαυσης, την προχωρημένη ηλικία πρώτης

13

τεκνοποίησης, το μικρότερο αριθμό αποκτηθέντων τέκνων, τη χρήση εμμηνοπαυσιακής

θεραπείας υποκατάστασης, τη χρήση αντισυλληπτικών, το μικρότερο ποσοστό θηλασμού από

τις μητέρες) αλλά είναι και άρρηκτα συνδεδεμένη με συμπεριφορικά πρότυπα που ιστορικά

αναπτύχθηκαν στη Δυτική Ευρώπη/Αμερική και αποτυπώνουν τον αναπτυγμένο (ή Δυτικό)

τρόπο ζωής. Αυτός ο τρόπος διαβίωσης χαρακτηρίζεται από μειωμένη σωματική δραστηριότητα,

την κατανάλωση αλκοόλ και φαγητού με αυξημένο γλυκαιμικό δείκτη, την παχυσαρκία.

Ανασκοπικά, ο ρυθμός επίπτωσης του καρκίνου του μαστού έχει υποστεί πολλές μεταβολές τις

τελευταίες δεκαετίες. Για τη δεκαετία του 1980 και του 1990, ο ρυθμός επίπτωσης του καρκίνου

του μαστού στις αναπτυγμένες περιοχές του πλανήτη (Βόρεια Αμερική, Ωκεάνια, Ευρώπη)

παρουσίαζε σταθερή άνοδο, αποτυπώνοντας τότε τις ευρείες μεταβολές στον επιπολασμό των

παραγόντων κινδύνου αλλά και κοινωνικόπολιτικές μεταβολές στις πολιτικές της Υγείας, όπως

την εγκαθίδρυση πολιτικών πρόληψης. Τέτοιες πολιτικές αποτέλεσαν για παράδειγμα η υιοθέτηση

ευρέως πρώιμων διαγνωστικών μεθόδων (screening μαστογραφία) και η παρατηρούμενη

αυξητική τάση πολύ πιθανόν αποτύπωνε την πρόοδο της ευαισθησίας των διαγνωστικών

μεθόδων, παρά μια πραγματική αύξηση της επίπτωσης. Από τις αρχές της δεκαετίας του 2000

και έπειτα, ο ρυθμός αυτός αναχαιτίστηκε. Αυτή η μετάβαση σε λιγότερες περιπτώσεις καρκίνου

του μαστού ετησίως στον αναπτυγμένο κόσμο, αποδόθηκε στη δραματική μείωση της χρήσης

της μετεμμηνοπαυσιακής θεραπείας υποκατάστασης, εξέλιξη που ακολούθησε την ενοχοποίηση

της προαναφερθείσας από επιστημονικές μελέτες της εποχής για την εμφάνιση

ορμονοσχετιζόμενων καρκίνων του γυναικείου φύλου. Από τα τέλη της δεκαετίας του 2000 και

έπειτα, πραγματοποιείται μια νέα επιδημιολογική αλλαγή στο ρυθμό αυτού με την επίπτωση στις

Ηνωμένες Πολιτείες Αμερικής, την Ωκεανία και την Ευρώπη φάινεται να αποκτά εκ νέου

αυξητική τάση. Η παρατήρηση αφορά, αυτή τη φορά, αποκλειστικά μια υποκατηγορία του

καρκίνου του μαστού (βλέπε παρακάτω): τις νεοπλασίες μαστού θετικές σε υποδοχείς

οιστρογόνων (Estrogen positive tumors), και όχι τις αρνητικές (ER negative tumors). Πιθανές

εξηγήσεις του ευρήματος θα μπορούσε να αποτελεί η ιδιαίτερη ευαισθησία της μαστογραφίας στο

συγκεκριμένο υπότυπο του καρκίνου του μαστού, καθώς και η θετική συσχέτιση του με την

περίσσεια βάρους- παχυσαρκίας.

Εν αντιθέσει με τις ιστορικά γνωστές περιοχές της υφηλίου που χαρακτηρίζονται από υψηλό

κίνδυνο εμφάνισης του καρκίνου του μαστού, οι χώρες σε οικονομική μετάβαση

(“αναπτυσσόμενες”) εμφανίζουν καλπαστικό ρυθμό αύξησης σε νέες περιπτώσεις μαστικής

νεοπλασίας, γεγονός που αντιβαίνει στις παλαιότερες καταγραφές. Η εξέλιξη αυτή αποτυπώνει

τις μαζικές κοινωνικοοικονομικές μεταβολές που συντελούνται συστηματικά (απασχόληση των

γυναικών στη βιομηχανία) και περιβαλλοντικές μεταβολές που υφίστανται αυτές οι χώρες και την

επιβολή ενός διαφορετικού βιορυθμού - συμπεριφορικού προτύπου από εκείνο που ως τώρα

αποτελούσε το κυρίαρχο (μετάβαση προς αυξημένη πρόσληψη θερμίδων, περίσσεια σωματικού

βάρους, μειωμένη σωματική δραστηριότητα, καθιστική απασχόληση). Έτσι περιοχές όπως η

Νότια Αμερική, η Αφρική, η Ασία αλλά και οι περιοχές υψηλού εισοδήματος (Ιαπωνία, Κορέα) με

χαμηλή ως τώρα επίπτωση του καρκίνου του μαστού, αποκτούν όλο και περισσότερο τους

αναγνωρισμένους παράγοντες κινδύνου του Δυτικού τρόπου ζωής, με συνέπεια την τάση

σύγκλισης της μέχρι τώρα υπάρχουσας διαφοράς. (Sung et al, 2021)

Η θνησιμότητα στις αναπτυγμένες χώρες, παρόλα αυτά, έχει μετριασθεί. Η θετική αυτή εξέλιξη

οφείλεται στους προωιμότερους διαγνωστικούς ελέγχους (με μαστογραφία όπως υποδεικνύουν

οι περισσότερες στρατηγικές πρόληψη της Δημόσιας Υγείας) που όπως υποδεινύουν οι Tabar et

14

al, 2018 , οδηγεί σε συντομότερη διάγνωση και σε κατά πολύ μειωμένη ακολούθως θνητότητα,

αλλά και στην πρόοδο των θεραπευτικών επιλογών, οι οποίες προσφέρουν ολοένα και πιο

εξατομικευμένη θεραπεία και βελτίωση της πρόγνωσης.

1.1.3 Υπότυποι καρκίνου του μαστού και μοριακή ταξινόμηση

Πέρα από την παραδοσιακή παθολογοανατομική ταξινόμηση του καρκίνου του μαστού σε

διηθητικό, μη διηθητικό (in situ) , πορώδη, λοβώδη, μεικτό , καθώς και κάποιες σπανιότερες

μορφές του όπως το φλεγμονώδη καρκίνο, τη νόσο Paget, το αγγειοσάρκωμα, το φυλλοειδή όγκο

και το θηλλοειδές νεόπλασμα, η χρήση μοριακών τεχνικών επέτρεψε τι χαρακτηρισμό των

καρκινικών μαστικών κυττάρων, και την ταξινόμηση των νεοπλασμάτων, βάση της έκφρασης

συγκεκριμένων γονιδίων/πρωτεϊνών που αναγνωρίστηκαν. Η βασική ταξινόμηση στο πρόσφατο

παρελθόν αποτελούσε ο χαρακτηρισμός της παρουσίας υποδοχείς ορμονών

15

(οιστρογόνων/προγεσταγόνων) και της έκφρασης του HER-2 (Human Epidermal Growth Factor-

2), γεγονός που υποδείκνυε και τη θεραπεία. ΄Η νέα ταξινόμηση εξυπηρετεί την ορθότερη

προγνωστικοποίηση του κινδύνου του ασθενούς όσο και την εξατομικευμένη στόχευση της

θεραπευτικής παρέμβασης (Harbeck et al, 2019). Οι μοριακοί υπότυποι που αναγνωρίζονται βάση

της “WHO Classification of Tumours, 5th Edition, Volume 2: Breast Tumours”, 2019, είναι οι

παρακάτω:

a. “Luminal (A , Β)”, οι οποίοι αποτελούν το πιο συχνό υπότυπο καρκίνου του μαστού και κατά

πλειονότητα εκφράζουν υποδοχείς οιστρογόνων (ER (+) tumors), ενώ ενδέχεται να

εκφράζουν και υποδοχείς προγεσταγόνων (PR (+) tumors)

1. a.1. “Luminal A” (συχνότητα = 60-70% του συνόλου) : αναγνωρίζονται ισχυρά θετικοί

υποδοχείς οιστρογόνων και προγεσταγόνων, χωρίς έκφραση του HER-2 παράγοντα,

ενώ έχουν χαμηλό δυναμικό πολλαπλασιασμού. Πρόκειται για έναν υπότυπο με καλή

πρόγνωση.

2. a.2. “Luminal B” (συχνότητα = 10-15%): εκφράζουν υποδοχείς οιστρογόνων ή και

προγεσταγόνων αλλά σε μικρότερο βαθμό από την υποκατηγορία Α. Ενδέχεται να

έχουν και θετική έκφραση του HER-2. Πρόκειται για έναν υπότυπο με ενδιάμεση

πρόγνωση.

b. “HER-2 (Human Epidermal Growth Factor-2) εμπλουτισμένοι“ (enriched) : υπερεκφράζουν

τον HER-2. Συνιστούν το 10-15% των κακοηθειών, και είναι συνήθως αρνητικοί σε υποδοχείς

οιστρογόνων / προγεσταγόνων. Προκαλούν επιθετική νόσο με ενδιάμεση πρόγνωση αλλά

καλή ανταπόκριση σε στοχευμένες θεραπείες

c. “Triple - negative” κακοήθειες (συχνότητα = 10-15%) : υπότυπος με αρνητική έκφραση

υποδοχέων οιστρογόνων/προγεσταγόνων καθώς και αρνητική έκφραση του HER-2.

Πρόκειται για υψηλόβαθμη νεοπλασία και με κακή πρόγνωση,

1.1.4 Παράγοντες κινδύνου για την εμφάνιση του καρκίνου του μαστού

Οι παράγοντες κινδύνου για την εμφάνιση του καρκίνου του μαστού είναι πολλαπλοί και ακόμη

υπό εξέταση καθώς η βιοπαθοφυσιολογία δημιουργίας και εξέλιξης της νόσου δεν είναι ακόμα

ολοκληρωμένα κατανοητή. Παρακάτω αναφέρονται οι συχνότεροι και πιο τεκμηριωμένοι

βιβλιογραφικά. (Poorolajal et al, 2020, Harbeck et al, 2019, Feng et al, 2018, Nelson et al, 2012)

Στους γενετικούς παράγοντες κινδύνου συμπεριλαμβάνονται οι γονιδιακές μεταλλάξεις

(υπεύθυνες για το 10%-15% της αιτιολογίας), σε γονίδια όπως BRCA1 και BRCA2 (αυξημένος

επιπολασμός στους Εσκενάζι-Εβραίους), ATM, CHECK2, PTEN, TP53 κ.α. (Kuchenbaecker ,

2017). Στους λοιπούς παράγοντες κινδύνου ανήκουν το γυναικείο φύλο (αυξάνει κατά 100 φορές

την πιθανότητα εμφάνισης μαστικής νεοπλασίας), η αυξημένη ηλικία (άνω των 55 ετών), το

θετικό οικογενειακό ιστορικό (σε συγγενή Α βαθμού ο κίνδυνος είναι σχεδόν διπλάσιος), το ύψος,

η φυλή και η εθνότητα (οι λευκές γυναίκες έχουν αυξημένη επίπτωση σε σχέση με τις υπόλοιπες,

ενώ οι Αφρο-Αμερικανές έχουν αυξημένη θνητότητα), η αυξημένη πυκνότητα μαστού,

συγκεκριμένες καλοήθεις και υπερπλαστικές οντότητες του μαστού αλλά και η προηγούμενη

κακοήθεια του μαστού. Επιπλέον, παράγοντα κινδύνου αποτελεί η έκθεση σε θεραπευτική

ακτινοβολία κατά την παιδική ηλικία. Ιδαίτερα στους αναπαραγωγικούς λόγους αναγνωρίζονται

η πρώιμη εμμηναρχή και η όψιμη εμμηνόπαυση, η ατεκνία, η μεγαλύτερη ηλικία απόκτησης

πρώτου παιδιού, ο μειωμένος θηλασμός και η κατάσταση της εμμηνόπαυσης. Τέλος, ένα

ποσοστό 20% της αιτιολογίας του καρκίνου του μαστού έχει αποδοθεί σε συμπεριφορικούς

παράγοντες στόχος των οποίων μπορούν να γίνουν οι πολιτικές Δημόσιας Υγείας για τη μείωση

16

της επιβάρυνσης της νόσου. Τέτοιοι παράγοντες είναι η χρήση αντισυλληπτικών, η μειωμένη

φυσική δραστηριότητα, το κάπνισμα, η κατανάλωση αλκοόλ (Papadimitriou et al, 2021) (τόσο

για τον προεμμηνοπαυσιακό όσο και για το μετεμμηνοπαυσιακό καρκίνο του μαστού), η

παχυσαρκία (γενική και κεντρική παχυσαρκία) (Amadou, 2013) για τον μετεμμηνοπαυσιακό

καρκίνο του μαστού (Renehan, 2018, Wang,2016), η αυξημένη ινσουλίνη νηστείας και ο

σακχαρώδης διαβήτης 2 (Pearson, Stuttgart, 2021)

17

1.2. Παχυσαρκία

1.2.1 Ο δείκτης μάζας σώματος (BMI)

Γενική παχυσαρκία

Ο δείκτης μάζας σώματος συνιστά μια ταξινομητική απόπειρα κατανόησης της περίσσειας

βάρους του σώματος του ανθρώπου, βασισμένο στα σωματομετρικά χαρακτηριστικά βάρος (σε

χιλιόγραμμα) και ύψος (σε μέτρα).

Ορίζεται ως BMI = .

Ένα άτομο χαρακτηρίζεται ως υπέρβαρο όταν το ΒΜΙ του υπερβαίνει τα 25 , ενώ ως

παχύσαρκο όταν αυτό υπερβαίνει τα 30 . Η παχυσαρκία ταξινομείται σε περαιτέρω

υποκατηγορίες με γνώμονα τη βαρύτητα της (στοιχεία από Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας,

WHO) . Δεν διαφοροποιείται η ταξινόμηση βάση φύλου.

Πίνακας 1.1 Ταξινόμηση του ΒΜΙ κατά

WHO

<16 Λιποβαρής

18-24,9 Φυσιολογικό βάρος

25-29.9 Υπέρβαρος

>30 Παχυσαρκία

30.0 - 34.9 Παχυσαρκία Τάξης 1

35.0 - 39.9 Παχυσαρκία τάξης 2

≥ 40 Παχυσαρκία τάξης 3

1.2.2 Ο Λόγος περιμέτρου μέσης / γοφών (waist to hip ratio, WHR)

Κεντρική παχυσαρκία

Αποτελεί έναν επιπλέον πληροφοριακό σωματομετρικό δείκτη για την περιοχική παχυσαρκία.

Αφορά σε δυσκατανεμημένη εναπόθεση λίπους, κυρίως στην περιοχή της κοιλίας, γνωστή ως

κεντρικού τύπου παχυσαρκία (άλλες ονομασίες: παχυσαρκία κοιλιάς, σπλαχνική, ανδροειδής,

ανδρικού-τύπου παχυσαρκία). Προκύπτει με μέτρηση του οριζοντίου μήκους της περιφέρειας της

μέσης , στο ύψος της λαγόνιας ακρολοφίας, με το άτομο ευρισκώμενο σε όρθια στάση, κατά την

εκπνοή, διαιρεμένο με τη μέγιστη οριζόντια περίμετρο των γοφών. WHR = .

Ως λόγος, δε φέρει μονάδα μέτρησης, ενώ τα φυσιολογικά όρια εμφανίζουν έμφυλες

διαφορές.

Η περιοχική αυτή παχυσαρκία έχει φανεί πως συνιστά έναν ανεξάρτητο της κεντρικής

παχυσαρκίας επιβαρυντικό παράγοντα για το μεταβολικό σύνδρομο και τα καρδιοαγγειακά

συμβάματα (Cao et al, 2018) με αυξημένο κίνδυνο για έμφραγμα του μυοκαρδίου, αλλά και την

θνητότητα από οποιοδήποτε λόγο. Η πληροφορία που παρέχει δεν εξαντλείται στο ΒΜΙ και ως

εκ τούτου κρίνεται σημαντική η μέτρηση του WHR σε υπέρβαρους ασθενείς (25 - 35

18

ΒΜΙ), ενώ σε εκείνους με παχυσαρκία 2ης τάξης και άνω, θεωρείται εξ ορισμού παθολογική.

Παρόλα αυτά, μέχρι στιγμής, δεν αποτελεί μέρος των οδηγιών των περισσότερων για τον

προσδιορισμό της παχυσαρκίας.

Τα φυσιολογικά όρια παρουσιάζουν σημαντική δια-πληθυσμιακή διακύμανση, ώστε σε

πληθυσμούς επιρρεπείς στην κεντρική εναπόθεση λίπους το παθολογικό όριο (και ο κίνδυνος που

αυτό εκφράζει) να ξεκινά από χαμηλότερα επίπεδα (πχ Νότια Ασία, Ιαπωνία). Τα φυσιολογικά

όρια βάση φύλου, είναι τα ακόλουθα στον Πίνακα 1.2

Πίνακας 1.2. Φυσιολογικά όρια

ανά φύλο WHR κατά WHO

Άνδρες

Γυναίκες

Μια παρεμφερής μέτρηση αποτελεί η μέτρηση της περιμέτρου της κοιλιάς (waist circumference,

WC), που πολλές φορές υποκαθιστά το WHR, με τα φυσιολογικά όρια να ταξινομούνται ανά

φύλο όπως φαίνεται στον Πίνακα 1.3

Πίνακας 1.3. Φυσιολογικά όρια

ανά φύλο WC κατά WHO-1

Άνδρες < 102 εκατοστά

Γυναίκες < 88 εκατοστά

1.2.3 Παχυσαρκία στον παγκόσμιο πληθυσμό: οι γυναίκες στο μικροσκόπιο

Η παχυσαρκία σήμερα έχει λάβει διαστάσεις πανδημίας (Swinburn et al, 2017, Obesity and

overweight, WHO, 2017, Finucane et al, 2011). Το 2015 ο επιπολασμός της περίσσειας βάρους

είχε τριπλασιαστεί συγκριτικά με το 1975 στα περισσότερα κράτη παγκοσμίως σύμφωνα με την

μεγάλη πληθυσμιακή μελέτη του Non-Communicable Disease (NCD) Risk factor Collaboration σε

200 κράτη με διαθέσιμα σωματομετρικά στοιχεία (συμμετέχοντες : 9.9 εκατομμύρια άνδρες, 9.3

εκατομμύρια γυναίκες). Συγκεκριμένα το 2016, 1.9 δισεκατομμύρια ενήλικες και των δύο φύλων

(το 39% του παγκόσμιου πληθυσμού των ενηλίκων, 9% των ανδρών και 40% των γυναικών) ήταν

υπέρβαροι, και περισσότεροι από 650 εκατομμύρια νοσηρά παχύσαρκο (13% του παγκόσμιου

πληθυσμού, 11% των ανδρών και 15% των γυναικών). Βιώσαμε μια μεταβολή από έναν κόσμο

όπου ο υποσιτισμένος/ λιποβαρής πληθυσμός ήταν διπλάσιος των υπέρβαρων σε ένα κόσμο

όπου οι υπέρβαροι είναι περισσότεροι. To σταθμισμένο για την ηλικία παγκόσμιο μέσο ΒΜΙ

μεταβλήθηκε από 21.7 (CI 95%: 21.3 -22.1) στους άνδρες το 1975, σε 24.2 (CI 95%:

24.2- 24.4) το 2014, και από 22.1 (CI 95% 21.7-22.5) στις γυναίκες το 1975 σε 24.4

(CI 95%: 24.2-24.6) το 2014 στις γυναίκες. Το εύρος της διακύμανσης κατά περιοχή του μέσου

BMI των γυναικών κυμαινόταν το 2014 από 21.8 (CI 95%: 21.4 - 22.3) στη νότια Ασία σε

32.2 (CI 95%: 31.5 - 32.8) στην Πολυνησία και τη Μικρονησία. Για τους άνδρες το

μικρότερο ΒΜΙ παρατηρήθηκε το 2014 στην κεντρική Αφρική και τη Νότια Ασία, το μέσο ΒΜΙ

ίσο με 21.8 , ενώ το μέσο μεγαλύτερο το 2014 ήταν ίσο με 29.2% και παρατηρήθηκε

19

στην Πολυνησία και τη Μικρονησία. O πληθυσμός των λιποβαρών ατόμων στο διάστημα μελέτης

μειώθηκε από 13.8% (CI 95%: 10.5 - 17.4) σε 8.8% (CI 95%: 7.4-10.3) στους άνδρες και από 14.6%

(CI: 95% 11.6 - 17:9) σε 9.7% (CI 95%: 8.3-11.1) στις γυναίκες. Ο επιπολασμός της παχυσαρκίας,

σταθμισμένης για την ηλικία, αυξήθηκε από 3.2% (CI 95% 2.4-4.1) το 1975 στους άνδρες σε 10.8%

(CI 95% 9.7-12), και στις γυναίκες από 6.4% (CI 95%: 5.1-7.8) σε 14.9% (CI 95%: 13.6-16.1).

Αναλυτικότερα για το γυναικείο φύλο, σύμφωνα με τη μελέτη του NCD Collaboration Study

(2016), η μέση αύξηση του μέσου BMI (σταθμισμένο για ηλικία ανά δεκαετία) ισούται με 0.59

(CI 95%: 0.49-0.70). Το μέσο ΒΜΙ ήταν υψηλότερο σε υψηλού εισοδήματος αγγλόφωνες

χώρες καθώς και στη νότια και βόρεια Αφρική και τη Μέση Ανατολή. Η μεγαλύτερη αύξηση του

μέσου BMI ανά δεκαετία διαπιστώθηκε στη Λατινική Αμερική ( 1.27 /δεκαετία), Η μέση

20

αύξηση του ΒΜΙ ήταν επίσης μεγαλύτερη του 1 ανά δεκαετία στη Μελανασία, την

Πολυνησία, τη Μικρονησία, σε υψηλού εισοδήματος αγγλόφωνες περιοχές, τη νοτιανατολική

Ασία, στην Ανδιατική Λατινική Αμερική και την Καραϊβική. Σπουδαίες αλλαγές δεν

παρατηρήθηκαν στο ΒΜΙ των γυναικών στις χώρες Μπαχραίην, Ναούρου, Σιγκαπούρη,

Ιαπωνία, Βόρεια Κορέα και σε πολλές Ευρωπαϊκές χώρες (ξεκινώντας εξαρχής εδώ από

ψηλότερο μέσο ΒΜΙ). Η αυξητική τάση ήταν μεγαλύτερη έως το έτος 2000 σε σχέση με τα

προηγούμενα 25 χρόνια στην Ωκεάνια και στις υψηλόμισθες Ευρωπαϊκές χώρες. Διακρατική

μεταβλητότητα στο ΒΜΙ ήταν επίσης μεγαλύτερη στις γυναίκες σε σχέση με εκείνη που

παρατηρήθηκε στους άνδρες, συγκεκριμένα μεταξύ αμερικανικής Σαμόα και Τιμορ-Λεστε ισούτο

με 14.1 τιμή που αντιστοιχεί σε διαφορά 35 κιλών ανά άτομο) . Κατά μέσο όρο οι γυναίκες

είχαν μεγαλύτερο μέσο ΒΜΙ το 2014 από τους άνδρες σε 141 από τις 186 χώρες που μελετήθηκαν.

Ο αριθμός των παχύσαρκων γυναικών αυξήθηκε από 71 εκατομμύρια το 1975, σε 375

εκατομμύρια γυναίκες το 2014. Από αυτές 126 εκατομμύρια ήταν σοβαρά παχύσαρκες

(παχυσαρκία τάξης 3, Πίνακας 1.1). Το 18,4% του συνολικού ποσοστού των παχύσαρκων

ατόμων (άνδρες και γυναίκες) παρατηρήθηκε σε υψηλόμισθες αγγλόφωνες περιοχές, οι οποίες

περιείχαν σε ακόμη μεγαλύτερο ποσοστό μέρος των σοβαρά παχύσαρκων ατόμων (27.1%, ίσο

με 50 εκατομμύρια ατόμων) και για τα δύο φύλα. Το 2014 ο επιπολασμός των σοβαρά

παχύσαρκων γυναικών ήταν 5% (ΒΜΙ>35 ) παγκοσμίως ενώ των νοσογόνων

παχύσαρκων ήταν 1.6 % παγκοσμίως (ΒΜΙ>40 ),

1.2.5 Παγκόσμιο φορτίο νόσου οφειλόμενο σε παράγοντες κινδύνου που οφείλονται σε μη

μεταδιδόμενες ασθένειες

Το 2015 δημοσιεύτηκε η έκθεση των GBD 2015 Risk Factors Collaborators, η οποία αφορούσε την

έκθεση σε 79 συμπεριφορικούς, περιβαλλοντικούς, επαγγελματικούς και μεταβολικούς

παράγοντες σε 195 χώρες και περιοχές διαχρονικά (1990-2015), κατατάσσοντας το αποδιδόμενο

αιτιολογικό φορτίο του καθενός σε Παγκόσμιο Φορτίου Νόσου, εκφρασμένο σε θανάτους και

προσαρμοσμένα-στην-ανικανότητα-χρόνια-ζωής (Disability-adjusted-life-years, DALYs) τα

οποία, σύμφωνα με το WHO, ορίζονται ως η απώλεια ενός χρόνου πλήρους υγείας, είτε λόγω

πρόωρου θανάτου είτε λόγω νόσου. Η μελέτη κατέταξε το αυξημένο BMI ως τέταρτο (4o) σε

συνεισφορά (επίπεδο τρία παράγοντα κινδύνου) σε DALYs αποδίδοντας του 120 εκατομμύρια

DALΥs παγκοσμίως για το μελετούμενο χρονικό διάστημα. Αυξημένη έκθεση παρατηρήθηκε και

στην υψηλή γλυκόζη νηστείας (3ος σε συνεισφορά παράγοντας με 143 εκατομμύρια DALYs), ενώ

την υπόλοιπη 5άδα απάρτιζαν η αυξημένη συστολική αρτηριακή πίεση, το κάπνισμα και η

παιδική υποθρεψία. Για το διάστημα 1990-2005 διαπιστώθηκε αύξηση στην έκθεση

(προσαρμοσμένη στην ηλικία) στο υψηλό ΒΜΙ, ως επιβλαβή έκθεση, κατά 38.7% στους άνδρες

(CI 95% 29.9-55.6) , και 34,4% στις γυναίκες (CI 95% 27.7-45.7), αυξήσεις στατιστικά σημαντικές

και στις δύο περιπτώσεις. Στο σύνολο των μεταβολικών κινδύνων αποδόθηκαν το 2005

14.403.000 θάνατοι, ενώ το 2015, 16.860.000 θάνατοι, με αντίστοιχα DALYs 335.277.000 το 2005

και 381.845.000 το 2015. Εξ αυτών, στον αυξημένο δείκτης μάζας σώματος (ΒΜΙ) αποδόθηκαν

3.314.000 θάνατοι (CI 95%: 2.241.000 - 4.504.000) το 2005, και αυξήθηκαν κατά 19.5 % (διαφορά

στατιστικά σημαντική) το 2015, μετρώντας 3.960.000 εκατομμύρια θανάτους. Ta DALYs που

αποδίδονται στο αυξημένο BMI είναι 98.478.000 (CI 95% 67.219 000 - 131.972.000) το 2005, ενώ

αυξάνονται στατιστικά σημαντικά σε 120.132.000 [CI 95% 83.829.000- 158.409.000), το 2015. Από

τις αιτίες θανάτου, πρώτη έρχεται η ισχαιμική καρδιακή νόσος με 1.436.000 θανάτους για το 2015

(CI 95% 960.000 - 1.965.000), το αιμορραγικό αγγειακό επεισόδιο με 651.000 (CI 95%: 431.000 -

894.000), o σακχαρώδης διαβήτης 2 με 555.000 (CI 95%: 404.000-718.000) το ισχαιμικό αγγειακό

επεισόδιο με 1.436.000 θανάτους (CI 95%: 431.000-894.000). Ακολουθούν η υπερτασική

21

καρδιοπάθεια και η χρόνια νεφρική νόσος οφειλόμενη σε υπέρταση. Με εξαίρεση το ισχαιμικό

αγγειακό επεισόδιο, όλα τα υπόλοιπα είχαν στατιστικά σημαντική αύξηση μέσα στη δεκαετία

2005-2015.

Στο θάνατο λόγω κακοηθειών αποδόθηκαν στο αυξημένο BMI 71.000 θάνατοι (CI 95% 22.000-

130.000) από τον καρκίνο του οισοφάγου, 62.000 θάνατοι ( CI 95% 38.000 - 91.000 ) από τον

ορθοπρωκτικό καρκίνο και 34.000 (CI 95% 20.000 - 52.0000) από τον καρκίνο του μαστού για

το έτος 2015, ενώ σε όλες τις περιπτώσεις παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική αύξηση μέσα στη

δεκαετία. Ta DALYs συμβάδιζαν σε αντιστοιχία με τους θανάτους και αναφορικά με τον καρκίνο

του μαστού μετρήθηκαν στα 774.000 έτη (95% CI 439.000 - 1.214.000). Σε αυτή την έκθεση

σημειώνεται πως συμπεριελήφθησαν 44 προοπτικές μελέτες που συνέδεαν το υψηλό ΒΜΙ με την

έκβαση του μετεμμηνοπαυσιακού καρκίνου του μαστού και 25 κοορτές που το συνέδεαν με τον

προ εμμηνοπαυσιακό καρκίνο του μαστού. Από τα αποτελέσματα των κοορτών το 2% στην

πρώτη περίπτωση, και το 8% στη δεύτερη, είχαν στατιστική σημαντική σχέση με το αντίστροφο

αποτέλεσμα.

Συνολικά, όλοι οι 79 κίνδυνοι μαζί συνεισέφεραν το 57,8% των παγκόσμιων θανάτων και το 12%

των DALYs, υπογραμμίζοντας τη συνεισφορά των μη-μεταδιδόμενων νοσημάτων στη

νοσηρότητα και θνητότητα. Από τους 27 παράγοντες που είχαν εξεσημασμένη αύξηση, το υψηλό

ΒΜΙ ήταν ο παράγοντας κινδύνου , μεταξύ της πρώτης πεντάδας που μεταβλήθηκε περισσότερο

μεταξύ 1990 και 2015, και για τα δύο φύλα, καθώς συνολικά, μαζί με την υψηλή γλυκόζη

νηστείας, αυξήθηκαν περισσότερο από 20% (NCD RIsK-2017). Οι ίδιες οι μελετητές

υπογραμμίζουν την πιθανότητα επέλευσης επιπλέον νοσηρότητας λόγω μεταβολικών

παραγόντων, την ανάγκη υιοθέτησης στρατηγικών πρόληψης αλλά και αντιμετώπισης των

συνεπειών τους, ενώ συστήνουν τη μελέτη του ΒΜΙ σε συνδυασμό με άλλα στοιχεία που

απαρτιώνουν τη μεταβολική απορρύθμιση του οργανισμού (σωματική άσκηση, σύσταση

καταναλισκόμενης τροφής) για καλύτερη κατανόηση της επίδρασης του.

1.2.4 Παχυσαρκία ως αυτοτελής νόσος

Παρότι η παχυσαρκία είχε αναγνωριστεί ως νόσος από το 1948, δε θεωρούνταν σημαντική για

τη δημόσια υγεία έως ότου η έλευση της νέας χιλιετίας και οι εκθέσεις για το αποδιδόμενο φορτίο

νόσου της περιόδου, κατέστησαν σαφή τον επιδημικό χαρακτήρα που έχει λάβει. Πλέον

πρόκειται για μία σύγχρονη πανδημική κατάσταση ενώ, από το 2010 και έπειτα, παγκοσμίως

(αναγνώριση από την Αμερικανική Ιατρική Εταιρεία (AMA), 2013, Διακήρυξη της Nagoya το

2015, έκθεση της World Obesity το 2017), η παχυσαρκία αναγνωρίζεται ως “νόσος της

παχυσαρκίας”. Η αναγνώριση αυτή αποσκοπεί στη συμπερίληψη της στις στρατηγικές πρόληψης

και θεραπείας της παχυσαρκίας στις πολιτικές Δημόσιας Υγείας των κρατών παγκοσμίως (James,

2008).

Πρόκειται για μια νόσο που χαρακτηρίζεται από ένα σύνθετο, χρόνιο, υποτροπιάζαν και

προοδευτικό πρότυπο, χρήζον παρέμβασης (Bray, 2017) Η αιτιολογία της παχυσαρκίας είναι

πολυπαραγοντική και σχετίζεται με εθνικούς, κοινωνικο-οικονομικούς λόγους (χαμηλό

εισόδημα, εύκολη πρόσβαση σε τροφή με υψηλό γλυκαιμικό δείκτη, καθιστικός τρόπος ζωής),

γενετική προδιάθεση, συμπεριφορική επιλογή και επίδραση της ψυχολογίας (Blüher, 2019). Έχει

υποκαταστήσει το κάπνισμα στους σχετιζόμενους με τη συμπεριφορά παράγοντες κινδύνου και

22

συνιστά μέρος της στόχευσης του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγειας (ΠΟΥ) για την πρόληψη μη

μεταδιδόμενων ασθενειών (μέρος του “Global Action Plan for the Prevention and Control of

Noncommunicable Diseases 2013–2020”), ενώ ήδη από το 2004 ο ΠΟΥ είχε δημοσιεύσει εναν σαφή

οδηγό για την αποφυγή της (“Global strategy on diet, physical activity and health”, Geneva: World Health Organization, 2004). Κύριος τοξικός επαγωγός της παχυσαρκίας είναι το φαγητό, η

περίσσεια και η σύνθεση του οποίου αλληλεπιδρά με υποκείμενη γενετική επιδεκτικότητα -

προδιάθεση του ξενιστή με συνεπαγωγή την παραγωγή θετικού ενεργειακού ισοζυγίου (Bray,

2017). To περισσότερο έκτοπο λίπος συσσωρεύεται στο λιπώδη ιστό, με συνέπεια την υπερτροφία

και υπερπλασία του, μια διαδικασία μη αντιστρεπτή, ενώ παράλληλα ένα μέρος διηθεί άλλα

όργανα (καρδιά, ήπαρ, αγγεία, πάγκρεας) επηρεάζοντας την εύρυθμη λειτουργία τους.

Παθοφυσιολογικά, προάγεται μια κατάσταση χρόνιας φλεγμονής στον οργανισμό με συνέπεια

την εκφυλιστική επαγωγή δομών και τη μόνιμη δυσλειτουργία άλλων. Συνιστά ένα

αναγνωρισμένο παράγοντα κινδύνου για αγγειακή νόσο (στεφανιαία νόσο, υπέρταση, αγγειακή

εγκεφαλική νόσο), για το μεταβολικό σύνδρομο (ανοχή στην ινσουλίνη, σακχαρώδης διαβήτης,

υπερλιπιδαιμία), οστεοαρθρίτιδα και υπερουριχαιμία , νόσους της χοληδόχους κύστεως, νόσους

του αναπνευστικού (υπνική άπνοια, obesity-related hypoventilation) και την καρκινογένεση

(στοιχεία από WHO, 2021, Deng, 2016). Έχει ενοχοποιηθεί ως παράγοντας κινδύνου για

τουλάχιστον 13 καρκίνους, συμπεριλαβανομένου του παχέος εντέρου, του μαστού, του

ενδομητρίου, του ήπατος, του προστάτη, της χοληδόχου κύστης (International Agency for

Research into Cancer and the World Cancer Research Fund (WCRF) , Global Challenge of Obesity

and the International Obesity Task Force, Global Cancer Observatory του WHO) και συνιστά

επιβαρυντικό παράγοντα της έκβασης. Ταυτόχρονα, η παχυσαρκία έχει και σοβαρό ψυχολογικό

αντίκτυπο στο υποκείμενο, καθώς τα άτομα υποφέρουν από κοινωνικό αποκλεισμό και

προκατάληψη από το κοινό αλλά και τους επαγγελματίες υγείας.

1.2.4.1 Παχυσαρκία και καρκίνος μαστού, μια τυπική και μια παράδοξη σχέση

Η παχυσαρκία αποτελεί προ-ογκογενετική κατάσταση, ευοδώνοντας τη μετάλλαξη και την

πρόοδο στην καρκινογένεση, ιδίως στις γυναίκες (Avgerinos et al, 2019, De Pergola and Silvestris,

2013). Συνιστά τόσο παράγοντα κινδύνου όσο και επιβαρυντικό παράγοντα στην πρόγνωση για

τους περισσότερους καρκίνους (Petrelli et al, 2021). O λιπώδης ιστός, χωριζόμενος στο λευκό

λιπώδη (White Adiposity Tissue) και στο καφέ λιπώδη Ιστό (Brown Adiposity Tissue) κατά τη

διάρκεια των περιόδων πρόσληψης περίσσειας ενέργειας υπερτρέφεται (αύξηση του όγκου των

κυττάρων) και, κατόπιν, υπερπλάθεται (αύξηση του αριθμού των λιποκυττάρων). Η

συσσώρευση λιπιδίων (τριγλυκεριδίων και άλλων) εντός του λιποκυττάρου έχει ως αποτέλεσμα

τη μετατόπιση του ενδοκρινικου-παρακρινικού του ρόλου από την έκκριση αντιφλεγμονοδών

παραγόντων στην έκκριση προφλεγμονωδών και αγγειογενετικών παραγόντων, (όπως οι

Ιντερλευκίνη-6, Ιντερλευκίνη-1, ο παράγοντας νέκρωσης του όγκου-α (TNF-a)). Καθώς το

λιποκύτταρο δεν έχει απεριόριστες δυνατότητες αύξησης του όγκου του, σε καταστάσεις

συνεχών προσλήψεων καταλήγει σε υποξία και νέκρωση. Έτσι, εκκινείται και συντηρείται μία

κατάσταση χρόνιας και υποκλινικής φλεγμονής που λαμβάνει χώρα σε ολόκληρο το λιπώδη ιστό

(DIvella et al, 2016, Quail et al, 2019). Το εκκριταγωγό κομμάτι του οργάνου αφορά μονάχα στο

λευκό λιπώδη ιστό. Παράγεται από αυτόν ένα σύνολο βιομορίων, γνωστό ως αδιποκίνες

(μεταβολίτες, κυτοκίνες, ορμόνες). Από αυτές, η αδιπονεκτίνη και η λεπτίνη, παρουσιάζουν

ενδείξεις ότι συμμετέχουν στην πολυπαραγοντική αιτιολογία του μαστικού καρκίνου και θα

επεξηγηθούν περισσότερο. Στο προφελγμονώδες περιβάλλον που περιγράφηκε παραπάνω, το

23

λευκό λιποκύτταρο μειώνει την παραγωγή αδιπονεκτίνης, η οποία έχει ένα προστατευτικό ρόλο

στην καρκινογένεση (Kelesidis et al, 2006), ή, ως εκ του αντιστρόφου, τα μειωμένα της επίπεδα

στις μετεμηννοπαυσιακές, αλλά και πρόσφατα στις προεμμηνοπαυσιακές γυναίκες

αναγνωρίζονται ως παράγοντας υψηλού κινδύνου (Liu et al, 2013, Yu et al, 2019). Η λεπτίνη

από την άλλη, προαγωγός της κυτταρικής ανάπτυξης, προ-καρκινοματώδες μόριο καθώς και

ενισχυτής της λειτουργίας της αρωματάσης υπερκφράζεται σε υπέρβαρες / παχύσαρκες γυναίκες

και οι μελέτες ως τώρα, επιβεβαιώνουν μια θετική συσχέτιση των υψηλών επιπέδων λεπτίνης και

του καρκίνου του μαστού (Sanchez-Jimenez et al, 2019, Ando et al, 2019, Pan et al, 2018, Niu et

al, 2013)

H φλεγμονώδης κατάσταση της παχυσαρκίας επιπλέον εγείρει συστηματικές αλλαγές στην

ομοιόσταση του οργανισμού, όπως την υπερινσουλιναιμία (λόγω ανοχής των ιστών στην

ινσουλίνη), τη δυσλιπιδαιμία και το λοιπό φάσμα του μεταβολικού συνδρόμου (Σακχαρώδης

Διαβήτης τύπου 2, αθηροσκλήρυνση) (Shunik, 2008). Πιθανά μέσω της αδυναμίας της απάντησης

των λιποκυττάρων στην αυξημένη πρόσληψη συντελείται καταρχάς ανοχή στην ινσουλίνη με

συνέπεια την ανάγκη αύξησης της παγκρεατικής έκκρισης για ρύθμισή της γλυκόζης πλάσματος

(Templeman et al, 2017), Βέβαια έχει υποστηριχθεί πως η υπερινσουλιναιμία μπορεί και να

προηγείται και να επάγει την παχυσαρκία (Johnson & Olefsky, 2013). Αναφορικά με τον καρκίνο

του μαστού, ο Σακχαρώδης Διαβήτης τύπου 2 φάινεται να σχετίζεται με αυξημένο κίνδυνο για

τις μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες (Tsilidis et al, 2019, Michels et al, 2003) ενώ η ινσουλίνη

νηστείας δεν έχει συνεπή αποτελέσματα (Hernandez et al, 2009). Ο Insulin Growth Factor-1 (IGF-

1), ο οποίος παράγεται κυρίως στο ήπαρ, φάινεται να προαγάγει την καρκινογένεση τόσο στις

προεμμηνοπαυσιακές όσο και στις μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες (Key et al, 2010). Τέλος , τα

κυκλοφορούντα λιπίδια στις επιδημιολογικές μελέτες παρατήρησης έχουν διαφορετική συσχέτιση

με την επίπτωση του καρκίνου του μαστού: η αυξημένη High-Density Lipoprotein (HDL-c) ορού

και τα αυξημένα Τριγλυκερίδια (TG), φάινεται να έχουν προστατευτική επίδραση σε σχέση με την

Low Density Lipoprotein (LDL-c) και τα την Ολική Χοληστερόλη, αποτελέσματα κυρίως για τις

μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες (TC) ( Ni, 2015)

Σε πολλές επιδημιολογικές μελέτες παρατήρησης αναφορικά με τον καρκίνο του μαστού και την

επίδραση της γενικής παχυσαρκίας (BMI), το πρόσημο της επίδρασης φαίνεται να εξαρτάται από

την εμμηνοπαυσιακή κατάσταση των γυναικών (πριν και μετά την εμμηνόπαυση). Στις

μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες η παχυσαρκία (κεντρική και περιφερική) αυξάνει τον κίνδυνο

εμφάνισης (Houghton, et al, 2021, Kyrgiou et al, 2017, Chen et al, 2017, Chan et al, 2016, White,

2015, Reeves et al, 2007). Αντίθετα, στις προεμμηνοπαυσιακές γυναίκες (κυρίως έως την ηλικία

των 30 ετών) το αυξημένο BMI (όχι το WHR) εμφανίζεται να έχει προστατευτικό ρόλο (Garcia-

Estevez, 2021, Chan, 2019, Minouk et al, 2018)

Ο λόγος για το παράδοξο αυτό εύρημα, ενάντια στη γενική αντίληψη για την επιβλαβή επίδραση

της παχυσαρκίας, παραμένει ασαφής, Ο καρκίνος του μαστού είναι ένας από τους κατεξοχήν

καρκίνους που έχουν συσχετιστεί με το υπερβολικό βάρος και ως εκ τούτου η συγκεκριμένη

παρατήρηση εκπλήσσει την επιστημονική κοινότητα. Οι προσπάθειες επεξήγησης κατευθύνονται

πρωτίστως στο παθοφυσιολογικό κομμάτι της παρουσίας εξεσημασμένου λιπώδους ιστού. Ο

λιπώδης ιστός συνιστά ένα αυτοτελές ενδοκρινικό όργανο (Kershaw and Flyer, 2004, Ahima,

2000, ), με διαφορετική λειτουργική συνεισφορά στο σώμα πριν και μετά την εμμηνόπαυση (Rose,

2013). Ο μαστός αποτελείται κυρίως από λιπώδη, ινώδη ιστό και μαστικούς αδένες ενώ η

ανάπτυξη του βρίσκεται υπό την λειτουργική επίδραση των κυκλοφορούντων οιστρογόνων. Οι

24

παχύσαρκες μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες φαίνεται να έχουν πολύ μεγαλύτερη συγκέντρωση

κυκλοφορούντων οιστρογόνων (οιστραδιόλης, οιστρόνης) συγκριτικά με εκείνα των γυναικών

με φυσιολογικό βάρος. Τη βιοσύνθεση τους έχει αναλάβει ο λιπώδης ιστός μετά τη λειτουργική

παρακμή των ωοθηκών ως ορμονοπαραγωγά όργανα. Ο λιπώδης ιστός καταλύει τη μετατροπή

των ανδρογόνων (τεστοστερόνης, ανδροστενεδιόνης, παραγώμενες από τα επινεφρίδια) σε

οιστρογόνα (οιστραδιόλη, οιστρόνη αντίστοιχα), με τη χρήση του ενζύμου αρωματάση

(CYP19A1), παρόν σε μαστικό και λιπώδη ιστό (Picon-Ruiz et al, 2017, Simpson and Brown, 2013).

Συγκεκριμένα, περιοχές του λιπώδους ιστού που εμφανίζουν αυξημένη δραστηριότητα της

αρωματάσης είναι κάποιες δομές που ονομάζονται “δικης-στέμματος” (crown-like structures) και

σηματοδοτούν εστίες ιστικής φλεγμονής και νέκρωσης των λιπωδών κυττάρων του μαστού

(περικυκλώνονται από μακροφάγα, ως μέρος της φλεγμονής που λαμβάνει χώρα) (Chan, 2021,

Picon-Ruiz 2017). Αυτό ενδεχομένως εξηγεί και την ανεύρεση σε παχύσαρκες γυναίκες

αυξημένης συχνότητας μαστικών νεοπλασιών που εκφράζουν οιστρογονικούς υποδοχείς (ER

positive). (Vrieling et al, 2010, Suzuki et al, 2009). Αντιθέτως οι παχύσαρκες γυναίκες σε

προεμμηνοπαυσιακή ηλικία τυγχάνουν ανάστροφης τροφοδότησης του υποφυσιακού-

υποθαλαμικού άξονα, υπεύθυνου για την έκκριση γοναδοτροπινών λόγω της παρουσίας

εξεσημασμένου λιπώδους ιστού ο οποίος ταυτόχρονα με τις γονάδες συντελεί στην αύξηση των

οιστρογόνων πλάσματος. Ως συνέπεια, οι παχύσαρκες γυναίκες αντιμετωπίζουν συχνότερα

ανωορρηκτικούς κύκλους, αμηνόρροια και καταληκτικά, αρνητική ανατροφοδότηση στις

ωοθήκες (μειωμένη δραστηριότητα) και μειωση των προγεσταγόνων που αυτές εκκρίνουν, τα

οποία έχουν πολλαπλασιαστική επίδραση στο μαστό (Dowsett and Folkerd, 2014, Lanari et al,

2002).

1.3 Μενδελιανή τυχαιοποίηση (Mendelian Ranodmization, MR)

Παρά τις εκτεταμένες σε αριθμό και μέγεθος μελέτες παρατήρησης που έχουν πραγματοποιηθεί

για τις υπό εξετάσεις εκθέσεις (παχυσαρκία) σε σχέση με την έκβαση (του κίνδυνου εμφάνισης

του καρκίνου του μαστού), οι περιγραφικές μελέτες, ad hoc, αδυνατούν να πραγματοποιήσουν

ένα συγκεκριμένο όριο : την απόδειξη της αιτιότητας. Μονάχα η συσχέτιση, και όχι η αιτιότητα,

είναι πιθανό να διαφανεί από αυτές, όσο προσεκτικά σχεδιασμένες και αν είναι. Ταυτόχρονα, οι

επιδημιολογικές μελέτες υπόκεινται σε πολλά σφάλματα. όπως συγχυτικούς παράγοντες

(confounding, residual confounding), αντίστροφη αιτιότητα, το αντίκτυπο των οποίων στα

αποτελέσματα των μελετών συχνά είναι δύσκολο να εκτιμηθεί με ακρίβεια. Στην κορωνίδα των

διαθέσιμων μεθόδων στην Ιατρική κοινότητα για την προαγωγή της έρευνας και της νέας γνώσης

ανευρίσκεται το πείραμα, δηλαδή οι τυχαιοποιημένες κλινικές δοκιμές (clinical trials). Παρά τη

δύναμη της τεκμηρίωσης τους, συχνά είναι αδύνατο ή ανήθικο να εφαρμοστούν για όλες τις

καταστάσεις και τις εκθέσεις που μελετώνται, ενώ σε άλλες περιπτώσεις, όταν εφαρμόζονται

αποκαλύπτουν στοιχεία αντιθετικά από εκείνα των μελετών παρατήρησης. Ταυτόχρονα είναι

μελέτες οικονομικά δαπανηρές (Lawlor et al, 2008).

Το έλλειμα αυτής της προσέγγισης κλήθηκε να καλύψει μια νέα σε χρήση μέθοδος

επιδημιολογικών μελετών, που εγκαλείται μια στατιστική μέθοδο που είχε ήδη περιγραφεί το 1928

από τον Philip G. Wright, αμερικανό οικονομολόγο, και έκανε την εμφάνιση της στην ιατρική

βιβλιογραφία χάριν στον Katan, το 1986, αναφερόμενη στο ερώτημα της συσχέτισης της

χοληστερόλης ορού και του καρκίνου. Οι τεχνολογικές εξελίξεις του 21ου αιώνα επέτρεψαν την

25

ευρεία ανάγνωση του ανθρώπινου γενετικού υλικού, καλωσορίζοντας τη μέθοδο των βοηθητικών

μεταβλητών (Instrumental variables - IVs), με τη χρήση γενετικών μεταβλητών, γνωστή ως

Μενδελιανή τυχαιοποίηση. Με όνομα που απευθύνεται στον πρώτο γενετιστή, τον Gregor

Mendel, o οποίος περιέγραψε τους νόμους της κληρονόμησης των ανθρώπινων

χαρακτηριστικών, η Μενδελιανή τυχαιοποιήση είναι μία μέθοδος που εκμεταλλεύεται τη

φυσιολογική διακύμανση των αλληλόμορφων στο γονιδίωμα του ανθρώπου προκειμένου να

εξαγάγει σχέσεις αιτιακές για την μακρόχρονη αθροιστική επίπτωση δυνητικά τροποποιήσιμων

παραγόντων κινδύνου, οι οποίοι σχετίζονται με την υγεία. Σύμφωνα με το δεύτερο νόμο

κληρονομικότητας του Mendel, ο οποίος και ονομάζεται νόμος της τυχαίας ανάθεσης

(ανεξάρτητης μεταβίβασης), τα αλληλόμορφα για κάθε γονίδιο (και κατ’ επέκταση, τα

σχετιζόμενα αλληλόμορφα με κάποιον φαινότυπο) αποδίδονται τυχαία και ανεξάρτητα μεταξύ

τους κατά τη δημιουργία των γαμετών και ως εκ τούτου είναι δυνατή η κληρονόμηση από τους

γονείς μιας πλειάδας διαφορετικών συνδυασμών των χαρακτηριστικών. Η μόνη προβληματική

αφορά σε χαρακτηριστικά τα οποία βρίσκονται πολύ κοντά χαρτογραφικά μεταξύ τους πάνω

στο γονιδίωμα, επομένως κληρονομούνται συχνότερα μαζί. Στη γενετική επιδημιολογία ως

βοηθητικές μεταβλητές χρησιμοποιούνται οι γενετικές μεταβλητές, οι οποίες θεωρούνται

δεδομένες και αμετάβλητες από περιβαλλοντικούς παράγοντες έπειτα της σύλληψης και άρα δεν

υπόκεινται σε συγχυτικούς παράγοντες. Συχνότεροι σε χρήση είναι οι σημειακοί πολυμορφισμοί

νουκλεοτιδίου (Single Nucleotide Polymorphism - SNPs) και χρησιμοποιούνται ως IVs ή “proxys”,

δηλαδή ως “οδηγοί” για τον εκάστοτε φαινότυπο του ατόμου και χωρίς να τεκμηριώνεται

αναγκαστικά πως οι ίδιο είναι υπαίτιοι για την εμφάνιση του φαινοτύπου (μπορούν να βρίσκονται

είτε σε ιντρόνια, αλληλουχίες δηλαδή που δε μεταφράζονται, είτε σε εξώνια, είτε σε μη

μεταγραφόμενες περιοχές). Με αυτόν τον τρόπο διαμορφώνεται το ανάλογο ενός πειράματος με

το φαινότυπο ενδιαφέροντος να αποτελεί το θεραπευτικό σχήμα - έκθεση για την υπό μελέτη

έκβαση σε ένα μέρος του υπό μελέτη πληθυσμού που φέρει κάποιο πολυμορφισμό

αλληλόμορφου, ενώ η έλλειψη αυτού του φαινοτύπου σε ένα άλλο μέρος του πληθυσμού

διαμορφώνει το “arm” του ελέγχου, σε μια τυχαιοποιημένη κλινική δοκιμή αν ήταν δυνατό μια

τέτοια να εφαρμοστεί, που μας επιτρέπει να εκτιμήσουμε την ύπαρξη και την ποσότητα

αιτιολογικής συσχέτισης μεταξύ των δύο φαινοτύπων ενδιαφέροντος.

Σημαντικό, για να μπορεί να χρησιμοποιηθεί ένας γενετικός τόπος ως βοηθητική μεταβλητή (IV)

είναι η επίδραση της στην έκβαση να περνάει αποκλειστικά μέσα από την έκθεση, με την οποία

συνδέεται ισχυρά (Smith, Ebrahim, 2003) Σε αυτό το σημείο, προκύπτει και η ανάγκη

οριοθέτησης μιας βοηθητικής μεταβλητής ως έγκυρης, προβληματική που θα απασχολεί κάθε

μελέτη μενδελιανής τυχαιοποίησης στο εφεξής.

ΟΙ 3 βασικές προϋποθέσεις (assumptions) που καθιστούν έγκυρη μια IV είναι οι παρακάτω:

1) Συσχέτιση (IV1): η IV (G) που χρησιμοποιείται πρέπει να συσχετίζεται με την έκθεση (X) υπό

μελέτη.23

2) Ανεξαρτησία (ή ανταλλαξιμότητα) (IV2): Η IV δεν πρέπει να συσχετίζεται με κάποιον

συγχυτικό (C) (παράγοντα της σχέσης έκθεσης (X)- έκβασης (Y)

Μη ύπαρξη οριζόντιας πλειοτροπίας (ή “exclusion restriction”) (IV3): η IV (G) επιδρά στην

έκβαση (Y) μόνο μέσω της έκθεσης (X), δεδομένων των συγχυτικών παραγόντων.

(Didelez, Sheehan 2007)

26

Επιπλέον προϋποθέσεις (additional assumptions) που χρησιμοποιούνται και η παραβίαση της θα

εισαγάγει την ανάγκη χρήσης επιπλέον στατιστικών μεθόδων για την περιφρούρηση του

συμπεράσματος είναι οι:

a.

b. Νo Measurement Error Assumption (ΝOME) : σύμφωνα με αυτή, οι συσχετίσεις των υπό

μελέτη γενετικών μεταβλητών (SNPs) με την έκθεση θεωρούνται γνωστές και, όχι προϊόν

εκτίμησης.

The Instrument Strength Independent of Direct Effect (InSIDE): σύμφωνα με αυτή, δεν υπάρχει

πλειοτροπικό. Μονοπάτι μεταξύ της γενετικής μεταβλητής και της έκαβσης, το οποίο δεν περνάει

με΄σα από τη δεδομένη έκθεση.

(Bowden et al, 2018, Burghess and Thompson, 2017)

Ένα σημαντικό ζήτημα στη μενδελιανή τυχαιοποίηση είναι η διαπίστωση της εγκυρότητας είτε

της παραβίασης των παραπάνω προϋποθέσεων. Στην πραγματικότητα, μονάχα στην πρώτη

προϋπόθεση (IV1) μπορεί να εφαρμοστεί αυστηρός έλεγχος με την επιλογή γενετικών

μεταβλητών οι οποίες συνδέονται στατιστικά σημαντικά (ισχυρά) με την έκθεση ενδιαφέροντος

και το γεγονός αυτής της συσχέτισης έχει τεκμηριωθεί και από ανεξάρτητες μελέτες σε μεγάλο

δείγμα. Διαφορετικά πρόκειται για “ασθενή μεταβλητή”, για την οποία η στατιστική απόδειξη για

τη συσχέτιση με την έκθεση είναι διαβλητή, επάγοντας το φαινόμενο της “μεροληψίας της

ασθενούς μεταβλητής” (“weak instrument bias”) και διαβάλλοντας το αποτέλεσμα της μεθόδου.

Οι υπόλοιπες δύο εκ των βασικών παραδοχών είναι δυσκολότερο να ελεγχθούν για την

εγκυρότητα τους, γεγονός που έχει εισαγάγει πολλές αναλύσεις ευαισθησίας για την εξέταση και

27

τεκμηρίωση κάθε συμπεράσματος αιτιακής επίδρασης στη μενδελιανή τυχαιοποίηση. Η

παραβίαση τους μπορεί να οφείλεται σε λόγους όπως οι παρακάτω:

A. Υποκείμενος βιολογικός μηχανισμός λόγω συσχέτισης της γενετικής μεταβλητής (G) μέσω

άλλου μονοπατιού πέραν της έκθεσης με την έκβαση (Y) (παραβίαση της IV2, είτε της IV3,

ανάλογα αν ο παράγοντας κινδύνου συνιστά, ή όχι, συγχυτικό παράγοντα της σχέσης

έκθεσης-έκβασης). Το φαινόμενο αυτό ονομάζεται οριζόντια πλειοτροπία (Εικόνα 1.5, (Β))

και σε αντίθεση με την κάθετη πλειοτροπία (Εικόνα 1.5 , (Α)), εισάγει μεροληψία στις μελέτες.

Μια διαφορετική αιτία παραβίασης των προϋποθέσεων της MR αποτελεί η “καναλοποίηση”

(canalization), γνωστή και ως αναπτυξιακή “αποζημίωση-υποκατάσταση” , και

περιγράφεται στις περιπτώσεις που παρά την ύπαρξη γενετικής επίδρασης το αποτέλεσμα

είναι μειωμένο ή απόν σε σχέση με το προβλεπόμενο ,

μέσω πιθανόν άλλα μηχανισμών υποκατάστασης (αναπτυξιακών, συμπεριφορικών κλπ).

B. Μη Μενδελιανή κληρονόμηση: η ύπαρξη γονιδίων τα οποία βρίσκονται πολύ κοντά σε ένα

χρωμόσωμα μπορεί να οδηγήσει σε γενετικές μεταβλητές που συσχετίζονται και παραβίαση

του δεύτερου νόμου της κληρονόμησης των χαρακτηριστικών του Μέντελ, οδηγώντας σε

αυτό που αναφέρεται ως “ανισορροπία σύνδεσης” μεταξύ των αλληλόμορφων (Linquage

Disequilibrum, LD) . Σε αυτήν την κατηγορία, εντάσσεται και το φαινόμενο της μεταβολής

της αιτιακής επίδρασης σε διαφορετικές υποομάδες του πληθυσμού και μπορεί να οφείλεται

σε πολλούς λόγους, όπως επιγενετικές μεταλλάξεις.

Πληθυσμιακές επιπτώσεις: Πολύ σημαντική είναι η επίδραση της πληθυσμιακής

διαστρωμάτωσης (population stratification), οφειλόμενη σε διακριτές υποκατηγορίες ατόμων

στον πληθυσμό υπό μελέτη, για την αποφυγή της οποίας επιλέγονται πληθυσμοί κοινής

καταγωγικής προέλευσης. Ταυτόχρονα, η ίδια η “επιβεβαίωση της συμμετοχής” στη μελέτη,

εφόσον συσχετίζεται με την υπό μελέτη γενετική μεταβλητή, εισαγάγει μεροληψία εφόσον το

δείγμα παύει να είναι αντιπροσωπευτικό για τον πληθυσμό υπόστρωμα που στοχεύει να

περιγράψει.

(Burgess S, and Thompson SG, 2015, Taylor, 2014, Lawlor et al, 2008)

28

1.3.1 Μεντελιανή τυχαιοποίηση δύο δειγμάτων (Two-sample Mendelian Randomization, 2-

sample MR, 2SMR)

Παραδοσιακά, η Μενδελιανή τυχαιοποίηση χρησιμοποεί ατομικά δεδομένα, ωστόσο, η δυσκολία

ανεύρεσης τέτοιων για κάθε υποκείμενο, όπως και τα προβλήματα στη στατιστική ανάλυση που

κάτι τέτοιο ενέχει, οδήγησε στην χρησιμοποίηση ευρέως της Μενδελιανής τυχαιοποίησης δύο

δειγμάτων. Σε αυτήν, στοιχεία συσχέτισης της γενετικής μεταβλητής με την έκθεση και την έκβαση

προκύπτουν από διαφορετικούς πληθυσμούς ( 2 δείγματα). Οι δυο πληθυσμοί πρέπει να είναι

κοινής καταγωγικής προέλευσης (Ευρωπαϊκής, Αφρικανικής κλπ) καθώς και μη

επικαλυπτόμμενοι μεταξύ τους (“non-overlapping” datasets, Angrist and Krueger, 1990). Νέες

δυνατότητες και περιορισμοί προκύπτουν από την ανάλυση δύο δειγμάτων, εκ των οποίων ένα

σημαντικό πλεονέκτημα είναι η αποφυγή της κατάρας του νικητή (“Winner’s curse”), το οποίο

προκύπτει όταν έχουν χρησιμοποιηθεί στοιχεία για την έκθεση και έκβαση από τα ίδια άτομα

(one-sample) με συνέπεια να υπερεκτιμάται η σχέση των γενετικών μεταβλητών με την έκθεση,

και να υποεκτιμάται η αιτιολογική συσχέτιση της έκθεσης με την έκβαση. (Taylor, 2017). Το ένα

σύνολο μελετά την επίδραση της γενετικής μεταβλητής στη μελετώμενη έκθεση, ενώ η άλλη την

επίδραση της γενετικής μεταβλητής που προέκυψε από το πρώτο, στην υπό μελέτη έκβαση. Τα

δείγματα επιπλέον μπορούν να είναι από περιληπτικά δεδομένα (summary- level data) σε

αντιδιαστολή με τα ατομικά δεδομένα (individual-level data). Τα περιληπτικά δεδομένα

εκμεταλλεύονται τη μεγάλη ποσότητα πληροφορίας που παρέχεται από τη μετα-ανάλυση

ευρυγονιδιωματικών μελετών (GWAS), καθώς και τη δημόσια διαθεσιμότητα τους για τους

ερευνητές. Σημαντικό πλεονέκτημα των περιληπτικών δεδομένων είναι η αύξηση της στατιστικής

ισχύος λόγω μεγαλύτερου μεγέθους δείγματος καθώς αυτά μπορεί να προκύψουν από

συνδυασμό μελετών, κυρίως σχετικά με εκβάσεις που έχουν διχοτομημένη (binary) έκβαση

(Burgess, 2016) .

1.3.2. Ευρογονιδιωματικές μελέτες συσχέτισης(Genome-Wide Association Studies, GWAS)

Πρόκεται για πειραματικές μελέτες χωρίς υπόθεση (hypothesis-free), αγνωστικιστικές στην

προσέγγιση τους, όπου μελετάται συστηματικά το ανθρώπινο γονιδίωμα χιλιάδων ή

εκατομμυρίων συμμετεχόντων με σκοπό την ανεύρεση ενός συνόλου γενετικών μεταβλητών,

συνήθως με τη μορφή των μονο-νουκλεοτιδικών πολυμορφισμών (SNPs), αναφορικά με τη

συσχέτιση τους με έναν ή παραπάνω φαινότυπους ενδιαφέροντος (παράγοντες κινδύνου ή

έκβαση). Σε αντίθεση, με τις “μελέτης συσχέτισης υποψήφιων γονιδίων” (Gene-specific-candidate

driven studies), oι μελέτες GWAS δεν αποσκοπούν στην ανεύρεση μεταλλάξεων/πολυμορφισμών

σε γονίδια που είναι ήδη γνωστά για τη βιολογική τους συσχέτιση με ένα γνώρισμα, αλλά

εκμεταλλευόμενες την εξέλιξη στην κατανόηση και ανάλυση του απλότυπου του ανθρώπινου

γονιδιώματος ψάχνουν στο κενό για γονιδιωματικούς τόπους (loci) ενδιαφέροντος για το

γνώρισμα, είτε είτε μέρος ενός γονιδίου είτε όχι. Λόγω τους μεγάλου αριθμού αναλύσεων που

πραγματοποιούνται είναι απαραίτητη η εφαρμογή διόρθωσης για πολλαπλές συγκρίσεις καθώς

και η τεκμηρίωση της επαναληψημότητας των ευρημάτων σε επαναληπτικές μελέτες (replication

studies) (Altshuler et al, 2008, Vissher et al, 2017).

1.3.3 Μέθοδος εκτίμησης της αιτιακής επίδρασης σε περιληπτικά δεδομένα μέσω της

Μενδελιανής τυχαιοποίησης

29

Για την εκτίμηση της αιτιακής επίδρασης μιας μονάχα γενετικής μεταβλητής σε κάποια έκβαση

χρησιμοποιούμε τον εκτιμητή Wald, γνωστή ως μέθοδο του λόγου των συντελεστώ. Στηρίζεται

στην εφαρμογή δυο διαφορετικών παλινδρομήσεων στη σχέση IV- έκθεση (G-X) και IV-έκβαση

(G-Y). Αν (G) η γενετική μεταβλητή, (X) η έκθεση, (Y) η συνεχής έκβαση, ο συντελεστής της

παλινδρόμησης της μεταβλητής στην έκθεση (Χ) και είναι ο συντελεστής της παλινδρόμησης

της μεταβλητής στην έκβαση (Υ), ο εκτιμητής Wald (W) ισούται με W = [1] (Wald,

1940, Lawlor et al, 2008, Burgess et al, 2017)

1.3.3.1 Μέθοδος σταθμισμένης αντίστροφης διακύμανσης

(Inverse weighting-variant method ,IVW)

Για την εκτίμηση της αιτιακής επίδρασης χρησιμοποιώντας πολλές γενετικές μεταβλητές που

έχουν προκύψει από πιθανά ετερογενείς μελέτες συνήθως εφαρμόζεται η μετα-αναλυτική

μέθοδος IVW, η οποία χρησιμοποιεί την αιτιακή επίδραση (εφόσον είναι προσδιορισμένη) από

κάθε ξεχωριστή μελέτη για να συνθέσει ένα κοινό εκτιμητή της αιτιακής επίδρασης. Θεωρούμε

πως υπάρχουν αλληλόμορφα γενετικών μεταβλητών (k σε αριθμό), όπου k=1,….ν (όπου

ν=φυσικός αριθμός), τα οποία ικανοποιούν τις προϋποθέσεις των έγκυρων βοηθητικών

μεταβλητών για τον υπό μελέτη φαινότυπο (Χ) στην έκβαση (Υ). Γι’ αυτά παρατηρείται μια μέση

αλλαγή στην εκτίμηση της έκθεσης (Χ) για κάθε επιπλέον αλληλόμορφο κινδύνου με μέσο

σφάλμα και μια παρατηρήσιμη μέση αλλαγή στην εκτίμηση της έκβασης (Y) για κάθε

επιπλέον αλληλόμορφο κινδύνου με μέσο σφάλμα . Η εκτίμηση της αιτιακής επίδρασης

γίνεται βασισμένη στο λόγο των συντελεστών για κάθε γενετική μεταβλητή μέσω της εφαρμογής

της μεθόδου IVW για εκτιμητές Wald [1], ενώ χρησιμοποιεί τη μέθοδο δέλτα για τον

υπολογισμό ασυμπτωματικών διακυμάνσεων για το λόγο δύο τυχαίων γενετικών μεταβλητών (

Βurgess and Thompson, 2015).

Η εκτίμηση της μεθόδου IVW είναι:

Η προσέγγιση του τυπικού σφάλματος είναι:

30

Πρόκειται για την ίδια εκτίμηση που θα λαμβάναμε από μια σταθμισμένη γραμμική

παλινδρόμηση των συντελεστών στους συντελεστές , δίχως σταθερό όρο,

χρησιμοποιώντας ως βάρη τα . (Βurgess and Thompson, 2015)

Η μέθοδος αυτή δε λαμβάνει υπόψιν της την αβεβαιότητα στην εκτίμηση της συσχέτισης της

γενετικής μεταβλητής με την έκθεση(Χ) και υποθέτει πως οι εκτιμήσεις των λόγων έχουν κανονική

κατανομή. Με δεδομένο ότι οι γενετικές μεταβλητές δεν βρίσκονται σε ανισορροπία σύνδεσης

(Linquage Disequilibrum) μεταξύ τους, προσεγγίζει ασυμπτωτικά τη μέθοδο των ελαχίστων

τετραγώνων δύο σταδίων (2SLS), και εφόσον οι γενετικές μεταβλητές είναι έγκυρες βοηθητικές

μεταβλητές , ο εκτιμητής IVW είναι ένας συνεπής εκτιμητής της αιτιακής επίδρασης (όσο αυξάνει

το δείγμα) δηλαδή μια σταθμισμένη μέση τιμή των λόγων των ατομικών εκτιμητών. (Burgess S,

Butterworth A, Thompson SG, 2013).

Οι παραπάνω υπολογισμοί αφορούν τη μετα-ανάλυση σταθερών επιδράσεων. Δεν επιτρέπεται

οποιαδήποτε πλειοτροπία και προϋποτίθεται μια σχέση προσθετικής γραμμικότητας στην

εκτίμηση. Η αιτιακή επίδραση που συνεισφέρει κάθε γενετική μεταβλητή ισούται με τη

σταθμισμένη εκτίμηση ενώ διαφορές ανευρίσκονται μόνο στην εκάστοτε διακύμανση τους.

Εν αντιθέσει, η μετά-ανάλυση τυχαίων επιδράσεων IVW (random effects IVW) επιτρέπει στις

εκτιμήσεις να διαφέρουν μεταξύ τους (διαφορετικές μέσες εκτιμήσεις) για κάθε γενετική

μεταβλητή. Περίσσεια διακύμανση από εκείνη που προβλέπει το μοντέλο σταθερών επιδράσεων

αντιμετωπίζεται ως ετερογένεια μεταξύ των επιδράσεων των SNPs, και αποδίδεται στο φαινόμενο

της οριζόντιας πλειοτροπίας. H εκτίμηση της IVW παραμένει αμερόληπτη εάν η οριζόντια

πλειοτροπία είναι ισορροπημένη (balanced horizontal pleiotropy). Η ύπαρξη ετερογένειας μπορεί

να εκτιμηθεί μέσω του στατιστικού μέτρου Cochran’s Q και (με μηδενική υπόθεση την απουσία

ετερογένειας). Η εκτίμηση στο μοντέλο τυχαίων επιδράσεων δε διαφέρει από εκείνη των

σταθερών επιδράσεων, ωστόσο η διακύμανση θα είναι πληθωρισμένη, καθώς προσμετράται

επιπλέον ετερογένεια και αβεβαιότητα στις εκτιμήσεις. (Burgess, Bowden, 2015) .

1.3.4 Αξιολόγηση των παραδοχών των βοηθητικών μεταβλητών - Αναλύσεις ευαισθησίας

1.3.4.1. Το στατιστικό F

Βάση της πρώτης προϋπόθεσης( IV1) για την εγκυρότητα των γενετικών μεταβλητών, τα

αλληλόμορφα που χρησιμοποιούνται πρέπει να συσχετίζονται ισχυρά με την έκθεση

ενδιαφέροντος. Ένα μέτρο στατιστικής αξιολόγησης της ισχύος αυτής της σχέσης είναι το

στατιστικό F, το οποίο προκύπτει από την ανάλυση παλινδρόμησης της γενετικής μεταβλητής

στην έκθεση. Γενικά το στατιστικό F συνδέεται με το ποσοστό της διακύμανσης το οποίο

επεξηγείται από τις γενετικές μεταβλητές ( ), το μέγεθος του δείγματος (Ν), και τον αριθμό των

μεταβλητών (Κ), σύμφωνα με τη συνάρτηση: . Επομένως, το

στατιστικό F αυξάνεται με την αύξηση του δείγματος και μειώνεται αν μειώσουμε τη χρήση των

παραμέτρων Κ που χρησιμοποιούμε στο μοντέλο (Burgess, Thompson, 2015). Ένας αυθαίρετος

“κανόνας των δαχτύλων” θέτει το κατώτερο όριο που χρησιμοποιείται για το στατιστικό F να

τουλάχιστον 10. Οι γενετικές μεταβλητές με F<10 θεωρούνται ασθενείς βοηθητικές μεταβλητές. To

αντίστροφο του μέτρου αυτού, υπό συγκεκριμένες περιπτώσεις, αξιολογεί τη μεροληψία του

γενετικού εκτιμητή : 1/F . Όταν F=10, σημαίνει πως η μεροληψία για τον IV αντιστοιχεί στο 10%

31

(Burgess, Thompson, 2011). Αυξημένο F σημαίνει επίσης παραβίαση της υπόθεσης NOME (No

Measurement Error Assumption), κατά την οποία η διακύμανση των εκτιμήσεων των

αλληλόμορφων με την έκθεση ισούται με 0, με άλλα λόγια δεν υπάρχει σφάλμα μέτρησης (Bowden

et al, 2016) .

1.3.4.2. Το στατιστικό

Το στατιστικό είναι μια προσαρμογή του ( μέτρο που χρησιμοποιείται στις μετά-αναλύσεις

προκειμένου να διερευνηθεί η ετερογένεια μεταξύ των μελετών) για την προσέγγιση της ισχύος

των IV και της εγκυρότητας της υπόθεσης NOME κατά την εφαρμογή της μεθόδου ευαισθησίας

MR-Egger , προσαρμοσμένο στο περιβάλλον της Μενδελιανής τυχαιοποίησης. Ορίζεται με βάση

το στατιστικό Q της σχέσης των αλληλόμορφων με την έκθεση ως όπου L

είναι ο αριθμός των μεταβλητών. Εκφράζει την πραγματική διακύμανση των εκτιμήσεων της

SNP-έκθεσης διαιρεμένο προς την εκτιμώμενη διακύμανση αυτής της σχέσης. Όταν οι

υποκείμενες συσχετίσεις των SNP-εκθέσεων είναι επαρκώς ετερογενείς, και η αβεβαιότητα στις

εκτιμήσεις των SNP-εκθέσεων είναι μικρή σε σχέση με την υποκείμενη μεταβλητότητα, το θα

είναι κοντά στο 1 και η επίδραση της εκτίμηση εξαιτίας της παραβίασης του ΝΟΜΕ θα είναι

αμελητέα. Αν οι υποκείμενες συσχετίσεις είναι σχετικά ομοιογενείς ή οι εκτιμήσεις του είναι

σχετικά ανακριβείς , το στατιστικό θα είναι πολύ μικρότερο του 1. Επιτρεπτό κατώτερο όριο

αποτελεί το 0.9 (αντιστοιχεί σε 10% σφάλμα μέτρησης της πραγματικής τιμής και σε στατιστικό

F = 10), ενώ ανώτατο όριο συνιστά το 1. (Bowden, Fabiolla de Greco, 2016).

1.3.4.3. Ανάλυση Παλινδρόμησης MR-Egger

(MR-Egger regression analysis)

Αποτελεί μια ανάλυση ευαισθησίας για την εκτίμηση της αιτιακής επίδρασης από άλλες μεθόδους

(IVW, IVW random effects) Μενδελιανής τυχαιοποίησης . Πρόκειται για μια προσαρμογή της

παλινδρόμησης Egger (χρησιμοποιούμενη ευρέως στις μετα-αναλυσεις για τον υπολογισμό του

σφάλματος μικρών μελετών) που μπορεί να εντοπίσει παραβιάσεις των βασικών προϋποθέσεων

της MR, παρέχοντας μια αιτιολογική εκτίμηση η οποία δεν υπόκειται σε αυτές τις παραβιάσεις,

αλλά είναι λιγότερο ισχυρή. Για να επιτευχθεί αυτό, απαιτεί πιο χαλαρές προϋποθέσεις από άλλες

μεθόδους μετά-αναλυτικής εκτίμησης (πχ IVW) , καθώς συμπεριφέρεται καλά ακόμη και με την

παρουσία θετικής πλειοτροπίας των IVs (παραβίαση της ΙV3). Ακόμη και αν όλες οι βοηθητικές

μεταβλητές είναι μη έγκυρες, εφόσον ισχύει η προϋπόθεση InSIDE (Instrument Strength

Independent of Direct Effects), η οποία ορίζεται ως η η ανεξαρτησία της συσχέτισης των

γενετικών επιδράσεων με την έκβαση υπό την παρουσία της συσχέτιση των γενετικών

επιδράσεων με την έκθεση, μπορεί να εφαρμοστεί αυτή η μετα-παλινδρομηση (meta-regression).

Η ΜR-Egger είναι μια γραμμική παλινδρόμηση που εισαγάγει ένα σταθερό όρο στο μοντέλο της,

το οποίο επιτρέπει τη διερεύνηση της ύπαρξης οριζόντιας πλειοτροπίας. Η μηδενική υπόθεση για

τη σταθερά (intercept) είναι πως ισούται με μηδέν και θα ισχύει η εναλλακτική υπόθεση όταν οι

εκτιμήσεις των ασθενέστερων γενετικών μεταβλητών παρασύρονται προς μια συγκεκριμένη

κατεύθυνση. Η InSIDE προϋπόθεση παραβιάζεται όταν οι πλειοτροπικές επιδράσεις δρουν μέσω

ενός συγχυτικού παράγοντα της σχέσης έκθεσης-έκβασης. Συνεπής εκτιμητής της αιτιακής

σχέσης μπορεί να προκύψει ακόμα και όταν όλες οι IVs παραβιάζουν τις προϋποθέσεις

εγκυρότητας, εφόσον Κίνα πολλές σε αριθμό. (Bowden, Smith, Burgess, 2015). Αν δεν υπάρχει

32

σταθερός όρος, η κλίση της καμπύλης της MR-Egger παλινδρόμησης θα ισούται με την εκτίμηση

της IVW.

1.3.4.4. Εκτιμητής σταθμισμένης διαμέσου

(Weighted Median estimator, WM)

Mια εναλλακτική μέθοδος ευαισθησίας που χρησιμοποιείται μετα-αναλυτικά για τη σύνθεση

πολλαπλών γενετικών βοηθητικών μεταβλητών σε μία αιτιακή εκτίμηση είναι ο εκτιμητής

σταθμισμένης διαμέσου, όπου όπως και ο εκτιμητής Egger, χαίρει συνέπειας ακόμα και σε

περίπτωση μη έγκυρων βοηθητικών μεταβλητών. Αποτελεί μια μετεξέλιξη του απλού διαμέσου

(Han, 2008), o οποίος μπορεί να θεωρηθεί ένας εκτιμητής σταθμισμένης διαμέσου με ίσα βάρη,

ενώ σε πεπερασμένα δείγματα φάινεται να μειώνει το λάθος τύπου 1. (Bowden, Davey Smith,

Haycock and Burgess , 2015). Απαιτεί τουλάχιστον το 50% των μεταβλητών να είναι έγκυρες IVs

. Διατάσσει τις εκτιμήσεις αναλογίας όλων των αλληλόμορφων, αποδίδει βάρη σε κάθε μία από

αυτές ανάλογα με την ισχύ των μεταβλητών και έπειτα βρίσκει τη διάμεση εκτίμηση τους. Ως

κανονικοποιημένο (“standardised”) βάρη, ανάλογα με τη μέθοδο IVW, χρησιμοποιούνται οι

αντίστροφες διακυμάνσεις του λόγο των εκτιμητών, που έχουν εκτιμηθεί με τη μέθοδο δέλτα,

χρησιμοποιώντας όρους πρώτης τάξης( Thomas et al, 2007). Tα μη κανονικοποιημένα βάρη είναι

πανομοιότυπα με εκείνα της IVW.

1.3.4.5. MR-PRESSO

(Mendelian Randomization Pleiotropy Residual Sum and Outlier Test)

Πρόκειται για μια στατιστική μέθοδος που μπορεί να διακρίνει και να διορθώσει πλειοτροπικές

έκτοπες / αποκλίνουσες (οutliers) τιμές στις πολυ-μεταβλητές μελέτες μενδελιανής τυχαιοποίησης

που χρησιμοποιούν περιληπτικά δεδομένα. Σε ένα πλαίσιο παλινδρόμησης, όπου οι συσχετίσεις

των μεταβλητών με την έκβαση παλινδρομούνται πάνω στις συσχετίσεις των ίδιων μεταβλητών

με την έκθεση, ώστε η κλίση της καμπύλης να δίνει μια εκτίμηση της αιτιακής επίδρασης της

έκθεσης με την έκβαση. Περιλαμβάνει 3 μέρη:

A. την ανεύρεση οριζόντιας πλειοτροπίας μέσω του MR-PRESSO global test: αξιολογεί τη

συνολική οριζόντια πλειοτροπία μεταξύ όλων των γενετικών μεταβλητών σε ένα MR test

συγκρίνοντας την παρατηρούμενη απόσταση όλων των μεταβλητών από τη γραμμή

παλινδρόμησης σε σχέση με την αναμενόμενη υπό τη μηδενική υπόθεση της μη ύπαρξης

πλειοτροπίας.

B. διόρθωση της οριζόντιας πλειοτρπίας μέσω της αφαίρεσης των έκτοπων τιμών (MR-PRESSO

outlier test), εξετάζοντας κάθε μεταβλητή ξεχωριστά ως προς το παρατηρήσιμο και το

αναμενόμενο. Απαιτεί τουλάχιστον το 50% των IVs να είναι έγκυρες και στηρίζεται στην

προϋπόθεση InSIDE (βλέπε υποκεφάλαιο 1.3 - Μενδελιανή τυχαιοποίηση).

33

C. έλεγχος για αξιοσημείωτες (στατιστικά σημαντικές) διαφορές της αιτιακής εκτίμησης πριν

και μετά τη διόρθωση για τις έκτοπες τιμές, με μηδενική υπόθεση τη μη ύπαρξης στατιστικά

σημαντικής διαφοράς ( MR-PRESSO distortion test) (Verbanck et al, 2018)

1.3.5 Πολυπαραγοντική Μενδελιανή τυχαιοποίηση

(Multivariable Mendelian Randomization, MVMR)

Στις περιπτώσεις όπου υπάρχει παραβίαση των ΙV2 και IV3 μεταβλητών είτε λόγω της ύπαρξης

συγχυτικού παράγοντα είτε λόγω οριζόντιας πλειοτροπίας (παραβίαση της IV3), τα

αποτελέσματα της IVW είναι μη έγκυρα. Οι γενετικές μεταβλητές μπορούν να συσχετίζονται με

πολλούς διαφορετικούς παράγοντες κινδύνου οι οποίοι μπορούν να συνεισφέρουν στη

μελετώμενη έκβαση Η πολυπαραγοντικη Μενδελιανή τυχαιοποίηση αποτελεί μια επέκταση της

μονο-παραγοντικής Μενδελυανής τυχαιοποίησης και χρησιμοποιώντας μεθόδους βοηθητικών

γενετικών μεταβλητών, περιλαμβάνει σε ένα κοινό μοντέλο εκτίμησης τους διάφορους

παράγοντες κινδύνου ή πιθανούς συχγυτικούς με σκοπό τη διασαφήνιση της συνεισφοράς του

καθενός. Σε αντίθεση με τη μονο-παραγοντική MR, η πολυπαραγοντική MR δε μελετά τη

συνολική επίδραση (total effect) αλλά την άμεση επίδραση (direct effect) που έχει ο κάθε

παράγοντας κινδύνου που εμπεριέχεται στο μοντέλο, διατηρώντας σταθερό τον άλλο.

Έστω ότι υπάρχει ένας αριθμός γενετικών μεταβλητών (G) που σχετίζεται με συγκεκριμένους

φαινότυπος-εκθέσεις (έστω , ), ενώ (Y) η μελετώμενη έκβαση και (U) κάποιος συγχυτικός

παράγοντας. Για να είναι έγκυρες μεταβλητές θα πρέπει, κατ’ αναλογία με τη univariate- MR, να

τηρούν τις παρακάτω προϋποθέσεις:

1) Να συσχετίζονται με έναν ή παραπάνω παράγοντες κινδύνου (δε χρειάζεται να σχετίζονται

με όλους) (MV-IV1)

2) Να μη συσχετίζονται με καμία (γνωστή ή άγνωστη) συγχυτική παράμετρο της σχέσης

έκθεσης- έκβασης (MV-IV2)

3) Να είναι δεσμευμένα (conditional) ανεξάρτητη από το αποτέλεσμα με δεδομένους τους

παράγοντες κινδύνου και τους συγχυτικούς παράγοντες (MV-IV3)

(Sanderson 2021, Sanderson 2020, Burgess and Thompson 2015)

1.3.5.1 Έλεγχος των προϋποθέσεων της MVMR

Αναφορικά με την (MV-IV1), η κάθε μία έκθεση θα πρέπει συσχετίζεται ισχυρά με τις SNPs τόσο

ανεξάρτητα, όσο και δεδομένων των άλλων εκθέσεων του μοντέλου (Sanderson and Windmeijer

2016), διαφορετικά οι εκτιμήσεις κινδυνεύουν από τη μεροληψία ασθενών μεταβλητών.

Αναφορικά με τις (ΜV-IV2), (MV-IV3) είναι σημαντικό να μην υπάρχει άλλη οδός επίδρασης

της γενετικής μεταβλητής στην έκβαση πέραν των εκθέσεων που περιλαμβάνονται στο μοντέλο.

Επομένως, η εκτίμηση είναι συμβατή με κάποια δεδομένη οριζόντια πλειοτροπία, από τη στιγμή

34

που αυτή εξαντλείται από τις μεταβλητές του μοντέλου. Με αυτόν τον τρόπο, λειτουργεί ως μια

επιπλέον προσαρμογή της MR, είτε και ως ανάλυση ευαισθησίας στις περιπτώσεις ύπαρξης

οριζόντιας πλειοτροπίας, που ξεπερνάει αυτή τη μεροληψία (Sanderson and Windmeijer, 2016).

Απαραίτητη προϋπόθεση επίσης είναι να χρησιμοποιηθούν τουλάχιστον τόσες γενετικές

μεταβλητές, όσες είναι οι εκθέσεις ενδιαφέροντος που έχουν συμπεριληφθεί στο μοντέλο.

1.3.5.2 Σχέσεις των εκθέσεων μεταξύ τους σε πολυπαραγοντικό μοντέλο Μενδελιανής

τυχαιοποίησης

Έστω G γενετική μεταβλητή η οποία σχετίζεται με τις υπό μελέτη εκθέσεις , η πρωτεύουσα

έκθεση υπό μελέτη και η άμεση επίδραση της στην έκβαση ( ) -> (Y), ενώ μια δευτερεύουσα

έκθεση και η άμεση επίδραση της ( ) -> (Y) και (U) θεωρείται ο συχυτικός παράγοντας

(γνωστός ή άγνωστος). Ας θεωρήσουμε πως οι σχέσεις μεταξύ των μεταβλητών είναι γραμμικές.

Τότε, η έκθεση μπορεί να λειτουργήσει με τους εξής τρόπους (Εικόνα 1.6):

I. ως μεσολαβητής (mediator) της σχέσης -Y : υπάρχει ένα μέρος της σχέσης το οποίο

επηρεάζει την έκβαση μέσω της έκθεσης ( -> ). Σε μια μονοπαραγοντική μελέτη, το

μέγεθος της αιτιακής επίδρασης αυτής της σχέσης θα αποδιδόταν μονάχα στη , ωστόσο

με τη συμπερίληψη της στο μοντέλο, διαφαίνεται η διαφορετική συνεισφορά ( ) αυτής της

έκθεσης στην έκβαση. Συγκεκριμένα, η πρωτεύουσα έκθεση επιδρά στη (με ποσότητα

επίδρασης ), επομένως η αναγνωρίζεται ως μεσολαβητής (mediator) της . Το

πολυπαραγοντικό μοντέλο μπορεί να υπολογίσει τόσο την άμεση επίδραση ( ) της στην

έκβαση, διατηρώντας σταθερό τον παράγοντα , όσο και της στην έκβαση, διατηρώντας

σταθερή τη . Η συνολική τώρα επίδραση (total effect) των δύο εκθέσεων θα ισούνται με

+ , και πολύ πιθανόν να είναι πολύ διαφορετική της άμεσης.

II. ως (οριζοντίως) πλειοτροπική συσχέτιση της γενετικής μεταβλητής G και με τις δύο εκθέσεις

( , ) , άλλωστε αυτή είναι μια επιτρεπόμενη συνθήκη από το πολυπαραγοντικό μοντέλο.

Όταν =0, άρα δεν υπάρχει συσχέτιση μεταξύ των και :, τότε η άμεση επίδραση της

στην Υ θα είναι ίση με ενώ η συνολική ίση με .

35

Άλλες πιθανές σχέσεις της ( Εικόνα 1.6) είναι οι εξής:

III. Ως συγχυτικός παράγοντας, επιδρώντας τόσο στη όσο και στη (scenario 1, εικόνα 1.7):

Σε αυτή την περίπτωση τόσο οι εκτιμήσεις της μονο-παραγοντικής όσο και της πολύ-

παραγοντικής MR , είναι διαβλητές.

IV. Ως επιταχυντής (collider) της σχέσης -Y (scenario 2, εικόνα 1.7): σε αυτήν την περίπτωση

τόσο η έκβαση Y όσο και η έκθεση επηρεάζουν την πρωταρχική έκθεση με αποτέλεσμα

να εισαγάγουμε μεροληψία στην εκτίμηση όταν διορθώνουμε για τη έκθεση. Είναι μια

μορφή σφάλματος επιλογής λόγω χαμηλής απόκρισης για συμμετοχή στη θεραπεία,

περιπτώσεων “lost-to-follow-up” ή ελλειπουσών τιμών, το οποίο μπορεί να προσαυξήσει ή

να ελαχιστοποιήσει τη σχέση. (Sanderson, 2018)

36

1.3.5.3 Μέθοδος εκτίμησης της αιτιακής επίδρασης σε περιληπτικά δεδομένα σε πολυ-

παραγοντική μενδελιανή τυχαιοποίηση

Ενώ σε ατομικά δεδομένα είναι δυνατό να χρησιμοποιήσουμε τη μέθοδο δυο σταδίων των

ελαχίστων τετραγώνων (2-Stage Least Square, 2SLS), στα περιληπτικά δεδομένα αυτό δεν είναι

δυνατό. Οι Burgess et al, έχουν εφαρμόσει, κατ’ αναλογία της μονοπαραγοντικής MR, τη μέθοδο

της σταθμισμένης αντίστροφης διακύμανσης (IVW) για την εκτίμηση ενός συνολικού εκτιμητή

της αιτιακής επίδρασης (Sanderson, 2019, Burgess S, Bowden 2015).

1.3.5.4 Αξιολόγηση της εγκυρότητας και της ισχύος των μεταβλητών σε πολύ-παραγοντική

Μενδελιανή τυχαιοποίηση περιληπτικών δεδομένων

Για MVMR ενός δείγματος προκειμένου να αξιολογηθεί η ισχύς των γενετικών μεταβλητών

χρησιμοποιείται το Sanderson-Windmeijer conditional F-statistic ( ), για το οποίο ισχύει ο

εμπειρικός κανόνας του χεριού (“rule of thumb”), > 10. Υπολογίζεται με τα εξής βήματα:

α) Η έκθεση Χ2 υφίσταται παλινδρόμηση σε όλες τις γενετικές μεταβλητές και προκύπτει το

εκτιμώμεο Χ2. β) Η έεκθεση Χ1 θα παλινδρομηθει στη Χ2 ώστε να προκύψει η εκτίμηση το TSLS δ

και υπολιγίζεται και το υπολειπομενο σφάλμα Χ1-δΧ2 (εκτιμηση μονο το δ εδω) γ) τα σφάλματα

παλινδρομούνται σε όλες τις γενετικές μεταβλητές και προκύπτει το στατιστικό Φ ως το η

επίδραση των μεταβλητών σε αυτη την παλινδρόμηση δ) το conditional F-statistic διορθώνεται

για τους βαθμούς ελευθεριας και ελέγχεται για στις οριακές τιμές των αδυναμων μεταβλητων (10

με βάση του “rule of thumb) (Sanderson, Davey Smith, Windmeijer, Bowden , 2019)

G

G

37

Για MVMR με δεδομένα από 2 μελέτες που αφορά και στις περισσότερες σύγχρονες MVMR

μελέτες, η αξιολόγηση της ισχύος των μεταβλητών και ευστάθειας των προϋποθέσεων της

MVMR ανάλυσης είναι ακόμα υπό έρευνα και δεν έχουν υλοποιηθεί σε κάποιο υπολογιστικό

πρόγραμμα. Οι ερευνητές Sanderson, Davey Smith, Windmeijer και Bowden προτείνουν τη χρήση

των παρακάτω στατιστικών μεθόδων:

(A) τροποποιημένο στατιστικό Cochran’s Q - έλεγχος υπο- ταυτοποίησης (Q strength in MVMR R package). Σε αυτό το τεστ, το τροποποιημένο στατιστικό Q, η ανάλυση του οποίου

υπάρχει αναλυτικά στους Sanderson, Davey Smith, Windmeijer, Bowden , 2019 , η μηδενική

υπόθεση υποστηρίζεται ότι οι μεταβλητές δεν περιέχουν αρκετή πληροφορία για να

προβλέψουν και τις δυο εκθέσεις (ή περισσότερες) και το θα κατανέμεται συμπτωτικά σε

κατανομή (όπου L είναι ο αριθμός των μεταβλητών). Απόρριψη της μηδενικής υπόθεσης

(ανεύρεση ετερογένειας) σημαίνει πως το είναι μεγαλύτερο από κάποια οριακή τιμή και

βεβαιώνει πως υπάρχει αρκετή πληροφορία στο μοντέλο για την ταυτοποίηση με ασφάλεια

της . Το Q μπορεί να υπολογισθεί με τον ίδιο τροπο για τη .

(B) τροποποιημένο στατιστικό Cochran’s ; τεστ για την εγκυρότητα των μεταβλητών (Q valid in MVMR R package) Σε αυτό το τροποποιημένο Cochran’s Q test , το οποίο είναι μια άμεση

γενίκευση του προσαρμοσμένου Q στατιστικού (που έχει προταθεί από τους Bowden et al,

2017) για τις μονοπαραγοντικές MR μελέτες. Η μηδενική υπόθεση εικάζει πως οι γενετικές

μεταβλητές δεν έχουν πλειοτροπικές επιδράσεις στην έκβαση και το στατιστικό έχει

ασυμπτωματική κατανομή στους (L-2) βαθμούς ελευθερίας , όπου L είναι ο αριθμός των

γενετικών μεταβλητών. Η εναλλακτική υπόθεση υπολογίζει υπερβολική ετερογένεια,

επομένως αμφισβητεί της προϋποθέσεις IV2/IV3, και προκύπτει όταν το ξεπερνάει την

οριακή τιμή για την ανάλογη κατανομή .

Και για τις δύο παραπάνω δοκιμασίες είναι σημαντικό να προσδιορισθεί ο όρος της

συνδιακύμανσης. Ο όρος αυτός μπορεί να υπολογιστεί ωστόσο μονάχα για ατομικά (ιndividual

level) δεδομένα. Μία προτεινόμενη λύση από τους Sanderson, Davey Smith, Windmeijer και

Bowden είναι η χρήση της μηδενικής τιμής, εφόσον έχουν υπολογιστεί οι γενετικές συσχετίσεις με

την κάθε έκθεση και την έκβαση σε διαφορετικά δείγματα (Χ+1, όπου Χ ειναι ο αριθμός των

εκθέσεων) (Sanderson et al, 2019)

1.3.5.5. Έλεγχος πλειοτροπίας σε MVMR - Multivariable MR Egger regression

Χρησιμοποιείται το προσαρμοσμένο στατιστικό (βλέπε παραπάνω) όπως και πολυ-μεταβλητη

(multi-variate) MR Egger παλινδρόμηση. Η μέθοδος MR-Egger και εδώ περιλαμβάνει έναν

σταθερό όρο, που όταν διαφέρει στατιστικά σημαντικά από το 0 τα δεδομένα εμφανίζουν μη

ισορροπημένη οριζόντια πλειοτροπία. Ωστόσο δε θα αναλυθεί περεταίρω καθώς δε θα

εφαρμοστεί στην παρούσα μελέτη (Rees, Wood, Burgess, 2017).

1.3.5.7. Ευρυ-γονιδιωματικές αναλύσεις, παχυσαρκία και καρκίνος του μαστού: η μενδελιανή

προσέγγιση

38

Έχοντας παρουσιάσει τη λογική των μελετών Μενδελιανής τυχαιοποίησης, θα αναφερθώ εκ των

υστέρων σε κάποιες ήδη υπάρχουσες μελέτες μενδελιανής τυχαιοποίησης, δημοσιευμένες όλες σε

παράθυρο δεκαετίας, οι οποίες διερεύνησαν τη σχέση της γενετικά προβλεπόμενης παχυσαρκίας

με τον κίνδυνο εμφάνισης σε οποιαδήποτε ηλικία του καρκίνου εμφάνισης του μαστού. Στις

μελέτες των Ahmed et al, 2021, Freuer et al, 2021, Vithayathil et al, 2021 , Richardson et al, 2020,

Nick Seen Ooi et al, 2019, Guo et al, 2016 επιβεβαιώνονται ευρήματα αντίστροφης αιτιότητας της

αιτιακής επίδρασης της γενικής παχυσαρκίας (ΒΜΙ) στον κίνδυνο εμφάνισης του καρκίνου του

μαστού. Στη μελέτη των Guo et al, 2016, για παράδειγμα μελετήθηκε ένας πληθυσμός 146,000

περίπου γυναικών Ευρωπαϊκής καταγωγής προέκυψε ένα νέο αποτέλεσμα σε σχέση με τις ήδη

υπάρχουσες μελέτες παρατήρησης που περιγράψαμε: το αυξημένο ΒΜΙ φάνηκε προστατευτικό

στον κίνδυνο εμφάνισης του καρκίνου του μαστού ανεξάρτητα από το εμμηνοπαυσιακό

στάτους των γυναικών. Επομένως, στις προ-εμμηνοπαυσιακές γυναίκες η πρόβλεψη φαίνεται να

ταυτίζεται με το παρατηρίσιμο έως τώρα, μάλιστα με ακόμα πιο ισχυρό τρόπο δηλαδή 46%

μείωση του κινδύνου για κάθε 5 αύξηση στο BMI. Παρόμοια αντίστροφη συσχέτιση

περιγράφηκε και για τις μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες (σε παρόμοιο μάλιστα ποσό) γεγονός που

θέτει εκ νέου ερωτήματα στην κατανόηση των περίπλοκων μηχανισμών συσχέτισης της γενετικής

και περιβαλλοντικής αλληλεπίδρασης για το ΒΜΙ και την καρκινογένεση. Το ποσοστιαίο μέρος

της πρόβλεψης από τις γενετικές μεταβλητές που έχουν εντοπιστεί ως τώρα υπολογίζεται στο

2.7%. Η γενετική προδιάθεση για αυξημένο ΒΜΙ φαίνεται να αποδίδει ακριβέστερα το βάρος του

ατόμου σε νεότερη ηλικία (παιδική, εφηβική), ενώ μετέπειτα η ταυτότητα της πρόβλεψης με την

παρατήρηση φαίνεται να αποκλίνει. Λόγω αυτού, τίθεται ως εύλογο ερώτημα αν η αύξηση

βάρους (δυναμική κατάσταση που περιλαμβάνει και την επίδραση άλλων παραγόντων) στην

ενήλικη ζωή, και όχι η απόλυτη τιμή του ΒΜΙ, διαδραματίζει ουσιαστικότερο παράγοντα

κινδύνου για τον καρκίνο του μαστού και σημείο εστίασης για τις μελέτες του μέλλοντος.

Στη μεγάλη έρευνα των Guo et al [1] , έγινε στάθμιση των ευρημάτων και με βάση παράγοντες

κινδύνου όπως η ηλικία εμμηναρχής, το κάπνισμα όπου φάνηκε η συσχέτιση να διαμεσολαβείται

από το ΔΜΣ και επομένως το effect του να περιορίζεται χωρίς να αντιστρέφεται. Τέλος, ιδιη

αντίστροφη συσχέτιση φαίνεται αν έχει και ο γενετικά προβλεπόμενος παιδικός ΔΜΣ καθώς και

ο λόγος περιμέτρου μέσης/γοφών (θα αναλυθεί παρακάτω) ατον κίνδυνο εμφάνισης καρκίνο του

μαστού [2] χωρίς ωστόσο να είναι γνωστοί το εμμηνοπαυσιακό status των γυναικών.

Λεπτομέρειες για τις περισσότερες μελέτες μενδελιανής τυχαιοποίησης που αναφέρθηκαν, καθώς

και παραπάνω μελέτες, θα ανφερθούν στο 4ο Κεφάλαιο της μελέτης.

1.4 Σκοπός της μελέτης

Σκοπός αυτής της μελέτης είναι αρχικά η αναζήτησή στη βιβλιογραφία δημοσιευμένων

ευρυγονιδιωματικών μελετών GWAS και ο εντοπισμός σε αυτές αξιοσημείωτων σημειακών μονο-

νουκλεοτιδικών πολυμορφισμών (στο τυπικό επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας αποδεκτό για

αυτές τις μελέτες P= ), οι οποίες σχετίζονται με τη γενική παχυσαρκία (general obesity),

όπως αυτή ορίζεται από το BMI, και την κεντρική παχυσαρκία (central obesity), όπως αυτή

ορίζεται από το WHR. Μέσω της εφαρμογής της στατιστικής μεθόδου της Μενδελιανής

τυχαιοποίησης 2 δειγμάτων, στη συνέχεια, στοχεύει στην εξέταση της ύπαρξης και του μεγέθους

της αιτιακής επίδρασης μεταξύ των φαινοτύπων αυτών και του καρκίνου του μαστού (ολικού

και υπότυπων). Στη συνέχεια, διερευνάται η σχέση μεσολάβησης με την παχυσαρκία που τυχόν

έχουν άλλες φαινοτυπικές εκθέσεις που έχουν συσχετισθεί με την εν λόγω κακοήθεια (μέσω της

39

μεθόδου 2-step MR). Τέλος, με τη συμπερίληψη αυτών σε πολυπαραγοντικά μοντέλα μενδελιανής

τυχαιοποίησης, εξετάζεται η μεταβολή της άμεσης αιτιακής επίδρασης της παχυσαρκίας (γενικής

και κεντρικής) με την παρουσία τους.

Κεφάλαιο 2ο: Μέθοδοι

2.0. Άντληση γονοτυπικών δεδομένων

2.1 Συσχέτιση των SNP με τον κίνδυνο εμφάνισης του καρκίνου του μαστού (μελετώμενη έκβαση)

O κίνδυνος εμφάνισης του καρκίνου του μαστού, η έκβαση ενδιαφέροντος της συγκεκριμένης

μελέτης, διερευνήθηκε ως ολικός κίνδυνος και ως κίνδυνος ανάλογα με το μοριακό υπότυπο. Τα

δεδομένα προήλθαν από τη μελέτη των Zhang et al, 2020.

Όσων αφορά στον ολικό κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου του μαστού, πραγματοποιήθηκε μελέτη

GWAS σε συνολικά γονοτυπικά δεδομένα από 133.384 ασθενείς και 113.789 μάρτυρες,

Ευρωπαϊκής καταγωγής. Από αυτά, δεδομένα 118.774 ασθενών και 96.201 μαρτύρων προήλθαν

από 82 μελέτες συμμετέχουσες στο συνασπισμό BCAC από περισσότερες από 20 χώρες (βάση

δεδομένων έκδοση 10 της BCAC). Οι περισσότερες μελέτες από αυτές ήταν έρευνες ασθενών -

μαρτύρων στο γενικό πληθυσμό, στα πλαίσια της ενδονοσοκομειακής παρακολούθησης, είτε

μέρος (“nested”) μιας μεγαλύτερης μελέτης κοορτής ενώ ένα υποσύνολο ερευνών αφορούσε σε

δεδομένα από έρευνες σε υποκείμενα με θετικό οικογενειακό ιστορικό της νόσου. Στους ασθενείς

συμπεριλήφθησαν περιπτώσεις καρκίνου με διηθητική νόσο, καρκίνωμα in situ και αγνώστου

διηθήσεως. Τα κλινικά και ιστολογικά χαρακτηριστικά των συμμετεχόντων συλλέχθησαν από

την εκάστοτε επιμέρους μελέτη, συγκεντρώθηκαν σε μια κεντρική βάση δεδομένων και

υποβλήθηκαν σε ελέγχους ποιότητας. Τα διαθέσιμα δεδομένα γονοτυποποιήθκαν (genotype)

βάση των δυο γονοτυπικών πινάκων γονιδιωματικού εύρους σχετικά με τους ορμονο-

παραγώμενους καρκίνους της Illumina, που είναι διαθέσιμοι: τον iCOGs και τον OncoArray. Για

ένα υποσύνολο των συμμετεχόντων, για τους οποίους ήταν διαθέσιμα γονοτυπικά δεδομένα και

από τους δύο πίνακες, επιλέχθηκαν εκείνα με βάση τον OncoArray. Από τις παραπάνω μελέτες

αποκλείστηκαν τα δεδομένα της Νορβηγίας καθώς δεν υπήρχαν δεδομένα μαρτύρων (ήταν

διαθέσιμα δεδομένα αποκλειστικά ασθενών). Αποκλειστικά για τον ολικό κίνδυνο

συμπεριλήφθησαν και περιληπτικά δεδομένα από 11 άλλες μελέτες για τον καρκίνο του μαστού,

οι οποίες προσέφεραν γονοτυπικά δεδομένα για 14.910 ασθενείς και 17.588 μάρτυρες, χωρίς

ωστόσο να παρέχεται παραπάνω πληροφορία για τον υπότυπο του όγκου. Αυτή η συμπερίληψη

στη μελέτη των Zhang et al, προσέδωσε ισχύ λόγω αύξησης του διαθέσιμου δείγματος.Μια

δεύτερη ομάδα δεδομένων με 9.414 ασθενείς και 9.494 μάρτυρες - φορείς της μετάλλαξης BRCA1

Ευρωπαϊκής καταγωγής προήλθαν από 58 μελέτες που συμμετείχαν στο συνασπισμό της

CIMBA. Το αποτέλεσμα αυτό προέκυψε από τα διαθέσιμα γονοτυπικά δεδομένα αφότου τέθηκαν

σε έλεγχο ποιότητας και αφαιρέθηκαν οι συμμετέχοντες που συνυπήρχαν στη βάση δεδομένων

της BCAC. Το μεγαλύτερο ποσοστό των διαθέσιμων δεδομένων είχε γονοτυποποιηθεί σε

OncoArray πίνακα ενώ ένας μικρότερος αριθμός 1.630 ασθενών και 1.712 μαρτύρων είχε

γονοτυποποιηθεί βάση του πίνακα iCOGs.

40

Όσων αφορά στον κίνδυνο εμφάνισης των υποτύπων του καρκίνου του μαστού ελέγχθηκε η

ετερογένεια βάση της παρουσίας οιστρογονικών υποδοχέων, προγεσταγονικών υποδοχέων, τον

ανθρώπινο επιδερμιδικό παράγοντα ανάπτυξης (HER2) υποδοχέων και βαθμού διαφοροποίησης

του όγκου (μικρό, ενδιάμεσο και υψηλό). Οι φαινότυποι που εξετάσθηκαν ήταν οι “Luminal A-

like”, “Luminal B-HER2-negative-like”, “Luminal B-like”, “HER-2 enriched-like”, “Triple-

negative”, “CIMBA-BRCA1-carriers”. Συμπεριλήφθησαν 81 μελέτες του συνασπισμού της BCAC ,

οι οποίες αφορούσαν μονάχα το διηθητικό καρκίνο του μαστού και διαμόρφωσαν ένα συνολικό

δείγμα από 106.278 περιπτώσεις ασθενών και 91.477 περιπτώσεις μαρτύρων. Αποκλείστηκαν

περιπτώσεις καρκίνων in situ, περιπτώσεις διηθητικού καρκίνου οι οποίες δεν είχαν πληροφορίες

για την ηλικία εμφάνισης και συμμετοχής στη μελέτη, όλων των μελετών από ένα κράτος εφόσον

έλλειπαν δεδομένα είτε μαρτύρων (πχ. Νορβηγία) είτε για όλους τους υπότυπους καρκίνου υπό

μελέτη, καθώς και τα περιληπτικά δεδομένα από 11 άλλες GWAS μελέτες που δεν παρείχαν

χαρακτηριστικά των όγκων (αναφέρεται παραπάνω πως χρησιμοποιήθηκαν μονάχα για τον

ολικό κίνδυνο)

2.1.1. Προοπτικές μελέτες που συμμετέχουν στην έρευνα για τον καρκίνο του μαστού

2.1.1.1. BCAC - Breast Cancer Association Consortium

Το Breast Cancer Association Consortium είναι ένας διεθνής διεπιστημονικός συνασπισμός

ερευνητικών ομάδων ενδιαφερόμενων στον κληρονομήσιμο κίνδυνο του καρκίνου του μαστού.

Ιδρύθηκε το 2005 και διευθύνεtαι από επιστήμονες του Πανεπιστημίου του Cambridge. Στόχος

του είναι η αναγνώριση γονιδίων που συσχετίζονται με τον κίνδυνο του καρκίνου του μαστού

χρησιμοποιώντας συνδυασμένα δεδομένα από πολλές έρευνες προκειμένου να εκτιμηθεί

αξιόπιστα η επικινδυνότητα υποψήφιων γονιδίων/γονιδιακών τόπων. Η κάθε μελέτη που

συμμετέχει καταχωρεί δημογραφικά δεδομένα, σημαντικά επιδημιολογικά (σχετικά με

παράγοντες κινδύνου για τον καρκίνο του μαστού), κλινικά δεδομένα (σχετιζόμενα με τη

διάγνωση, την παθολογοανατομία, τη θεραπεία και την έκβαση) και γενετικά δεδομένα για τους

συμμετέχοντες/συμμετέχουσες. Υπάρχουν πάνω από 100 ομάδες (με στοιχεία από περισσότερες

από 420.000 γυναίκες) που επί του παρόντος λαμβάνουν μέρος στο συνασπισμό αυτό, και πρέπει

να πληρούν μια εκ των παρακάτω προϋποθέσεων: α) συμπερίληψη τουλάχιστον 500

περιπτώσεων ασθενών με διηθητικό καρκίνωμα του μαστού και 500 περιπτώσεων υγιών

μαρτύρων από τον ίδιο πληθυσμό, με διαθέσιμα DNA δείγματα για να πραγματοποιηθεί

γονοτυπική ανάλυση, β) τουλάχιστον 1000 περιπτώσεις καρκίνου του μαστού με follow-up και

πληροφορίες για την ολική επιβίωση. Ο BCAC περιλαμβάνει δεδομένα γονοτυπικής ανάλυσης

από δυο μεγάλους γονοτυπικούς πίνακες (arrays) σχεδιασμένους για τη μελέτη της συσχέτισης

ορμονο-σχετιζόμενων καρκίνων και γενετικών μεταβλητών, τον iCOGS (Τον Illumina Infinium

array που περιλαμβάνει 211.155 SNPs) και τον OncoArray (επίσης ένας πίνακας της Illumina

Infinium που περιλαμβάνει 533,531 SNPs

2.1.1.2. CIMBA - Consortium of Investigators of Modifiers of BRCA1/2

Πρόκειται για ένα συνασπισμό περισσότερων των 80 διεθνών ερευνητικών ομάδων ο οποίος

ιδρύθηκε το 2005 από το Πανεπιστήμιου του Cambridge και το Εθνικό Ινστιτούτου Καρκίνου του

Ηνωμένου Βασιλείου (NCI) με στόχο τη μελέτη γενετικών τροποποιητών (modifiers) του κινδύνου

41

εμφάνισης γυναικολογικών καρκίνων σε φορείς μεταλλάξεων των BRCA1/ BRCA2 γονιδίων.

Περιλαμβάνει φαινοτυπικά χαρακτηριστικά 80.000 φορέων μεταλλάξεων (ανδρών και γυναικών)

και γονοτυπικά χαρακτηριστικά 43.000. Οι μελέτες που μπορούν να ενταχθούν στο συνασπισμό

πρέπει να περιλαβάνουν ένα ελάχιστο αριθμό 50 γυναικών ή 20 ανδρών φορέων μεταλλάξεων

στα εν λόγω γονίδια, με κατά προτίμηση δείγματα διαθέσιμα για γονοτυποποιήση.

2.1.1.3 Δημοσιευμένοι πίνακες (arrays) γενετικών μεταβλητών (SNPs ) σχετιζόμενων με τον

κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου του μαστού

Μια δημοσιευμένη βάση δεδομένων που προέκυψε από την πρωτοβουλία GAME-ON

είναι η OncoArray η οποία περιλαμβάνει έναν πίνακα με περισσότερους από 500.000

πολυμορφισμούς μονού νουκελοτιδίου (SNPs), που έχουν επιλεγεί για τον εκάστοτε υπό μελέτη

καρκίνο και τη λειτουργική τους συσχέτιση. Παραπάνω από το 50% αυτού του πίνακα είναι

διαθέσιμο για την ανακάλυψη νέων μεταβλητών. Περιλαμβάνει μεταβλητές μέσα σε γονίδια

κλειδιά συσχετισμένα με τον καρκίνο του μαστού (BRCA1, BRCA2, MLH1, MLH2). Εμπορική

εκδοχή του παραπάνω πίνακα είναι διαθέσιμη από την Illumina.

Ο Δεύτερος διαμορφωμένος πίνακας γονοτύπισης της Illumina σχετιζόμενος με

γενετικούς παράγοντες κινδύνου για την εμφάνιση 3 ορμονο-σχετιζόμενων καρκίνων (μαστού,

προστάτη, ωοθηκών) είναι ο iCOGs. Διαμορφώθηκε ως μέρος της Collaborative Oncological

Gene-Environment Study και περιλαμβάνει γενετικό υλικό από 250,000 συμμετέχοντες/ουσες των

μεγάλων μελετών BCAC, OCAC( Ovarian Cancer Association Consortium), PRACTICAL (Prostate

Cancer Association Group to Investigate Cancer Associated Alterations in the Genome) και CIMBA

(The Consortium of Investigators of Modifiers of BRCA1/2). Περιέχει συνολικά 220,123 SNPs, εκ

των οποίων τα 72,266 προέρχονται από το BCAC, και τα 51,901 από τους υπόλοιπους

συνασπισμούς μελετών. περιλαμβάνουν SNPs σχετιζόμενα με τον ολικό κίνδυνο για τους

εκάστοτε καρκίνους, με τον κίνδυνο για υπότυπους αυτών των καρκίνων, σχετιζόμενα με την

επιβίωση μετά τη διάγνωση και με άλλα χαρακτηριστικά ( Π.Χ.. εμμηναρχή, πυκνότητα μαστού,

SNPs σχετιζόμενα με τα γονίδια BRCA1/BRCA2 και άλλα).

2.2.Συσχέτιση των SNPs με τις μελετώμενες εκθέσεις (exposures)

2.2.1 Κύριες Εκθέσεις - Μονοπαραγοντική two-sample MR (Univariate two-sample MR) ΒΜΙ

και WHR (προσαρμοσμένο στο BMI)

Tα ευρυγωνιδιωματικά δεδομένα τόσο για το ΒΜΙ όσο και για το WHR προήλθαν από GWAS

από τη μελέτη των Pulit et al, 2019. Ο φαινότυπος της γενικής παχυσαρκίας παρήχθηκε από

τους ερευνητές χρησιμοποιώντας τα φαινοτυπικά δεδομένα καταγεγραμμένα στην προοπτική

κοορτή UK Biobank. Διαιρέθηκε το σωματικό βάρος σε χιλιόγραμμα προς το μετρούμενο

ύψος σε εκατοστά στο τετράγωνο. Αυτά τα σωματομετρικά στοιχεία που είχαν αξιολογηθεί στο

εκάστοτε ερευνητικό κέντρο της UKBB, κατά την πρώτη επαφή με τους συμμετέχοντες. Ο

φαινότυπος της κεντρικής παχυσαρκίας, όπως αποδίδεται με το λόγο της διαμέτρου της μέσης

42

προς τη διάμετρο των γοφών (Waist to Hip Ratio, WHR προέκυψε μετά τη διαίρεση της

διαμέτρου της μέσης προς τη διάμετρο των γοφών, σωματομετρικά στοιχεία που είχαν

αξιολογηθεί στο εκάστοτε ερευνητικό κέντρο της UKBB, κατά την πρώτη επαφή με τους

συμμετέχοντες. Σε αυτή τη βασική αξιολόγηση, εκπαιδευμένο προσωπικό, χρησιμοποιώντας

κανονικοποιημένες διαδικασίες και τη μη διατατή “Wessex sprung” ταινία πραγματοποίησε και

κατέγραψε τις μετρήσεις.

Μετά τη δημιουργία του λόγου BMI και WHR, πραγματοποιήθηκε παλινδρόμηση της μέτρησης

WHR στο φύλο, την ηλικία κατά την εκτίμηση, την τετραγωνική ηλικία κατά την εκτίμηση και το

κέντρο αξιολόγησης, καθώς και διόρθωση για το ΒΜΙ. Για να προκύψουν, αποκλειστικά τα

δεδομένα που αντιστοιχούσαν στις γυναίκες, πραγματοποιήθηκαν ειδικές κατά φύλο αναλύσεις

(sex-specific). Στη δική μας μελέτη, χρησιμοποιήθηκαν δεδομένα αποκλειστικά για τις γυναίκες.

Η GWAS της UK Biobank (UKBB) περιλάμβανε 484.653 δείγματα με γονοτυπικά δεδομένα τα

οποία είχαν υποκατασταθεί με τη χρήση μεικτών γραμμικών μοντέλων ώστε να ληφθεί υπόψιν η

συσχέτιση και η ετερογένεια των παραγόντων, με βάση τη δεύτερή έκδοση δεδομένων της UKBB

(Ιούνιος του 2017). Σε αυτήν την έκδοση δεν είχαν συμπεριληφθεί τα διορθωμένα δεδομένα

υποκατάστασης των ελλειπουσών τιμών, για της περιοχές που δεν υπήρχαν δεδομένα, από το

non-Haplotype-Reference Consortium (HRC), επομένως χρησιμοποιήθηκε ένα υποσύνολο των

SNPs για τα οποία υπήρχαν HRC δεδομένα. Χρησιμοποιήθηκαν μεικτά γραμμικά μοντέλα BOLT

(LMM-BOLT) προκειμένου να ληφθούν υπόψιν όλοι οι τρόποι συσχετίσεων, στρωματοποίησης

του πληθυσμού και άλλες πιθανώς κρυμμένες δομές στα δεδομένα.

Για να ληφθεί το μεγαλύτερο δυνατό δείγμα με σκοπό να αυξηθεί η στατιστική ισχύς της μελέτης

χρησιμοποιήθηκαν και τα αποτελέσματα της ήδη υπάρχουσας GWAS για το WHR και το

προσαρμοσμένο στο BMI WHR , πραγματοποιημένη από τους Shungin et al, 2015 και

περιλαμβάνοντας υλικό από το συνασπισμό της GIANT (Genetic Investigation of Antrhopometric

Traits). Πραγματοποιήθηκε μετά-ανάλυση των αποτελεσμάτων των δύο GWAS

χρησιμοποιώντας IVW σταθερών επιδράσεων στο METAL, αφού είχαν αφαιρεθεί τα SNPs τα

οποία είχαν μια διαφορά > 15% στη συχνότητα μεταξύ των δύο πηγών προέλευσης των

δεδομένων. Συνολικά μελετήθηκαν 27.4 εκατομμύρια SNPs σε ένα δείγμα 694.649 ατόμων.

Προκειμένου να εκτιμηθεί το σκορ του Luinqage DIsequilibrum καθώς και η γενετικός

πληθωρισμός (λάμδα), υπολογίσθηκε ένα σκορ από τα τα ίδια δείγματα που χρησιμοποιήθηκαν

για τον υπολογισμό του LD σκορ ως αναφορά στο BOLT-LMM. Χρησιμοποιήθηκαν μονάχα

SNPs υψηλής ποιότητας και το LD σκορ της παλινδρόμησης υπολογίστηκαν με το LDSC

λογισμικό (Bulik-Sullivan et al, 2015) Σαν έλεγχος ευαισθησίας για την εγκυρότητα των

αποτελεσμάτων πραγματοποιήθηκε GWAS σε δεδομένα WHR που δεν είχαν προσαρμοστεί για

το ΒΜΙ. Έπειτα πραγματοποιήθηκε και εξωτερικός έλεγχος εγκυρότητας στην ανεξάρτητη βάση

δεδομένων EXTEND.

2.1.1.1. Προοπτικές μελέτες που αναφέρθηκαν παραπάνω:

• UK Biobank

Πρόκειται για τρέχουσα [2012, σήμερα] προοπτική μελέτη κοορτής που λαμβάνει χώρα στο

Ηνωμένο Βασίλειο και στοχεύει στη διερεύνηση γενετικών, περιβαλλοντικών και συμπεριφορικών

παραγόντων που συμβάλλουν στη νοσηρότητα της μέσης και προχωρημένης ηλικίας. Περίοδος

43

επιστράτευσης συμμετεχόντων αποτέλεσε η 5ετία 2006-2010. Στάλθηκαν 9.2 εκατομμύρια

προσκλήσεις σε άτομα 40-69 ετών, καταγεγραμμένα στο Εθνικό Σύστημα Υγείας (NHS) του

Ηνωμένου Βασιλείου που κατοικούσαν έως και 25 μίλια από το καθένα εκ των 22 κέντρων

μελέτης (Αγγλία, Σκωτία, Ουαλία). Παρά το μικρό αριθμό ανταπόκρισης, προέκυψε ένας αριθμός

503.325 εθελοντών συμμετεχόντων για τους οποίους κατά την βασική αξιολόγηση λήφθηκε

συγκατάθεση και πολλά φαινοτυπικά στοιχεία: λεπτομερές προσωπικό-οικογενειακό ιστορικό,

δημογραφικά στοιχεία και στοιχεία του τρόπου ζωής (μέσω ερωτηματολογίου αυτοαναφοράς σε

οθόνη και συνέντευξης), σωματομετρικές μετρήσεις σε ανθρωπομετρικά χαρακτηριστικά, ειδικές

απεικονίσεις και δείγματα βιολογικού υλικού. Από δείγματα αίματος προήλθε η εξαγωγή του

DNA και η γονοτυποποίησ του για όλους τους συμμετέχοντες (περισσότερα στοιχεία για τη

μεγάλη αυτή προοπτική μελέτη παρουσιάζονται εδώ: Sudlow et al, 2016, Allen et al, 2012). Τα

δεδομένα της διατίθενται ελεύθερα στους ερευνητές μετά από αίτηση.

• Genetic Investigation of Anthropometric Traits (GIANT) consortium

Πρόκειται για μια διεθνή συνεργασία ερευνητών από διάφορα ινστιτούτα, χώρες και ομάδες, το

οποίο έχει ως στόχο την εντόπιση γενετικών τόπων που επηρεάζουν στο ανθρώπινο μέγεθος και

σχήμα, συμπεριλαμβανομένων ανθρωπομετρικών στοιχείων όπως το ύψος και μετρήσεις για την

παχυσαρκία,

2.2.3 Μελετώμενοι μεσολαβητές (mediators)

2.2.3.1. CRP (C-reactive protein) , προσαρμοσμένη για το BMI

Για την εκτίμηση του γενετικά προβλεπόμενου κινδύνου της χρόνιας φλεγμονής (εκφραζόμενη

μέσα από τα κυκλοφορούντα επίπεδα της CRP) χρησιμοποιήθηκαν SNPs από την μελέτη των

Litigant et al, 2018 όπως προέκυψαν από τη μετα-ανάλυση 2 πολύ μεγάλων GWAS, των HapMap

και 1KG GWAS, σε υποκείμενα και των δύο φύλων Ευρωπαϊκής προέλευσης . Η HapMap GWAS

μετα-ανάλυση προέκυψε το 2012 μετά από πρόσκληση της ομάδας CIGW [Cohorts for Heart and

Aging in Genomic Epidemiology (CHARGE) Inflammation Working Research Group (CIWG)] και

περιλάμβανε 78 μελέτες με 204,402 συμμετέχοντες ενώ η 1000Genome (1KG) GWAS περιλάμβανε

148,164 συμμετέχοντες από 49 μελέτες με υποκατεστημένες (imputed) γενετικές τιμές. Οι

συμμετέχουσες κοορτές συμπεριλήφθησαν είτε στη μία είτε στην άλλη μετα-ανάλυση είτε και στις

δύο. Προτού χρησιμοποιηθούν στη κάθε μία εκ των δύο μελετών οι εκάστοτε γενετικές μεταβλητές

υπεβλήθησαν σε έλεγχο ποιότητας και διερευνήθηκε η συσχέτιση τους με τα επίπεδα της CRP

χρησιμοποιώντας μοντέλο αθροιστικής γραμμικής παλινδρόμησης προσαρμοσμένο για την

ηλικία, το φύλο, την υποκατασκευή του πληθυσμού (principal component) και για τη συσχέτιση

των συμμετεχόντων μεταξύ τους (relatedness). Πριν τη μετα-ανάλυση οι μεταβλητές ελέχθηκαν

για την ποιότητα της υποκατάστασης βάση του Index ενώ σε της κάθε μελέτης διορθώθηκαν

τα δδομένα για γενετικό πληθωρισμό (ώστε να αποφευχθεί το σφάλμα τύπου 1).

Για τη μελέτη HapMap, οι ερευνητές πραγματοποιήσαν μετανάλυση σταθερών επιδράσεων μέσω

της μεθόδου IVW για κάθε γενετική μεταβλητή (μέθοδο που υπήρχε στο λογισμικό εργαλείο

βιοπληροφορικής GWAMA) και πραγματοποιήθηκε δεύτερος γενωμικός έλεγχος στα δεδομένα

που προέκυψαν από τη μετα-ανάλυση. Για την GWAS 1KG χρησιμοποιήθηκε το λογισμικό

METAL και πραγματοποιήθηκε μετα-ανάλυση σταθερών επιδράσεων μέσα από αυτό.

Αφαιρέθηκαν μεταβλητές που ήταν παρούσες σε λιγότερο από το 50% των δειγμάτων. Η μετα-

44

ανάλυση HapMap συμπεριέλαβε 2.437.193 γενετικές μεταβλητές, και η 1KG GWAS περιλάμβανε

10.019.203 μεταβλητές.

Πραγματοποιήθηκε επίσης ανάλυση διαφοροποιήμενη για το φύλο, δεδομένα της οποίας

χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη, ενώ πραγματοποιήθηκαν BMI-προσαρμοσμένες

αναλύσεις στην 1KG μετα-αναάλυση ώστε να καθοριστεί η διαμεσολάβηση του ΒΜΙ στην

εντόπιση γενετικών τόπων συσχετιζόμενων με τη CRP και να αυξηθεί η ισχύς του εντοπισμού

συσχετίσεων που δε διαμεσολαβούνται από το ΒΜΙ.

2.2.3.2. Γλυκαιμικά Χαρακτηριστικά

2.3.3.2.1 Ινσουλίνη Νηστείας - προσαρμοσμένα για τα ΒMI

Τα γονοτυπικά δεδομένα για τα SNPs που χρησιμοποιήθηκαν στην ινσουλίνη νηστείας

προέκυψαν από την GWAS των Chen et al, 2021, όπου διερευνήθηκε γενετικοί τόποι συσχετισμού

με γλυκαιμικά χαρακτηριστικά (Ινσουλίνη Νηστείας, Γλυκόζη Νηστείας, Γλυκοζυλιωμένη

Αιμοσφαιρίνη, δοκιμασία γλυκόζης 2 ωρών) σε υποκείμενα χωρίς διαβήτη, με διαφυλική

προέλευση (70% Ευρωπαϊκής καταγωγής, 30% μη - Ευρωπαϊκής καταγωγής). Συμμετείχαν από

41 έως 131 κοορτές για καθένα από τα 4 χαρακτηριστικά και αναλύθηκαν δεδομένα από 85.915

έως 281.416 άτομα για κάθε χαρακτηριστικό. Ο φαινότυπος της ινσουλίνης νηστείας (fasting

insulin) μετρήθηκε σε mmol/l. Κάθε κοορτή διενήργησε έλεγχο ποιότητας πριν προσφέρει τα

δείγματα της στη μελέτη, ενώ τα δείγματα τυποποιήθηκαν ως προς το γονότυπο

χρησιμοποιώντας το Illumina Metabochip (Voight, 2012). Στο επίπεδο της κάθε έρευνας επίσης

πραγματοποιήθηκε παλινδρόμηση με συμμεταβλητές το ΒΜΙ, ειδικές συμμεταβλητές για κάθε

μελέτη, και τα κύρια χαρακτηριστικά για τη στρωματοποιήση του πληθυσμού (principal

components). H προσαρμογή για το ΒΜΙ φαίνεται να διευκολύνει την ανεύρεση γενετικών τόπων

για την ινσουλίνη-νηστείας. Για κάθε διαφορετική καταγωγική προέλευση διενεργήθηκαν

διαφορετικές μετα-αναλύσεις χρησιμοποιώντας IVW σταθερών επιδράσεων το οποίο είναι

ευρισκόμενο στο λογισμικό METAL (Willer 2010). Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε, μετά-

ανάλυση διαφυλική συνδυάζοντας τις μετά-αναλύσεις μονής-κληρονομικότητας

χρησιμοποιώντας το MANTRA (Morris, 2011). Ως παράγοντας ευρυ-γονιδιωματικής

σημαντικότητας ορίστηκε ο παράγοντας log10Bayes’ Factor (BF) > 6, σχετικά συγκρίσιμος στο P

< . Οι μονοκληρονομικές και διακληρονομικές αναλύσεις εντόπισαν 95 γενετικούς τόπους

για την ινσουλίνη νηστείας.

2.3.3.2.2 Σακχαρώδης διαβήτης 2 - (ΣΔ2 /T2DM)

Τα στοιχεία για τα SNPs που αφορούν το σακχαρώδη διαβήτη 2 προήλθαν από την μετα-

ανάλυση που διενέργησαν οι Majagan et al, το 2018, σε 32 GWAS Ευρωπαϊκής προέλευσης

(74.124 ασθενείς με Σακχαρώδη Διαβήτη 2 και 824.006 μάρτυρες, εκ των οποίων άνδρες ήταν

41.846 ασθενείς και 383.767 μάρτυρες ενώ γυναίκες ήταν 30.053 ασθενείς και 434.336 μάρτυρες).

Αναλύθηκαν 27 εκατομμύρια μεταβλητές που προέκυψαν είτε από το αποτέλεσμα της

45

γονοτυπικής ανάλυσης είτε από την υποκατάσταση των άγνωστων τιμών χρησιμοποιώντας

64.976 απλότυπους από το Haplotype Reference Consortium (HRC) για τις 31 από τις 32 GWAS,

ενώ για την εναπομείνουσα (την deCODE GWAS) χρησιμοποιήθηκε το πάνελ αναφοράς από

30.440 ακολουθίες απλοτυπιών εύρους ολόκληρου γονιδιώματος σε Ισλανδικό πληθυσμό. Για τη

μετά-ανάλυση για συνδυασμένο-φύλο χρησιμοποιήθηκαν μοντέλο σταθερών επιδράσεων με

βάρη αντίστροφης- διακύμανσης των log-ORs , εφαρμοσμένο στο METAL60. Aνευρέθησαν

συνολικά 406 σήματα συσχετισμένα με την εμφάνιση Σακχαρώδους Διαβήτη τύπου 2

ανεξαρτήτως φύλου: 243 αξιοσημείωτοι τόποι (εύρους-γονιδιώματος) σε συμβατικό επίπεδο

στατιστικής σημαντικότητας p-value= και επιπλέον 160 συσχετίσεις μέσα στους

παραπάνω γενετικούς τόπους σε επίπεδο στατιστικής σημαντικότητα p=10-5. Από αυτούς, 231

μεταβλητές ταυτοποιήθηκαν σε στατιστική σημαντικότητα εύρους γονιδιώματος (p<5*10-8) ενώ

162 ήταν στατιστικά σημαντικά και σε πιο αυστηρό επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας (p=

) σε ανάλυση χωρίς προσαρμογή στο ΒΜΙ, ενώ 152 σε ένα μικρότερο δείγμα σε ΒΜΙ -

προσαρμοσμένη ανάλυση. Από αυτά τα 140 ταυτίζονταν μεταξύ τους ενώ 12 ήταν στατιστικά

σημαντικά μόνο μετά την προσαρμογή. Συνολικά, η προσαρμογή για το BMI οδήγησε σε μείωση

των σημάτων σε σχέση με την μη προσαρμοσμένη ανάλυση ,ενδεικτικό αποτέλεσμα της ισχυρής

συσχέτισης μεταξύ του ΒΜΙ και του ΣΔ2. Οι συγκεκριμένοι γενετικοί τόποι αντιπροσωπεύουν τον

κίνδυνο για ΣΔ2 ο οποίος κυρίως σχετίζεται με την παχυσαρκία/ εναπόθεση λιπώδους ιστού. Για

τη διερεύνηση της διεμφυλικής ετερογένειας διενεργήθηκε για κάθε μεταβλητή ειδική μετα-

ανάλυση ως προς το φύλο, με απουσία και παρουσία προσαρμογής για το ΒΜΙ.

Χρησιμοποιήθηκε μετά-ανάλυση σταθερών επιδράσεων με η οποία και ήταν στατιστικά

σημαντική σε 13 από τα 403 στα σήματα ευαισθησίας για ΣΔ2 , δηλαδή 7.7%.

2.3.3.2.3 IGF-1 (Insulin Growth Factor-1)

Τα στοιχεία για την Insulin Growth Factor-1 λήφθησαν από την UK Biobank. Η βιολογική

μεταβλητή (nmol/L) αυτή μετρήθηκε σε βιολογικό δείγμα αίματος σε 468,306 συμμετέχοντες, στην

έκδοση του Μαρτίου 2019 της UKBB. To δείγμα παραλήφθηκε σε δύο στιγμές της μελέτης: στιγμή

0 (βασική αξιολόγηση, χρονική περίοδος 2006-2010 με 126.766 συμμετέχοντες) και στιγμή 1

(χρονική περίοδος 2012-2013 με 17.697 συμμετέχοντες). Οι συμμετέχοντες ήταν και των δύο

φύλων.

2.3.3.3. Λιπίδια (Λιποπρωτείνης Χαμηλής πυκνότητας - Low Density Lipoprotein, Λιποπρωτείνη

Υψηλής πυκνότητας - High Density Lipoprotein), Τριγλυκερίδια)

Τα SNPs των λιπιδίων προήλθαν από τη μελέτη των Willer et al, 2013 στην οποία συνελέχθησαν

περιληπτικά δεδομένα από 60 μελέτες σε συνολικό δείγμα 188.578 υποκειμένων (κυρίως

Ευρωπαϊκής καταγωγής αλλά και σε μικρό ποσοστό μη - Ευρωπαϊκής καταγωγής: Νότια Ασία,

Ανατολική Ασία, πρόσφατη Αφρικανική). Ο φαινότυπος της έκθεσης (επίπεδα λιπιδίων στο αίμα)

μετρήθηκε μετά από 8 ώρες νηστείας, ενώ είχαν αποκλεισθεί άτομα τα οποία λάμβαναν

υπολιπιδιαμικούς παράγοντες. Ο φαινότυπος σε κάθε μελέτη είχε προσαρμοστεί για την ηλικία,

το τετράγωνο της ηλικίας, το φύλο , ενώ πραγματοποιήθηκαν και πιο ειδικές προσαρμογές όπως

“principal component” Price, 2005, είτε προσεγγίσεις μεικτών μοντέλων στο 35% των μελετών,

προκειμένου να διορθωθεί η πληθυσμιακή δομή. Τα δεδομένα 23 μελετών γονοτυποοποιήθηκαν

βάση πινάκων GWAS (όπως περιγράφονται στη μελέτη ) ενώ 37 μελετών χρησιμοποιώντας το

46

προσαρμοσμένο (custom) iSelect Metabochip της Illumina (Voight, 2012) , το οποίο περιλαμβάνει

υποσχόμενες μεταβλητές από προηγούμενες GWAS με για τη μελέτη μεταβολικών,

καρδιαγγειακών και ανθρωπομετρικών χαρακτηριστικών.

Ως πρωταρχική στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε γραμμική παλινδρόμηση η οποία είχε

ως εξαρτημένη μεταβλητή τις τιμές των χαρακτηριστικών μετασχηματισμένες με αντίστροφη

κανονική κατανομή και ως ανεξάρτητες την προβλεπόμενο αριθμό των αλληλόμορφων, για κάθε

μεμονωμένο SNPs με δεδομένα που ήταν πυκνά υποκατεστημένα (imputed). Χρησιμοποιήθηκαν

διαφορά εργαλεία ανάλυσης ολικού γονιδιώματος (PLINK, SNPTEST, EMMAX, κα. ). Για την

επακόλουθη μετά-ανάλυση των GWAS εφαρμόστηκε η μέθοδος Stouffer (Stpuffer, 1949 , γνωστή

και ως αντίστροφη κανονική, με διαφορετικά βάρος για κάθε μελέτη που συμμετείχε, το οποίο

ήταν ανάλογο της τετραγωνικής ρίζας του μεγέθους του δείγματος. Προκειμένου να διορθωθούν

τα αποτελέσματα για πληθωρισμό εξαιτίας πιθανής πληθυσμιακής διαστρωμάτωσης, αρχικά

πραγματοποιήθηκε γονιδιωματικός έλεγχος σε κάθε δείγμα και έπειτα επαναλήφθηκε η

διαδικασία με τα πρώτα αποτελέσματα της μετά-ανάλυσης. Η κάθε μετά-ανάλυση περιορίστηκε

σε δείγματα κοινής καταγωγικής προέλευσης και ήταν προσαρμοσμένη για την ηλικία και το

φύλο.

Συνολικά γονοτυποποίθηκαν 196.7110 γενετικές μεταβλητές, και μετά από γενομική διόρθωση,

ανευρέθησαν στο συμβατικό επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας (P < 5* 10-8) 157 γενετικοί

τόποι (loci) συσχετισμένοι με τη επίπεδα λιπιδίων στο αίμα, εκ των οποίων τα 62 αποτελούν νέα

ευρήματα. Τα Ευρωπαϊκά δείγματα χρησιμοποιήθηκαν για την ανακάλυψη νέων γονιδιακών

τόπων ενώ τα μη Ευρωπαϊκά χρησιμοποιήθηκαν μόνο για ανάλυση λεπτής χαρτογράφησης (fine

- mapping).

2.3.3.4.Τεστοστερόνη

Στοιχεία γονοτυποποιημένων αναλύσεων προήλθαν από 426,989 συμμετέχοντες και των δύο

φύλων στην UKBB (έκδοση του Μαρτίου 2019 της UKBB). Η μεταβλητή ήταν συνεχής ( nmol/L)

και προήλθε από δείγματα αίματος τα οποία παρελήφθησαν σε δύο στιγμές (στη βασική

αξιολόγηση και χρονική περίοδο 2006-2010, με 425.137 συμμετέχοντες, και στη στιγμή 1, χρονική

περίοδος 2012-2013, με συμμετέχοντες 16.038 άτομα.

2.3.4. Διαμόρφωση τελικής λίστας των SNPs

Από τα SNPs που εντοπίστηκαν στις δημοσιευμένες GWAS των Pulit et al, 2019, Chen et al ,

2021, Majagan et al, 2018, Willer et al, 2013, καθώς και στα δημοσιευμένα δεδομένα της UKBB

(version March 2019) διαθέσιμα δεδομένα υπήρχαν για τις γυναίκες για το φαινότυπο που

αφορούν το ΒΜΙ, WHR (προσαρμοσμένο στο ΒΜΙ), τεστοστερόνη, IGF-1 ενώ για όλα τα λιπίδια

(HDL-C, LDL-C, Tριγλυκερίδια), τη CRP, το σακχαρώδη διαβήτη 2 και την ινσουλίνη νηστείας δεν

υπήρχαν δεδομένα ξεχωριστά για τις γυναίκες. Επομένως για αυτά τα φαινοτυπικά

χαρακτηριστικά έχουν χρησιμοποιηθεί μεικτά δεδομένα και για τα δύο φύλα καθώς δεν υπήρχαν

διαθέσιμες ή ανάλογου μεγέθους GWAS για sex-specific χαρακτηριστικά. Επίσης, για τις

μεταβλητές που μελετήθηκαν , οι οποίες ήταν προσαρμοσμένες για το ΒΜΙ, αυτό προσδιορίζεται.

Έτσι, για τη μελέτη μας στο επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας P=5*10-8 εντοπίστηκαν 316

SNPs για το ΒΜΙ, 253 για το WHR (BMI προσαρμοσμένο). Στις πολυπαραγοντικά μοντέλα

μεσολάβησης στη σχέση BMI-καρκίνος του μαστού συμπεριλήφθησαν 370 SNPs για τα λιπίδια

και το ΒΜΙ συνολικά (μεμονωμένα για τα τριγλυκερίδια 54 SNPs, για την HDL 78, για την LDL 88)

, 406 για την IGF-1 και το ΒΜΙ συνολικά (200 SNPs για την IGF-1 συνολικά), 359 για την

47

Τεστοστερόνη και το ΒΜΙ (88 SNPs για την τεστοστερόνη ), 412 για το ΣΔ2 και το ΒΜΙ συνολικά

(200 SNPs για το ΣΔ2) , 330 για την ινσουλίνη νηστείας και το ΒΜΙ (37 μονάχα για την ινσουλίνη

νηστείας) και 328 για τη CRP. (48 μεμονωμένα για τη CRP). Στις πολυπαραγοντικές αναλύσεις

για τη μεσολάβηση των δευτερογενών φαινοτύπων στη σχέση WHR και καρκίνο του μαστού

εντοπίσαμε 292 SNPs για τα λιπίδα και WHR, 351 για την IGF-1 και WHR, 290 για την

τεστοστερόνη και το WHR, 355 για το σακχαρώδη διαβήτη 2 και το WHR, 260 για την ινσουλίνη

νηστείας και το WHR και 275 για τη CRP και το WHR.

2.3.5. Εναρμόνιση δεδομένων (Harmonization of Data)

Πριν τη χρήση των βάσεων δεδομένων που αναφέρθηκαν προηγουμένως, απαραίτητο βήμα είναι

η εναρμόνιση των δεδομένων. Για να είναι δυνατό να πραγματοποιηθεί η εναρμόνιση απαιτείται

να υπάρχει η πληροφορία για το μέτρο της επίδρασης κάθε γενετικής μεταβλητής (effect) και το

αλληλόμορφο κινδύνου (effect allele). Επιπλέον πληροφορίες που διευκολύνουν τη διαδικασία

είναι το άλλο αλληλόμορφο (other allele) και η συχνότητα εμφάνισης του αλληλόμορφου

κινδύνου (EAF). Στόχος της εναρμόνισης είναι τα δεδομένα της συσχέτισης των SNPs με την

έκθεση ενδιαφέροντος (GX) και τα δεδομένα συσχέτισης των SNPs με την έκβαση ενδιαφέροντος

(GY) να είναι κωδικοποιημένα με βάση το ίδιο αλληλόμορφο. Στις περισσότερες περιπτώσεις, το

αλληλόμορφο που προκαλεί την αύξηση στη έκθεση που μελετάται, θεωρείται το αλληλόμορφο

κινδύνου. Αυτή είναι η θετική κατεύθυνση και συνήθως τα αλληλόμορφα στα δεδομένα (GX)

σχετίζονται με την έκθεση ενδιαφέροντος σε αυτήν την κατεύθυνση. Όταν αυτό δε συμβαίνει,

προκειμένου όλα τα δεδομένα να είναι ομογενή, κατά την εναρμόνιση πραγματοποιείται αμοιβαία

ανταλλαγή του αλληλόμορφου κινδύνου από το άλλο αλληλόμορφα, ο συντελεστής

παλινδρόμησης πολλαπλασιάζεται με -1 και η EAF αφαιρείται από τη μονάδα. Επιπλέον, όταν η

δεύτερη βάση δεδομένων (που συσχετίζει τα SNPs με τη μελετώμενη έκβαση) είναι

κωδικοποιημένη βάση του άλλου αλληλόμορφου , πραγματοποιείται αλλαγή σύμφωνα με το

αλληλόμορφο που είναι κωδικοποιημένη η GX. Ο συντελεστής παλινδρόμησης του GY

πολλαπλασιάζεται με -1 και η EAF του GY αφαιρείται από τη μονάδα.

2.3.6. Μενδελιανή τυχαιοποίηση 2 δειγμάτων

Για την εκτίμηση της αιτιακής επίδρασης των εκθέσεων ενδιαφερόντων στον κίνδυνο εμφάνισης

του ολικού καρκίνου του μαστού και των υποτύπων του, χρησιμοποιήθηκε μονοπαραγοντική

μενδελιανή τυχαιοποίηση δύο δειγμάτων σε περιληπτικά δεδομένα όπως αναφέρονται

παραπάνω. Η στατιστική ανάλυση διενεργήθηκε με τη βοήθεια των λογιστικών πακέτων της R

cran/MendelianRandomization (Github) ενώ εφαρμόστηκε το μοντέλο της IVW μετα-ανάλυσης

τυχαίων επιδράσεων, το οποίο επιτρέπει διαφορετική μέση αιτιακή εκτίμηση για κάθε SNP καθώς

και ισορροπημένη ορiζόντια πλειοτροπία. Η ομογένεια των εκτιμήσεων των IVs ελέγχθηκε μέσω

του στατιστικού μέτρου της ετερογένειας Cochran’s Q και του στατιστικού ,

2.3.6.1 Ανάλυση ευαισθησίας

Για να αξιολογηθεί η εγκυρότητα των παραδοχών των IVs πραγματοποιήθηκαν αναλύσεις

ευαισθησίας στα παραπάνω σύνολα δεδομένων μέσω της εφαρμογής 3 επιπλέον μεθόδων

μενδελιανής τυχαιοποίησης. Με τη χρήση του πακέτου της R cran/MendelianRandomization

(Github) εφαρμόσαμε τα μοντέλα της Weighted median method και της MR-Egger, ενώ με το

48

πακέτο της R rondolab/MR-PRESSO (GitHub, n.d.-d) (με NbDistribution =1000,

SignifThreshold=0.05) εφαρμόσαμε το μοντέλο της MR-PRESSO.

2.3.7. Πολυπαραγοντική Μεντελυανή τυχαιοποίηση περιληπτικών δεδομένων (3 και παραπάνω

δειγμάτων)

Για το δεύτερο μισό της ανάλυσης, και την εκτίμηση της αιτιακής επίδρασης των πρωταρχικών

εκθέσεων ενδιαφερόντων προσαρμοσμένο για φαινοτύπους που συνιστουν μεσολαβητές αυτής

της σχέσης στον κίνδυνο εμφάνισης ολικού καρκίνου του μαστού εφαρμόστηκε μεντελυανή

τυχαιοποίσηη περιληπτικών δεδομένων. Για να εξακριβωθεί αν οι δευτερογενείς φαινότυποι

δρουν όντως ως μεσολαβητές ακολουθήθηκαν τα βήματα της 2-step MR (Haycock, 2016). Η

στατιστική ανάλυση διενεργήθηκε με τη βοήθεια των λογιστικών πακέτων της R MVMR (Github)

ενώ εφαρμόστηκε το μοντέλο της IVW μετα-ανάλυσης χρησιμοποιώντας βάρη πρώτης τάξης. Η

ισχύς των γενετικών μεταβλητών εκτιμήθηκε μέσω του Cochrane’s Q strength (Q_strength) ενώ η

ετερογένεια των SNPs εκτιμήθηκε μέσω του Cochrane’s Q validity (Q_valid) . Η συνδιακύμανση

μεταξύ των μεταβλητών θεωρήθηκε μηδενική (by default) εφόσον οι γενετικές μεταβλητές είχαν

προέλθει από διαφορετικά (non-overlapping) δείγματα.

2.3.8. PhenoScanner

Στη διαδικτυκαή αυτή πλατφόρμα κάναμε μια περιορισμένη αναζήτηση για δημοσιευμένες

δευτερογενείς συσχετίσεις κάποιων πιθανών έκτοπων SNPs όπως προέκυψαν από την ανάλυση

MR-PRESSO. Αναμενόμενο ήταν να βρεθούν αρκετές, και ως εκ τούτου, είχε σχεδιαστεί η

διενέργεια και του πολυπαραγοντικού μοντέλου. Στο PhenoScanner, επιλέχθηκε το πεδίο

Catalogues -> Diseases and Traits, p-values = 0.05, Proxies=None, = 0.8 ενώ επιλέχθηκε η έκδοση

19 του Human Genome, σύμφωνα με την οποία θα εξάγονταν τα δεδομένα.

49

Κεφάλαιο 3ο : Αποτελέσματα

Προκειμένου να μελετήσουμε τη σχέση διαμεσολάβησης των δευτεροπαθών φαινοτύπων σε

σχέση με τους πρωτογενείς στο αποτέλεσμα του κινδύνου εμφάνισης του καρκίνου του μαστού,

πραγματοποιούμε την ανάλυση μας στα τέσσερα ακόλουθα βήματα. Αρχικά διερευνούμε την

επίδραση των πρωτευόντων φαινοτύπων της γενικής και κεντρικής παχυσαρκίας στον κίνδυνο

εμφάνισης του καρκίνο του μαστού και των υποτύπων του. Έπειτα, επιλέγουμε να μελετήσουμε

περεταίρω ως έκβαση τον ολικό καρκίνο του μαστού κσι μελετάμε τη σχέση των δευτερευόντων

φαινοτύπων με αυτόν. Στη συνέχεια εξετάζουμε τη σχέση πρωτευόντων - δευτερευόντων

φαινοτύπων (καθώς και τη πιθανή σχέση μεσολάβησης στην επίδραση των πρωτευόντων μέσω

των πρωτευόντων στο endpoint) και καταληκτικά, εφαρμόζουμε πολυπαραγοντικά μοντέλα που

εμπεριέχουν τους παράγοντες κινδύνου, τόσο πρωτεύοπντες όσο και δευτερεύοντες.

Μέρος 1ο

3.1 Γενική παχυσαρκία

3.1.1. Η εφαρμογή της μενδελιανής τυχαιοποίησης δύο δειγμάτων για την επίδραση της

παχυσαρκίας στον κίνδυνο ανάπτυξης του καρκίνου του μαστού (στις γυναίκες) ανέδειξε την

προστατευτική επίδραση της γενικής παχυσαρκίας, εκφραζόμενη κατά 1-SD αύξηση στο ΒΜΙ,

στον κίνδυνο εμφάνισης του ολικού καρκίνου του μαστού. Η αιτιακή επίδραση που αναδείχθηκε

με την IVW τυχαίων επιδράσεων, για κάθε αύξηση 5 , είχε OR: 0.885, CI95% = (0.827-

0.947). Συμπερασματικά , η αύξηση του ΒΜΙ κατά 5 , σύμφωνα με την IVW, μειώνει την

πιθανότητα εμφάνισης του μαζικού καρκίνου κατά 11.5%. (Πίνακας 3.1). Βάση του στατιστικού

Cochran’s Q διαπιστώθηκε η παρουσία ετερογένειας (πίνακας 3.3), θέτοντας το μοντέλο τυχαίων

επιδράσεων της IVW σε αμφισβήτηση. Οι εκτιμήσεις των επιδράσεων των αναλύσεων

ευαισθησίας για την αξιολόγηση των IVs ήταν συνεπείς με την IVW όσον αφορά την κατεύθυνση

τους. Ταυτόχρονα, παρά τη μειωμένη ισχύ τους σε σχέση με το μοντέλο εκτίμησης IVW και στις

δυο αναλύσεις ευαισθησίας που χρησιμοποιήσαμε (Weighted Median, MR-Egger) το αποτέλεσμα

ήταν στατιστικά σημαντικό. (Πίνακας 3.1)

Η μηδενική υπόθεση της μη ύπαρξης κατευθυνόμενης πλειοτροπίας, απορρίφθηκε (πίνακας 3.2).

Με βάση την τιμή 𝐼{𝐺𝑋}2 η επίδραση της NOME assumption δεν ήταν αμελητέα, επομένως πιθανόν

ο υπολογισμός της αιτιακής επίδρασης από την MR Egger δεν είναι αδιάβλητος (Πίνακας 3.3)

Για τον εντοπισμό των έκτοπων πλειοτρoπικών SNPs χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος MR-PRESSO

και εντοπίστηκαν τα εξής 11 πλειοτροπικά SNPS : rs10182181, rs10761785, rs11672660, rs12462975, rs1558902, rs17751061, rs2267812, rs4148155, rs625652, rs6585198, rs7084454. Μετά

την αφαίρεση τους, ωστόσο, δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά στην εκτίμηση

της αιτιακής επίδρασης, σύμφωνα με το distortion test τς μεθόδου. Επίσης, η διορθωμένη

εκτίμηση της αιτιακής επίδρασης από το μοντέλο IVW τυχαίων επιδράσεων της MR PRESSO,

μετά την απομάκρυνση των SNPs, παρέμεινε στατιστικά σημαντική. (Πίνακας 3.4)

50

Πίνακας 3.1: Μενδελιανή τυχαιοποίηση 2 δειγμάτων για την επίδραση του ΒΜΙ στον κίνδυνο

εμφάνισης ολικού καρκίνου μαστού και των υποτύπων του

Έκβαση Έκθεση Ν (SNPs) Μέθοδος OR (95% CI) P-value

Ολικός

καρκίνος

μαστού

ΒΜΙ 316 IVW (random

effects) 0.885 ( 0.827,

0.947) 0,000*

Weighted

Median 0.875 (0.815,

0.939) 0,000*

MR-Egger 0.629 (0.523,

0.757) 0,000*

Luminal A BM 316 IVW (random

effects)

0.93 (0.858,

1.008) 0,076

Weighted

Median 0.934 (0.852,

1.024) 0,147

MR-Egger 0.65 (0.523,

0.757) 0,000*

Luminal B BMI 316 IVW (random

effects)

0.892 (0.799,

0.996) 0,173

Weighted

Median 0.856 (0.71,

1.031) 0,102

MR-Egger 0.676 ( 0.477,

0.958) 0,028*

Luminal

B/HER 2

αρνητικός

BMI 316 IVW (random

effects)

0.892 ( 0.799,

0.996) 0,043*

Weighted

Median 0.742 ( 0.634,

0.868) 0,000*

MR-Egger 0.582 ( 0.43,

0.787) 0,000*

ΗΕR2

enriched BMI 316 IVW (random

effects) 0.871 ( 0.733,

1.036) 0,119

Weighted

Median 0.859 (0.658,

1.122) 0,265

MR-Egger 0.424 ( 0.264,

0.682) 0,000*

triple

negative BMI 316 IVW (random

effects)

0.871 ( 0.799,

0.979) 0,021*

Weighted

Median 0.809 (0.687,

0.952) 0,011*

MR-Egger 0.601 (0.436,

0.829) 0,002*

* ο αστερίσκος υποδηλώνει στατιστικά σημαντικό αποτέλεσμα στο επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας a=5%

3.1.1 Στρωματοποιημένη ανάλυση ανά υπότυπο του καρκίνου του μαστού: ER/PR (+) όγκοι

51

Πραγματοποιήθηκε στρωματοποιημένη ανάλυση της επίδρασης της γενικής παχυσαρκίας στους

υποτύπους τους καρκίνου του μαστού και προέκυψαν τα εξής αποτελέσματα αναφορικά με τους

ορμονοευαίσθητους καρκίνους (οιστρογόνα / προγεσταγόνα θετικούς). Για τους καρκίνους τους

μαστού “Luminal A” διαφάνηκε προστατευτική αιτιακή επίδραση (OR: 0.93, CI95%: 0.858, 1.008),

η οποία ωστόσο δεν ήταν στατιστικά σημαντική στο επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας 5% για

το μοντέλο τυχαίων επιδράσεων της IVW. (Πίνακας 3.1). Από το στατιστικό Cochran’s Q

διαφάνηκε η παρουσία ετερογένειας των IVs, θέτοντας το αποτέλεσμα της μεθόδου υπό

αμφισβήτηση. Οι εκτιμήσεις των επιδράσεων των αναλύσεων ευαισθησίας για την αξιολόγηση

των IVs ήταν συνεπείς με την κατεύθυνση της IVW (“προστατευτική” επίδραση). Το αποτέλεσμα

τόσο της Weigted Median, όσο και της MR-Egger ανάλυσης, ήταν στατιστικά σημαντικό,

παρουσιάζοντας ωστόσο κατευθυνόμενη πλειοτροπία (Πίνακας 3.2). Με βάση την η

επίδραση της ΝΟΜΕ δε ήταν αμελητέα , θέτοντας υπό αμφισβήτηση την εκτίμηση της MR-Egger.

Για τον εντοπισμό των πλειοτροπικών SNPs χρησιμοποιήθηκε η MR-PRESSO με εντοπισμό 3

έκτοπων SNPs : rs1558902, rs625652, rs6585198, χωρίς ωστόσο η αφαίρεσή τους να μεταβάλλει

με στατιστικά σημαντικό τρόπο την αιτιακή επίδραση που υπολογίσθηκε (distortion test= 0.158).

Η εκτίμηση της αιτιακής επίδρασης σύμφωνα με το μοντέλο τυχαίων επιδράσεων της MR

PRESSO ήταν OR = 0,962 (p-val= 0,004), αποτέλεσμα επίσης μη στατιστικά σημαντικό. (Πίνακας

3.4)

Πίνακας 3.2: MR-Egger έλεγχος για την ύπαρξη κατευθυνόμενης πλειοτροπίας στις αναλύσεις της

σχέσης ΒMI-καρκίνος μαστού

Έκβαση Έκθεση Intercept (95% CI) P-value

Ολικός καρκίνος

μαστού BMI 0,007 (0.004, 0.011) 0,000*

Luminal A BMI 0,008 (0,003, 0.012) 0,001*

Luminal B BMI 0.006 (0.000, 0.012) 0,067

Luminal B/ HER2

αρνητικός BMI 0,009 (0.003, 0.015) 0,004*

HER2 enriched BMI 0.015 (0.005, 0,024) 0,001*

Triple negative BMI 0.008 (0.001, 0.014) 0,015* * ο αστερίσκος υποδηλώνει στατιστικά σημαντικό αποτέλεσμα στο επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας a=5%

Για τους “Luminal B” καρκίνους του μαστού, επίσης δεν αποδείχθηκε στατιστικά σημαντικό

αποτέλεσμα με βάση τη μέθοδο IVW τυχαίων επιδράσεων στο επίπεδο στατιστικής

σημαντικότητας 5%. Δεν ανατράπηκε ωστόσο το πρόσημο της “προστατευτικής” σχέσης σε

συμφωνία με το πρότυπο του ολικού καρκίνου (Πίνακας 3.1). Από τη μελέτη του στατιστικού

Cochran’s Q προκύπτει πως η ανάλυση αυτή έχει μετριασμένη ετερογένεια (Q = 399.4191, Πίνακας

3.3) ως προς τις εκτιμήσεις των SNPs. Οι αναλύσεις ευαισθησίας για την αξιολόγηση των

παραδοχών των IVs είχαν την ίδια κατεύθυνση αιτιακής επίδρασης όπως του μοντέλου τυχαίων

επιδράσεων IVW. Παρότι η Weighted Median μέθοδος ευαισθησίας δεν ανέδειξε στατιστική

σημαντικότητα στην εκτιμώμενη αιτιακή επίδραση, η εκτίμηση της αιτιακής επίδρασης της MR-

Egger, αν και λιγότερη ισχυρή από τις προηγούμενες, ήταν στατιστική σημαντική με OR: 0.676 (

95% CI: 0.477, 0.958) (Πίνακας 3.1). Δεν απορρίφθηκε η μηδενική υπόθεση της μη ύπαρξης

κατευθυνόμενης πλειοτροπίας της ανάλυσης MR-Egger (πίνακας 23, intercept p-value=0.067) .

52

Ωστόσο το αποτέλεσμα της ανάλυσης δεν ήταν αμελητέο επομένως η επίδραση της NOME,

άρα η εκτίμηση της αιτιακής επίδρασης της MR-Egger θεωρείται διαβλητή. Από την εφαρμογή

της MR-PRΕSSO ανάλυσης εντοπίστηκε 1 πιθανό έκτοπο SNP rs1558902, η αφαίρεσή του οποίου

δεν οδήγησε σε στατιστικά σημαντική διαφορά στο αποτέλεσμα των εκτιμήσεων (distortion test,

p-val= 0.228). Η ίδια η εκτίμηση σε μοντέλο IVW τυχαίων επιδράσεων της MR-PRESSO δεν ήταν

στατιστικά σημαντική (Πίνακας 3.4)

Ο τελευταίος από τους ER/PR (+) υπότυπους του καρκίνου του μαστού, ο “Luminal B/ HER2

αρνητικός”, στην εφαρμογή μενδελιανής τυχαιοποίησης δύο δειγμάτων περιληπτικών δεδομένων,

ανέδειξε στατιστικά σημαντική προστατευτική επίδραση της γενικής παχυσαρκίας στον κίνδυνο

εμφάνισης καρκίνου μαστού του συγκεκριμένου υποτύπου. Για την ακρίβεια, στο IVW μοντέλο

τυχαίων επιδράσεων είχαμε OR : 0.892 , με CI 95%: ( 0.799, 0.996), το οποίο μεταφράζεται σε

10,8% προστασία για κάθε αύξηση του ΒΜΙ κατά 5 . (Πίνακας 3.1) Από την εκτίμηση του

στατιστικού Q για την εκτίμηση της ετερογένειας των εκτιμήσεων των SNPs, προέκυψε πράγματι

ετερογένεια (Πίνακας 3.3). Παρόλα αυτά, οι αναλύσεις ευαισθησίας που πραγματοποιήθηκαν

στη συνέχεια, για την αξιολόγηση της εγκυρότητας των IVs δεν ανέδειξαν μονάχα την ίδια

εκτιμώμενη αιτιακή κατεύθυνση (“προστασία”) αλλά ήταν και στατιστικά σημαντικές εκτιμήσεις

αιτιακών επιδράσεων (MR-Egger, Weighted Median). Όπως προέκυψε από τον έλεγχο της

πλειοτροπίας στην ανάλυση MR-Egger, διαπιστώνεται κατευθυνόμενη θετική πλειοτροπία στο

δείγμα (Πίνακας .2), ενώ η τιμή του στατιστικού (<0.9, Πίνακας 3.3) υποδείκνυε πως η

επίδραση του ΝΟΜΕ δεν ήταν αμελητέα. Από την ανάλυση της MR-PRESSO γι’ αυτόν τον

υπότυπο, προέκυψε ένα πιθανό έκτοπο SNP του οποίου η αφαίρεση δεν οδήγησε σε στατιστικά

σημαντικά αλλαγή στην εκτίμηση (η εκτίμηση ήταν στατιστικά σημαντική και σύμφωνα με τη

διορθωμένη εκτίμηση της IVW random effects της MR-PRESSO, Πίνακας 3.4).

3.1.2 Στρωματοποιημένη ανάλυση ανά υπότυπο του καρκίνου του μαστού: ER/ PR (-) όγκοι

Στους ER/PR αρνητικούς καρκίνους, η εικόνα ήταν παρόμοια με τους ER/ PR θετικούς.

Παρατηρούμε τις ενδείξεις μιας προστατευτικής σχέσης μεταξύ ΒΜΙ και κινδύνου εμφάνισης του

εκάστοτε υποτύπου του καρκίνου του μαστού. Εντούτοις, η εκτίμηση της αιτιακής επίδρασης για

τους “HER2 enriched” καρκίνους του μαστού ήταν στατιστικά μη σημαντική (με OR 0.871 95%CI

0.733, 1.036) για την IVW τυχαίων επιδράσεων. Αντίθετα, στην περίπτωση των triple negative

κακοηθειών του μαστού , η αιτιακή επίδραση που εκτιμήθηκε είναι σημαντική στο επίπεδο

στατιστικής σημαντικότητας 5%. Συγκεκριμένα, η αύξηση του BMI κατά 5 προστατεύει

κατά 12.9% τον κίνδυνο εμφάνισης αυτών των νεοπλασιών , με OR : 0.871, 95% CI: 0.799, 0.979.

(Πίνακας 3.1). Με βάση του στατιστικού Cochran’s Q διαπιστώνεται ετερογένεια στις εκτιμήσεις,

θέτοντας υπό αμφισβήτηση το μοντέλο IVW τυχαίων επιδράσεων. (Πίνακας 3.3). Οι εκτιμήσεις

των επιδράσεων των αναλύσεων ευαισθησίας για την αξιολόγηση των IVs ήταν συνεπείς με την

κατεύθυνση της IVW (προστατευτική σχέση). Το αποτέλεσμα της Weighted Median (OR: 0.809,

95% CI (0.687, 0.952) ήταν στατιστικά σημαντικό, όπως και η εκτίμηση της αιτιακής επίδρασης

της MR-Egger (OR: 0.601, 95% CI (0.436, 0.829) (Πίνακας 3.1). Με βάση το σταθερό όρο της MR

Egger ανάλυσης παρατηρείται οριζόντια κατευθυνόμενη πλειοτροπία των γενετικών μεταβλητών.

(Πίνακας 3.2), ενώ η τιμή του στατιστικού εκφράζει κάποια επίδραση της ΝΟΜΕ στον

υπολογισμό της αιτιακής επίδρασης. Με την εφαρμογή της MR-PRESSO μεθόδου εντοπίστηκαν

3 έκτοπες παρατηρήσεις , οι : rs12462975, rs1558902, rs6585198, που ωστόσο δεν επηρέασαν το

αποτέλεσμα τόσο, ώστε να μεταβληθεί στατιστικά σημαντικά η αιτιακή εκτίμηση μετά την

απομάκρυνση τους. Έτσι, η αιτιακή επίδραση που εκτιμά η IVW της MR-PRESSO είναι

στατιστικά σημαντική και αντίστοιχά, προστατευτική.

53

Συμπερασματικά, σε όλα τα υποσύνολα του καρκίνου του μαστού, όπως και στις συνολικές

περιπτώσεις καρκίνου του μαστού στις γυναίκες, η γενική παχυσαρκία εκφραζόμενη με το δείκτη

ΒΜΙ φαίνεται να δρα προστατευτικά στον κίνδυνο εμφάνισης της εν λόγω κακοήθειας. Σε άλλες

περιπτώσεις, η παρατήρηση αυτή είναι στατιστικά σημαντική και σε άλλες όχι, χωρίς να

διακρίνεται με ασφάλεια ένα διαφορετικό πρότυπο μεταξύ ορμονοθετικών και ορμονοαρνητικών

καρκίνων.

Πίνακας 3.3: Έλεγχος ετερογένειας (ΙVW κι MR-Egger) και υπολογισμός του στατιστικού 𝐼{𝐺𝑋}2

στις αναλύσεις MR της επίδρασης του ΒΜΙ στον καρκίνο του μαστού

Έκβαση Έκθεση IVW MR-Egger

Q P-value Q P- value Ολικός

καρκίνος

μαστού

BMI 990.8123 0,000* 945.6490 0,000* 0,847

Luminal A BMI 794.3315 0,000* 765.4117 0,000* 0,849

Luminal B BMI 399.4191 9E-04* 395.1910 0.0013* 0,847

HER2

enriLumina

l B/ HER2

αρνητικόςc

hed

BMI 422.0334 1E-04* 410.5346 2E-04* 0,849

HER2

enriched BMI 355.2275 0,0587 344.1275 0.1166 0,847

Triple

negative BMI 456.5318 0,000* 448.1563 0,000* 0,849

* ο αστερίσκος υποδηλώνει στατιστικά σημαντικό αποτέλεσμα στο επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας a=5%

Πίνακας 3.4: Εύρεση πλειοτροπικών SNPs μέσω της μεθόδου MR-PRESSO στη μελέτη της

επίδραση του ΒΜΙ στον κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου του μαστού

Έκβαση Eκτίμηση

(corrected) P-value Global test Global test

p-value Outliers Distortion test , p-val

Ολικός

καρκίνος

μαστού

0,917 0,004* 1005.449 1E-04* rs10182181

rs10761785

rs11672660 rs12462975 rs1558902 rs17751061 rs2267812 rs4148155 rs625652

rs6585198

rs7084454

0,116

Luminal A 0,962 0,292 805.5338 1E-04* rs10761785

rs11672660 0,158

54

rs1558902

rs625652

rs6585198

rs7084454 Luminal B 0,963 0,568 403.5845 9E-04* rs1558902 0,228

Luminal B/

HER2

αρνητικός

0,88 0,023* 425.4575 1E-04* rs7084454

0,847

HER2

enriched ΝΑ ΝΑ 358.3549 0,054 NA NA

Triple

negative 0,927 0,188 462.1281 1E-04* rs12462975

rs1558902,

rs6585198

0.13

* ο αστερίσκος υποδηλώνει στατιστικά σημαντικό αποτέλεσμα στο επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας a=5%

3.2. Κεντρική παχυσαρκία

3.2.1. Η εφαρμογή της μενδελιανής τυχαιοποίησης δύο δειγμάτων στα δεδομένα των GWAS που

αναφέρονται στο Κεφάλαιο 2 με το ερώτημα της επίδρασης του φαινότυπου της παχυσαρκίας

στην καρκινογένεση του μαστού, ανέδειξε την προστατευτική επίδραση της κεντρικής

παχυσαρκίας, εκφραζόμενη ως αύξηση του WHR κατά 1-SD, στον κίνδυνο εμφάνισης του

ολικού καρκίνου του μαστού. Η εκτίμηση της αιτιακής επίδρασης που αναδείχθηκε με την IVW

τυχαίων επιδράσεων για κάθε αύξηση 0.07 του λόγου, είχε OR: 0,895 (0.829, 0.966) (Πίνακας 3.5).

Συγκεκριμένα , η αύξηση του WHR κατά 0.07 κατά την IVW μειώνει την πιθανότητα εμφάνισης

10.5% (Πίνακας 3.5). Βάση του στατιστικού Cochran’s Q διαπιστώθηκε η παρουσία αυξημένης

ετερογένειας μεταξύ των εκτιμήσεων (Πίνακας 3.7), θέτοντας υπό αμφισβήτηση το μοντέλο

τυχαίων επιδράσεων της IVW, αν και ακριβώς σ’ αυτην την αδυναμία κλήθηκε να απαντήσει το

μοντέλο τυχαίων επιδράσεων, επιτρέποντας μεγαλύτερη ελευθερία στο μοντέλο.

Αδιαμφισβήτητα, όσο οαυξάνεται ο αριθμός των γενετικών μεταβλητών που χρησιμοποιούνται,

τόσο αναμένεται μεγαλύτερη ετερογένεια, αλλά και αυξάνεται η ισχύς της εκτίμησης. Οι

εκτιμήσεις των επιδράσεων των αναλύσεων ευαισθησίας για την αξιολόγηση των γενετικών

μεταβλητών ήταν συνεπείς με την IVW όσον αφορά την κατεύθυνση της επίδρασης.

Ταυτόχρονα, παρά τη μειωμένη συγκριτικά ισχύ τους και στις δυο αναλύσεις ευαισθησίας που

χρησιμοποιήσαμε (Weighted Median, MR-Egger) αναδείχθηκε στατιστικά σημαντική η εκτίμηση

της αιτιακής επίδρασης της σχέσης. (Πίνακας 3.5)

Η μηδενική υπόθεση της μη ύπαρξης κατευθυνόμενης πλειοτροπίας, απορρίφθηκε (πίνακας 3.6),

επομένως οριζόντιας κατευθυνόμενη πλειοτροπία ήταν παρούσα. Παρ’ όλα αυτά, η εκτίμηση του

στατιστικού ήταν οριακά αποδεκτή (( =0.9, Πίνακας 3.8).

Για τον εντοπισμό των έκτοπων πλειοτροπικών παρατηρηθέντων SNPs χρησιμοποιήθηκε η MR-

PRESSO μέθοδος, από όπου εντοπίστηκαν τα εξής 14 SNPS: rs1002473, rs10445337, rs10761785, rs10840349, rs13256367, rs13283416, rs1558902, rs17584626, rs28445639, rs6090040, rs7395513, rs747472, rs8033381, rs974801. Μετά από την απομάκρυνση τους δε διαπιστώθηκε στατιστικά

σημαντική διαφορά στην εκτίμηση της αιτιακής επίδρασης σύμφωνα με το distortion test (pval-

distortion=0.656) (Πίνακας 3.8) Επίσης, η εκτίμηση της αιτιακής επίδρασης από το μοντέλο IVW

τυχαίων επιδράσεων της MR PRESSO παρέμεινε στατιστικά σημαντική. (Πίνακας 3.8)

55

Πίνακας 3.5: Μενδελιανή τυχαιοποίηση 2 δειγμάτων για την επίδραση του WHR στον κίνδυνο

εμφάνισης ολικού καρκίνου μαστού και υποτύπων

Έκβαση Έκθεση Ν (SNPs) Μέθοδος OR (95% CI) P-value

Ολικός

καρκίνος

μαστού

WHR 253 IVW (random

effects) 0,895 (0.829,

0.966) 0,004*

Weighted

Median 0.86 ( 0.802,

0.922) 0,000*

MR-Egger 0.875 ( 0.608,

0.876) 0,001*

Luminal A WHR 253 IVW (random

effects)

0, 882 (0.807,

0.965) 0,006*

Weighted

Median 0.858 ( 0,.783,

0.939) 0,001*

MR-Egger 0.695 (0.56,

0.862) 0,001*

Luminal B WHR 253 IVW (random

effects)

0.896 ( 0.791,

1.015) 0,084

Weighted

Median 0.899 (0.737,

1.094) 0,288

MR-Egger 0.793 (0.584,

1.075) 0,134

Luminal

B/HER 2

αρνητικός

WHR 253 IVW (random

effects)

0.927 (0.824,

1.042) 0,205

Weighted

Median 0.957 (0.816,

0.122) 0,589

MR-Egger 0.661 ( 0.498,

0.878) 0,004*

ΗΕR2

enriched WHR 253 IVW (random

effects) 0.807 ( 0.684,

0.95) 0,01*

Weighted

Median 0.7 (0.54,

0.908) 0,007*

MR-Egger 0.652 (0.436,

0.974) 0,037*

triple

negative WHR 253 IVW (random

effects)

0.845 ( 0.757,

0.942) 0,002*

Weighted

Median 0.867 (0.733,

1.026) 0,097

MR-Egger 0.824 (0.633,

1.075) 0,154

* ο αστερίσκος υποδηλώνει στατιστικά σημαντικό αποτέλεσμα στο επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας a=5%

56

Πίνακας 3.6. MR-Egger έλεγχος για την ύπαρξη κατευθυνόμενης πλειοτροπίας στις αναλύσεις της

σχέσης WHR-καρκίνου του μαστού (και υποτύπων)

Έκβαση Έκθεση Intercept (95% CI) P-value

Ολικός καρκίνος

μαστού WHR 0,005 (0.001, 0.009) 0,017*

Luminal A WHR 0.006 (0.001, 0.011) 0,018*

Luminal B WHR 0.003 (-0.004, 0.01) 0,388

Luminal B/ HER2

αρνητικός WHR 0.009 (0.002,0.015) 0,01*

HER2 enriched WHR 0.005 (-0.004, 0.015) 0,255

Triple negative WHR 0.001 (-0.006, 0.007) 0,846 * ο αστερίσκος υποδηλώνει στατιστικά σημαντικό αποτέλεσμα στο επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας a=5%

Πίνακας 3.7: Έλεγχος ετερογένειας (ΙVW και MR-Egger μεθόδων) και υπολογισμός του

στατιστικού 𝐼{𝐺𝑋}2 στις αναλύσεις MR της επίδρασης του WHR στον καρκίνο του μαστού

Έκβαση Έκθεση IVW MR-Egger

Q P-value Q P-Value Ολικός

καρκίνος

μαστού

WHR 1028.7272

0,000* 1005.7248

0,000* 0.91

Luminal A WHR 828.7032 0,000* 810.5137 0,001* 0,901

Luminal B WHR 329.0658 8E-04* 328.0914 8E-04* 0,9

HER2

enriLumina

l B/ HER2

αρνητικός

WHR 393.4789 0,000* 382.5012 0,000* 0,9

HER2

enriched WHR 268.9456 0,2212 267.5617 0,2257 0,9

Triple

negative WHR 332.1963 9E-04* 332.1464 4E-04* 0,901

* ο αστερίσκος υποδηλώνει στατιστικά σημαντικό αποτέλεσμα στο επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας a=5%

3.2.1 Στρωματοποιημένη ανάλυση ανάλογα με τον υπότυπο του καρκίνου του μαστού: ER/PR

(+) όγκοι

57

Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε ανάλυση της επίδρασης της κεντρικής παχυσαρκίας στους

υπότυπους τους καρκίνους του μαστού και προέκυψαν τα εξής αποτελέσματα αναφορικά με

τους ορμονο-ευαίσθητους υπότυπους (θετικούς σε υποδοχείς οιστρογόνων).

Για τον υπότυπο “Luminal A” διαφάνηκε προστατευτική αιτιακή επίδραση (OR : 0, 882, CI95%

0.807, 0.965), η οποία ήταν στατιστικά σημαντική στο επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας του

5% για το μοντέλο τυχαίων επιδράσεων της IVW. (Πίνακας 3.5). Από το στατιστικό Cochran’s Q

ήταν σαφής η παρουσία αυξημένης ετερογένειας. Οι εκτιμήσεις των επιδράσεων των αναλύσεων

ευαισθησίας για την αξιολόγηση των IVs ήταν συνεπείς με την κατεύθυνση της IVW όσων αφορά

το πρόσημο (“προστατευτική” σχέση). Το αποτέλεσμα τόσο του Weigted Median, όσο και της

MR-Egger ανάλυσης ήταν στατιστικά σημαντικό. Επικράτησε ωστόσο η εναλλακλτική υπόθεση

της ύπαρξης κατευθυνόμενης πλειοτροπίας (Πίνακας 3.6). Με βάση την η επίδραση της

ΝΟΜΕ δε ήταν αμελητέα , αλλά βρισκόταν εντός αποδεκτών ορίων, επομένως η ΝOME

ικανοποιήθηκε (Πίνακας 3.7) Για τον εντοπισμό των έκτοπων παρατηρήσεων χρησιμοποιήθηκε

η MR-PRESSO με τον εντοπισμό 10 έκτοπων SNPs : rs1002473, rs10445337, rs13256367, rs13283416, rs1558902, rs17584626, rs6090040, rs7395513, rs8033381, rs974801 , χωρίς ωστόσο η

αφαίρεσή τους να μεταβάλλει με στατιστικά σημαντικό τρόπο την αιτιακή επίδραση που

υπολογίσθηκε (distortion test= 0,815. (Πίνακας 8) Η εκτίμηση της αιτιακής επίδρασης σύμφωνα

με το μοντέλο τυχαίων επιδράσεων της MR PRESSO ήταν 0.880 (p-val<0.05).

Για τους “Luminal B” καρκίνους του μαστού δεν αποδείχθηκε στατιστικά σημαντικό αποτέλεσμα

με βάση τη μέθοδο IVW τυχαίων επιδράσεων στο επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας 5% (OR:

0.896 95% CI0.791, 1.015), ωστόσο δεν ανατράπηκε το πρόσημο της “προστατευτικής” σχέσης

όπως και στην περίπτωση του ολικού καρκίνου (Πίνακας 3.5). Από τη μελέτη του στατιστικού

Cochran’s Q προκύπτει πως η ανάλυση αυτή έχει μετριασμένη ετερογένεια (Q = 329.0658 ,

Πίνακας 3.7, με βάση την κατανομή για τους δεδομένους βαθμούς ελευθερίας), ενώ οι

αναλύσεις ευαισθησίας για την αξιολόγηση των παραδοχών των γενετικών μεταβλητών είχαν

την ίδια κατεύθυνσης αιτιακής επίδρασης με το μοντέλο τυχαίων επιδράσεων IVW. Τόσο η

Weighted Median, όσο και η MR-Egger αναλύσεις ευαισθησίας δεν ανέδειξαν στατιστικά

σημαντική σχέση. Δεν απορρίφθηκε η μηδενική υπόθεση της μη ύπαρξης κατευθυνόμενης

πλειοτροπίας της ανάλυσης MR-Egger (πίνακας 6, intercept p-value=0.388) ενώ αποδεκτό ήταν

το αποτέλεσμα της . Από την εφαρμογή της MR-PRSSO ανάλυσης εντοπίστηκε 1 SNP,

rs1558902, η αφαίρεσή του οποίου δεν οδήγησε σε στατιστικά σημαντική διαφορά στο

αποτέλεσμα των εκτιμήσεων (distortion test p-val= 0.634). Η ίδια η εκτίμηση του μοντέλου IVW

τυχαίων επιδράσεων της MR-PRESSO δεν ήταν στατιστικά σημαντική (Πίνακας 3.8).

Για το “LuminalB/ HER2 αρνητικό” υπότυπο, επίσης, δεν αναδείχθηκε στατιστικά σημαντική

“προστατευτική” επίδραση της κεντρικής παχυσαρκίας στον κίνδυνο εμφάνισης του.

Συγκεκριμένα, στο IVW μοντέλο τυχαίων επιδράσεων είχαμε OR: 0.927 , με CI 95%: 0.824, 1.042.

(Πίνακας 3.5) Από την εκτίμηση του στατιστικού Q για την εκτίμηση της ετερογένειας των

εκτιμήσεων των SNPs, διαπιστώνεται ετερογένεια (Πίνακας 3.7). Από τις αναλύσεις ευαισθησίας

που πραγματοποιήθηκαν στη συνέχεια για την αξιολόγηση της εγκυρότητας των γενετικών

μεταβλητών και του ευρήματος, αναδείχθηκε η ίδια κατεύθυνση (“προστασία”) της αιτιακής

επίδρασης αλλά μονάχα η ανάλυση MR-Egger, με τις πιο χαλαρές της προϋποθέσεις, είχε

στατιστικά σημαντικό αποτέλεσμα. Όπως προέκυψε από τον έλεγχο της πλειοτροπίας στην

ανάλυση MR-Egger, όντως διαπιστώνεται κατευθυνόμενη πλειοτροπία στο δείγμα της μελέτης,

και επομένως και η τιμή του στατιστικού ήταν οριακά αποδεκτή Από την MR-PRESSΟ

ανάλυση διαπιστώθηκε 2 outliers, rs13256367 rs2820443, η απομάκρυνση των οποίων δεν

58

ανέδειξε στατιστικά σημαντική διαφορά από την ακατέργαστη εκτίμηση της αιτιακής επίδρασης

(Πίνακας 3.8).

3.2.2 Κίνδυνος εμφάνισης υποτύπων του καρκίνου του μαστού: ER/PR (-) όγκοι

Στους ER/PR αρνητικούς καρκίνους, είχαμε μια παρόμοια εικόνα με τους ER/PR θετικούς, δηλαδή

παρατηρούμε τις ενδείξεις μιας προστατευτικής σχέσης μεταξύ WHR και κινδύνου εμφάνισης

του εκάστοτε υποτύπου του καρκίνου του μαστού. Η αιτιακή επίδραση για τους “HER2 enriched

“καρκίνους του μαστού ήταν στατιστικά σημαντική με OR 0.807, CI 95% (0.684, 0.95) για την

IVW τυχαίων επιδράσεων, δηλαδή “προστατευτική¨ επίδραση ίση με 19.3% στον κίνδυνο

εμφάνισης αυτού του καρκίνου για κάθε αύξηση του WHR κατά 0.07. Την ίδια κατεύθυνση

αιτιακής επίδραση με εύρημα ταυτόχρονα στατιστικά σημαντικό είχαν και οι εκτιμήσεις των

αναλύσεων ευαισθησίας που πραγματοποιήθηκαν (Weighted Median, MR-Egger, Πίνακας 3.5).

Από το στατιστικό Cochran’s Q της IVW έχουμε και πάλι την παρουσία ετερογένειας, που

εξηγείται μερικώς από την πλειάδα των SNPs που χρησιμοποιήθηκαν. Οι αναλύσεις ευαισθησίας

ωστόσο συνηγορούν υπέρ της εγκυρότητας των SNPs. Από το σταθερό όρο της MR-Egger δεν

προκύπτει η ύπαρξη κατευθυνόμενης πλειοτροπίας (πίνακας 3.6), ενώ είμαστε ευχαριστημένοι

από την εκτίμηση του ( Πίνακας 3.7). Από την MR-PRESSO μέθοδο για τον προσδιορισμό

των έκτοπων παρατηρήσεων , αυτές δεν μπόρεσαν να εντοπιστούν λόγω ελλειπουσών τιμών.

Στην περίπτωση των “Triple negative” κακοηθειών μαστού, η αιτιακή επίδραση είναι σημαντική

στο επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας 5% για την IVW τυχαίων επιδράσεων . Συγκεκριμένα,

η αύξηση του WHR κατά 0.07, “προστατεύει” κατά 15,5% τον κίνδυνο εμφάνισης αυτών των

νεοπλασιών , με OR : 0.845, CI95%: (0.757, 0.942). (Πίνακας 3.5). Με βάση το στατιστικό

Cochran’s Q διαπιστώνεται ετερογένεια στις εκτιμήσεις , θέτοντας υπό αμφισβήτηση το μοντέλο

IVW τυχαίων επιδράσεων. (Πίνακας 3.7). Οι εκτιμήσεις των επιδράσεων των αναλύσεων

ευαισθησίας για την αξιολόγηση των IVs ήταν συνεπείς με την κατεύθυνση της IVW, χωρίς

ωστόσο το αποτέλεσμα της εκτίμησης που προέκυψε να είναι στατιστικά σημαντικό. Με βάση το

σταθερό όρο της ΜR-Egger ανάλυσης δεν παρατηρείται κατευθυνόμενη πλειοτροπία στα

αποτελέσματα. (Πίνακας 3.6), ενώ η τιμή του στατιστικού εκφράζει είναι αποδεκτό. Με την

εφαρμογή της MR-PRESSO μεθόδου εντοπίστηκε 1 έκτοπη παρατήρηση, η rs156913. Η

απομάκρυνση της δε μετέβαλλε στατιστικά σημαντικά την εκτίμηση. (Πίνακας 3.8)

Εν κατακλείδι, η κεντρική παχυσαρκία, όπως εκφράζεται με το λόγο περιμέτρου μέσης προς

γοφών (WHR) φαίνεται πως στο βαθμό που είναι γενετικά καθορισμένη, κατά την αύξηση της,

προστατεύει τις γυναίκες από τον κίνδυνο εμφάνισης του καρκίνου του μαστού, βάση της

μενδελιανής τυχαιοποίησης δύο δειγμάτων περιληπτικών δεδομένων που πραγματοποιήσαμε

εδώ. Να σημειωθεί πως οι εκτιμήσεις που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα ανάλυση έχουν

αντληθεί από GWAS όπου έχει γίνει ήδη η διόρθωση τους για το ΒΜΙ. Η προστατευτική σχέση

υπάρχει τόσο στους ορμονο-αρνητικούς όσο και στους ορμονο-θετικούς καρκίνους, χωρίς

ωστόσο να αναδεικνύεται σε όλους τους υποτύπους μια αιτιακή επίδραση στατιστικά

σημαντική.

59

Πίνακας 3.8: Εύρεση πλειοτροπικών SNPs μέσω της μεθόδου MR-PRESSO στην επίδραση του

WHR στον κίνδυνο εμφάνισης του ολικού καρκίνου μαστού και υποτύπων

Έκβαση Eκτίμηση

(corrected) P-value Global test Global test

p-value Outliers Distortion test , p-val

Ολικός

καρκίνος

μαστού

0,906 0,001* 1039.154 2E-0*4 rs1002473

rs10445337

rs10761785

rs10840349

rs13256367

rs13283416

rs1558902

rs17584626

rs28445639

rs6090040

rs7395513

rs747472

rs8033381

rs974801

0,656

Luminal A 0,889 0,001* 836.9227 2E-04* rs1002473

rs10445337

rs13256367

rs13283416

rs1558902

rs17584626

rs6090040

rs7395513

rs8033381

rs974801

0,815

Luminal B 0,916 0,165 331.9872 0,001* rs1558902

0,634

Luminal B/

HER2

αρνητικός

0,915 0,124 396.8998 2E-04* rs13256367

rs2820443 0,859

HER2

enriched NA NA 270.8796 0,225 NA NA

Triple

negative 0,868 0,009* 335.5053 5E-04* rs1569135 0,539

* ο αστερίσκος υποδηλώνει στατιστικά σημαντικό αποτέλεσμα στο επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας a=5%

Μέρος 2ο

3.3. Πολυπαραγοντική Μενδελιανή τυχαιοποίηση -Ανάλυση μεσολάβησης (mediation)

Σχέση δευτερογενών φαινοτύπων με την έκβαση

Στη συνέχεια της μελέτης μας, πραγματοποιήθηκαν πολυπαραγοντικές αναλύσεις, ως περαιτέρω

αναλύσεις ευαισθησίας στο υπό μελέτη ερώτημα, χρησιμοποιώντας 6 διαφορετικές δευτερεύοντε

ς φαινοτύπους σε συνάρτηση με την παχυσαρκία. Στόχος της ανάλυσης αυτής ήταν να

συνυπολογιστεί η επίδραση των δευτερευόντων αυτών παραγόντων κινδύνου στην αιτιακή

επίδραση που υπολογίσθηκε από τους πρωτεύοντες παράγοντες κινδύνου στις μονο-

παραγοντικές αναλύσεις, διορθώνοντας ίσως την εκείνη, και προσφέροντας παραπάνω

κατανόηση στο βιολογικό μονοπάτι της καρκινογένεσης το οποίο ιχνηλατούμε. Οι δευτερεύοντες

60

παράγοντες κινδύνου που μελετήθηκαν ήταν οι εξής: C-reactive protein (CRP), ινσουλίνη

νηστείας (fasting insulin-FI), ο σακχαρώδης διαβήτης 2 (T2DM), ο insuline-like growth-factor 1

(igf-1), η τεστοστερόνη (testosterone) και τα λιπίδια (LDL, HDL, TG). Τα τελευταία λόγω της

έντονης μοριακής συσχέτισης τους μελετώνται με πολυ-παραγοντικό μοντέλο εξ ορισμού.

Περισσότερες λεπτομέρειές για τις GWAS από τις οποίες αντλήθηκαν οι γενετικές μεταβλητές

βρίσκονται στο Κεφάλαιο 2 της παρούσας μελέτης. Η μελετώμενη έκβαση που χρησιμοποιήθηκε

επιλέχθηκε να είναι μονάχα ο συνολικός καρκίνος του μαστού, χάριν διευκόλυνσης της έρευνας,

αλλά και λόγω της μη ύπαρξης ουσιαστικά διαφοράς στην κατεύθυνση της επίδρασης των

δεικτών παχυσαρκίας στις στρωματοποιημένες αναλύσεις. Στόχος μας λοιπόν ήταν ο

υπολογισμός της άμεσης αιτιακής επίδρασης (direct effect) των πρωτογενών παραγόντων της

ανάλυσης μας (BMI, WHR) μετά από την μεσολάβηση (mediation) δευτερευόντων παραγόντων

κινδύνου στη μελετώμενη έκβαση, ενώ δεν είναι ο υπολογισμός των της έμμεσης αιτιακής

επίδρασης αυτών (indirect effect). Η άμεση επίδραση ορίζεται ως η υπολειπόμενη επίδραση της

έκθεσης στην έκβαση, εφόσον έχουμε διορθώσει για μία δευτερεύουσα έκθεση, η οποία λαμβάνει

χώρα μέσω μονοπατιών διαφορετικών από εκείνους που υποδεικνύει (και άρα εξηγεί με την

παρουσία του) κάθε φορά ο εκάστοτε μεσολαβητής. Η συσχέτιση που επιτρέπεται σε αυτή τη

μελέτη μεταξύ πρωτευόντων και δευτερευόντων εκθέσεων είναι εκείνη της μεσολάβησης. Για το

σκοπό αυτό θα χρησιμοποιήσουμε τη μέθοδο της “2-step MR” (Haycock et al, 2016, Burghess et

al, 2015)

Προκειμένου να συμπεριλάβουμε τις προ-αναφερθείσες εκθέσεις ως υπό διερεύνηση εκθέσεις της

αιτιακής επίδρασης στον κίνδυνο της εμφάνισης του καρκίνου του μαστού, πρέπει να

αποδείξουμε πως συσχετίζονται (ανεξαρτήτως κατεύθυνσης) πράγματι με την έκβαση του

καρκίνου αυτού. Παρότι για κάθε μία από τις μεταβλητές που αναφέραμε υπάρχουν μελέτες

Μενδελιανής τυχαιοποίησης που υποδεικνύουν την ύπαρξη αιτιακής επίδρασης στη νόσο,

παρατίθενται επιπλέον στον Πίνακα 3.9, οι 9 μονο-παραγοντικές αναλύσεις δύο δειγμάτων που

πραγματοποιήθηκαν στα πλαίσια της παρούσας μελέτης , με τα διαθέσιμα δεδομένα των ευρυ-

γονιδιωματικών μελετών (GWAS) που αναφέρονται στο Κεφάλαιο 2.

Από τα αποτελέσματα του Πίνακα 3.9, προκύπτει πως οι γενετικές μεταβλητές (SNPs) για τους

φαινοτύπους CRP, IGF-1, Testosterone, HDL σχετίζονται με τη μελετώμενη έκβαση με στατιστικά

σημαντικό τρόπο, ενώ για τις υπόλοιπες εκθέσεις δεν προκύπτει στατιστικά σημαντική συσχέτιση.

Θα αντλήσουμε λοιπόν τις θεωρητικές συσχετίσεις που χρειαζόμαστε από δημοσιευμένες μελέτες

2-sample MR, ακόμη και αν δεν έχουν χρησιμοποιήσει τις ίδιες GWAS για άντληση δεδομένων με

τις δικές μας. Τέλος, αναφορικά με τα λιπίδια, ούτως ή άλλως εφόσον ένα εξ αυτών φαίνεται να

συσχετίζεται, για βιολογικούς λόγους είναι δόκιμο να συμπεριληφθούν όλα.

Δημοσιευμένες μελέτες μενδελιανής τυχαιοποίησης από τις οποίες προκύπτει συσχέτιση με τη

μελετώμενη έκβαση, και αναφέρονται παρακάτω:

α) Λιπίδια (TG, HDL, LDL): Johnson et al, 2020, Beeghly-Fadiel, 2020 (μόνο για την HDL), Nowak

et al, 2018 (για τις LDL, HDL),

β) Ινσουλίνη νηστείας (FI): Shu et al, 2019, Pearson-Stuttard et al, 2021

γ) Σακχαρώδης Διαβήτης 2 (T2DM) : Pearson-Stuttard et al, 2021

Ενώ αναφέρονται οι δημοσιευμένες με αιτιακή συσχέτιση με την έκβαση και για τις εκθέσεις που

αποδείξαμε στατιστικά σημαντικό αποτέλεσμα:

61

δ) IGF-1: Larson et al, 2020

ε)Τεστοστερόνη: Ruth et al, 2020

στ) CRP: Robinson et al, 2021

Πίνακας 3.9: Μονοπαραγοντική ανάλυση μενδελιανής τυχαιοποίησης δύο δειγμάτων για την

αιτιακή επίδραση του παράγοντα κινδύνου (έκθεση) στον κίνδυνο εμφάνισης ολικού καρκίνου

του μαστού (έκβαση), μέθοδος IVW

Εκθεση SNPs

(N) IVW OR (95% CI) P-value

CRP 48 1.07 (1.006, 1.139) 0,032 T2DM 201 0,985 (0.955, 1.017) 0,369 FI 38 0,939 (0.711, 1.24) 0,656 Igf-1 204 1.076 (1.022, 1.132) 0,005 Testosterone

88 1.116 (1.039, 1.198) 0,003

HDL 88 1.103 (1.043, 1.168) 0,001 LDL 78 1.033 (0.985, 1.083) 0,181 TG 54 0.927 (0.927, 1.002) 0,056 (*) ο αστερίσκος υποδηλώνει στατιστικά σημαντικό αποτέλεσμα στο επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας α=5%

Από τον Πίνακα 3.9 προκύπτει πως δεν αποδεικνύεται η αιτιακή επίδραση του Σακχαρώδη

Διαβήτη 2 και της ινσουλίνης νηστείας στον κίνδυνο εμφάνισης του καρκίνου του μαστού και

γι’ αυτό δε θα χρησιμοποιηθούν παραπάνω στην ανάλυση μας. Από τους υπόλοιπους

δευτεροπαθείς φαινοτύπους, η LDL δεν εμφανίζεται να έχει αυτόνομη σχέση με την υπό μελέτη

έκβαση , ωστόσο καθώς συνδέεται με βιολογικό μηχανισμό με τα υπόλοιπα λιπίδια , δεν είν

αι σώφρον να αφαιρεθεί κάποιο από αυτά και θα συμπεριληφθούν όλα.

Μέρος 3ο

3.3.1 Διερεύνησης σχέσης μεσολάβησης ΒΜΙ και δευτερογενών φαινοτύπων

Πίνακας 3.10: MR-analysis δυο δειγμάτων για την επίδραση του ΒΜΙ στους υπό μελέτη

παράγοντες κινδύνου, μέσω της μεθόδου IVW τυχαιων επιδράσεων

Εκθεση Εκβαση SNP

(N) IOR (05% CI) P-val

ΒΜΙ CRP 313 1.474 (1.38, 1.573) 0,000 * BMI IGF-1 316 0.872. (0.836, 0.909) 0,000*

BMI Testosterone 316 1.091 (1.052, 1.132) 0,000*

62

BMI TG 307 1.215 (1.168, 1.264) 0,000*

BMI HDL 307 0,774 (0.74, 0.81) 0,000*

BMI LDL 307 1.002 (0.944, 1.065) 0,94 * ο αστερίσκος υποδηλώνει στατιστικά σημαντικό αποτέλεσμα

Στον Πίνακα 3.10, για όλους τους φαινοτύπους που χρησιμοποιήθηκαν ως έκβαση, με εξαίρεση

την HDL, προκύπτει πως η αύξηση του ΒΜΙ θα προκαλέσει αύξηση και αυτών των παραγόντων.

Στην περίπτωση της LDL η συσχέτιση δε φαίνεται ωστόσο να είναι στατιστικά σημαντική. Για

όλες τις υπόλοιπες μεταβλητές, αναδεικνύεται στατιστικά σημαντική αιτιολογική σχέση,

υποδεικνύοντας πως o μηχανισμός δράσης του ΒΜΙ στον καρκίνο του μαστού, μπορεί να

διαμεσολαβείται από την εκάστοτε έκθεση του Πίνακα 3.10.

Προκειμένου να μπορεί να χρησιμοποιηθεί δόκιμα μια μεταβλητή ως μεσολαβητής (mediator), και

να βοηθήσει στην κατανόηση του βιολογικού μηχανισμού της σχέσης που μελετάται, δε θα έπρεπε

να δρα ως συγχυτικός (confounder) παράγοντας της σχέσης. Συγχυτικός παράγοντας ορίζεται

εκείνος ο παράγοντας που επιδρά τόσο στην εξαρτημένη (έκβαση) όσο και στην ανεξάρτητη

μεταβλητή (έκθεση). Εν προκειμένω, οι παράγοντες κινδύνου που χρησιμοποιήσαμε φαίνεται να

συσχετίζονται με την έκβαση (Πίνακας 3.10), όπως και η η κυρίαρχη έκθεση (ΒΜΙ=Χ1) φαίνεται

να έχει αιτιακής επίδραση σε αυτούς (ΧΙ->Χ2) , πράγμα που υποδηλώνει τη μεσολάβηση της

επίδρασης του Χ1-> Y(έκβαση) και από αυτούς. Όπως φαίνεται και στο διάγραμμα DAG

(Κεφάλαιο 2), αν υπάρχει αμφίδρομη σχέση, δηλαδή αν προκύπτει πως οι ίδιοι αυτοί φαινότυποι

έχουν και αιτιακή επίδραση στο ΒΜΙ (Χ2->Χ1), τότε ενδεχομένως δρουν και και ως συγχυτικοί

παράγοντες της σχέσης ΒΜΙ-έκβασηX1-> Y). Επομένως , δε θα έπρεπε να χρησιμοποιηθούν για

τον υπολογισμό της άμεσης αιτιακή επίδρασης του ΒΜΙ στην έκβαση στο πολυπαραγοντικό μας

μοντέλο, γιατί δεν αποτελούν μονάχα μεσολαβητές και η επίδραση τους θα είναι δύσκολο να

εκτιμηθεί.

Όπως φαίνεται στον Πίνακα 3.11, στον οποίο αναγράφονται τα αποτελέσματα της ανάλυσης

Μενδελιανής τυχαιοποίησης περιληπτικών δεδομένων δύο δειγμάτων κανένας από τους

αναφερόμενους παράγοντες δεν εμφανίζει στατιστικό σημαντικό αποτέλεσμα στην αντίστροφη

σχέση, δηλαδή (Χ2-> Χ1) , εκτός την τεστοστερόνη (Testosterone), σε στατιστικά σημαντικό

βαθμό. Υπάρχει λοιπόν μια αμφίδρομη σχέση μεταξύ της κύριας έκθεσης μας (ΒΜΙ) και της

τεστπστερόνης. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε ανάλυση πολυπαραγοντικής μενδελιανής

τυχαιοποίησης (‘3 δειγμάτων”) δίχως την προσαρμογή για την προαναφερθείσα έκθεση.

Πίνακας 3.11: Μενδελυανή τυχαιοποίηση δυο δειγμάτων για τη σχέση των υπο μελέτη

παραγόντων κινδύνου με την πρωτογενή έκθεση κινδύνου (ΒΜΙ), με τη χρήση της IVW τυχαίων

επιδράσεων

Εκθεση Εκβαση SNPs

(N) OR (95% CI) P-val

CRP ΒΜΙ 48 1.061 (0.997, 1.129) 0,060

IGF-1 BMI 200 1.007 (0.976, 1.04) 0,651

63

Testosterone BMI 88 1.055 (1.016, 1.096) 0,005* TG BMI 54 0,987 (0.943,1.034 0,593

HDL BMI 88 0,969 (0.923, 1.018) 0,209

LDL BMI 78 0.962 (0.939, 0.985) 0,593 * ο αστερίσκος υποδηλώνει στατιστικά σημαντικό αποτέλεσμα στο επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας a=5%

3.3.2 Πολυπαραγοντική Μελέτη μενδελιανής τυχαιοποιησης : ΒΜΙ και δευτερεύοντες φαινότυποι

Πίνακας 3.12: Πολυπαραγοντική Μενδελιανής τυχαιοποίησης περιληπτικών δεδομένων με κύρια έκθεση

(ΒΜΙ) και μεσολαβητές (mediators) για τη μελέτη της αιτιακής επίδρασης στην ολικό καρκίνου του μαστού

(έκβαση), με χρήση της IVW random effects.

Εκθεση (Χ1) Μεσολαβητής

(Χ2) SNP (N)

-

συνολικ

ά

Β1

coefficient

BMI

OR, 95%CI - direct effect του

ΒΜΙ P-val

ΒΜΙ CRP 328 -0.15 0,861 (0.801, 0.925) 5,387381E-05* BMI IGF-1 406 -0,117 0.89 (0.828, 0.956) 0,002 *

BMI (LDL, HDL, TG) 370 -0,079 0,924 (0.856, 0.998) 0,046 *

ΒΜΙ - 316 -0,122 0.885 (0.827, 0.947) (**Πίνακας

3.1) 0,000*

* ο αστερίσκος υποδηλώνει στατιστικά σημαντικό αποτέλεσμα στο επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας a=5%** μεταγραφή αποτελέσματος από

τον αναφερόμενο Πίνακα

Aς δεχτούμε την παραδοχή πως οι σχέσεις που μελετώνται είναι γραμμικές και δεν υπάρχει

αλληλεπίδραση μεταξύ των γενετικών μεταβλητών. Οι γενετικές μεταβλητές που

χρησιμοποιήθηκαν ήταν στατιστικά σημαντικές στο τυπικό επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας

για τις ευρυ-γονιδιωματικές μελέτες (p= 5*10-8) , και είχαν συσχέτιση με με τον κύριο ή

δευτερογενή (δευτερογενείς) παράγοντα υπό μελέτη είτε με αμφότερους. Άλλωστε αυτή η

πλειοτροπία των γενετικών μεταβλητών είναι αποδεκτή στα πλαίσια της πολυ-παρραγοντικής

μελέτης MR.

Από τα αποτελέσματα του Πίνακα 13.2, αξίζει να σημειωθεί πως :

α) κατά τη συμπερίληψη των λιπιδίων στη σχέση BMI-BRCA , η άμεση αιτιακή επίδραση του ΒΜΙ

στον κίνδυνο εμφάνισης του καρκίνου του μαστού, υπολογισμένο βάση της μεθόδου IVW

τυχαίων επιδράσεων, έχει OR =0,924, με CI 95% (0.856, 0.998). Συγκριτικά, με την

μονοπαραγοντική σχέση του BMI με τον καρκίνο του μαστού (Πίνακας 3.1) έχουμε μια μεταβολή

της αιτιακής επίδρασης προς λιγότερο προστατευτική. Η μεταβολή αυτή στοιχειοθετείται από τη

μεταβολή του coefficient b1 της κύριας έκθεσης από -0.122 σε (-0,079, μεταβολή ίση με -0.079-

(-0,122`)/(-0.122) = 0,35, που αντιστοιχεί στο 35% της αρχικής εκτίμησης. (Πίνακας 3.12)

Φαίνεται πως ένας μέρος του προστατευτικού βιολογικού μονοπατιού που σηματοδοτείται από

το γενετικά προβλεπόμενο αυξημένο ΒΜΙ για τον κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου του μαστού στις

64

γυναίκες διαμεσολαβείται και άρα εξηγείται από την γενετικά προβλεπόμενη αύξηση των λιπιδίων

στο αίμα, με τα οποία μπορεί το ΒΜΙ να σχετίζεται. Το ποσοστό αυτό ισούται 35% της αρχικής

εκτίμησης όταν έχουμε προσαρμόσει για τα λιπίδια. Για κάθε αύξηση του ΒΜΙ κατά 5𝑘𝑔

𝑚2,

κρατώντας σταθερά τα λιπίδια, προκύπτει μια προστατευτική επίδραση της τάξης του 7.6% για

τον κίνδυνο εμφάνισης του καρκίνου του μαστού. Για την αξιολόγηση της ισχύος των

μεταβλητών που χρησιμοποιήθηκαν εκμεταλλευτήκαμε το Cochran’s Q strength. Η τιμή του είναι

αρκετά μεγάλη για την οριακή τιμή που προκύπτει από τη κατανομή για τους 365 βαθμούς

ελευθερίας του μοντέλου και επομένως υπάρχει επαρκής πληροφορία στις γενετικές μεταβλητές

που χρησιμοποιούμε για να προβλέψουμε και τις δυο εκθέσεις. Εμπειρικά, για την αξιολόγηση της

ισχύος των γενετικών μεταβλητών χρησιμοποιείται και το F-conditional , το οποίο θα πρέπει

παραδοσιακά να έχει τιμή μεγαλύτερο του 5, γεγονός που συμβαίνει εδώ για όλες τις μεταβλητές

(Πίνακας 3.13). Για την αξιολόγησης της εγκυρότητας των γενετικών μεταβλητών ως δόκιμες IVs

χρησιμοποιείται το στατιστικό Q - validity . Στην προκειμένη περίπτωση απορρίπτεται η μηδενική

υπόθεση της μη ύπαρξης πλειοτροπικών επιδράσεων των γενετικών μεταβλητών, εφόσον το Q

είναι αρκετά μεγάλο. Επομένως οι παραδοχές των IV2/IV3 (βλέπε κεφάλαιο 1) τίθενται σε

αμφισβήτηση. Να σημειωθεί πως για τον υπολογισμό των στατιστικών Q η συν-διακύμανση

μεταξύ των μεταβλητών θεωρήθηκε μηδενική.

β) κατά τη συμπερίληψη της IGF-1 στο πολυπαραγοντικό μοντέλο προκύπτει μια μικρή αύξηση

στην εκτίμηση της άμεσης αιτιακής επίδρασης του ΒΜΙ στον ολικό κίνδυνο εμφάνισης του

καρκίνου του μαστού, με βάση το μοντέλο IVW τυχαίων επιδράσεων. Αυτή η αύξηση ισοδυναμεί

με μετριασμό του “προστατευτικού” αποτελέσματος κατά 4% (-0.117 – (-0.122)/(-0.122)= 0.04 )

(Πίνακας 3.12). Σε αυτό το μοντέλο , για κάθε αύξηση του BMI κατά 5𝑘𝑔/𝑚2 προκύπτει

προστατευτικό αποτέλεσμα ίσο 11 %για τον κίνδυνο εμφάνισης του καρκίνου του μαστού,

οποιοδήποτε υποτύπου.

Πίνακας 3.13: Αξιολόγηση της εγκυρότητας και της ισχύος των μεταβλητών σε πολύ-

παραγοντική Μενδελιανή τυχαιοποίηση περιληπτικών δεδομένων (συνδιακύμανση =0)

Κύρια

έκθεσ

η

Μεσολαβητή

ς S

N

P

s

Coefficient

β1 ( ΒΜΙ) St.

Error

β1

Cochran’s Q

strength Cochran’s Q-

validity (p-val) F-conditional statistic

ΒΜΙ CRP 3

2

8

-0.15 0.0366 14129.69 (BMI) 6972.906 (CRP)

976.6225

(2.20135e-66) 43.07831 (ΒΜΙ) 21.25886 (CRP)

BMI IGF-1 4

0

6

-0,117 0,037 17071.42

(BMI)

14655.8.

(IGF1)

1277.9

(1.313986e-91) 42.04782 (BMI) 36.09803 (IGF1)

BMI (LDL, HDL,

TG) 3

7

0

-0,079 0.039

3 14482.84

(BMI)

9890.632

(LDL)

1131.002

(2.81711e-79) 39.14282 (BMI) 26.73144 (LDL) 18.40115 (HDL) 15.47666 (TG)

65

6808.424

(HDL)

5726.363

(TG)

3.4.1. 1 Διερεύνησης σχέσης μεσολάβησης WHR και δευτερογενών φαινοτύπων

Παρακάτω παρατίθεται η αντίστοιχη με την προηγούμενη ανάλυση, στα πλαίσια της “2-step MR”

για την άλλη κύρια μεταβλητή της μελέτης, το WHR.

Έχοντας υποδείξει πως οι παράγοντες υπό μελέτη συσχετίζονται με τη μελετώμενη έκβαση

(Κεφάλαιο 3, 3.3) , εξετάζουμε τη αιτιακή επίδραση της κεντρικής παχυσαρκίας (WHR) στους

υπό εξέταση μεσολαβητές. (Πίνακας 13.4), σε μονο-παραγοντικά μοντέλα Μενδελιανής

τυχαιοποιήης δύο δειγμάτων με τις μεθόδους και το υλικό που έχουν αναφερθεί νωρίτερα

(Κεφάλαιο 2).

Πίνακας 3.14: MR-analysis δυο δειγμάτων για την επίδραση του WHR στους υπό μελέτη

παράγοντες κινδύνου, με χρήση IVW τυχαίων επιδράσεων.

Εκθεση Εκβαση SNP

(N) IVW OR (95% CI) P-val

WHR CRP 251 1.113 (1.034, 1.198) 0,004* WHR IGF-1 252 1.06 (1.007, 1.114) 0,025*

WHR Testosterone 252 0,928 (1.052, 1.132) 0,000*

WHR TG 255 1.451 (1.38, 1.525) 0,000*

WHR HDL 225 0,713 (0.676, 0.753) 0,000*

WHR LDL 225 1.116 (1.039, 1.203) 0,004* * ο αστερίσκος υποδηλώνει στατιστικά σημαντικό αποτέλεσμα στο επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας a=5%

Βάση των αποτελεσμάτων του Πίνακας 3.14, το WHR (ανεξάρτητη μεταβλητή) εμφανίζει

στατιστικά σημαντική αιτιακή επίδραση για όλους τους υπό μελέτη δευτερεύοντες φαινότυπους

(εξαρτημένη μεταβλητή).

Πίνακας 3.15: Μενδελιανή τυχαιοποίηση δυο δειγμάτων για την αιτιακή επίδραση των υπό μελέτη

δευτερευόντων εκθέσεων στην κύρια έκθεση υπό μελέτη (WHR), με τη χρήση της IVW τυχαίων

επιδράσεων

Εκθεση Εκβαση SNPs

(N) IVW OR IVW (95% CI) P-val

66

CRP WHR 48 1.066 (1.022, 1.113) 0,03*

IGF-1 WHR 200 0.99 (0.99, 1.024) 0,549

Testosterone WHR 88 1.025 (0.974, 1.079) 0,340

TG WHR 53 1.151 (1.128 ,1.267) 0,004*

HDL WHR 88 0,906 (0.846, 0.969) 0,004*

LDL WHR 84 1.033 (0.979, 1.089) 0,241

• ο αστερίσκος υποδηλώνει στατιστικά σημαντικό αποτέλεσμα στο επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας a=5%

Στην “αντίστροφη” ανάλυση μονοπααγοντικής Μενδελιανής τυχαιοποίησης δυο δειγμάτων

περιληπτικών δεδομένων, όπου έκβαση συνιστά η κύρια έκθεση υπό μελέτη, δηλαδή το WHR, οι

γενετικές μεταβλητές για τις CRP, TG, HDL φαίνεται να συσχετίζονται στατιστικά σημαντικά μαζί

του (Πίνακας 3.15). Το γεγονός αυτό υποδεικνύει μια αμφι-κατευθυνόμενη σχέση καθώς όπως

είδαμε στον Πίνακα 13, οι γενετικές μεταβλητές για το WHR συσχετίζονται στατιστικά σημαντικά

με τις δευτερεύοντες εκθέσεις, όπως τις έχουμε ορίσει στη μελέτη μας. H διπλή κατεύθυνση ίσως

αντιπροσωπεύει διαφορετικές επιδράσεις των γενετικών μεταβλητών κατά τη διάρκεια της ζωής

κάποιου. Σε κάθε περίπτωση, εφόσον η σχέση δεν περιορίζεται μονάχα στη μεσολάβηση (Χ1-

>Χ2->Y) αλλά συνυπάρχει και η αντίστροφη σχέση (Χ2->Χ1->Y), δε δύναται να ερμηνεύσουμε

την άμεση αιτιακή επίδραση της κύριας έκθεσης στη μελετώμενη έκβαση τόσο εύκολα. Οι

φαινότυποι του T2DM, FI, CRP δε θα αναλυθούν λοιπόν σε πολυ-παραγοντικό μοντέλο, ενώ οι

φαινότυποι για τα λιπίδια θα χρησιμοπoιηθούν λόγω της δομικής συσχέτισης μεταξύ τους, που

προϋποθέτει πως η μελέτη του ενός θα συμπεριλαμβάνει την προσαρμογή και για τα υπόλοιπα.

3.4.2 Πολυπαραγοντική Μελέτη μενδελιανής τυχαιοποιησης : WHR και δευτερεύοντες

φαινότυποι

Πίνακας 3.16: Πολυπαραγοντική Μενδελιανή τυχαιοποίηση περιληπτικών δεδομένων με κύρια

έκθεση (WHR) και μεσολαβητές για τη μελέτη της αιτιακής επίδρασης στην ολικό καρκίνου του

μαστού (έκβαση), με χρήση της IVW random effects

Εκθεση

(Χ1) Μεσολαβητή

ς (Χ2)

SNP (N)

συνολικ

ά

Coefficien

t β1

(WHR)

St. Error

β1 IVW OR, 95%CI - direct effect

του WHR P-val

WHR Testosterone 290 -0,095 0,037 0.91 (0.846, 0.979) 0,012*

WHR IGF-1 351 -0,096 0,039 0.908 (0.842, 0.981) 0,013*

WHR (LDL, HDL,

TG) 292 -0,056 0,0493 0.945 (0.858, 1.041) 0,254

WHR - 253 -0,111 0,895 (0.829, 0.966) (**Πίνακας 3.5)

0,004*

• ο αστερίσκος υποδηλώνει στατιστικά σημαντικό αποτέλεσμα στο επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας a=5%

* μεταγραφή αποτελέσματος από τον αναφερόμενο Πίνακα

Με τις παραδοχές της γραμμικότητας και της μη αλληλεπίδρασης μεταξύ των λιπιδίων, τα

αποτέλεσμα της πολυ-παραγοντικής ανάλυσης του Πίνακα 3.16 αξίζει να σημειώσουμε τα εξής:

67

α) η αιτιακή επίδραση, όπως εκφράζεται με την άμεση επίδραση του WHR στον κίνδυνο

εμφάνισης του καρκίνου του μαστού οποιασδήποτε κατηγορίας, διατηρεί την προστατευτική της

σχέση και κατά τη διόρθωση για την τεστοστερόνη. Εντούτοις, υπάρχει μετριασμός της αιτιακής

επίδρασης στο μοντέλο τυχαίων επιδράσεων IVW στο πολυ-παραγοντικό μοντέλο σε σχέση με

το μονο-παραγοντικό, με ΟR=0.91, 95%CI = (0.846, 0.976) ενώ OR= 0.895, CI95%= (0.829, 0.966)

αντίστοιχα. Το ποσοστό που φαίνεται να διαμεσολαβείται από την τεστοστερόνη στις γυναίκες

ισούται με 15%. Η άμεση αιτιακή επίδραση που προκύπτει συνοψίζεται στη μείωση κατά 9% του

κινδύνου εμφάνισης καρκίνου του μαστού οποιοδήποτε τύπου για κάθε αύξηση κατά 0.07 του

WHR, κρατώντας σταθερή την τεστοστερόνη, και το αποτέλεσμα είναι στατιστικά σημαντικό.

Για την αξιολόγηση της ισχύος των γενετικών μεταβλητών που χρησιμοποιήθηκαν

χρησιμοποιήσαμε το στατιστικό Cochrans’ Q strength , συμφώνα με το οποίο το μοντέλο μας

διαθέτει αρκετή ισχύς για να εξηγήσει αμφότερες τις εκθέσεις. Παρόλα αυτά, το F-conditional

υποδεικνύει μειωμένη ισχύ γενετικών μεταβλητών για το φαινότυπο της τεστοστερόνης με F<10 ,

μικρότερο από όσο ορίζει ο εμπειρικός κανόνας “του δείκτη”, υποδεικνύοντας μικρής ισχύς των

μεταβλητών μας. Για την αξιολόγηση της εγκυρότητας των βοηθητικών μεταβλητών,

παρουσιάζεται το Cochran’s Q validity με μηδενική υπόθεση της μη ύπαρξης πλειοτροπικών

επιδράσεων των γενετικών μεταβλητών στην έκβαση. εδώ η η μηδενική υπόθεση ανατρέπεται με

το στατιστικό Q αρκετά υψηλό για τη δεδομένη κατανομή, με συμπέρασμα την ύπαρξη

ετερογένειας και την αμφισβήτηση των IV2/IV3 παραδοχών.

β) η προσαρμογή με βάση την igf-1 επίσης οδηγεί σε μετριασμό της προστατευτικής σχέσης του

αυξημένου κεντρικού σωματότυπου. Συγκεκριμένα, με OR: 0.908, CI95% (0.842, 0.981), το WHR

εμφανίζει προστατευτική επίδραση 9.2% για κάθε αύξηση του WHR κατά 0.07, έχοντας

διορθώσει για την igf-1. Σε σχέση με την αρχική εκτίμηση (πίνακας 3.5), η συγκεκριμένη εκτίμηση

είναι μετριασμένη κατά 13%, ποσοστό που φαίνεται να διαμεσολαβείται από την παρουσία της

igf-1 ως mediator. Αναφορικά με την ισχύ των βοηθητικών γενετικών μεταβλητών τόσο το

Cochran’s Q strength , όσο και το F-statistic υποδηλώνουν αρκετή πληροφορία για να

επεξηγηθούν και οι δυο μεταβλητές. Τέλος, φαίνεται επίσης η ύπαρξη ετερογένειας στις

βοηθητικές μεταβλητές, καθώς το Cochran’s Q statistic είναι μεγαλύτερη από την οριακή τιμή της

αντίστοιχης κατανομής. (Πίνακας 3.17)

γ) Τη μεγαλύτερη ωστόσο επίδραση στο αποτέλεσμα φαίνεται και εδώ να έχουν τα λιπίδιάα, με

βαθμό διαμεσολάβησης ίσο με 0.111- (-0.056)/(-0.111)=0.49, δηλαδή 49% της αρχικής τιμής.

Και εδώ μετριάζεται , ωστόσο παραμένει το προστατευτικό αποτέλεσμα της κεντρικής

παχυσαρκίας για τον κίνδυνο εμφάνισης του καρκίνου του μαστού, και εκφράζεται ως 5,5%

προστασία για κάθε 0.07 αύξηση του WHR γενετικά καθορισμένου, έχοντας συμπεριλάβει και

την εκτίμηση των λιπιδίων, σε σχέση με το μονοπαραγοντικό μοντέλο. ΤΟ F-statistic είναι

αρκετό για να εκτιμηθούν και οι δύο μεταβλητές, αλλά και εδώ είναι παρόν ένας

βαθμός ετερογένειας στο μοντέλο.

Πίνακας 3.17: Αξιολόγηση της εγκυρότητας και της ισχύος των μεταβλητών σε πολύ-

παραγοντική Μενδελιανή τυχαιοποίηση περιληπτικών δεδομένων (συνδιακύμανση =0)

Κύρια

έκθεση Μεσολαβητ

ής SN

Ps Coefficie

nt b1

(WHR)

Cochran’s

Q strength Cochran’s

Q-validity

(p-val)

F-conditional statistic

68

WHR Testosterone 29

0 -0,095 17478.11

(WHR) 5844.665 (testosterone)

1034.29 (

5.348329e-

85)

40.06907 (WHR) 5.930675 (testosterone)

WHR IGF-1 35

1 -0,096 16467.31

(WHR)

14795.91

(IGF1)

1287.103

9.170136e-

108

46.91542 (WHR) 42.15359 (IGF-1)

WHR (LDL, HDL,

TG) 29

2 -0,056 11832.89

(WHR)

9893.136

(LDL)

6446.236

(HDL)

5254.914

(TG)

1329.828

(1.181138e-

13)

40.52361 (WHR) 33.8806 (LDL) 22.07615 (HDL) 17.99628 (TG)

3.5 Συσχέτιση με δευτερογενή φαινοτυπικά χαρακτηριστικά

Πραγματοποιήθηκε στην πλατφόρμα Phenoscanner (Kamat,2019, Staley, 2016) αναζήτηση

δευτερογενών χαρακτηριστικών των έκτοπων γενετικών μεταβλητών τις οποίες εντόπισε η

εφαρμογή της μεθόδου MR-PRESSO, στα τμήματα 3.1 και 3.2. Οι γενετικές αυτές

μεταβλητές,όπως παρουσιάζεται στον επόμενο πίνακα, φάινεται να σχετίζονται με πολλούς

φαινοτύπους, πέραν των μελετωμενων. Εξ αυτών, πολλοί συνιστούν παράγοντες κινδύνου για

τον καρκίνο του μαστού (ινσουλίνη νηστείας, σακχαρώδης διαβήτης τύπου 2, λιπίδια ορού,

εισαγάγωντας επομένως οριζόντια πλειοτροπία. Ένα μέρος αυτής διερευνήθηκε με την

εισαγωγή παραγόντων κινδύνου στο πολυπαραγοντικό μοντέλο του 2ου μέρους των

αποτελεσμάτων.

Πίνακας 3.18: Συσχετίσεις (σε p<10-5) των SNPs που εντοπίστηκαν ως πιθανά έκτοπα SNPs στην

MR-Presso που πραγματοποιήθηκε στη μελέτη μενδελιανής τυχαιοποίσης δύο δειγμάτων του ΒΜΙ

και του κινδύνου ανάπτυξης καρκίνου του μαστού.

SNP Χρωμοσωμική

Θέση (Hg 19)

Γονίδιο Δευτερογενή φαινοτυπικά χαρακτηριστικά

rs1002473 chr5:56274077

AC114

973.1

Comparative height size at age 10, Height, Impedance

of leg left, Impedance of leg right, Impedance of whole

body

rs11672660 chr19:46180184

GIPR Body mass index, Body mass index in physically active

males/indivdiuals, Body mass index in females greater than

50 years of age, Body mass index in females, Body mass index

in males, Body mass index in non-smokers, Body mass index

adjusted for physical activity in females, Body mass index

adjusted for physical activity, Body mass index adjusted for

smoking in males, Body mass index adjusted for smoking,

Hip circumference in females, Hip circumference, Obesity

69

class 1,2, Waist circumference in females/ males, Waist

circumference, Waist hip ratio in males, Waist hip ratio,

Weight, Low density lipoprotein, Total cholesterol, 2 hour

glucose, 2 hour glucose tolerance test, Fasting blood glucose,

2 hour fasting glucose, Body mass index in physically active

individuals, Body mass index in physically active

individuals, Body mass index joint analysis main effects and

physical activity interaction, Body mass index joint analysis

main effects and physical activity interaction, Arm fat mass

left, Arm fat mass right, Arm fat percentage left, Arm fat

percentage right, Arm fat-free mass left/right, Arm

predicted mass left/ right, Basal metabolic rate, Body fat

percentage, Body mass index, Comparative body size at age

10, Creatinine in urine, Hip circumference, Impedance of

arm left/ right, Impedance of leg left/ Impedance of leg right,

Impedance of whole body, Leg fat mass left/ right, Leg fat

percentage left/ right, Leg fat-free mass left/right, Leg

predicted mass left/right, Sodium in urine, Trunk fat mass,

Trunk fat percentage, Trunk fat-free mass, Trunk predicted

mass, Waist circumference, Weight, Whole body fat mass,

Whole body fat-free mass, Whole body water mass, Total

cholesterol ,Coronary artery disease

rs10445337 chr17:44067400

AC1149

73.1

Eosinophil count, Eosinophil percentage of granulocytes,

Eosinophil percentage of white cells, Granulocyte count,

Hematocrit, Hemoglobin concentration, High light scatter

percentage of red cells, High light scatter reticulocyte count,

Lymphocyte percentage of white cells, Mean corpuscular

hemoglobin ,Mean corpuscular volume, Mean platelet

volume, Monocyte count, Myeloid white cell count,

Neutrophil count, Neutrophil percentage of granulocytes,

Neutrophil percentage of white cells, Red blood cell count,

Red cell distribution width, Reticulocyte count,

Reticulocyte fraction of red cells, Sum basophil neutrophil

counts, Sum eosinophil basophil counts, Sum neutrophil

eosinophil counts, Lumber spine bone mineral density,

Lumbar spine bone mineral density, Height, , Waist hip ratio

in females, Intracranial volume, Parkinson’s disease, Red

blood cell count RBC, Alcohol intake frequency, Average

weekly champagne plus white wine intake, Comparative

height size at age 10, Daytime dozing or sleeping, Drive

faster than motorway speed limit, Ever unenthusiastic or

disinterested for a whole week ,Fed-up feelings ,Forced

expiratory volume in 1-second, Forced expiratory volume in

1-second, best measure ,Forced expiratory volume in 1-

second, predicted percentage ,Forced vital capacity ,best

measure, Frequency of tenseness or restlessness in last 2

weeks, Getting up in morning, Guilty feelings, Hair or

balding pattern: pattern 2,3,4, Hand grip strength left, Hand

grip strength right ,Hearing difficulty or problems with

background noise ,Heel bone mineral density ,Illnesses of

mother: parkinsons disease ,Impedance of arm left/right

,Impedance of leg left/ right, Impedance of whole body,

70

Irritability, Left-handedness, Medication for pain relief,

constipation, heartburn: ibuprofen, none of the above,

paracetamol, Miserableness, Mood swings, Mouth or teeth

dental problems: mouth ulcers, Nap during day, Nervous

feelings, Neuroticism score, Number of live births ,Pain type

experienced in last month: headache, Peak expiratory flow,

Qualifications: A levels or as levels or equivalent,

Qualifications: college or university degree ,Relative age of

first facial hair, Relative age voice broke ,Self-reported

helicobacter pylori ,Sensitivity or hurt feelings, Sitting

height ,Snoring, Systolic blood pressure ,Treatment with

blood pressure medication, Treatment with paracetamol,

Trunk fat percentage, Types of physical activity in last 4

weeks: other exercises, Types of transport used, excluding

work: cycle, Worrier or anxious feelings ,Worry too long

after embarrassment ,High grade serous ovarian cancer,

Invasive ovarian cancer ,Serous invasive ovarian cancer

,Years of educational attainment, Neuroticism, IgG

digalactosylation ,IgG galactosylation IgG N-glycosylation

rs12462975

chr19:30272202

CCNE1 Body mass index in males greater than 50 years of age, Arm

fat mass left/ ight, Arm fat percentage left/ right, Arm fat-

free mass left/ right, Arm predicted mass left/ right, Basal

metabolic rate, Body fat percentage, Body mass index,

Creatinine in urine, Diastolic blood pressure, Height, Hip

circumference, Impedance of leg left, Impedance of leg

right, Impedance of whole body, Leg fat mass left/ right, Leg

fat percentage left, Leg fat percentage right, Leg fat-free

mass left/right, Leg predicted mass left/right, Sitting height,

Treatment with bendroflumethiazide, Trunk fat mass,

Trunk fat percentage ,Trunk fat-free mass, Trunk predicted

mass, Usual walking pace, Waist circumference, Weight,

Whole body fat mass, Whole body fat-free mass, Whole

body water mass

rs12462975 chr19:30272202

CCNE1 Body mass index in males greater than 50 years of age, Arm

fat mass left/ right, Arm fat percentage left/ right, Arm fat-

free mass left/ right, Arm predicted mass left/ right, Basal

metabolic rate, Body fat percentage, Body mass index,

Creatinine in urine, Diastolic blood pressure, Height, Hip

circumference, Impedance of leg left/ right, Impedance of

whole body, Leg fat mass left, Leg fat mass right/left, Leg fat

percentage right/ left, Leg fat-free mass right/left, Leg

predicted mass right, Sitting height, Treatment with

bendroflumethiazide, Trunk fat mass, Trunk fat percentage,

Trunk fat-free mass, Trunk predicted mass, Usual walking

pace, Waist circumference, Weight, Whole body fat mass,

Whole body fat-free mass, Whole body water mass

rs1558902 chr16:53803574

FTO Body mass index females, Body mass index males, Body mass

index, Type II diabetes, Childhood BMI, Childhood obesity,

Body mass index in physically active females/males/ active

indivdiuals, Body mass index in physically active

indivdiuals, Body mass index in females greater than 50

71

years of age, Body mass index in females less than or equal

to 50 years of age, Body mass index in females, Body mass

index in physically inactive females/males, , Body mass

index in physically inactive indivdiuals, Body mass index in

males greater than 50 years of age, Body mass index in males

less than or equal to 50 years of age, Body mass index in

males, female non-smokers, non-smokers, female smokers,

male smokers, smokers Body mass index in smokers, Body

mass index tails, Body mass index ajusted for physical

activity in females, Body mass index adjsuted for physical

activity in males, Body mass index adjusted for physical

activity, Body mass index adjusted for smoking in

females/males, Body mass index adjusted for smoking, Body

mass index, Hip circumference in females/ males, Hip

circumference, Obesity class 1,2,3, Overweight, Waist

circumference in females/males, Waist circumference,

Waist hip ratio in females/ males, Waist hip ratio , Weight

in females/ males, Weight, High density lipoprotein,

Triglycerides, Adult obesity body mass index, BMI in

adolescence/young adulthood, BMI tails upper and lower

5th percentiles, Body mass index, , Body mass index, Body

mass index 25-30-35-40 kgm2, Body mass index adults, C

reactive protein, Extreme obesity body mass index, Extreme

obesity with early age of onset, HDL cholesterol,

Nonsyndromic striae distensae stretch marks, Obesity body

mass index 30 kgm2, Obesity in children and adolescents

with early age of onset, Obesity with early age of onset age

2, Overweight body mass index 25 kgm2, Percent body fat,

Subcutaneous adipose tissue, Type 2 diabetes, Waist

circumference, Weight ,log Leptin, Body fat percentage,

HbA1c, BMI adjusted for smoking behaviour, BMI in non

smokers/smokers, Body fat percentage, Body mass index age

interaction, Body mass index joint analysis main effects and

smoking interaction, C reactive protein levels or HDL

cholesterol levels pleiotropy, Childhood body mass index,

Glycated hemoglobin levels, Height adjusted BMI,

Menarche age at onset, Obesity early onset extreme, Waist

circumference, Age at menarche, Alcohol intake frequency,

Arm fat mass left, Arm fat mass right/left, Arm fat

percentage right/ s left/ right, Arm predicted mass left/ right,

Average weekly beer plus cider intake, Average weekly red

wine intake, Average weekly spirits intake, Basal metabolic

rate, Body fat percentage, Body mass index, Comparative

body size at age 10

Comparative height size at age 10

Creatinine in urine

Diabetes diagnosed by doctor

Getting up in morning

Heel bone mineral density

Heel bone mineral density left

Heel bone mineral density right

Hip circumference

72

Illnesses of father: diabetes

Illnesses of mother: diabetes

Illnesses of siblings: diabetes

Illnesses of siblings: high blood pressure

Illnesses of siblings: none of the above, group 1

Impedance of arm left

Impedance of arm right

Impedance of leg left

Impedance of leg right

Impedance of whole body

Leg fat mass left

Leg fat mass right

Leg fat percentage left

Leg fat percentage right

Leg fat-free mass left

Leg fat-free mass right

Leg predicted mass left

Leg predicted mass right

Medication for cholesterol, blood pressure or diabetes: blood

pressure medication

Medication for cholesterol, blood pressure or diabetes:

cholesterol lowering medication

Medication for cholesterol, blood pressure or diabetes: none

of the above

Mononeuropathies of upper limb

Morning or evening person

Number of self-reported non-cancer illnesses

Number of treatments or medications taken

Overall health rating

Relative age of first facial hair

Relative age voice broke

Self-reported breast cancer

Self-reported diabetes

Self-reported hypertension

Self-reported type 2 diabetes

Sleep duration

Snoring

Sodium in urine

Treatment with bendroflumethiazide

Treatment with blood pressure medication

Treatment with gliclazide

Treatment with metformin

Treatment with simvastatin

Trunk fat mass

Trunk fat percentage

Trunk fat-free mass

Trunk predicted mass

Usual walking pace

Vascular or heart problems diagnosed by doctor: high blood

pressure

Vascular or heart problems diagnosed by doctor: none of the

above

73

Waist circumference

Weight

Whole body fat mass

Whole body fat-free mass

Whole body water mass

Age at menarche

Body mass index

Obesity

Obesity

Waist circumference

rs17751061

chr19:19413092

SUGP1 Basophil count, Basophil percentage of granulocytes,

Basophil percentage of white cells, Platelet count,

Plateletcrit, Sum eosinophil basophil counts, Height,

Body mass index, Comparative body size at age 10,

Forced expiratory volume in 1-second, predicted,

Hearing difficulty or problems, Height, Impedance of

arm left/ right, Impedance of leg left/ right, Impedance

of whole body, Leg fat percentage left, Sitting height,

Waist circumference

rs2267812 chr7:74138121

GTF2I Red cell distribution width, Age at menarche, Age

completed full time education, Alcohol intake

frequency, Arm fat mass left, Arm fat mass right, Arm

fat percentage left, Arm fat percentage right, Body fat

percentage, Body mass index, Hip circumference,

Impedance of leg right, Impedance of whole body, Leg

fat mass left/right, Leg fat percentage left/right, Mouth

or teeth dental problems: none of the above, Number

of self-reported non-cancer illnesses, Self-reported

hypertension, Vascular or heart problems diagnosed by

doctor: high blood pressure, Vascular or heart

problems diagnosed by doctor: none of the above,

Waist circumference, Whole body fat mass, Age at

menarche

rs4148155 chr4:89054667

ABCG2 Gout, Serum urate, Urate, Uric acid, Urate levels, Basal

metabolic rate, Body mass index, Impedance of leg left/

right, Impedance of whole body, Leg fat-free mass

left/right, Leg predicted mass left/right, Self-reported

gout, Treatment with allopurinol, Treatment with

colchicine, Weight, Whole body fat-free mass, Whole

body water mass

rs625652 chr11:65641931

EFEMP

2

Eosinophil count, Eosinophil percentage of

granulocytes, Eosinophil percentage of white cells

,Neutrophil percentage of granulocytes, Sum

eosinophil basophil counts, Arm fat mass left/right,

Arm fat percentage left/right,, Arm predicted mass

right, Basal metabolic rate, Body mass index,

Comparative body size at age 10, Forced vital capacity,

best measure, Height, Hip circumference, Impedance

74

of arm left/right Impedance of leg left/ right,

Impedance of whole body, Leg fat mass left/right, Leg

fat percentage left, Leg fat-free mass left/right, Leg

predicted mass left/light, Overall health rating, Self-

reported psoriasis, Time spent watching television,

Weight, Whole body fat mass

rs6585198 chr10:114762237 TCF7L2 Body mass index males, Body mass index, Type II

diabetes, Type II diabetes adjusted for BMI, Body mass

index, Hip circumference, , Obesity class 3, HbA1c, log

Proinsulin, Arm fat mass left/right, Arm fat percentage

left/ right, Body fat percentage, Body mass index,

Diabetes diagnosed by doctor, Eye problems or

disorders: diabetes related eye disease, Hip

circumference, Illnesses of father/mother/siblings:

diabetes, , Impedance of arm left, Leg fat mass left/

right, Leg fat percentage left/ right, Medication for

cholesterol, blood pressure or diabetes: insulin, Self-

reported diabetes, Self-reported type 2 diabetes,

Started insulin within one year, diagnosis of diabetes,

Treatment with cholesterol lowering medication,

Treatment with gliclazide, Treatment with insulin

product, Treatment with metformin, Treatment with

pioglitazone, Trunk fat mass, Weight, Whole body fat

mass

rs7084454 chr10:21821274

MLLT10 Granulocyte percentage of myeloid white cells,

Monocyte count, Monocyte percentage of white cells,

Arm fat mass left/right, Arm fat percentage left/right

,Arm fat-free mass left/ right, Arm predicted mass

left/ight, Basal metabolic rate, Bilateral oophorectomy,

Body fat percentage, Body mass index, Creatinine in

urine, Diastolic blood pressure, Ever had

hysterectomy, Forced vital capacity, Forced vital

capacity, best measure, Hip circumference, Impedance

of arm left/right

Leg fat mass left/right, Leg fat percentage left/ right,

Leg fat-free mass left, Leg predicted mass left,

Medication for pain relief, constipation, heartburn:

paracetamol, Number of operations, Number of

treatments or medications taken, Sodium in urine,

Time spent watching television, Treatment with

paracetamol, Trunk fat mass, Trunk fat percentage,

Types of physical activity in last 4 weeks: none of the

above, Types of physical activity in last 4 weeks:

walking for pleasure, Usual walking pace, Vascular or

heart problems diagnosed by doctor: none of the

above, Waist circumference, Weight, Whole body fat

75

mass, High grade serous ovarian cancer, Invasive

ovarian cancer, Serous invasive ovarian cancer

Πίνακας 3.19: Συσχετίσεις (σε p<10-5) των SNPs που εντοπίστηκαν ως πιθανά έκτοπα SNPs στην

MR-Presso που πραγματοποιήθηκε στη μελέτη μενδελιανής τυχαιοποίσης δύο δειγμάτων του

WHR και του κινδύνου ανάπτυξης καρκίνου του μαστού.

SNP Χρωμοσωμ.

Θέση (hg 19)

Γονίδ

ιο

Δευτερογενή φαινοτυπικά χαρακτηριστικά

rs1002473 chr5:56274077

AC11

4973.

1

Comparative height size at age 10, Height, Impedance of

leg left, Impedance of leg right, Impedance of whole body

rs1569135 chr2:188115398

AC00

7319.

1

Hip circumference adjusted for BMI, Waist circumference,

Waist hip ratio in physically active indivdiuals, Waist hip

ratio in physically active indivdiuals, Waist hip ratio in

females, Waist hip ratio in males, Waist hip ratio adjusted

for physical activity in females, Waist hip ratio adjusted for

physical activity in males, Waist hip ratio adjusted for

physical activity, Waist hip ratio adjusted for physical

activity, Waist hip ratio adjusted for smoking, Waist hip

ratio adjusted for smoking

Waist hip ratio, Waist hip ratio adjusted for BMI in females

greater than 50 years of age, Waist hip ratio adjusted for

BMI, Waist to hip ratio adjusted for BMI adjusted for

smoking behaviour, Waist to hip ratio adjusted for body

mass index, Comparative body size at age 10, Forced vital

capacity, Leg fat percentage left, Leg fat percentage right,

Pulse rate, Sitting height, Waist circumference

rs974801 chr4:106071064 TET2 Lymphocyte count, Lymphocyte percentage of white cells,

Neutrophil percentage of white cells, Height, High density

lipoprotein, Fasting insulin, Inflammatory bowel disease,

log Fasting insulin

log Fasting insulin adjusted for BMI, Alcohol intake

frequency, Arm fat-free mass left, Arm fat-free mass right,

Arm predicted mass left, Arm predicted mass right, Basal

metabolic rate, Birth weight of first child, Comparative

height size at age 10, Forced expiratory volume in 1-

second, Forced expiratory volume in 1-second, best

measure, Forced expiratory volume in 1-second, predicted,

Forced vital capacity, Forced vital capacity, best measure,

Height, Leg fat-free mass left, Leg fat-free mass right, Leg

predicted mass left, Leg predicted mass right, Peak

expiratory flow, Sitting height, Trunk fat-free mass, Trunk

predicted mass, Weight, Whole body fat-free mass, Whole

body water mass

76

rs7395513 chr11:69262756 AP0

0043

9.2

Malignant neoplasm of kidney, except renal pelvis

rs10445337 chr17:44067400

MAP

T

Eosinophil count, Eosinophil percentage of granulocytes,

Eosinophil percentage of white cells, Granulocyte count,

Hematocrit, Hemoglobin concentration, High light scatter

percentage of red cells, High light scatter reticulocyte count,

Lymphocyte percentage of white cells, Mean corpuscular

hemoglobin, Mean corpuscular volume, Mean platelet volume,

Monocyte count, Myeloid white cell count, Neutrophil count,

Neutrophil percentage of granulocytes, Neutrophil percentage

of white cells, Red blood cell count, Red cell distribution width,

Reticulocyte count, Reticulocyte fraction of red cells, Sum

basophil neutrophil counts, Sum eosinophil basophil counts,

Sum neutrophil eosinophil counts, Lumbar spine bone mineral

density, Height, Waist hip ratio in females, Intracranial volume,

Parkinson’s disease, Red blood cell count RBC, Alcohol intake

frequency, Average weekly champagne plus white wine intake,

Comparative height size at age 10, Daytime dozing or sleeping,

Drive faster than motorway speed limit, Ever unenthusiastic or

disinterested for a whole week, Fed-up feelings, Forced

expiratory volume in 1-second, Forced expiratory volume in 1-

second, best measure, Forced expiratory volume in 1-second,

predicted percentage, Forced vital capacity, Forced vital

capacity, best measure, requency of tenseness or restlessness in

last 2 weeks, Getting up in morning, Guilty feelings, Hair or

balding pattern: pattern 2, 3, 4, Hand grip strength left/ right,

Hearing difficulty or problems with background noise, Heel

bone mineral density, Height, Illnesses of mother: parkinsons

disease, Impedance of arm left/right, Impedance of leg left/right,

Impedance of whole body, Irritability, Left-handedness,

Medication for pain relief, constipation, heartburn: ibuprofen,

none of the above, paracetamole, Miserableness, Mood swings,

Mouth or teeth dental problems: mouth ulcers, Nap during day,

Nervous feelings, Neuroticism score, Number of live births, Pain

type experienced in last month: headache, Peak expiratory flow,

Qualifications: A levels or as levels or equivalent, Qualifications:

college or university degree, Relative age of first facial hair,

Relative age voice broke, Self-reported helicobacter pylori,

Sensitivity or hurt feelings, Sitting height, Snoring, Systolic

blood pressure, Treatment with blood pressure medication,

Treatment with paracetamol, Trunk fat percentage, Types of

physical activity in last 4 weeks: other exercises, Types of

transport used, excluding work: cycle, Worrier or anxious

feelings, Worry too long after embarrassment, High grade serous

ovarian cancer, Invasive ovarian cancer, Serous invasive ovarian

cancer, Years of educational attainment, Neuroticism, IgG

digalactosylation, IgG galactosylation, IgG N-glycosylation

rs1076178

5

chr10:65318766

REEP3

Basophil percentage of granulocytes, Basophil percentage

of white cells, Granulocyte count, Granulocyte percentage

of myeloid white cells, Mean platelet volume, Monocyte

77

percentage of white cells, Myeloid white cell count,

Neutrophil count, Neutrophil percentage of white cells,

Platelet count, Platelet distribution width, Red blood cell

count, Sum basophil neutrophil counts, Sum neutrophil

eosinophil counts, White blood cell count, Adrenic acid

22:4n6, Linoleic acid 18:2n6

Body mass index in females, Height, Hip circumference

adjusted for BMI, Waist hip ratio, High density

lipoprotein, Triglycerides, Platelet count, Serum

testosterone T level, log Fasting insulin, Body mass index,

Plasma omega 6 polyunsaturated fatty acid levels adrenic

acid, Age at menarche, Age completed full time education,

Alcohol usually taken with meals, Average weekly beer

plus cider intake, Average weekly red wine intake, Body

mass index, Diastolic blood pressure, Height, Impedance

of arm left/right, , Impedance of whole body, Leg fat mass

right

Leg fat percentage left/ right, Mineral and other dietary

supplements: zinc, Qualifications: A levels or as levels or

equivalent, Qualifications: college or university degree,

Qualifications: none, Relative age of first facial hair, Self-

reported cholelithiasis or gall stones, Sodium in urine,

Usual walking pace

rs1084034

9

chr11:10076430

SBF2

Arm fat percentage left/right, Arm fat-free mass right/left,

Arm predicted mass left/right, , Basal metabolic rate, Body

fat percentage, Height, Impedance of arm left /right,

Impedance of leg left,/right, Impedance of whole body,

Leg fat percentage left, Leg fat percentage right ,Leg fat-

free mass left, Leg fat-free mass right, Leg predicted mass

left ,Leg predicted mass right ,Trunk fat percentage, Trunk

fat-free mass ,Trunk predicted mass, Whole body fat-free

mass, Whole body water mass

rs1325636

7

chr8:128334900 CASC8

Malignant neoplasm of prostate, Self-reported breast

cancer, Self-reported prostate cancer

rs1328341

6

chr9:119301607

ASTN2

Height, Arm fat-free mass left/right, Arm predicted mass

left, Arm predicted mass right ,Basal metabolic rate, Hand

grip strength right/left, Height, Hip circumference, Leg

fat-free mass left/right, Leg predicted mass left/ right, Peak

expiratory flow, Sitting height, Trunk fat-free mass, Trunk

predicted mass, Whole body fat-free mass, Whole body

water mass

rs1558902 chr16:53803574

FTO Body mass index females/males, Body mass index, Type II

diabetes, Childhood BMI, Childhood, obesity, Body mass

index in physically active females/males, n physically

active indivdiuals, n females greater than 50 years of age,

in females less than or equal to 50 years of age, males

greater than 50 years of age, in males less than or equal to

78

50 years of age, in physically inactive

females/males/individuals, Body mass index in males,n

female non-smokers, in male non-smokers, in non-

smokers, n female smokers, in male smokers, in smokers,

tails, adjusted for physical activity in females, adjusted for

physical activity in males, adjusted for physical activity,

for smoking in females, for smoking in males, for smoking,

Hip circumference in females/ males, Obesity class 1, 2, 3,

Overweight, Waist circumference in females/males, Waist

hip ratio

Weight in females/ males, Weight, High density

lipoprotein, Triglycerides, Adult obesity body mass index,

BMI in adolescenceyoung adulthood, BMI tails upper and

lower 5th percentiles, Body mass index 25, 30, 35, 40

kgm2, Body mass index adults, C reactive protein,,

Extreme obesity body mass index, Extreme obesity with

early age of onset, HDL cholesterol, Nonsyndromic striae

distensae stretch marks, Obesity body mass index, Obesity

body mass index 30 kgm2, Obesity in children and

adolescents with early age of onset, Obesity with early age

of onset age 2, Overweight body mass index 25 kgm2,

Percent body fat, Subcutaneous adipose tissue, Weight, log

Leptin, Body fat percentage, HbA1c, BMI adjusted for

smoking behaviour, BMI in non smokers, BMI in smokers,

Body fat percentage,Body mass index age interaction, Body

mass index joint analysis main effects and smoking

interaction, Body mass index joint analysis main effects

and smoking interaction, Body mass index joint analysis

main effects and smoking interaction, C reactive protein

levels or HDL cholesterol levels pleiotropy, Childhood

body mass index, Glycated hemoglobin levels, Height

adjusted BMI, Menarche age at onset, Obesity, Obesity

early onset extreme, Age at menarche, Alcohol intake

frequency, Arm fat mass left/right,, Arm fat percentage

left/right, Arm fat percentage right, Arm fat-free mass

left/right, Arm predicted mass left, Arm predicted mass

right, Average weekly beer plus cider intakeAverage

weekly red wine intakeAverage weekly spirits intakeBasal

metabolic rateBody fat percentage, Comparative body size

at age 10, Comparative height size at age 10,Creatinine in

urine,Diabetes diagnosed by doctor, Getting up in

morning, Heel bone mineral density, Heel bone mineral

density left/right, Illnesses of father: diabetes, llnesses of

mother: diabetes

Illnesses of siblings: diabetes

Illnesses of siblings: high blood pressure

Illnesses of siblings: none of the above, group 1

Impedance of arm left

79

Impedance of arm right

Impedance of leg left

Impedance of leg right

Impedance of whole body

Leg fat mass left

Leg fat mass right

Leg fat percentage left

Leg fat percentage right

Leg fat-free mass left

Leg fat-free mass right

Leg predicted mass left

Leg predicted mass right

Medication for cholesterol, blood pressure or diabetes:

blood pressure medication

Medication for cholesterol, blood pressure or diabetes:

cholesterol lowering medication

Medication for cholesterol, blood pressure or diabetes:

none of the above

Mononeuropathies of upper limb

Morning or evening person

Number of self-reported non-cancer illnesses

Number of treatments or medications taken

Overall health rating

Relative age of first facial hair

Relative age voice broke

Self-reported breast cancer

Self-reported diabetes

Self-reported hypertension

Self-reported type 2 diabetes

Sleep duration

Snoring

Sodium in urine

Treatment with bendroflumethiazide

Treatment with blood pressure medication

Treatment with gliclazide

Treatment with metformin

Treatment with simvastatin

Trunk fat mass

Trunk fat percentage

Trunk fat-free mass

Trunk predicted mass

Usual walking pace

Vascular or heart problems diagnosed by doctor: high

blood pressure

Vascular or heart problems diagnosed by doctor: none of

the above

Waist circumference

Weight

80

Whole body fat mass

Whole body fat-free mass

Whole body water mass

Age at menarche

Body mass index

Obesity

Obesity

Waist circumference

rs1758462

6

chr6:20560435

CDKAL1

Hair or balding pattern: pattern 4, Illnesses of mother:

diabetes, Illnesses of father: diabetes

rs2844563

9

chr2:25182488

DNAJC27

High light scatter percentage of red cells, High light scatter

reticulocyte count, Immature fraction of reticulocytes,

Lymphocyte count, Reticulocyte count, Reticulocyte

fraction of red cells, Arm fat mass left, Arm fat mass right,

Arm fat percentage left, Arm fat percentage right, Body fat

percentage, Body mass index, Comparative body size at age

10, Hand grip strength right, Height, Hip circumference,

Impedance of leg left, Impedance of leg right, Leg fat mass

left, Leg fat mass right, Leg fat percentage left, Leg fat

percentage right, Sitting height, Trunk fat mass, Trunk fat

percentage, Waist circumference, Weight, Whole body fat

mass

rs6090040 chr20:62692060

TCE

A2

Mean corpuscular volume, Impedance of whole body,

Medication for cholesterol, blood pressure or diabetes:

cholesterol lowering medication, Medication for

cholesterol, blood pressure or diabetes: none of the above,

Number of self-reported non-cancer illnesses, Self-

reported high cholesterol, Self-reported hypertension,

Systolic blood pressure, Treatment with cholesterol

lowering medication, Treatment with simvastatin

Vascular or heart problems diagnosed by doctor: high

blood pressure, Vascular or heart problems diagnosed by

doctor: none of the above

rs747472 chr5:173353514 CPEB

4

Body mass index females, Body mass index,High light

scatter percentage of red cells, High light scatter

reticulocyte count, Immature fraction of reticulocytes,

Mean corpuscular hemoglobin, Mean corpuscular volume,

Red cell distribution width, Reticulocyte count,

Reticulocyte fraction of red cells, Waist circumference

adjusted for BMI,, Waist hip ratio adjusted for physical

activity, Waist hip ratio adjusted for physical activity,

Waist circumference adjusted for smoking in females,

Waist hip ratio adjusted for smoking, Waist hip ratio,

Waist hip ratio adjusted for BMI, Waist circumference

adjusted for physical activity, Waist circumference

adjusted for physical activity, Triglycerides, Basal

81

metabolic rate, Diastolic blood pressure, Hip

circumference, Leg fat-free mass left, Leg fat-free mass

right, Leg predicted mass left, Leg predicted mass right,

Systolic blood pressure, Whole body fat-free mass, Whole

body water mass

rs8033381 chr15:75080685 CSK Granulocyte percentage of myeloid white cells,

Hematocrit, Hemoglobin concentration, Monocyte count,

Monocyte percentage of white cells, Red blood cell count,

Diastolic blood pressure, Systolic blood pressure, Diastolic

blood pressure, Systolic blood pressure, Creatinine in

urine, Diastolic blood pressure, Hearing difficulty or

problems with background noise, Medication for

cholesterol, blood pressure or diabetes: blood pressure

medication, Medication for cholesterol, blood pressure or

diabetes: none of the above, Self-reported hypertension,

Systolic blood pressure, Treatment with

bendroflumethiazide, Treatment with blood pressure

medication, Treatment with ramipril, Vascular or heart

problems diagnosed by doctor: high blood pressure,

Vascular or heart problems diagnosed by doctor: none of

the above, Coronary artery disease

Κεφάλαιο 4ο: Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη, εκμεταλλευτήκαμε για τη στατιστική ανάλυση μια σχετικά παλιά μέθοδο

με πρωτότυπη εφαρμογή τις τελευταίες δύο δεκαετίες, τη Μενδελιανή τυχαιοποίηση. Με τη

μέθοδο αυτή μας επιτρέπεται η απόδειξη όχι μονάχα της συσχέτισης αλλά και της αιτιακής

επίδρασης (όπως και το μέγεθος αυτής) των μελετούμενων φαινοτύπων (έκθεση-έκβαση), καθώς

προσομοιάζει της πειραματικής προσέγγισης των κλινικών δοκιμών, σε ένα πείραμα το οποίο έχει

82

καθοριστεί αν αγνοία του υποκειμένου και λαμβάνει χώρα από τη σύλληψη του και έπειτα. Με

τον τρόπο αυτό μελετώνται τροποποιήσιμοι παράγοντες υγείας για τα μακροπρόθεσμα

αποτελέσματα τους στο υποκείμενο κατά τη διάρκεια της ζωής του. Στη μελέτη μας

πραγματοποιήσαμε μονο-παραγοντική και πολυ-παραγοντική Μενδελιανή τυχαιοποίηση ώστε

να προσδιορίσουμε το αιτιακό, ανεξάρτητο αποτέλεσμα των φαινοτύπων που μας ενδιέφεραν,

τόσο κατά μόνας και έχοντας προσαρμόσει για δευτεροπαθείς φαινοτυπικές εκθέσεις. Η

μελετώμενη έκβαση εδώ ήταν ο κίνδυνος εμφάνισης καρκίνου του μαστού στις γυναίκες

Ευρωπαϊκής καταγωγής, ολικός αλλά και διαστρωματοποιημένος βάση μοριακού υποτύπου με

δεδομένα ασθενών μαρτύρων τα οποία προήλθαν από το συνασπισμό ερευνών της BCAC. Οι

πρωτεύοντες φαινότυποι κινδύνου που διερευνήθηκαν αφορούσαν την παχυσαρκία,

εκφραζόμενη είτε ως γενική παχυσαρκίας (ΒΜΙ), είτε ως περιοχική παχυσαρκία (WHR). Ως

δευτεροπαθείς φαινότυποι εξετάσθηκαν για τη σχέση μεσολάβησής του στην παχυσαρκία και

των δύο τύπων η CRP, η τεστοστερόνη, ο σακχαρώδης διαβήτης 2, η igf-1, η ινσουλίνη νηστείας

και τα λιπίδια (LDL, HDL, TG).

Στο 1ο μέρος της μελέτης διερευνήσαμε τη συσχέτιση μεταξύ των φαινοτύπων της παχυσαρκίας

και του κινδύνου εμφάνισης του καρκίνου του μαστού, τόσο του συνολικού όσο και των

μοριακών υποτύπων. Αποδείξαμε την προστατευτική επίδραση του αυξημένου BMI στον

κίνδυνο εμφάνισης του καρκίνου μαστού οποιοδήποτε υποτύπου (ολικός κίνδυνος) σε

στατιστικά σημαντικό βαθμό, τόσο στην IVW τυχαίων επιδράσεων όσο και στην εκτίμηση της

μεθόδου MR-PRESSO μετά την αφαίρεση πιθανών έκτοπων SNPs. Οι αναλύσεις ευαισθησίας, αν

και μικρότερης ισχύος ήταν συμβατές με αυτή την αιτιακή επίδραση σε στατιστικά σημαντικό

βαθμό. Ταυτόχρονα, αποδείξαμε την προστατευτική επίδραση του BMI στον κίνδυνο εμφάνισης

των υποτύπων “Luminal A”, “Luminal B/ HER2 negative” και “Triple Negative” σε στατιστικά

σημαντικό βαθμό στην μέθοδο αναφοράς μας (IVW random effects). Οι αναλύσεις ευαισθησίας

είχαν την ίδια κατεύθυνση παρότι στον “Luminal A” δεν ήταν όλες στατιστικά σημαντικές, ενώ

αντίθετα στη “Luminal B/HER2 negative” και στον “Triple negative” ήταν. H IVW τυχαίων

επιδράσεων της MR PRESSO διατήρησε τη στατιστική σημασίας της και την κατεύθυνση της

αιτιακής επίδρασης μετά την αφαίρεση των έκτοπων SNPs για τις “Luminal B/HER2 Negative”

νεοπλασίες, αλλά την έχασε για τις “Luminal A”. Για τον υπότυπο “HER2 enriched” δεν

αποδείξαμε στατιστικά σημαντική συσχέτιση. Εντούτοις, σε όλους τους υποτύπους

επισημαίνεται πως η κατεύθυνση της επίδρασης ήταν προστατευτική.

4.1 Σύγκριση με άλλες μελέτες

Τα ευρήματα αυτά κάθε άλλο παρά πρωτοφανή είναι. Συμβατό με προηγηθείσες μελέτες

μενδελιανής τυχαιοποίησης πάνω στο ίδιο ερώτημα, η αντίστροφη αυτή αιτιακή σχέση έχει

εντοπιστεί στο πρόσφατο παρελθόν, όπως στις έρευνες των Ahmed et al, 2021, όπου ανευρέθηκε

προστατευτική επίδραση με OR ΙVW: 0.69 ( CI 95%= 0.58 - 0.81) για τις παχύσαρκες

μετεμμηνοπαυσιακές και τον κίνδυνο εμφάνισης του καρκίνου του μαστού σε δείγμα της UKBB ,

εύρημα που παρέμεινε στατιστικά σημαντικό και στις αναλύσεις ευαισθησίας (Weighted Median,

Weighted mode, MR-Egger, MR-PRESSO). Πιο μετριασμένο αλλά επίσης προστατευτικό για τον

κίνδυνο του καρκίνου του μαστού ήταν και το εύρημα των Vithayathil et al, 2021 σε μια μελέτη

που διερευνήθηκε η επίδραση της παχυσαρκίας σε 22, διαφορετικής εντόπισης, καρκίνους,

συμπεριλαμβανομένου του μαστού, με προστατευτική σχέση να προκύπτει για τον ολικό όσο και

για τους θετικούς/αρνητικούς ER προσδιορισμένους καρκίνους. Παρόμοια επίδραση φάνηκε να

έχει η παχυσαρκία στον καρκίνο του μαστού (τόσο στους ER+/ER- καρκίνους) στην έρευνα

Μενδελιανής τυχαιοποίησης των Freuer et al, 2021 σχετικά με την παχυσαρκία (με

83

χρησιμοποιήση διάφορων μεθόδων προσδιορισμού της, μεταξύ των οποίων και του BMI) και την

επίδραση της σε καρκίνους των γυναικών (ωοθηκών, μήτρας, μαστού). Την ίδια προστατευτική

επίδραση στον καρκίνο του μαστού (όσο και στις στρωματοποιημένες για τους υποδοχείς

οιστρογόνων αναλύσεις) εντόπισαν οι Shu et al, 2019 σε έρευνα για τη συσχέτιση της

παχυσαρκίας, παραγόντων ανοχής στην ινσουλίνη και του εν λόγω καρκίνου με OR για το BMI

(OR = 0.70 για 5-μονάδες αύξηση, 95% CI=0.65-0.76), σε ασθενείς Ευρωπαϊκής καταγωγής της

BCAC. Επίσης προστατευτικό ήταν το αποτέλεσμα της μελέτης των Nick Seen Ooi et al, 2019, σε

ασθενείς και μάρτυρες των προοπτικών ερευνών 23andME, BCAC για τη συσχέτιση

ανθρωπομετρικών χαρακτηριστικών και της καρκινογένεσης στο μαστό. Παλαιότερες αλλά

αξιόλογες είναι οι μελέτες των Guo et al, και Benn et al, το 2016. H πρώτη εκ των δύο

συγκεκριμένα συνιστά και μία από τις πρωτοπόρες μελέτες που πραγματοποιήθηκαν πάνω στο

γενετικά προσδοκώμενο αυξημένο BMI σε συνάρτηση με τον καρκίνο του μαστού, με

πλεονεκτήματα της το μέγεθος αυτής καθώς και τη δυνατότητα να αποδώσει στρωματοποιημένα

αποτελέσματα βάση του εμμηνοπαυσιακού στάτους των γυναικών (διαχωρισμός σε προ/ μετά

εμμηνοπαυσιακές), γεγονός που διευκόλυνε τη σύγκριση με τις επιδημιολογικές μελέτες που θα

δούμε στη συνέχεια.

Σε αυτήν την μελέτη, προέκυψε OR IVW=  0.65 για κάθε 5 αύξηση του BMI, με 95% CI:

0.56–0.75, p = 3.32 × 10−10, δίδοντας παρόμοια αποτελέσματα και για τα δυο εμμηνοπαυσιακά

επίπεδα. Η ανάλυση μενδελιανής τυχαιοποίησης των Benn et al, από την άλλη είναι η μοναδική

που βρήκαμε στη δημοσιευμένη βιβλιογραφία με αναφερόμενη επιβαρυντική συσχέτιση μεταξύ

του αυξημένου BMI και του καρκίνου του μαστού. Ωστόσο η έρευνα αυτή είχε πολύ μικρό αριθμό

μαρτύρων (ασθενείς που ανέπτυξαν καρκίνο του μαστού στην τετράχρονη παρακολούθηση =

1402) γεγονός που προξενεί αμφιβολία για την ορθότητα του συμπεράσματος. Ξεχωριστή μνεία

γίνεται στη μελέτη των Quin et al, 2019, που αφορούσε φορείς μεταλλάξεων στα γονίδια κινδύνου

BRCA1/BRCA2 σε ασθενείς που συμμετείχαν στη CIMBA , και η οποία μελέτησε τόσο το

παρατηρούμενο όσο και το γενετικά προσδοκώμενο BMI σε σχέση με τον καρκίνο του μαστού.

Τόσο το παρατηρούμενο όσο και το γενετικά καθορισμένο αυξημένο BMI είχαν αντίστροφη

εκτιμώμενη αιτιακή επίδραση με τον καρκίνο του μαστού, ενώ αυτή η αιτιακή επίδραση

παρατηρήθηκε κυρίως για τους προ-εμμηνoπαυσιακούς καρκίνους. Βιβλιογραφική ανασκόπηση

της υπάρχουσας βιβλιογραφίας έως το 2018 πραγματοποιήθηκε από τους Perce et al, 2018.

Ιδιαίτερο ενδιαφέρον έχει η μελέτη του Richardson et al, 2020 η οποία , σε μια προσπάθεια να

διερευνήσει περαιτέρω το παράδοξο της προστατευτικής παχυσαρκίας όταν προβλέπεται με

γενετικές μεταβλητές σε σχέση με την εμφάνιση κακοηθειών όπως εκείνη του μαστού , δοκίμασε

να εντοπίσει γενετικές μεταβλητές άλλες για την παιδική παχυσαρκία (10 έτη) και διαφορετικές

για την ενήλικη ζωή (μέση ηλικία συμμετεχόντων 56 έτη). Ως έκβαση πέραν των κακοηθειών

(μαστού και προστάτη), μελέτησε τη στεφανιαία νόσο και το σακχαρώδη διαβήτη 2. Από την

πολυπαραγοντικά ανάλυση μενδελιανής τυχαιοποίησης που διενεργήθηκε, σε ένα μοντέλο που

περιλάμβανε τόσο την παιδική όσο και την ενήλικη παχυσαρκία (γενετικά προβλεπόμενη),

προέκυψε πως η παιδική παχυσαρκία διατήρησε στο μοντέλο την έντονη προστατευτική της

αιτιακή επίδραση στον καρκίνο μαστού (είτε θετικό είτε αρνητικό σε οιστρογονικούς υποδοχείς)

(OR IVW MVMR : 0.59, 95% CI: 0.50- 0.71), ενώ η άμεση αιτιακή επίδραση της ενήλικης

παχυσαρκίας μετριάστηκε σε βαθμό που ήταν στατιστική μη σημαντική (OR IVW MVMR: 1.08,

με 95% CI: 0.93 με 1.27. Άλλη μια μελέτη , εκείνη των Gao et al, 2016, μελέτησε τα γνωρίσματα της

παχυσαρκίας (ΒΜΙ,WHR ) σε συνάρτηση με 5 κακοήθειες (προστάτη, μαστού, ωοθηκών,

πνεύμονα και ορθοκολικό) και συμπεριέλαβε γενετικές μεταβλητές σε στατιστικά σημαντική

συσχέτιση με τους φαινοτύπους αυτούς στη γέννηση (birthweight), την παιδική ηλικία (childhood

BMI) και την ενήλικη ζωή (adult ΒΜΙ). Στις περιπτώσεις, όπως και στην προηγούμενη έρευνα, της

παιδικής και της ενήλικης παχυσαρκίας τόσο για το ΒΜΙ όσο και το WHR, η αιτιακή επίδραση

84

τους βρέθηκε προστατευτική. Ωστόσο, οι γενετικές μεταβλητές των εκάστοτε φαινοτυπικών

εκθέσεων δεν είχαν συμπεριληφθεί σε ένα κοινό πολυπαραγοντικό μοντέλο, όπως στην

προηγούμενη, ώστε να συνυπολογισθούν πλειοτροπικές αλληλεπιδράσεις και να μπορεί να

υπολογισθεί η άμεση αιτιακή επίδραση του ενός φαινότυποι δεδομένου του άλλου. Ενδεχομένως,

τότε να προέκυπτε ένα συμπέρασμα παρόμοιο με της προηγούμενης μελέτης. Οι μελέτες αυτές

πάντως, προσεγγίζοντας το ζήτημα υπό μελέτη από μια διαφορετική σκοπιά υπογραμμίζουν ένα

συμπέρασμα που μοιάζει λογικά να ευσταθεί : οι γενετικές μεταβλητές που χρησιμοποιούνται για

την πρόβλεψη της παιδικής παχυσαρκίας μοιάζουν να σχετίζονται καλύτερα με τον

προστατευτικό ρόλο της ενήλικης καρκινογένεσης, ενώ ενδεχομένων η ενήλικη παχυσαρκία που

προβλέπεται γενετικά δεν είναι ισχυρος-αξ προγνωστικός δείκτης . Δεδομένου ότι τα

αλληλόμορφα που μελετώνται έχουν μια σχετικά μικρή αλλά διαρκή επίδραση μακρόχρονα τότε

, αφενός είναι ευκολότερο να επηρεάσουν το φαινότυπο και να εκφραστούν στην παιδική ηλικία-

νεαρή ενήλικη ζωή και, αφετέρου, δοθέντος του χρόνου και της σο σύμπραξης άλλων

παραγόντων (περιβαλλοντικών, πολιτισμικών) αλλά και , τα αλληλόμορφα αυτά είναι

δυσκολότερο να έχουν διείσδυση και έκφραση σε μεγαλύτερη ηλικία. Η προστατευτική επίδραση

της παχυσαρκίας φαίνεται να συνάδει με το ρόλο της παχυσαρκίας ως ορμονοπαραγωγού

οργάνου και στην παρεμβολή αυτής στον άξονα υποθαλάμου - υπόφυσης - ωοθηκών με

συνέπεια ανωορρηκτικούς κύκλους. Αυτή η άποψη αφορά ως τώρα επιδημιολογικές μελέτες

παρατήρησης και συγκεκριμένα το εμμένον εύρημα της προστατευτικής παχυσαρκίας στον

κίνδυνο εμφάνισης του προεμμηνοπαυσιακού καρκίνου του μαστού (βλέπε Κεφάλαιο 1).

Ταυτόχρονα, το συγκεκριμένο εύρημα υποστηρίζεται και από επιδημιολογικές μελέτες

παρατήρησης, όπως θα δούμε παρακάτω. Τα συμπεράσματα αυτά μένει να διερευνηθούν και με

γενετικές μελέτες και με εστίαση στο βιοπαθολογικών μηχανισμών που ενεργοποιούνται κατά την

παιδική ηλικία ή την πρώιμη ενήλικη ζωή.

Ως τώρα, πιθανόν λόγω μη, μέχρι προσφάτως, διαθεσιμότητας δημοσιευμένων δεδομένων ευρυ-

γονιδιωματικών μελετών δεν έχει παραχθεί κάποια μελέτη που να διερευνά όλους τους μοριακούς

υπότυπους του καρκίνου του μαστού που αναφέρθηκαν στην παρούσα μελέτη, ενώ η

διαστρωμάτωση της έκβασης ως τώρα αφορούσε μονάχα το χαρακτηρισμό τους βάση της

ύπαρξης ή όχι οιστρογονικών υποδοχέων στα νεοπλάσματα.

Συγκρίνοντας τα ευρήματα μας, με εκείνα των επιδημιολογικών μελετών παρατήρησης,

προκύπτει η ασυμβατότητα που αναφέρω στην εισαγωγή (Κεφάλαιο 1) και σχετίζεται με

διαφορές στην κατεύθυνση της επίδρασης μεταξύ ερευνών μενδελιανής τυχαιοποιήσης και

επιδημιολογικών ερευνών παρατήρησης, καθώς και μεταξύ προεμμηνοπαυσιακής -

μετεμμηνοπαυσιακής κατάστηασης στις τελευταίες. Εστιάζοντας βιβλιογραφικά σε

ανασκοπήσεις και μετα-αναλύσεις που έχουν επεξεργαστεί το ζήτημα της συσχέτισης της

παχυσαρκίας με τον καρκίνο του μαστού, τα αποτελέσματα έχουν ως εξής. Στην ανασκόπηση

ομπρέλα και μετα-ανάλυση της Kyrgiou et al, 2017 μελετήθηκε η παχυσαρκία συγκριτικά με τον

κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου διαφόρων εντοπίσεων, με συμπέρασμα τα στοιχεία να είναι ισχυρά

αποδεικτικά πως το αυξημένο BMI αυξάνει το μετεμμηνοπαυσιακό καρκίνο του μαστού.

Ταυτόχρονα, οι ερευνητές υπέδειξαν πως ενδεχομένως η “αύξηση του βάρους” (weight gain) και

όχι το BMI καθαυτό να συνιστά πιο αντιπροσωπευτικό (δυναμικό) δείκτη των βιολογικών

μηχανισμών που μπορεί να επεξηγούν το παρόν εύρημα. Στη μετα-ανάλυση των Béatrice Lauby-

Secretan et al, 2016, ως ομάδα εργασίας του IARC (International Agency Research on Cancer),

τμήμα της έρευνας που διεξάγει ο Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας, αναφέρεται ίδιο συμπέρασμα

με το προηγούμενο, αναφέροντας επίσης πως οι μετεμμηνοπαυσιακές υπέρβαρες γυναίκες

κινδυνεύουν παραπάνω από οιστρογονο-θετικούς καρκίνους παρά αρνητικούς. Παρόλα αυτά,

85

και εδώ, το αυξημένο BMI στην παιδική ηλικία, την εφηβεία και την πρώιμη ενήλικη ζωή (<25

ετών) φαίνεται να είχε αντίστροφη συσχέτιση με την εμφάνιση του καρκίνου του μαστού. Ήπια

επιβαρυντική συσχέτιση μεταξύ του αυξημένου BMI και του μετεμμηνοπαυσιακού καρκίνου του

μαστού εντοπίζεται και στη συστηματική ανασκόπηση και μετα-ανάλυση του Renehan et al,

2018. Τέλος, στην πληθυσμιακή εμβληματική μελέτη των Arnold et al, 2015 , με στοιχεία από όλες

τις διαθέσιμες χώρες παγκοσμίως από το 2002 ως το 2012, ο μετεμμηνοπαυσιακός καρκίνος του

μαστού αποτελεί έναν από τους πιο ισχυρά σχετιζόμενους με την παχυσαρκία κακοήθειες.

Αναφορικά με μελέτες που συμπεριέλαβαν στοιχεία από προεμμηνοπαυσιακές και

μετεμμηνποπαυσιακές γυναίκες, προκύπτούν τα εξής: η μετά-ανάλυση των Chen et al, 2017 με

3,318,796 συμμετέχουσες από 31 προοπτικές μελέτες, επιβεβαιώνει το εύρημα του επιβαρυντικού

ΒΜΙ στον μετεμμηνοπαυσιακό καρκίνο του μαστού με ευρισκόμενο κίνδυνο εκφραζόμενο μέσω

σχετικού κινδύνου (RR): 1.33 (95%CI: 1.20-1.48). Ταυτόχρονα, για τις προεμμηνοπαυσιακές

γυναίκες, η ίδια μελέτη, αναφέρει RR =0.94(95%CI: 0.80-1.11) , εύρημα που σε ανάλυση της υπο-

ομάδας των Ευρωπαίων γυναικών είναι στατιστικά σημαντικό με RR = 0.79 (95%CI: 0.70-0.88.

Αναφορικά με τον προ-εμμηνοπαυσιακό καρκίνο του μαστού, μια πιο πρόσφατη μελέτη, εκείνη

των Schoemaker et al, 2018 (στα πλαίσια της Premenopausal Breast Cancer Collaborative Group)

, ακριβώς στοχεύοντας στη διερεύνηση αυτής της παράδοξη αντίστροφης αιτιακής σχέσης,

διενήργησε μια πολυκεντρική ανάλυση στην οποία συμμετείχαν 19 προοπτικές μελέτες με

ατομικά δεδομένα από 758 592 συμμετέχουσες. Παρότι παρατηρήθηκε αντίστροφη συσχέτιση

για όλες τις ηλικιακές κατηγορίες που μελετήθηκαν (έως την ηλικία των 54 ετών) , πιο ισχυρή

αναδείχθηκε η αντίστροφη συσχέτιση για το αυξημένο BMI και τον προεμμηνοπαυσιακό καρκίνο

του μαστού στην ηλικία μεταξύ 18 έως 24 ετών (HR: 0.77, 95% CI= 0.73-0.80) . Επίσης,

ισχυρότερες αναδείχθηκαν οι προστατευτικές συσχετίσεις της επίδρασης σε νεοπλασίες θετικές

σε οιστρογονικούς και προγεσταγονικούς υποδοχείς σε σχέση με τις αρνητικές. Παρόμοιο εύρημα

επιβεβαιώθηκε στην ανασκόπηση της βιβλιογραφίας των Chan et al, 2019 για το αυξημένο BMI

της πρώιμη ενήλικης ζωής (18-30 ετών) το οποίο εμφάνιζε αντίστροφη συσχέτιση με τον καρκίνο

του μαστού, τόσο τον προεμμηνοπαυσιακό όσο και τον μετεμμηνιπαυσιακό. Θετική συσχέτιση

με τον μετεμμηνοπαυσιακό καρκίνο του μαστού είχε το ενήλικο ΒΜΙ, η “αύξηση του βάρους”

(weight gain) και η αυξημένη παχυσαρκία σώματος (όχι γενική) εκφραζόμενη ως περίμετρος της

μέσης, αλλά και λόγος περιμέτρου μέσης / γοφών (WHR) όταν είχε διορθωθεί για το ΒΜΙ.

Σύμφωνα με ακόμα μετα-αναλύσεις και ανασκοπήσεις των Cherangi et al , 2012 αναδείχθηκε

επίσης η προστατευτική τάση για τον προεμμηνοπαυσιακό καρκίνο του μαστού από την γενική

παχυσαρκία (αυξημένο ΒΜΙ) , χωρίς ωστόσο να είναι στατιστικά σημαντικό το αποτέλεσμα (OR

= 0.93 (95% CI 0.86, 1.02)).

Ξεχωριστό, επίσης ενδιαφέρον, και σε σχέση με τη δική μας μελέτη, έχουν οι έρευνες που

περιλάμβαναν την υπό μελέτη συσχέτιση σε διαφορετικούς εκάστοτε πληθυσμούς, με ευρήματα

που έχουν ως εξής: οι Wang et al, 2016 απέδειξαν πολύ ισχυρότερη συσχέτιση του αυξημένου

ΒΜΙ και του καρκίνου του μαστού (ολικού) στις γυναίκες καταγωγής από την Ασία και τον

Ειρηνικό σε σχέση με εκείνες από την Ευρώπη, την Αυστραλία και τη Βόρεια Αμερική. Στην

έρευνα των Amadou et al, το 2013 (συστηματική ανασκόπηση και μετα-ανάλυση δοσολογικής

απόκρισης) επιβεβαιώθηκε η προαναφερόμενη σχέση του προστατευτικού αυξημένου ΒΜΙ για

τον προεμμηνιπαυσιακό καρκίνο του μαστού, ωστόσο κατά τη διόρθωση με βάση την εθνότητα,

η σχέση παρέμεινε στατιστικά σημαντική μόνο για τις Αφρικανές και τις Καυκάσιες, ενώ στην

περίπτωση των γυναικών από Ειρηνικό-Ασία η σχέση αντιστράφηκε τελείως και παρατηρήθηκε

μια στατιστικά σημαντική θετική συσχέτιση. Σε μια pooled ανάλυση κοορτών των Wada et al,

2014 στην Ιαπωνία, επιβεβαιώθηκε ο αυξημένος κίνδυνος του μετεμμηνοπαυσιακού καρκίνου

του μαστού αλλά και, συμβατό με την προηγούμενη έρευνα που ανέφερα, οριακά στατιστικά

σημαντικό επιβαρυντικό το αυξημένο ΒΜΙ για την εμφάνιση του προ-εμμηνοπαυσιακού

86

καρκίνου του μαστού. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν πιθανόν πως υπάρχει μια γεωγραφική

κατανομή που διαστρωματώνει την επίδραση του αυξημένου ΒΜΙ στον καρκίνο του μαστού,

γεγονός που προβάλλει τη σημασία της διερεύνησης της γενετικής βάσης του ΒΜΙ σε διάφορους

πληθυσμούς.

Τέλος, αναφορικά με τους υποδοχείς ορμονών και τους μοριακούς υπότυπους του καρκίνου του

μαστού, στην έρευνα των Yang et al το 2011, μελετώντας παράγοντες κινδύνου που

συσχετίζονται με τον καρκίνο του μαστού και τον τρόπο που αυτού επιδρούν στους υπότυπους

του σε έρευνες συμμετέχουσες στη BCAC, υποδείχθηκε μια διμορφική κατανομή της συσχέτισης

ανάλογα με την ηλικία. Συγκεκριμένα, για γυναίκες ηλικίας <50 ετών, η παχυσαρκία (BMI>30

) ήταν πιο κοινό εύρημα στους ER(-) (οιστρογονο-υποδοχείς), PR(-) (προγεσταγόνο-

υποδοχείς) σε σχέση με τους θετικούς, ενώ αντίθετα στις γυναίκες ηλικίας >50 ετών η παχυσαρκία

ήταν λιγότερη συχνή στους PR(-). Επίσης, η παχυσαρκία δε φαίνεται να συνδέεται με τον “Triple

Negative” καρκίνο. Σε μια πρόσφατη pooled ανάλυση κοορτών με πάνω από 1.000.000

συμμετέχουσες, οι Piet A van den Brandt , 2021 υπέδειξαν αφενός πως το ΒΜΙ (μετρημένο στο

baseline της κοορτής) συσχετιζόταν αντίστροφα με τον προεμμηνοπαυσιακό καρκίνο ενώ θετικά

ισχυρά με τον μετεμμηνοπαυσιακό καρκίνο, και ιδίως τον ER(+), αφετέρου πως το αυξημένο ΒΜΙ

στην πρώιμη ενήλικη ζωή ήταν προστατευτικό τόσο για τον προεμμηνοπαυσιακό όσο και για τον

εμμηνοπαυσιακό καρκίνο του μαστού. Η αντίστροφη συσχέτιση του πρώιμου ενήλικου

αυξημένου ΒΜΙ ήταν περισσότερη ισχυρή για τους ER(-) καρκίνους του μαστού. Στις τελευταίες

γυναίκες μάλιστα δε φαίνεται να είχε επίπτωση στην εμφάνιση καρκίνου η αύξηση του βάρους

(weight gain) μετέπειτα στη ζωή τους, ενώ στις λεπτότερες γυναίκες, η αύξηση του βάρους από

την ηλικία των 18-20 και έπειτα είχε ως συνέπεια την αύξηση του κινδύνου για τον

μετεμμηνοπαυσιακό καρκίνο του μαστού. Τέλος, θα αναφέρω μια ανασκοπική μελέτη που

περιλάμβανε δημοσιευμένες κοορτές και μελέτες ασθενών μαρτύρων από το 1982 έως το 2012,

εκείνη των Munschel et al, 2014 , η οποία αναφέρει ένα περιληπτικό σχετικό κίνδυνο για τους

ER(+) μικρότερο < 1 (προστατευτικό) για τους προεμμηνοπαυσιακούθς καρκίνους και το

αυξημένο ΒΜΙ, ενώ περιληπτικό RR>1 για τους μετεμηνοπαυσιακούς ΕR(+) καρκίνους του

μαστού. Αντίθετα, για τους ER- καρκίνους του μαστού το summary RR ήταν 1.06 95% CI: 0.70,

1.60) για τους προεμμηνοπαυσιακούς και 0.98 (95% CI: 0.78, 1.22) για τους μετεμμηνιπαυσιακούς

καρκίνους, αποτελέσματα μη στατιστικά σημαντικά. Δεν είναι ξεκάθαρη λοιπόν η συσχέτιση της

παχυσαρκίας με τους οιστρογονο-αρνητικούς καρκίνους του μαστού στις μελέτες παρατήρησης.

Αναφορικά με τη συσχέτιση της κεντρικής παχυσαρκίας με τον καρκίνο του μαστού, διεξάγαμε

μελέτη μενδελιανής τυχαιοποίησης δύο δειγμάτων, περιληπτικών δεδομένων. Τα δεδομένα για

τον καρκίνο του μαστού προήλθαν και εδώ από το συνασπισμό BCAC και μας επέτρεψαν τη

διερεύνηση των μοριακών υποτύπων αυτής της νεοπλασίας σε σχέση με το λόγο περιμέτρου

μέσης/γοφών (WHR). Τα ευρήματα μας συνοπτικά απέδειξαν μια προστατετυική αιτιακή

επίδραση για τον καρκίνο του μαστού, οποιοδήποτε υποτύπου, σε στατιστικά σημαντικό βαθμό

τόσο στην εκτίμησης της αιτιακής επίδρασης μέσω της ΙVW τυχαίων επιδράσεων, όσο και στην

εκτίμηση της MR-PRESSO μετά την αφαίρεση πιθανόν πλειοτροπικών εκτιμήσεων (SNPs). Tην

ίδια κατεύθυνση καθώς και στατιστική σημαντικότητα, αν και μειωμένες σε ισχύς, είχαν και οι

άλλες δύο αναλύσεις ευαισθησίας που διενεργήθηκαν (Weighted Median, MR-Egger). Για όλους

τους υπότυπους του καρκίνου του μαστού, είτε εντάσσονται στην κατηγορία των

οιστρογονο/προγεσταγόνο θετικών, είτε εντάσσονται στην κατηγορία των

οιστρογονο/προγεσταγόνων αρνητικών υποδοχέων νεοπλασιών, η προστατευτική επίδραση

παραμένει, χωρίς ωστόσο να είναι πάντοτε στατιστικά σημαντική. Στατιστικά σημαντική

προστατευτική επίδραση είχε η αύξηση κατά 0.07 του WHR στους “Luminal A” (ER+) ,

“HER2Enriched” ER-) και στους “Triple Negative” (ΕR-) καρκίνους του μαστού σύμφωνα με την

87

IVW τυχαίων επιδράσεων. Στις δύο πρώτες περιπτώσεις τη στατιστική σημαντικότητα τους

(καθώς και την κατεύθυνση τους) διατήρησαν και στις αναλύσεις ευαισθησίας που ακολούθησαν

(MR-Egger, Weighted Median), ενώ στην τρίτη περίπτωση ενώ διατήρησε την κατεύθυνση της,

έχασε τη στατιστική σημαντικότητα του στις αναλύσεις ευαισθησίας. Στην MR-PRESSO ανάλυση

ευαισθησίας δεν διαπιστώθηκε στατιστικά σημαντική αλλαγή στην εκτίμηση με βάση το distortion

test μετά την αφαίρεσή των πλειοτροπικών SNPs, και η διορθωμένη εκτίμηση της MR-PRESSO

IVW τυχαίων επιδράσεων διατήρησε τη στατιστική σημασία της για τον “Luminal A”, και “Triple

Negative” καρκίνο του μαστού, ενώ για τον “HER2Enriched” , δεν μπόρεσε να υπολογισθεί.

Αναφορικά με τις προηγηθείσες μελέτες μενδελιανής τυχαιοποίησης σχετικά με το ερώτημα της

κεντρικά κατανεμημμένης παχυσαρκίας και του κινδύνου εμφάνισης του καρκίνου του μαστού,

από την ανασκόπηση της βιβλιογραφίας προέκυψαν λιγότερα αποτελέσματα από εκείνα για τη

γενική παχυσαρκία (ΒΜΙ). Συγκεκριμένα, οι περισσότερες έχουν ήδη αναφερθεί προηγουμένως

καθώς το WHR ήταν ένας από τους ανθρωπομετρικούς δείκτες που χρησιμοποιήθηκαν στην

προσέγγιση της παχυσαρκίας ποικιλοτρόπως. Στην έρευνα των Shu et al, 2019, μελετήθηκε το

γενετικά προσδιορισμένο WHR, έχοντας γίνει διόρθωση για το ΒΜΙ, σε 54 γενετικές μεταβλητές

SNPs και η ατιακή του επίδραση σε άτομα της BCAC, Ευρωπαϊκής καταγωγής. Προέκυψε πως

το WHRadjBMI ήταν προστατευτικό για την εμφάνιση του καρκίνου του μαστού με OR IVW:

0,85, και 95%CI= 0.79-0.91, p = 9.22 × 10-6, εύρημα παρόμοιo σε μέγεθος με το δικό μας.

Ταυτόχρονα, ήταν σταθερό εύρημα ανεξάρτητα από το οιστρογονικό status (θετικό ή αρνητικό)

των όγκων. Αντίστροφη συσχέτιση, ωστόσο οριακά στατιστικά μη σημαντική, παρατηρήθηκε

στην μελέτη των Gao et al,2016 με OR IVW= 0.75 (CI 95%=0.53-100), για τον καρκίνο του μαστού.

Σε καμία από αυτές τις μελέτες δεν αναλύθηκαν περαιτέρω οι υπότυποι του καρκίνου του

μαστού, πέραν της κατάταξης σε ER+/ER-.

Από τη σκοπιά των επιδημιολογικών μελετών παρατήρησης επίσης οι μελέτες που έχουν

ασχοληθεί με την κεντρική παχυσαρκία είναι πολύ λιγότερες από εκείνες που αφορούν τη γενική

παχυσαρκία και τον καρκίνο του μαστού. Στην ανασκόπηση και μετα-ανάλυση των Harvie et al,

το 2013, προέκυπτε το συμπέρασμα πως η προσαρμογή για το ΒΜΙ εξαφάνιζε την όποια

επίδραση φαινόταν να έχει το WHR στο μετεμμηνοπαυσιακό καρκίνο του μαστού, ενώ αντίθετα,

η προσαρμογή για το ΒΜΙ στον προ-εμμηνιοπαυσιακό καρκίνο του μαστού, εισήγαγε μια

συσχέτιση μεταξύ του WHR και του προεμμηνοπαυσιακού καρκίνου του μαστού. Στη μετά-

ανάλυση δόσης-απάντησης προοπτικών ερευνών των Chen et al, 2016 , όπου μελετήθηκε

ακριβώς η επίδραση της κεντρικής παχυσαρκίας στον προ- και μετεμμηνοπαυσιακό καρκίνο του

μαστού, προκύπτει πως η κεντρική παχυσαρκία, εκφρασμένη με το μέτρο της περιμέτρου της

μέσης (waist circumference -WC) ,και όχι του λόγου περιμέτρου μέση προς γοφών (WHR),

σχετίζεται με μια μέτρια αύξηση του καρκίνου του μαστού και στις δυό εμμηνοπαυσιακές ομάδες,

ανεξάρτητα μάλιστα από τη γενική παχυσαρκία. Στην πρόσφατη μελέτη του Houghotn et al, 2021

, μελετήθηκαν τα αποτελέσματα της κοορτής Nurses’ Health Study με συμπέρασμα αντιθετικό με

το προηγούμενο. Εδώ, το WHR προσαρμοσμένο για το BMI, και όχι το WC ή το ΗC (Hip

Circumference - περίμετρος γοφών), φαίνεται να έχει θετική συσχέτιση με τον

προεμμηνοπαυσιακό καρκίνο του μαστού, (OR μεταξύ 5ου προς 1ο πεμπτημόριο= 1.27, 95% CI

= 1.04 έως 1.54) και ειδικά για τους ER (-), PR (-) και βασικού τύπου (basal - like) καρκίνους.

Αντίθετα, στους μετεμμηνοπαυσιακούς καρκίνους, το WHR χάνει τη στατιστικά σημαντική

συσχέτιση του μετά από την προσαρμογή για το ΒΜΙ. Σε μια άλλη μελέτη της κεντρικής

παχυσαρκίας, εκείνη των Wight et al, 2016, με στοιχεία από την κοορτή Sister Study επίσης

χρησιμοποιώντας το WC, και όχι το WHR, εμφανίζεται θετική συσχέτιση με την εμφάνιση του

προεμμηνοπαυσιακού όσο και του μετεμμηνοπαυσιακού καρκίνου του μαστού. Στην προοπτική

88

μελέτη των Lee et al, 2018, στην Κορέα, προέκυψε πως το WHR (προσαρμοσμένο για το ΒΜΙ)

είχε οριακά στατιστικά σημαντική συσχέτιση τόσο για τον προ όσο και για τον

μετεμμηνοπαυσιακό καρκίνο του μαστού.

Από ό,τι φαίνεται παρά τις ενδείξεις μιας θετικής συσχέτισης του WHR με την καρκινογένεση οι

μελέτες που αφορούν στον καρκίνο του μαστού δε χαίρουν για την ώρα ευρύτητας και

συμπερίληψης τέτοιων ώστε τα συμπεράσματα να είναι συνεπή και σταθερά. Από την άλλη οι

μελέτες μενδελιανής τυχαιοποίησης που έχουν πραγματοποιηθεί έχουν όλες ευρήματα συμβατά

με τα δικά ευρήματα, συνέπεια που προσδίδει ισχύς στο δικό μας αποτέλεσμα. Ο τρόπος

ερμηνείας τους, παρότι δυσδιάκριτος ενδεχόμενος, ίσως συμβαδίζει με την ερμηνεία της γενικής

παχυσαρκίας (της γενετικά προσδιοριζόμενης). Υπό γενετική καθοδήγηση, ίσως ερμηνεύεται

καλύτερα το νεανικό ή το παιδικό μας ΒΜΙ , όπως και η εναπόθεση κεντρικού λίπους, σε θέσεις

μεταβολικά ενεργές ώστε να συμβάλλουν στην απορρύθμιση των ορμονο-εξαρτώμενων

ωοθηκικών κύκλων των γυναικών, καταλήγοντας σε ανωορρηκτικούς κύκλους και σε διαφυγή

της “πολιορκίας” των μαστικών κυττάρων από την περίσσεια ορμονών.

Στη συνέχεια της ανάλυσης μας, θελήσαμε να εισαγάγουμε στο μοντέλο περισσότερους πιθανούς

παράγοντες κινδύνου για την εμφάνιση του καρκίνου του μαστού ώστε να εκτιμήσουμε την

αιτιακή επίδραση των κυρίων φαινοτύπων μας στην έκβαση σε ένα κοινό μοντέλο, καθώς και τη

μεταβολή αυτής, έχοντας λάβει υπόψιν και αυτούς τους δευτεροπαθείς φαινότυπους.

Εφαρμόσαμε τη μέθοδο πολυπαραγοντικής μενδελιανής τυχαιοποιήσης, εισάγοντας στο μοντέλο

εκ περιτροπής κάθε δευτερεύοντα φαινότυπο. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιήσαμε παράγοντες με

γνωστή συσχέτιση με τον καρκίνο του μαστού (σε μελέτες μενδελιανής τυχαιοποίησης) και με

διαθέσιμα δημοσιευμένα περιληπτικά δεδομένα από ευρυγονιδιωματικές μελέτες. Τα στοιχεία των

GWAS που χρησιμοποιήθηκαν αναφέρονται στο κεφάλαιο 2. Σε κάθε περίπτωση, επιλέχθηκαν οι

μεγαλύτερες σε μέγεθος GWAS από τις διαθέσιμες. Σημειώνεται πως δεν υπήρχαν για όλες τις

GWAS στοιχεία ειδικά για το φύλο (sex-specific) ενώ στην περίπτωση μη ύπαρξης

χρησιμοποιήθηκαν μεικτά. H σχέση των δευτερευόντων φαινότυπων αυτών με τους κύριους

φαινότυπος περιορίστηκε στη μελέτη μας, σε σχέση μεσολάβησης. Ως μεσολαβητής νοείται ένας

φαινότυπος όταν μέσω της σχέσης του με την έκβαση και τον κύριο φαινότυπο, επεξηγεί ένας

μέρους του βιολογικού μονοπατιού της συσχέτισης αυτών των δύο. Στα πολυπαραγοντικά

μοντέλα επιλέχθηκε να μελετηθεί ως έκβαση το σύνολο των περιπτώσεων του καρκίνου του

μαστού, χωρίς διαστρωμάτωση για το μοριακό υπότυπο, αντίστοιχη με εκείνη του πρώτου

μέρους της μελέτης. Αυτή η επιλογή ήταν συνεπής με το γεγονός πως δεν παρατηρήθηκε διαφορά

στην κατεύθυνση της σχέσης για κανέναν από τους υποτύπους, είτε σε συνάρτηση με το ΒΜΙ,

είτε με το WHR. α στοιχεία της έκβασης που χρησιμοποιήθηκαν ήταν επίσης από δεδομένα της

BCAC.

Θεωρώντας πως η επίδραση της έκθεσης στο μεσάζοντα (mediator), καθώς και επίδρασης της

έκθεσης και τους μεσάζοντας στην έκβαση είναι γραμμική, χωρίς αλληλεπιδράσεις (Burghess,

2015), εντοπίσαμε γενετικές μεταβλητές με ισχυρή συσχέτιση (στο τυπικό επίπεδο στατιστικής

σημαντικότητας των GWAS) με τους φαινότυπους της παχυσαρκίας (BMI/WHR) και τους

δευτεροπαθείς φαινοτύπους. Ακολουθώντας τα βήματα της “2-step MR” (Haycock et al, 2016) για

τη μελέτη της μεσολάβησης στα πολυπαραγοντικά μοντέλα της MR, αρχικά μελετήσαμε τη σχέση

του εν δυνάμει μεσολαβητή με την έκβαση. Για τις περιπτώσεις που δεν προέκυψε στατιστικά

σημαντική σχέση, δε χρησιμοποιήσαμε τις εν λόγω μεταβλητές σε περεταίρω αναλύσεις.

Έπειτα , μελετήσαμε τη σχέση της έκθεσης με το μεσολαβητή. Γενετικές μεταβλητές για το BMI

89

/WHR χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιορίσουν την αιτιακή επίδραση των ΒΜΙ/WHR στους

δευτεροπαθείς φαινοτύπους ενδιαφέροντος (1). Αντίστροφα, γενετικές μεταβλητές για τον

εκάστοτε δευτεροπαθή φαινότυπο χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό της αιτιακής

επίδρασης στα ΒΜΙ/WHR (2). Θεωρήθηκαν με ασφάλεια μεσολαβητές όσες συσχετίσεις είχαν

στατιστικά σημαντικό αποτέλεσμα στην μόνο-παραγοντική Μενδελιανή τυχαιοποίηση (1), ενώ

δε μελετήθηκαν περαιτέρω φαινότυποι οι οποίοι είχαν στατιστικά σημαντικό αποτέλεσμα και στη

μόνο-παραγοντική Μενδελιανή τυχαιοποιήση (2) (αμφί-κατευθυνόμενη σχέση), με το φόβο πως

μπορούν να συνιστούν συγχυτικούς παράγοντες στη βασική μελετώμενη σχέση. Υπό αυτό το

πρίσμα στο πολυπαραγοντικό μοντέλο MR συμπεριλήφθησαν ως μεσολαβητές για τη σχέση

ΒΜΙ- ολικός καρκίνος του μαστού οι IGF-1, η CRP και τα λιπίδια. Αντίστοιχα, για τη σχέση WHR-

καρκίνος του μαστού χρησιμοποιήθηκαν οι μεσολαβητές τεστοστερόνη, IGF-1, λιπίδια. Από τα

αποτελέσματα όλων των πολυπαραγοντικών μοντέλων, η προστατευτική κατεύθυνση του

φαινότυπου της παχυσαρκίας παρέμεινε.

Από τα αποτελέσματα που προέκυψαν για την πρώτη σχέση (BMI-BRCA), οι προσαρμογές για

τα λιπίδια ορού και η igf-1 φαίνεται να ήταν εκείνες οι οποίες μετέβαλλαν περισσότερο την αιτιακή

επίδραση του ΒΜΙ στο μοντέλο. Ο μετριασμός του προστατευτικού αποτελέσματος ήταν στην

πρώτη περίπτωση 36% ενώ στη δεύτερη περίπτωση 4%. Εντούτοις, η προστατευτική δράση του

ΒΜΙ δεν ήταν αμελητέα (μείωση κατά 7% και 11% αντίστοιχα για κάθε αύξηση κατά 5 k𝑔/𝑚2

του ΒΜΙ στον κίνδυνο εμφάνισης του καρκίνου του μαστού). Συμπεραίνουμε λοιπόν, πως τα

λιπίδια συνιστούν έναν κύριο μεσολαβητή για τη σχέση από την παχυσαρκία στην

καρκινογένεση. Η CRP ως μεταβλητή είχε διαφορετική παρουσία, ενισχύοντας την

προστατευτική σχέση, γεγονός που εκτιμήθηκε ως πιθανός διπλός ρόλος (μεσολαβητής και

συγχυτής) ωστόσο δεν εξετάσθηκε παραπάνω, στα πλαίσιαα της παρούσας μελέτης.

Ως τώρα, δεν υπάρχουν δημοσιευμένες μελέτες οι οποίες να εξετάζουν τους πιθανούς

μεσολαβητές στη σχέση καρκινογένεσης και παχυσαρκίας.

Από την έρευνα στην υπάρχουσα βιβλιογραφία, 6 δημοσιευμένες μελέτες μενδελιανής

τυχαιοποίησης που αναζητούν την αιτιακή επίδραση των λιπιδίων στον κίνδυνο εμφάνισης του

καρκίνου του μαστού. Αναφέρω συνοπτικά κάποια αποτελέσματα: η έρευνα από τους Nowak et

al, 2018, βρίσκει πως η γενετικά αυξημένη LDL αυξάνει τον κίνδυνο εμφάνισης του καρκίνου του

μαστού, ενώ οι HDL, LDL φάνηκαν να αυξάνουν τον κίνδυνο εμφάνισης των ορμονοθετικών

καρκίνων του μαστού. Στη μελέτη των Marju Orho-Melander et al, 2018 φάινεται πως τα

τριγλυκερίδια (TG), μετά την προσαρμογή για την πλειοτροπία, έχουν προστατευτική επίδραση

στον κίνδυνο εμφάνισης του καρκίνου του μαστού, ενώ δεν εντοπίζεται συσχέτιση για την LDL.

H αυξημένη HDL (γενετικά καθοριζόμενη) φαίνεται να είναι επιβαρυντική και στην έρευνα των

Beeghly-Fadiel, 2020, ενώ καμία συσχέτιση ή μη συνεπή αποτελέσματα προκύπτουν για τα

υπόλοιπα λιπίδια αίματος. Καμία συσχέτιση για την LDL δεν αποδεικνύει και η έρευνα των

Carter et al, 2020. Ενδιαφέρον έχει η μελέτη των Johnson et al, 2020, η οποία μελετά την επίδραση

των λιπιδίων σε πολυ-παραγοντικό μοντέλο (MVMR) το οποίο συμπεριλαμβάνει και εκτιμήσεις

του ΒΜΙ σε δεδομένα από ασθενείς και μάρτυρες της BCAC. Η μελέτη στο μονοπαραγοντικό

μοντέλο βρίσκει επιβαρυντικά αποτελέσματα για την HDL, ενώ προστατευτικά αποτελέσματα για

τα τριγλυκερίδια (παρόμοια αποτελέσματα παρουσιάζουμε και εμείς στον Πίνακα 9, παρότι μη

στατιστικά σημαντικά), αιτιακές κατευθύνσεις τις οποίες διατηρεί και στο πολυπαραγοντικό

μοντέλο έχοντας προσαρμόσει για το BMI και την ηλικία εμμηναρχής. Συγκεκριμένα, στο

πολυπαραγοντικό μοντέλο προκύπτει για το ΒΜΙ OR IVW= 0.90 (95% CI=0.87-0.94, P=1.15 × 10−6.

Αυτή η αιτιακή επίδραση είναι αρκετά κοντά στην άμεση αιτιακή επίδραση που υπολογίστηκε

90

στο δικό μας μοντέλο για το ΒΜΙ έχοντας προσαρμόσει για τα λιπίδια (υπενθυμίζω με OR

IVW=0.924, (95%CI =0.856 - 0.998). Επιδημιολογικές μελέτες παρατήρησης επίσης υπάρχουν

για την εν λόγω συσχέτιση και θα αναφερθώ συνοπτικά για να υποδείξω εκ νέου την

ασυμβατότητα μεταξύ των μελετών παρατήρησης και μενδελυανής τυχαιοποιήσης και στο

επίπεδο λιπιδίων-καρκίνου μαστού. Έτσι, στην μετα-ανάλυση των Ni et al, 2015 με 1.189.635

συμμετέχοντες προκύπτει πως ενδεχομένως τα τριγλυκερίδια είναι προστατευτικά για τον

κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου του μαστού. Συσχέτιση για την LDL δεν παρατηρήθηκε, ενώ για την

HDL παρατηρήθηκε προστατευτική επίδραση για στην καρκινογένεση του μετεμμηνοπαυσιακού

καρκίνου του μαστού , αλλά όχι του προεμμηνοπαυσιακού. Στην συστηματική ανασκόπηση και

μετά-ανάλυση των Wu, το 2021, διαπιστώθηκαν αυξημένα τριγλυκερίδια και LDL στο

προεμμηνιπαυσιακό καρκίνο του μαστού. Το αιτιακό μονοπάτι που πιθανόν μεσολαβεί ως

μηχανισμός είναι εκείνο του μεταβολικού συνδρόμου (που συνδέεται τόσο με την παχυσαρκία,

όσο και με τη διαταραχή του μεταβολισμού των λιπιδίων).

Για την IGF-1 σε δύο δημοσιευμένες αναλύσεις MR που ανευρέθησαν, των Larson et al, 2020 και

των Tan et al, 2021 , όπου και στις δυο αναλύσεις φάινεται πως η igf-1 έχει επιβαρυντική αιτιακή

επίδραση στον καρκίνο του μαστού. Σε επιδημιολογικές μελέτες παρατήρησης (Endogenous

Hormones and Breast Cancer Collaborative Group, 2010, Wu et al, 2020) προκύπτει επίσης μάλλον

επιβαρυντική συσχέτιση της igf-1 με τον καρκίνο του μαστού.

Από τα αποτελέσματα που προέκυψαν για τη δεύτερη σχέση (WHR-BRCA) η προσαρμογή για

την τεστοστερόνη, την igf-1 και τα λιπίδια, δεν αναιρεί την προστατευτική αιτιακή επίδραση στην

εμφάνιση του καρκίνου του μαστού. Στις πρώτες δύο περιπτώσεις μάλιστα, η άμεση αιτιακή

επίδραση παρέμεινες στατιστικά σημαντική. Ο μετριασμός του προστατευτικού αποτελέσματος

του WHR στην έκβαση βρέθηκε 16 % στο μοντέλο που συμπεριλαμβάνει την τεστοστερόνη, με

αποτέλεσμα 9% μειωμένη πιθανότητα εμφάνισης καρκίνου του μαστού οποιοδήποτε τύπου (σε

σχέση με το 10.5% της μονοπαραγοντικής ανάλυσης). Στην περίπτωση της διαμεσολάβησης από

την igf-1 είχαμε αύξηση κατά 14% του OR που εκτιμήθηκε, υποδεικνύοντας πως η σχέση

διαμεσολαβείται από την παρουσία αυξημένης igf-1 και μετριασμό του προστατευτικού

αποτελέσματος της WHR (σε 9.2% μειωμένο καρκίνο του μαστού κατά 0.07 αύξηση του WHR,

κρατώντας σταθερή την igf-1). Τέλος, και εδώ τη μεγαλύτερη αύξηση την εμφανίζουν τα λιπίδια,

πιθανά λόγω της στενής συσχέτισης τους με το βιολογικό υπόβαθρο του μεταβολικού

συνδρόμου το οποίο εκκινείται και συντηρείται από την περίσσεια βάρους. Το ποσοστό

μεσολάβησης βρέθηκε ίσο με 49%, και σημαντικός ήταν ο μετριασμός του προστατευικού

αποτελέσματος σε σχέση με το μονοπαραγοντικό μοντέλο, παρότι διατηρήθηκε το

προστατευτικό πρόσημο.

Η σχέση του καρκίνου του μαστού με την τεστοστερόνη έχει μελετηθεί σε μία μελέτη μενδελιανής

τυχαιοποίησης, εκείνη των Ruth et al, με ευρύτερη διάθεση να διερευνηθεί η συσχέτιση σε γυναίκες

και άνδρες της γενετικά καθορισμένης αυξημένης τεστοστερόνης ορού στον κίνδυνο εμφάνισης

νοσηρών οντοτήτων. Εκεί, φάνηκε πως η αυξημένη τεστοστερόνη ορού σχετίζεται με τον κίνδυνο

εμφάνισης ER+ καρκίνων μαστού, αλλά όχι ER (-). Από επιδημιολογικής απόψεως υπάρχουν

μελέτες που αναφέρουν θετική συσχέτιση μεταξύ του καρκίνου του μαστού και της

τεστοστερόνης (Key, 2013, Key, 2015).

Βάση των επιδημιολογικών μελετών που για την ώρα είναι περισσότερες και πιο εκτενείς στη

διερεύνηση της συσχέτισης του καρκίνου του μαστού που συσχετίζεται με την παχυσαρκία

(obesity-realted breast Cancer) από εκείνες της μενδελιανής τυχαιοποίησης, υπάρχουν ενδείξεις

πως οι παράγοντες που μελετήθηκαν συμμετέχουν ως μεσολαβητές σε μοριακό επίπεδο της

καρκινογένεσης του μαστού και μάλιστα πολλοί από αυτούς μπορεί να διαφέρουν στην

91

κατεύθυνση της συσχέτισης ανάλογα με την εμμηνοπαυσιακή κατάσταση της γυναίκας. (Garcia-

Estevez 2021, Lorincz and Sukumar, 2006), ενώ κάποιο από αυτούς, παρότι μέρος του

μεταβολικού συνδρόμου μπορεί να σχετίζονται με τον καρκίνο του μαστού μέσω βιολογικού

μονοπατιού ανεξάρτητου από εκείνου της παχυσαρκίας.

Η αναζήτησή των συσχετίσεων στο Phenoscanner για τις γενετικές μεταβλητές (SNPs) των BMI/

WHR φαινοτύπων, που εντοπίστηκαν ως πιθανές πλειοτροπικές παρατηρήσεις, στη μονο-

παραγοντική μελέτη φαίνεται να συσχετίζονται με αρκετά δευτερογενή φαινοτυπικά

χαρακτηριστικά. Συνίσταται, επομένως η διερεύνηση των αλληλεπιδράσεων αυτών των

παραγόντων προκειμένου να διασαφηνιστεί ο ρόλος τους ως μεσολαβητές, συγχυτικοί

παράγοντες ή παράγοντες κινδύνου στην εμφάνιση του καρκίνου του μαστού.

4.2 Πλεονεκτήματα και Περιορισμοί της μελέτης

Ένα από τα κύρια πλεονεκτήματα της μελέτης μας είναι κατ’ αρχάς η επιλογή της μενδελιανής

τυχαιοποίησης ως μέθοδο ανάλυσης των δεδομένων για την εξαγωγή αιτιακών συμπερασμάτων

στη μελετώμενη σχέση. Στα ad hoc πλεονεκτήματα της μεθόδου περιλαμβάνονται η δυνατότητα

της να μειώνει τα σφάλματα μέτρησης, να αποφεύγει πολλούς συγχυτικούς παράγοντες,

παρόντες στις μελέτες παρατήρησης, και να υποδεικνύει την αιτιότητα (ποσοτικά και ποιοτικά),

όχι μόνο τη συσχέτιση. Όσων αφορά στο θέμα της διερεύνησης της αιτιακής επίδρασης του

φαινοτύπου της παχυσαρκίας στον καρκίνο του μαστού μελετήθηκε τόσο η γενική όσο και η

κεντρική παχυσαρκία προκειμένου να προσεγγιστεί, ει δυνατόν, καλύτερα το διαφορετικό

πρότυπο βιοπαθογένεσης που αυτοί οι δείκτες μπορεί να αντιπροσωπεύουν. Παρότι έχουν

δημοσιευθεί αρκετές μελέτες ήδη αναφορικά με το συγκεκριμένο ερώτημα, εφόσον ο καρκίνος

του μαστού είναι νεοπλασία συχνότατη αλλά και ισχυρά σχετιζόμενη με την παχυσαρκία, η

μελέτη μας, σε σχέση με τις προηγούμενες, είχε το πλεονέκτημα της εξαγωγής πιο αναλυτικών

δεδομένων για τους διάφορους μοριακούς υποτύπους του καρκίνου του μαστού, προσέγγιση

πιο αναλυτική συγκριτικά με την παραδοσιακή κατηγοριοποίηση σε νεοπλασίες ανάλογα της

παρουσίας των υποδοχέων οιστρογόνων - προγεσταγόνων. Αφενός, ως μελέτη μενδελιανής

τυχαιοποίησης δύο δειγμάτων, χρησιμοποιήθηκαν σε όλες τις περιπτώσεις, μη- επικαλυπτόμενα

δείγματα (non-overlapping) του πληθυσμού, όπως φαίνεται από την αναφορά στις

συμμετέχουσες μελέτες στο Κεφάλαιο 2, που ωστόσο προέρχονται από το ίδιο πληθυσμιακό

υπόστρωμα (Ευρωπαίοι). Προκειμένου να τεκμηριωθεί η εγκυρότητα των συμπερασμάτων,

προσπαθήσαμε να τηρήσουμε όλες τις προϋποθέσεις που απαιτεί η μέθοδος της μενδελιανής

τυχαιοποίησης για να είναι έγκυρη και να τις ελέγξουμε ποικιλοτρόπως. Η πρώτη προϋπόθεση

(IV1) , σύμφωνα με την οποία οι γενετικές μεταβλητές οφείλουν να συνδέονται ισχυρά με τους

φαινότυπους-εκθέσεις για τις οποίες συνιστούν βοηθητικές μεταβλητές, ικανοποιήθηκε.

Χρησιμοποιήθηκαν για όλες τις εκθέσεις (πρωτεύουσες και δευτερεύουσες) γενετικές μεταβλητές

που συνδέονται στατιστικά σημαντικά με τον καρκίνο του μαστού στο τυπικό επίπεδο

στατιστικής σημαντικότητας των GWAS. Αναφορικά με τη 2η και 3η προϋπόθεση, σύμφωνα με

τις οποίες οι γενετικές μεταβλητές δε συνδέονται με συγχυτικούς παράγοντες της σχέσης έκθεσης-

έκβασης (IV2), και ότι είναι δεσμευμένα ανεξάρτητες από την έκβαση, δεδομένων της έκθεσης

και όλων των συγχυτικών παραγόντων (IV2), πραγματοποιήσαμε αναζήτηση στο

Phenoscanner, (κυρίως των μεταβλητών που θεωρήθηκαν πιθανά έκτοπες στις αναλύσεις

92

ευαισθησίας), και προσδιορίσαμε πιθανές άλλες δευτερεύουσες συσχετίσεις τους. Από την

αναζήτησης αυτή, εντοπίστηκαν αρκετές αλληλεπιδράσεις και θεωρήθηκε δεδομένο πως για

αρκετές γενετικές μεταβλητές των ΒΜΙ/WHR υπάρχει συσχέτιση με την έκβαση μέσω και άλλου

μονοπατιού (οριζόντια πλειοτροπία). Λαμβάνοντας υπόψιν αυτήν την ετερογένεια,

χρησιμοποιήσαμε ως βασική στατιστική ανάλυση της IVW τυχαίων επιδράσεων, που προσμετρά

παράγοντες αβεβαιότητας στο μοντέλο. Χρησιμοποιήσαμε το στατιστικό Cochrans’ Q για να

ποσοτικοποιήσουμε αυτήν την ετερογένεια, ενώ καθώς αυτή ήταν εν πολλοίς παρούσα στη

μελέτη, πραγματοποιήσαμε στη συνέχεια μια σειρά αναλύσεων ευαισθησίας. Εφαρμόσαμε τις

Weighted Median, MR-Egger, μεθόδους που λαμβάνουν υπόψιν πιθανές υπερβάσεις των

προϋποθέσεων (assumptions) και αξιολογήσαμε μέσω αυτών την ισχύ των μεταβλητών μας και

την εγκυρότητας του ως IVs. Επιπλέον, χρησιμοποιήσαμε το MR pleiotropy residual sum and

outlier test (MR-PRESSO) για να εντοπίσουμε πλειοτροπικές παρατηρήσεις (P-value όριο: 0.05 ).

Εφόσον η μελετώμενη σχέση φάνηκε να είχε πλειοτροπικές συσχετίσεις με την έκβαση,

προχωρήσαμε στην εφαρμογή πολυπαραγοντικής μενδελιανής τυχαιοποιήσης, ως επιπλέον

ανάλυση ευαισθησίας. Η σχέση που επιτρέψαμε στους δευτεροπαθείς φαινοτύπους να έχουν με

την κύρια έκθεση στη σχέση έκθεσης - έκβασης είναι εκείνη της μεσολάβησης. Επομένως,

διερευνήσαμε μια σειρά από διαθέσιμους παράγοντες, δευτεροπαθείς φαινοτύπους, για τους

οποίους υπάρχει το ενεργό ερώτημα για τη συσχέτιση τους με τη μελετώμενη έκβαση, και οι

οποίοι, ενδεχομένως δρουν ως μεσολαβητές στο βιολογικό μονοπάτι. Εφαρμόσαμε την πολυ-

παραγοντική μενδελιανή τυχαιοποίηση σε φαινότυπος που είχαμε σαφή ενδείξεις πως επρόκειτο

για μεσολαβητές (mediators) αυτής της σχέσης, και διενεργήσαμε αξιολόγηση της ισχύoς και

εγκυρότητας των μεταβλητών βάση των στατιστικών Cohcrans’ Q και F -statistic conditional.

Ωστόσο, η μελέτη μας είχε και σημαντικούς περιορισμούς που πρέπει να αναφερθούν. Αρχικά τα

δεδομένα που χρησιμοποιήθηκαν αφορούσαν μετρήσεις από τράπεζες δεδομένων σε μία

στιγμιοτυπική στιγμή στη ζωή του ατόμου ενώ η μενδελιανή τυχαιοποιήση εξ ορισμού διερευνά

την συσσωρευτική αιτιακή επίδραση μακροχρόνιων εκθέσεων ως παράγοντες κινδύνου για την

έκβαση. Επίσης, η χρήση περιληπτικών δεδομένων κατά την ανάλυση δεν επέτρεψε την

πραγματοποίηση στρωματοποιημένης ανάλυσης για ορισμένες μεταβλητές ενδιαφέροντος για τις

οποίες έχει γίνει προσαρμογή των δεδομένων, επομένως δεν μπορούν αφενός να αξιολογηθούν

πλήρως οι συγχυτικοί παράγοντες σε ατομικό επίπεδο, όπως η ηλικία και τα κύρια συστατικά για

τη στρωματοποιήση του πληθυσμού (principal component), ενώ αφετέρου δεν μπορούμε να

εκτιμήσουμε στοιχεία που στις επιδημιολογικές αναλύσεις παρατήρησης φαίνεται να έχουν

βιολογική σημασία, όπως το εμμηνοπαυσιακό στάτους. Ταυτόχρονα, μία εμμένουσα

προβληματική που επιμένει είναι και εκείνη της αδυναμίας να αποδειχθεί η εγκυρότητα και

ισχύς των προϋποθέσεων της Μενδελιανής τυχαιοποίησης. Πρακτικά, πέραν της πρώτης

προϋπόθεσης που έχει πιο σαφή απόδειξη, για τις υπόλοιπες δύο χρησιμοποιούνται έμμεσα

στοιχεία για να τα αξιολογήσουμε, γεγονός που αφήνει πάντα ανοικτό το ενδεχόμενο της

ύπαρξης σφάλματος. Επίσης, η επιλογή των συμμετεχόντων θέτει ορισμένους περιορισμούς.

Αφενός, πρόκειται για γυναίκες μονάχα Ευρωπαϊκής καταγωγής, δεδομένο που περιορίζει τα

συμπεράσματα μας. Απαιτούνται άλλες μελέτες για να διερευνηθεί η δυνατότητα της γενίκευσης

των συμπερασμάτων μας ευρύτερα σε άλλες πληθυσμιακές ομάδες, μιας και όπως διαφάνηκε

στη βιβλιογραφική ανασκόπηση παραπάνω, έχουν παρατηρηθεί διαφορές στην κατεύθυνση της

σχέσης ανάλογα την πληθυσμιακή ομάδα που μελετάται. Αφετέρου, παρότι η ανάλυση μας

αφορούσε αποκλειστικά στο γυναικείο φύλο, για διάφορες δευτερεύουσες εκθέσεις δεν ήταν

δυνατό να βρεθούν δεδομένα αποκλειστικά για τις γυναίκες, με συνέπεια να χρησιμοποιηθούν

μεικτά. Όπως οι έδειξαν οι Gao et al, το 2021, σε μια μελέτη για τα ανθρωπομετρικά

93

χαρακτηριστικά των δύο φύλων σχετικά με τους καρκίνους μαστού και προστάτη, η χρήση

μεικτών δεδομένων μπορεί να οδηγήσει στην επιλογή γενετικών μεταβλητών που δεν είναι

αντιπροσωπευτικές για το κάθε φύλο ξεχωριστά, ειδικά όσων αφορά σε νόσους σχετιζόμενους

με το φύλο (Π.Χ. sex-specific cancers). Μεικτά δεδομένα στη μελέτη μας είχαμε για την ινσουλίνη

νηστείας (fasting Insulin), το Σακχαρώδη Διαβήτη τύπου 2 (T2DM), τα λιπίδια ορού, τη CRP.

Ταυτόχρονα, επιπλέον στη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν κάποιες μεταβλητές προσαρμοσμένες ήδη

για το ΒΜΙ, όπως η WHR, γεγονός καθ’αυτό που μπορεί να εισαγάγει μεροληψία στο δείγμα,

σχόλιο που υπογραμμίζεται επίσης από τον Lawlor , 2016 στο Commentary που δημοσίευσε

πάνω στις “ευκαιρίες και προκλήσεις της μενδελιανής τυχαιοποιήσης” με αφορμή την έρευνα των

Gao et al, 2016 (αναλύεται παραπάνω). Μεροληψία προς τη μηδεμνική υπόθεση μπορεί να

προκύψει και από την κατάρα του νικητή (“Winner’s curse”), δηλαδή την ανάδειξη μη

αντιπροσωπευτικής εκτίμησης που αφορά τον πληθυσμό της μελέτης σε σχέση με το γενικό

πληθυσμό που μελετάται. Το γεγονός αυτό μπορεί να μετριαστεί με τη διαθεσιμότητα

περισσότερων περιληπτικών δεδομένων και την επανάληψη της ανάλυσης έπειτα σε δεδομένα

από κάποιο ανεξάρτητο δείγμα (replication studies ). Τα συμπεράσματα τα οποία εξήχθησαν

στην παρούσα μελέτη θα πρέπει να μελετηθούν με προσοχή, καθώς παρότι υποστηρίζονται από

πολλές προϋπάρχουσες μελέτες στο Α κομμάτι τους, αφενός εμφανίζουν αυξημένη ετερογένεια

και αφετέρου δεν διεξήχθησαν περαιτέρω αναλύσεις ευαισθησίας αναφορικά με το

πολυπαραγοντικό μοντέλο (Β μέρος), όπως η MR-Egger για MVMR. Πραγματοποιήθηκαν επίσης

πολλαπλές συγκρίσεις και ενδεχομένως στο Β Μέρος, ένα μέρος της στατιστικής σημαντικότητας

των συμπερασμάτων να έχει προκύψει από τυχαιότητα. Όπως αναφέρθηκε και παραπάνω, η

μενδελιανή τυχαιοποίηση υπόκειται σε κάποιες ατέλειες εξ ορισμού, όπως η τροχιοδρόμηση

(canalization), κατά την οποία ο οργανισμός θα υιοθετήσει μέσω προσαρμοστικών μεθόδων

διαφορετικό φαινοτυπικό προφίλ από το γενετικά αναμενόμενο, ώστε να υπερκεράσει τυχόν

επιβαρυντικούς φαινότυπους. Ταυτόχρονα, τα εκάστοτε πολιτιστικά πρότυπα συμπεριφορών

επίσης τροχειοδρομούν προς συγκεκριμένες συμπεριφορικές ανακατευθύνσεις τους διάφορους

πληθυσμούς. Συνίσταται η διασταύρωση των αποτελεσμάτων (triangulation) που προκύπτουν

από τη μενδελιανή τυχαιοποίηση μεταξύ άλλων μελετών μενδελιανής τυχαιοποίησης και η

συναξιολόγηση τους με τα συμπεράσματα των επιδημιολογικών μελετών παρατήρησης και των

κλινικών δοκιμών. Στην κατεύθυνση της πολυπαραγοντικής MR επίσης δε διερευνήθηκαν οι

άλλες μορφές συσχέτισης που θα μπορούσαν να εγκύψουν μεταξύ των παραγόντων κινδύνου

(π. χ. Bidirectional MR) είτε πολυπαραγοντικό μοντέλο που να στοχεύει στην εκτίμηση από

κοινού των αιτιακών επιδράσεων κάθε πιθανού παράγοντα κινδύνου υπό την παρουσία των

υπόλοιπων.

4.3 Συμπεράσματα

Στην παρούσα μελέτη, η εφαρμογή της Μενδελιανής τυχαιοποίησης ανέδειξε την αιτιακή

επίδραση της παχυσαρκίας προστατευτικά στον κίνδυνο ανάπτυξης του καρκίνου του μαστού

στις γυναίκες, καθώς και τη διαμεσολάβηση άλλων παραγόντων που συμμετέχουν στο μονοπάτι

αυτής της σχέσης. Ως ο πρώτος σε επίπτωση καρκίνος παγκοσμίως για το 2021, η πρόκληση για

την πρόληψη του συνιστά σημαντικό έρεισμα για τη Δημόσια Υγεία. Τα αντικρουόμενα στοιχεία

της Μενδελιανής τυχαιοποίσης με εκείνα των επιδημιολογικών μελετών παρατήρησης ως προς

το ακριβή ρόλο της παχυσαρκίας σε αυτόν, χρήζουν περαιτέρω διερεύνησης μέσω μελετών σε

ανεξάρτητα δείγματα και σε περισσότερες πληθυσμιακές ομάδες, με αξιοποίηση της ολοένα και

ευρύτερης διαθεσιμότητας των εργαλείων της Μενδελιανής τυχαιοποίησης, έτσι ώστε να

αποσαφηνηστεί ο ρόλος της αλληλεπίδρασης και τα ευρήματα να αποτελέσουν γόνιμο έδαφος

στόχευσης των προληπτικών μέτρων της Δημόσιας Υγείας. Η προσέγγιση αυτού του σύνθετου

94

φαινομένου, όπως ο καρκίνος σχετιζόμενος με την παχυσαρκία, από διάφορα βιολογικά

μονοπάτια συνιστά επίσης ένα ζητούμενο που πιθανός να βοηθήσει στην επίλυση αυτού του

παράδοξου φαινομένου.

95

Περίληψη

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του μαστού είναι ο καρκίνος με τη μεγαλύτερη επίπτωση και θνησιμότητα μεταξύ

των γυναικών στα περισσότερα κράτη παγκοσμίως. Η μετάβαση αυτή αντικατοπτρίζει εξελίξεις

στο πρότυπο ζωής που περιλαμβάνει τους αναγνωρισμένους παράγοντες κινδύνου αυτής της

κακοήθειας, όπως η παχυσαρκία. Η περίσσεια βάρους σήμερα έχει λάβει χαρακτήρα πανδημικής

επέκτασης σε όλο τον πλανήτη. Οι επιδημιολογικές μελέτες επιβεβαιώνουν το παραπάνω εύρημα

αναφορικά με τη συσχέτιση της παχυσαρκίας στον καρκίνο του μαστού, αλλά μονάχα στην

υποκατηγορία του μετεμμηνοπαυσιακού καρκίνου του μαστού. Αντιθέτως, τα αποτελέσματα για

τον καρκίνο στις προεμμηνοπαυσιακές γυναίκες είναι συχνά αντικρουόμενα μεταξύ τους, συχνά

ωστόσο φαίνεται πως η παχυσαρκία έχει προστατευτική δράση. Το εύρημα αυτό συνιστά ένα

παράδοξο και χρήζει περαιτέρω μελέτης.

Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι να ξεπεράσεις τους περιορισμούς που θέτουν a priori οι

επιδημιολογικές μελέτες εφαρμόζοντας τη μέθοδο της Μενδελιανής τυχαιοποίησης. Ο

σκοπός της διακρίνεται στην εξέταση α) του βαθμού που οι μεταβλητές γονοτύπισης για τον

προσδιορισμό της παχυσαρκίας, είτε γενικής (μέσω ΒΜΙ), είτε κεντρικής (μέσω WHR), επιδρούν

αιτιακά στην ανάπτυξη του συνολικού και των υπότυπων του καρκίνου του μαστού στις

γυναίκες και β) κυρίως, στη διασαφήνιση του πολυπαραγοντικού αυτού βιολογικού μηχανισμού

μέσω της συμπερίληψης δευτερευόντων παραγόντων κινδύνου για τον καρκίνο του μαστού και

απόδειξη του μεγέθους που η αρχική αιτιακή επίδραση της παχυσαρκίας διαμεσολαβείται

από εκείνους

Μεθολογία

Εφαρμόστηκε η μέθοδος της Μενδελιανής τυχαιοποίησης δύο δειγμάτων και οι μέθοδοι

ανάλυσης ευαισθησίας για την αξιολόγηση των παραδοχών των βοηθητικών μεταβλητών σε

περιληπτικά δεδομένα. Ανευρέθηκαν 316 SNPs για το ΒΜΙ και 253 για το WHR, ενώ για τις

δευτερογενείς εκθέσεις που μελετήθηκαν ανευρέθηκαν για τη CRP 48, για την ινσουλίνη νηστείας

37, για το Σακχαρώδη Διαβήτη τύπου 2 201, για την Τεστοστερόνη 88, για την iGF-1 200, για τα

Τριγλυκερίδια 54, για την HDL 88, για τη LDL 78. Για τους δευτερογενείς φαινοτύπους, μελετήθηκε

η σχέση μεσολάβησης στην κύρια έκθεση με την έκβαση και έπειτα συμπεριλήφθηκαν σε μοντέλο

πολυπαραγοντικής μενδελιανής τυχαιοποίησης περιληπτικών δεδομένων με έκβαση μονάχα το

συνολικό καρκίνο του μαστού. Τα περιληπτικά δεδομένα για τον καρκίνο του μαστού

αντλήθηκαν από το συνασπισμό BCAC και CIMBA ενώ τα περιληπτικά δεδομένα για τη

συσχέτιση των SNPs με την παχυσαρκία αντλήθηκαν από δημοσιευμένες τη UKBB (για το BMI

και το WHR). Οι GWAS από τις οποίες αντλήθηκαν τα δεδομένα για τη CRP ήταν οι HapMap και

1KG GWAS, για την Ινσουλίνη νηστείας ήταν εκείνη των Chen et al (2021), για το Σακχαρώδη

Διαβήτη 2 εκείνη των Malagan et al (2018), για την IGF-1 και την τεστοστερόνη η UKBB, ενώ για

τα λιπίδια η GWAS των Willer et al (2013).

Αποτελέσματα

Μελετώντας αρχικά τους βασικούς φαινοτύπους σε μονοπαραγοντικά μοντέλα δύο

δειγμάτων προκύπτει πως τόσο για τον ολικό καρκίνο του μαστού, όσο και για τους

υποτύπους του η γενετικά καθορισμένη γενική παχυσαρκία, όπως εκφράζεται από το ΒΜΙ

, είναι προστατευτική στον κίνδυνο εμφάνισής του. Συγκεκριμένα, βάση της κύριας

96

μεθόδου μας IVW προκύπτει πως για κάθε 5 𝑘𝑔/𝑚2 αύξηση του ΒΜΙ έχουμε προστασία ίση

με 11%, OR= 0.89 (CI 95% : 0.83, 0.95). Συμβατές με αυτό το αποτέλεσμα ήταν και οι υπόλοιπες

αναλύσεις ευαισθησίας (MR-Egger, Weighted Median, MR-PRESSO) τόσο για τον ολικό κίνδυν

ο , όσο και για τους υποτύπους του καρκίνου του μαστού, χωρίς ωστόσο τα αποτελέσματα

να είναι στατιστικά σημαντικά πάντοτε. Παρόμοιο αποτέλεσμα σε μέγεθος και πρόσημο

προέκυψε και για την κεντρική παχυσαρκία, όπως εκφράζεται από το WHR, όπου για κάθε

αύξηση 0.07 του λόγου, παρατηρήσαμε OR IVW= 0.89 (CI 95%: 0.83, 0.97) , επομένως

προστατευτική επίδραση επίσης. Συμβατά αποτελέσματα προκύπτουν και για τους

υπόλοιπους υποτύπους για όλες τις αναλύσεις ευαισθησίας. Στη συνέχεια μελετήθηκε η

σχέση των δευτερογενών φαινότυπων με την έκβαση. Από τη μελέτη των πιθανών μεσολαβητών,

αφαιρέθηκαν οι φαινότυποι του Σακχαρώδη Διαβήτη 2 και της ινσουλίνης νηστείας, καθώς

δεν αποδείχθηκε η αιτιακή επίδραση τους στη μελετώμενη έκβαση. Από το

πολυπαραγοντικό μοντέλο για τον καρκίνο του μαστού, προκύπτει πως οι δευτερεύοντες

φαινότυποι των λιπιδίων και της igf-1 μεσολαβούν το 36% και το 4% αντίστοιχα του

προστατευτικού αποτελέσματος του ΒΜΙ, με συνέπεια το άμεσο αποτέλεσμα του ΒΜΙ να εί

ναι λιγότερο προστατευτικό. Αντίστοιχα, στο πολυπαραγοντικό μοντέλο του WHR οι

δευτερεύοντες φαινότυποι των λιπιδίων, της τεστοστερόνης και του igf-1 φαίνεται να

επεξηγούν μέσω μεσολάβησης το 49%, 15% και 13% αντίστοιχα της αρχικής αιτιακής

επίδρασης αντίστοιχα. Η άμεση αιτιακή επίδραση του WHR παραμένει προστατευτική αλλά σε

μικρότερο βαθμό.

Συμπεράσματα

Τα αποτελέσματα της μελέτης φωτίζουν το βιο-παθοφυσιολογικό μονοπάτι μεταξύ

παχυσαρκίας και καρκινογένεσης. Επιβεβαιώνουν ευρήματα προηγούμενων μενδελιανών

μελετών και αντιβαίνουν σε εκείνα πολλών επιδημιολογικών μελετών παρατήρησης. Επιπλέον,

αποδεικνύουν τη σχέση μεσολάβησης των λιπιδίων, του igf-1 και της τεστοστερόνης (για το

WHR) εύρημα που δεν έχει μελετηθεί στο παρελθόν και προσθέτει στην προτεραία γνώση. Η

μελέτη μας διατηρεί τα πλεονεκτήματα της μεθόδου που εφαρμόζει. Οι περιορισμοί τη

ς έγκεινται στην αδυναμία πλήρους απόδειξης της εγκυρότητας των προϋποθέσεων για τ

ις γενετικές μεταβλητές που χρησιμοποιήθηκαν, γεγονός που χαρακτηρίζει όλες τις

μελέτες αυτού του είδους. Περαιτέρω μελέτη και διερεύνηση και άλλων ενδεχόμενων

μεσολαβητών, καθώς και άλλων πολυπαραγοντικων μοντέλων πέραν της μεσολάβησης, κ

ρίνεται σκόπιμη.

97

Summary

Introduction

Breast cancer ranks first amongst other cancers in incidence and mortality internationally

for women, but recently also for both sexes. Advances in lifestyle and behavioral changes

along the globe have played a significant role in that. One of them, particularly widespread,

is weight excess, which during the last 30 years has developed into a pandemic. Post-

menopausal breast cancer is strongly positively linked to obesity in epidemiological

studies, but this is not always the case for premenopausal. The cause of this paradox has

not yet been clarified, so in this study there is the intention of a further understanding of

obesity’s biological path to carcinogenesis via the application of Mendelian randomization

method.

Aim of this study is a) to examine the direction and quantity of the causal effect of

genotyped data for general (expressed in BMI measures) and central obesity (expressed

in WHR measures) to the danger of getting breast cancer (total, and subtypes) b) to

expand the first part by applying multivariable models of this association, in which,

secondary variables are examined as possible mediators for the endpoint of total breast

cancer.

Methodology

We applied the method of two- sample Mendelian randomization, along with sensitivity

analysis for the evaluation of MR assumptions in summary-level data, and multivariable

Mendelian Randomization. We found in total 316 SNPs for BMI, 253 for WHR as our

primary phenotypes and 48 SNPs for CRP, 37 for fasting insulin, 201 for Diabetes Mellitus type

2, 88 for Testosterone, 200 for igf-1, 54 for Triglycerides, 88 for HDL, 78 for LDL, as our secondary

phenotypes. Summary data for breast cancer cases and controls were taken from the BCAC and

CIMBA consortium (133.384 cases and 113.789 controls), while the summary data for the

association with general obesity came from large published GWAS such as UKBB (BMI, WHR, IGF-

1, Testosterone), HapMap and 1KG GWAS for CRP, Chen et al (2021) for FI, Malagan et al (2018)

for T2DM and Willer et al (2013) for lipids.

Results

In our univariate MR models, we concluded that BMI and WHR both have a protective impact in

breast cancer risk. The results remained protective in all sensitivity analysis applied (Weighted

Median, MR-Egger, MR-PRESSO). For 5 𝑘𝑔/𝑚2 increase in BMI, the OR of IVW random effects

was OR= 0.89 (CI 95%: 0.83, 0.95) (11% protective effect), as also, for 0.07 increase in WHR the

OR of IVW random effects was OR IVW=0.89 (CI 95%: 0.83, 0.97). From the secondary phenotypes

investigated, we did not confirm a causal effect for T2DM and FI, thus, these two, were withheld

from further analysis. From the multivariable model for total breast cancer and BMI, lipids and igf-

1 were the main mediators of the association, mediating 38% and 4%, respectively. On the

98

multivariable model, concerning the WHR and its effect on total breast cancer risk, the secondary

phenotypes that were mediating the association were lipids, testosterone, and igf-1, with an effect

of 49%, 15% and 13%, respectively. The direct effect of primary phenotypes remained protective

in both MVMR models, although decreased.

Conclusion

Our study confirms the protective effect of genetic predisposition to obesity in breast cancer risk, a

finding which is in accordance with published mendelian randomization studies. Furthermore, it

adds to previous knowledge the identification of possible mediators of the association, indicating

that lipids, igfd-1 and testosterone (for WHR) play an important role in the carcinogenesis path

caused by obesity. Surpassing the restrictions of classical epidemiology, mendelian randomization

is a promising alternative method that gains recognition and has opened a broader field for study.

Nevertheless, its innate restrictions, as the inability to prove the accuracy and validity of its

assumptions, remain. Future research is needed to fully understand the associations proven here.

99

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

1. Abraham Wald "The Fitting of Straight Lines if Both Variables are Subject to Error," The

Annals of Mathematical Statistics, Ann. Math. Statist. 11(3), 284-300, (September, 1940) 2. Ahmed M, Mulugeta A, Lee SH, Mäkinen VP, Boyle T, Hyppönen E. Adiposity and

cancer: a Mendelian randomization analysis in the UK biobank. Int J Obes (Lond). 2021 Dec;45(12):2657-2665. doi: 10.1038/s41366-021-00942-y. Epub 2021 Aug 27. PMID: 34453097.

3. Allen, Naomi & Sudlow, Cathie & Downey, Paul & Peakman, Tim & Danesh, John & Elliott, Paul & Gallacher, John & Green, Jane & Matthews, Paul & Pell, Jill & Sprosen, Tim & Collins, Rory. (2012). UK Biobank: Current status and what it means for epidemiology. Health Policy and Technology. 1. 123–126. 10.1016/j.hlpt.2012.07.003.

4. Altshuler D, Daly MJ, Lander ES. Genetic mapping in human disease. Science. 2008 Nov 7;322(5903):881-8. doi: 10.1126/science.1156409. PMID: 18988837; PMCID: PMC2694957.

5. Amadou A, Ferrari P, Muwonge R, Moskal A, Biessy C, Romieu I, Hainaut P. Overweight, obesity and risk of premenopausal breast cancer according to ethnicity: a systematic review and dose-response meta-analysis. Obes Rev. 2013 Aug;14(8):665-78. doi: 10.1111/obr.12028. Epub 2013 Apr 25. PMID: 23615120.

6. Andò S, Gelsomino L, Panza S, Giordano C, Bonofiglio D, Barone I, Catalano S. Obesity, Leptin and Breast Cancer: Epidemiological Evidence and Proposed Mechanisms. Cancers (Basel). 2019 Jan 9;11(1):62. doi: 10.3390/cancers11010062. PMID: 30634494; PMCID: PMC6356310.

7. Angrist, Joshua - KRUEGER, A.B. 1990/02/01- The Effect of Age at School Entry on Educational Attainment: An Application of Instrumental Variables with Moments from Two Samples, VL - 87, DO - 10.2307/2290263 Journal of the American Statistical Association

8. Arnold M, Pandeya N, Byrnes G, Renehan PAG, Stevens GA, Ezzati PM, Ferlay J, Miranda JJ, Romieu I, Dikshit R, Forman D, Soerjomataram I. Global burden of cancer attributable to high body-mass index in 2012: a population-based study. Lancet Oncol. 2015 Jan;16(1):36-46. doi: 10.1016/S1470-2045(14)71123-4. Epub 2014 Nov 26. PMID: 25467404; PMCID: PMC4314462.

9. Avgerinos KI, Spyrou N, Mantzoros CS, Dalamaga M. Obesity and cancer risk: Emerging biological mechanisms and perspectives. Metabolism. 2019 Mar;92:121-135. doi: 10.1016/j.metabol.2018.11.001. Epub 2018 Nov 13. PMID: 30445141.

10. Benn M, Tybjærg-Hansen A, Smith GD, Nordestgaard BG. High body mass index and cancer risk-a Mendelian randomisation study. Eur J Epidemiol. 2016 Sep;31(9):879-92. doi: 10.1007/s10654-016-0147-5. Epub 2016 Apr 9. PMID: 27061578.α

11. Blüher M. Obesity: global epidemiology and pathogenesis. Nat Rev Endocrinol. 2019 May;15(5):288-298. doi: 10.1038/s41574-019-0176-8. PMID: 30814686.

12. Bowden J, Davey Smith G, Burgess S. Mendelian randomization with invalid instruments: effect estimation and bias detection through Egger regression. Int J Epidemiol. 2015 Apr;44(2):512-25. doi: 10.1093/ije/dyv080. Epub 2015 Jun 6. PMID: 26050253; PMCID: PMC4469799.

100

13. Bowden J, Del Greco M F, Minelli C, Zhao Q, Lawlor DA, Sheehan NA, Thompson J, Davey Smith G. Improving the accuracy of two-sample summary-data Mendelian randomization: moving beyond the NOME assumption. Int J Epidemiol. 2019 Jun 1;48(3):728-742. doi: 10.1093/ije/dyy258. PMID: 30561657; PMCID: PMC6659376.

14. Bray GA, Kim KK, Wilding JPH; World Obesity Federation. Obesity: a chronic relapsing progressive disease process. A position statement of the World Obesity Federation. Obes Rev. 2017 Jul;18(7):715-723. doi: 10.1111/obr.12551. Epub 2017 May 10. PMID: 28489290.

15. Bulik-Sullivan BK, Loh PR, Finucane HK, Ripke S, Yang J; Schizophrenia Working Group of the Psychiatric Genomics Consortium, Patterson N, Daly MJ, Price AL, Neale BM. LD Score regression distinguishes confounding from polygenicity in genome-wide association studies. Nat Genet. 2015 Mar;47(3):291-5. doi: 10.1038/ng.3211. Epub 2015 Feb 2. PMID: 25642630; PMCID: PMC4495769.

16. Burgess S, Butterworth A, Thompson SG. Mendelian randomization analysis with multiple genetic variants using summarized data. Genet Epidemiol. 2013 Nov;37(7):658-65. doi: 10.1002/gepi.21758. Epub 2013 Sep 20. PMID: 24114802; PMCID: PMC4377079.

17. Burgess S, Davies NM, Thompson SG. Bias due to participant overlap in two-sample Mendelian randomization. Genet Epidemiol. 2016 Nov;40(7):597-608. doi: 10.1002/gepi.21998. Epub 2016 Sep 14. PMID: 27625185; PMCID: PMC5082560.

18. Burgess S, Small DS, Thompson SG. A review of instrumental variable estimators for Mendelian randomization. Statistical Methods in Medical Research. 2017;26(5):2333-2355. doi:10.1177/0962280215597579

19. Burgess S, Thompson SG. Multivariable Mendelian randomization: the use of pleiotropic genetic variants to estimate causal effects. Am J Epidemiol. 2015 Feb 15;181(4):251-60. doi: 10.1093/aje/kwu283. Epub 2015 Jan 27. PMID: 25632051; PMCID: PMC4325677.

20. Burgess S, Thompson SG. Multivariable Mendelian randomization: the use of pleiotropic genetic variants to estimate causal effects. Am J Epidemiol. 2015 Feb 15;181(4):251-60. doi: 10.1093/aje/kwu283. Epub 2015 Jan 27. PMID: 25632051; PMCID: PMC4325677.

21. Burgess Stephen, Simon G. Thompson , Mendelian Randomization, Methods for Causal Inference Using Genetic Variants, Published March 6, 2015 by Chapman and Hall/CRC 224 Pages 22 B/W Illustrations

22. Cao Q, Yu S, Xiong W, Li Y, Li H, Li J, Li F. Waist-hip ratio as a predictor of myocardial infarction risk: A systematic review and meta-analysis. Medicine (Baltimore). 2018 Jul;97(30):e11639. doi: 10.1097/MD.0000000000011639. PMID: 30045310; PMCID: PMC6078643.

23. Chan DSM, Abar L, Cariolou M, Nanu N, Greenwood DC, Bandera EV, McTiernan A, Norat T. World Cancer Research Fund International: Continuous Update Project-systematic literature review and meta-analysis of observational cohort studies on physical activity, sedentary behavior, adiposity, and weight change and breast cancer risk. Cancer Causes Control. 2019 Nov;30(11):1183-1200. doi: 10.1007/s10552-019-01223-w. Epub 2019 Aug 30. PMID: 31471762.

24. Chang SL, Tchernof A, Durocher F, Diorio C. Associations of Biomarkers of Inflammation and Breast Cancer in the Breast Adipose Tissue of Women with Combined Measures of Adiposity. J Obes. 2021 Aug 13;2021:3620147. doi: 10.1155/2021/3620147. PMID: 34426770; PMCID: PMC8380177.

25. Chen GC, Chen SJ, Zhang R, Hidayat K, Qin JB, Zhang YS, Qin LQ. Central obesity and risks of pre- and postmenopausal breast cancer: a dose-response meta-analysis of prospective studies. Obes Rev. 2016 Nov;17(11):1167-1177. doi: 10.1111/obr.12443. Epub 2016 Jul 19. PMID: 27432212.

26. Chen J, Spracklen CN, Marenne G, Varshney A, Corbin LJ, Luan J, Willems SM, Wu Y, Zhang X, Horikoshi M, Boutin TS, Mägi R, Waage J, Li-Gao R, Chan KHK, Yao J, Anasanti MD, Chu AY, Claringbould A, Heikkinen J, Hong J, Hottenga JJ, Huo S, Kaakinen MA, Louie T, März W, Moreno-Macias H, Ndungu A, Nelson SC, Nolte IM, North KE, Raulerson CK, Ray D, Rohde R, Rybin D, Schurmann C, Sim X, Southam L,

101

Stewart ID, Wang CA, Wang Y, Wu P, Zhang W, Ahluwalia TS, Appel EVR, Bielak LF, Brody JA, Burtt NP, Cabrera CP, Cade BE, Chai JF, Chai X, Chang LC, Chen CH, Chen BH, Chitrala KN, Chiu YF, de Haan HG, Delgado GE, Demirkan A, Duan Q, Engmann J, Fatumo SA, Gayán J, Giulianini F, Gong JH, Gustafsson S, Hai Y, Hartwig FP, He J, Heianza Y, Huang T, Huerta-Chagoya A, Hwang MY, Jensen RA, Kawaguchi T, Kentistou KA, Kim YJ, Kleber ME, Kooner IK, Lai S, Lange LA, Langefeld CD, Lauzon M, Li M, Ligthart S, Liu J, Loh M, Long J, Lyssenko V, Mangino M, Marzi C, Montasser ME, Nag A, Nakatochi M, Noce D, Noordam R, Pistis G, Preuss M, Raffield L, Rasmussen-Torvik LJ, Rich SS, Robertson NR, Rueedi R, Ryan K, Sanna S, Saxena R, Schraut KE, Sennblad B, Setoh K, Smith AV, Sparsø T, Strawbridge RJ, Takeuchi F, Tan J, Trompet S, van den Akker E, van der Most PJ, Verweij N, Vogel M, Wang H, Wang C, Wang N, Warren HR, Wen W, Wilsgaard T, Wong A, Wood AR, Xie T, Zafarmand MH, Zhao JH, Zhao W, Amin N, Arzumanyan Z, Astrup A, Bakker SJL, Baldassarre D, Beekman M, Bergman RN, Bertoni A, Blüher M, Bonnycastle LL, Bornstein SR, Bowden DW, Cai Q, Campbell A, Campbell H, Chang YC, de Geus EJC, Dehghan A, Du S, Eiriksdottir G, Farmaki AE, Frånberg M, Fuchsberger C, Gao Y, Gjesing AP, Goel A, Han S, Hartman CA, Herder C, Hicks AA, Hsieh CH, Hsueh WA, Ichihara S, Igase M, Ikram MA, Johnson WC, Jørgensen ME, Joshi PK, Kalyani RR, Kandeel FR, Katsuya T, Khor CC, Kiess W, Kolcic I, Kuulasmaa T, Kuusisto J, Läll K, Lam K, Lawlor DA, Lee NR, Lemaitre RN, Li H; Lifelines Cohort Study, Lin SY, Lindström J, Linneberg A, Liu J, Lorenzo C, Matsubara T, Matsuda F, Mingrone G, Mooijaart S, Moon S, Nabika T, Nadkarni GN, Nadler JL, Nelis M, Neville MJ, Norris JM, Ohyagi Y, Peters A, Peyser PA, Polasek O, Qi Q, Raven D, Reilly DF, Reiner A, Rivideneira F, Roll K, Rudan I, Sabanayagam C, Sandow K, Sattar N, Schürmann A, Shi J, Stringham HM, Taylor KD, Teslovich TM, Thuesen B, Timmers PRHJ, Tremoli E, Tsai MY, Uitterlinden A, van Dam RM, van Heemst D, van Hylckama Vlieg A, van Vliet-Ostaptchouk JV, Vangipurapu J, Vestergaard H, Wang T, Willems van Dijk K, Zemunik T, Abecasis GR, Adair LS, Aguilar-Salinas CA, Alarcón-Riquelme ME, An P, Aviles-Santa L, Becker DM, Beilin LJ, Bergmann S, Bisgaard H, Black C, Boehnke M, Boerwinkle E, Böhm BO, Bønnelykke K, Boomsma DI, Bottinger EP, Buchanan TA, Canouil M, Caulfield MJ, Chambers JC, Chasman DI, Chen YI, Cheng CY, Collins FS, Correa A, Cucca F, de Silva HJ, Dedoussis G, Elmståhl S, Evans MK, Ferrannini E, Ferrucci L, Florez JC, Franks PW, Frayling TM, Froguel P, Gigante B, Goodarzi MO, Gordon-Larsen P, Grallert H, Grarup N, Grimsgaard S, Groop L, Gudnason V, Guo X, Hamsten A, Hansen T, Hayward C, Heckbert SR, Horta BL, Huang W, Ingelsson E, James PS, Jarvelin MR, Jonas JB, Jukema JW, Kaleebu P, Kaplan R, Kardia SLR, Kato N, Keinanen-Kiukaanniemi SM, Kim BJ, Kivimaki M, Koistinen HA, Kooner JS, Körner A, Kovacs P, Kuh D, Kumari M, Kutalik Z, Laakso M, Lakka TA, Launer LJ, Leander K, Li H, Lin X, Lind L, Lindgren C, Liu S, Loos RJF, Magnusson PKE, Mahajan A, Metspalu A, Mook-Kanamori DO, Mori TA, Munroe PB, Njølstad I, O'Connell JR, Oldehinkel AJ, Ong KK, Padmanabhan S, Palmer CNA, Palmer ND, Pedersen O, Pennell CE, Porteous DJ, Pramstaller PP, Province MA, Psaty BM, Qi L, Raffel LJ, Rauramaa R, Redline S, Ridker PM, Rosendaal FR, Saaristo TE, Sandhu M, Saramies J, Schneiderman N, Schwarz P, Scott LJ, Selvin E, Sever P, Shu XO, Slagboom PE, Small KS, Smith BH, Snieder H, Sofer T, Sørensen TIA, Spector TD, Stanton A, Steves CJ, Stumvoll M, Sun L, Tabara Y, Tai ES, Timpson NJ, Tönjes A, Tuomilehto J, Tusie T, Uusitupa M, van der Harst P, van Duijn C, Vitart V, Vollenweider P, Vrijkotte TGM, Wagenknecht LE, Walker M, Wang YX, Wareham NJ, Watanabe RM, Watkins H, Wei WB, Wickremasinghe AR, Willemsen G, Wilson JF, Wong TY, Wu JY, Xiang AH, Yanek LR, Yengo L, Yokota M, Zeggini E, Zheng W, Zonderman AB, Rotter JI, Gloyn AL, McCarthy MI, Dupuis J, Meigs JB, Scott RA, Prokopenko I, Leong A, Liu CT, Parker SCJ, Mohlke KL, Langenberg C, Wheeler E, Morris AP, Barroso I; Meta-Analysis of Glucose and Insulin-related Traits Consortium (MAGIC). The trans-ancestral genomic architecture of glycemic traits. Nat Genet. 2021 Jun;53(6):840-860. doi: 10.1038/s41588-021-00852-9. Epub 2021 May 31. PMID: 34059833; PMCID: PMC7610958.

102

27. Chen MJ, Wu WY, Yen AM, Fann JC, Chen SL, Chiu SY, Chen HH, Chiou ST. Body mass index and breast cancer: analysis of a nation-wide population-based prospective cohort study on 1 393 985 Taiwanese women. Int J Obes (Lond). 2016 Mar;40(3):524-30. doi: 10.1038/ijo.2015.205. Epub 2015 Oct 7. PMID: 26443343; PMCID: PMC4786735.

28. Chen Y, Liu L, Zhou Q, Imam MU, Cai J, Wang Y, Qi M, Sun P, Ping Z, Fu X. Body mass index had different effects on premenopausal and postmenopausal breast cancer risks: a dose-response meta-analysis with 3,318,796 subjects from 31 cohort studies. BMC Public Health. 2017 Dec 8;17(1):936. doi: 10.1186/s12889-017-4953-9. PMID: 29216920; PMCID: PMC5721381.

29. Cheraghi Z, Poorolajal J, Hashem T, Esmailnasab N, Doosti Irani A. Effect of body mass index on breast cancer during premenopausal and postmenopausal periods: a meta-analysis. PLoS One. 2012;7(12):e51446. doi: 10.1371/journal.pone.0051446. Epub 2012 Dec 7. PMID: 23236502; PMCID: PMC3517558.

30. De Pergola G, Silvestris F. Obesity as a major risk factor for cancer. J Obes. 2013;2013:291546. doi: 10.1155/2013/291546. Epub 2013 Aug 29. PMID: 24073332; PMCID: PMC3773450.

31. Deng T, Lyon CJ, Bergin S, Caligiuri MA, Hsueh WA. Obesity, Inflammation, and Cancer. Annu Rev Pathol. 2016 May 23;11:421-49. doi: 10.1146/annurev-pathol-012615-044359. PMID: 27193454.

32. Didelez V, Sheehan N. Mendelian randomization as an instrumental variable approach to causal inference. Stat Methods Med Res. 2007 Aug;16(4):309-30. doi: 10.1177/0962280206077743. PMID: 17715159.

33. Divella R, De Luca R, Abbate I, Naglieri E, Daniele A. Obesity and cancer: the role of adipose tissue and adipo-cytokines-induced chronic inflammation. J Cancer. 2016 Nov 26;7(15):2346-2359. doi: 10.7150/jca.16884. PMID: 27994674; PMCID: PMC5166547.

34. Dowsett M, Folkerd E. Reduced progesterone levels explain the reduced risk of breast cancer in obese premenopausal women: a new hypothesis. Breast Cancer Res Treat. 2015 Jan;149(1):1-4. doi: 10.1007/s10549-014-3211-4. Epub 2014 Nov 21. PMID: 25414027.

35. Eleanor Sanderson, George Davey Smith, Frank Windmeijer, Jack Bowden, An examination of multivariable Mendelian randomization in the single-sample and two-sample summary data settings, International Journal of Epidemiology, Volume 48, Issue 3, June 2019, Pages 713–727, https://doi.org/10.1093/ije/dyy262

36. Endogenous Hormones and Breast Cancer Collaborative Group, Key TJ, Appleby PN, Reeves GK, Roddam AW. Insulin-like growth factor 1 (IGF1), IGF binding protein 3 (IGFBP3), and breast cancer risk: pooled individual data analysis of 17 prospective studies. Lancet Oncol. 2010 Jun;11(6):530-42. doi: 10.1016/S1470-2045(10)70095-4. Epub 2010 May 14. PMID: 20472501; PMCID: PMC3113287.

37. Feng Y, Spezia M, Huang S, Yuan C, Zeng Z, Zhang L, Ji X, Liu W, Huang B, Luo W, Liu B, Lei Y, Du S, Vuppalapati A, Luu HH, Haydon RC, He TC, Ren G. Breast cancer development and progression: Risk factors, cancer stem cells, signaling pathways, genomics, and molecular pathogenesis. Genes Dis. 2018 May 12;5(2):77-106. doi: 10.1016/j.gendis.2018.05.001. PMID: 30258937; PMCID: PMC6147049.

38. Finucane MM, Stevens GA, Cowan MJ, Danaei G, Lin JK, Paciorek CJ, Singh GM, Gutierrez HR, Lu Y, Bahalim AN, Farzadfar F, Riley LM, Ezzati M; Global Burden of Metabolic Risk Factors of Chronic Diseases Collaborating Group (Body Mass Index). National, regional, and global trends in body-mass index since 1980: systematic analysis of health examination surveys and epidemiological studies with 960 country-years and 9·1 million participants. Lancet. 2011 Feb 12;377(9765):557-67. doi: 10.1016/S0140-6736(10)62037-5. Epub 2011 Feb 3. PMID: 21295846; PMCID: PMC4472365.

39. Freuer D, Linseisen J, O'Mara TA, Leitzmann M, Baurecht H, Baumeister SE, Meisinger C. Body Fat Distribution and Risk of Breast, Endometrial, and Ovarian Cancer: A Two-Sample Mendelian Randomization Study. Cancers (Basel). 2021 Oct 9;13(20):5053. doi: 10.3390/cancers13205053. PMID: 34680200; PMCID: PMC8534230.

103

40. Gao C, Patel CJ, Michailidou K, Peters U, Gong J, Schildkraut J, Schumacher FR, Zheng W, Boffetta P, Stucker I, Willett W, Gruber S, Easton DF, Hunter DJ, Sellers TA, Haiman C, Henderson BE, Hung RJ, Amos C, Pierce BL, Lindström S, Kraft P; the Colorectal Transdisciplinary Study (CORECT); Discovery, Biology and Risk of Inherited Variants in Breast Cancer (DRIVE); Elucidating Loci Involved in Prostate Cancer Susceptibility (ELLIPSE); Follow-up of Ovarian Cancer Genetic Association and Interaction Studies (FOCI); and Transdisciplinary Research in Cancer of the Lung (TRICL). Mendelian randomization study of adiposity-related traits and risk of breast, ovarian, prostate, lung and colorectal cancer. Int J Epidemiol. 2016 Jun;45(3):896-908. doi: 10.1093/ije/dyw129. Epub 2016 Jul 17. PMID: 27427428; PMCID: PMC6372135.

41. Gao Y, Zhang J, Zhao H, Guan F, Zeng P. Instrumental Heterogeneity in Sex-Specific Two-Sample Mendelian Randomization: Empirical Results From the Relationship Between Anthropometric Traits and Breast/Prostate Cancer. Front Genet. 2021 Jun 9;12:651332. doi: 10.3389/fgene.2021.651332. PMID: 34178025; PMCID: PMC8220153.

42. García-Estévez L, Cortés J, Pérez S, Calvo I, Gallegos I, Moreno-Bueno G. Obesity and Breast Cancer: A Paradoxical and Controversial Relationship Influenced by Menopausal Status. Front Oncol. 2021 Aug 13;11:705911. doi: 10.3389/fonc.2021.705911. PMID: 34485137; PMCID: PMC8414651.

43. Global Burden of Disease Cancer Collaboration, Fitzmaurice C, Abate D, Abbasi N, Abbastabar H, Abd-Allah F, Abdel-Rahman O, Abdelalim A, Abdoli A, Abdollahpour I, Abdulle ASM, Abebe ND, Abraha HN, Abu-Raddad LJ, Abualhasan A, Adedeji IA, Advani SM, Afarideh M, Afshari M, Aghaali M, Agius D, Agrawal S, Ahmadi A, Ahmadian E, Ahmadpour E, Ahmed MB, Akbari ME, Akinyemiju T, Al-Aly Z, AlAbdulKader AM, Alahdab F, Alam T, Alamene GM, Alemnew BTT, Alene KA, Alinia C, Alipour V, Aljunid SM, Bakeshei FA, Almadi MAH, Almasi-Hashiani A, Alsharif U, Alsowaidi S, Alvis-Guzman N, Amini E, Amini S, Amoako YA, Anbari Z, Anber NH, Andrei CL, Anjomshoa M, Ansari F, Ansariadi A, Appiah SCY, Arab-Zozani M, Arabloo J, Arefi Z, Aremu O, Areri HA, Artaman A, Asayesh H, Asfaw ET, Ashagre AF, Assadi R, Ataeinia B, Atalay HT, Ataro Z, Atique S, Ausloos M, Avila-Burgos L, Avokpaho EFGA, Awasthi A, Awoke N, Ayala Quintanilla BP, Ayanore MA, Ayele HT, Babaee E, Bacha U, Badawi A, Bagherzadeh M, Bagli E, Balakrishnan S, Balouchi A, Bärnighausen TW, Battista RJ, Behzadifar M, Behzadifar M, Bekele BB, Belay YB, Belayneh YM, Berfield KKS, Berhane A, Bernabe E, Beuran M, Bhakta N, Bhattacharyya K, Biadgo B, Bijani A, Bin Sayeed MS, Birungi C, Bisignano C, Bitew H, Bjørge T, Bleyer A, Bogale KA, Bojia HA, Borzì AM, Bosetti C, Bou-Orm IR, Brenner H, Brewer JD, Briko AN, Briko NI, Bustamante-Teixeira MT, Butt ZA, Carreras G, Carrero JJ, Carvalho F, Castro C, Castro F, Catalá-López F, Cerin E, Chaiah Y, Chanie WF, Chattu VK, Chaturvedi P, Chauhan NS, Chehrazi M, Chiang PP, Chichiabellu TY, Chido-Amajuoyi OG, Chimed-Ochir O, Choi JJ, Christopher DJ, Chu DT, Constantin MM, Costa VM, Crocetti E, Crowe CS, Curado MP, Dahlawi SMA, Damiani G, Darwish AH, Daryani A, das Neves J, Demeke FM, Demis AB, Demissie BW, Demoz GT, Denova-Gutiérrez E, Derakhshani A, Deribe KS, Desai R, Desalegn BB, Desta M, Dey S, Dharmaratne SD, Dhimal M, Diaz D, Dinberu MTT, Djalalinia S, Doku DT, Drake TM, Dubey M, Dubljanin E, Duken EE, Ebrahimi H, Effiong A, Eftekhari A, El Sayed I, Zaki MES, El-Jaafary SI, El-Khatib Z, Elemineh DA, Elkout H, Ellenbogen RG, Elsharkawy A, Emamian MH, Endalew DA, Endries AY, Eshrati B, Fadhil I, Fallah Omrani V, Faramarzi M, Farhangi MA, Farioli A, Farzadfar F, Fentahun N, Fernandes E, Feyissa GT, Filip I, Fischer F, Fisher JL, Force LM, Foroutan M, Freitas M, Fukumoto T, Futran ND, Gallus S, Gankpe FG, Gayesa RT, Gebrehiwot TT, Gebremeskel GG, Gedefaw GA, Gelaw BK, Geta B, Getachew S, Gezae KE, Ghafourifard M, Ghajar A, Ghashghaee A, Gholamian A, Gill PS, Ginindza TTG, Girmay A, Gizaw M, Gomez RS, Gopalani SV, Gorini G, Goulart BNG, Grada A, Ribeiro Guerra M, Guimaraes ALS, Gupta PC, Gupta R, Hadkhale K, Haj-Mirzaian A, Haj-Mirzaian A, Hamadeh RR, Hamidi S, Hanfore LK, Haro JM, Hasankhani M, Hasanzadeh A, Hassen HY, Hay RJ, Hay SI, Henok A, Henry NJ, Herteliu C, Hidru HD, Hoang CL, Hole MK, Hoogar P, Horita N, Hosgood HD, Hosseini M, Hosseinzadeh M, Hostiuc M, Hostiuc S,

104

Househ M, Hussen MM, Ileanu B, Ilic MD, Innos K, Irvani SSN, Iseh KR, Islam SMS, Islami F, Jafari Balalami N, Jafarinia M, Jahangiry L, Jahani MA, Jahanmehr N, Jakovljevic M, James SL, Javanbakht M, Jayaraman S, Jee SH, Jenabi E, Jha RP, Jonas JB, Jonnagaddala J, Joo T, Jungari SB, Jürisson M, Kabir A, Kamangar F, Karch A, Karimi N, Karimian A, Kasaeian A, Kasahun GG, Kassa B, Kassa TD, Kassaw MW, Kaul A, Keiyoro PN, Kelbore AG, Kerbo AA, Khader YS, Khalilarjmandi M, Khan EA, Khan G, Khang YH, Khatab K, Khater A, Khayamzadeh M, Khazaee-Pool M, Khazaei S, Khoja AT, Khosravi MH, Khubchandani J, Kianipour N, Kim D, Kim YJ, Kisa A, Kisa S, Kissimova-Skarbek K, Komaki H, Koyanagi A, Krohn KJ, Bicer BK, Kugbey N, Kumar V, Kuupiel D, La Vecchia C, Lad DP, Lake EA, Lakew AM, Lal DK, Lami FH, Lan Q, Lasrado S, Lauriola P, Lazarus JV, Leigh J, Leshargie CT, Liao Y, Limenih MA, Listl S, Lopez AD, Lopukhov PD, Lunevicius R, Madadin M, Magdeldin S, El Razek HMA, Majeed A, Maleki A, Malekzadeh R, Manafi A, Manafi N, Manamo WA, Mansourian M, Mansournia MA, Mantovani LG, Maroufizadeh S, Martini SMS, Mashamba-Thompson TP, Massenburg BB, Maswabi MT, Mathur MR, McAlinden C, McKee M, Meheretu HAA, Mehrotra R, Mehta V, Meier T, Melaku YA, Meles GG, Meles HG, Melese A, Melku M, Memiah PTN, Mendoza W, Menezes RG, Merat S, Meretoja TJ, Mestrovic T, Miazgowski B, Miazgowski T, Mihretie KMM, Miller TR, Mills EJ, Mir SM, Mirzaei H, Mirzaei HR, Mishra R, Moazen B, Mohammad DK, Mohammad KA, Mohammad Y, Darwesh AM, Mohammadbeigi A, Mohammadi H, Mohammadi M, Mohammadian M, Mohammadian-Hafshejani A, Mohammadoo-Khorasani M, Mohammadpourhodki R, Mohammed AS, Mohammed JA, Mohammed S, Mohebi F, Mokdad AH, Monasta L, Moodley Y, Moosazadeh M, Moossavi M, Moradi G, Moradi-Joo M, Moradi-Lakeh M, Moradpour F, Morawska L, Morgado-da-Costa J, Morisaki N, Morrison SD, Mosapour A, Mousavi SM, Muche AA, Muhammed OSS, Musa J, Nabhan AF, Naderi M, Nagarajan AJ, Nagel G, Nahvijou A, Naik G, Najafi F, Naldi L, Nam HS, Nasiri N, Nazari J, Negoi I, Neupane S, Newcomb PA, Nggada HA, Ngunjiri JW, Nguyen CT, Nikniaz L, Ningrum DNA, Nirayo YL, Nixon MR, Nnaji CA, Nojomi M, Nosratnejad S, Shiadeh MN, Obsa MS, Ofori-Asenso R, Ogbo FA, Oh IH, Olagunju AT, Olagunju TO, Oluwasanu MM, Omonisi AE, Onwujekwe OE, Oommen AM, Oren E, Ortega-Altamirano DDV, Ota E, Otstavnov SS, Owolabi MO, P A M, Padubidri JR, Pakhale S, Pakpour AH, Pana A, Park EK, Parsian H, Pashaei T, Patel S, Patil ST, Pennini A, Pereira DM, Piccinelli C, Pillay JD, Pirestani M, Pishgar F, Postma MJ, Pourjafar H, Pourmalek F, Pourshams A, Prakash S, Prasad N, Qorbani M, Rabiee M, Rabiee N, Radfar A, Rafiei A, Rahim F, Rahimi M, Rahman MA, Rajati F, Rana SM, Raoofi S, Rath GK, Rawaf DL, Rawaf S, Reiner RC, Renzaho AMN, Rezaei N, Rezapour A, Ribeiro AI, Ribeiro D, Ronfani L, Roro EM, Roshandel G, Rostami A, Saad RS, Sabbagh P, Sabour S, Saddik B, Safiri S, Sahebkar A, Salahshoor MR, Salehi F, Salem H, Salem MR, Salimzadeh H, Salomon JA, Samy AM, Sanabria J, Santric Milicevic MM, Sartorius B, Sarveazad A, Sathian B, Satpathy M, Savic M, Sawhney M, Sayyah M, Schneider IJC, Schöttker B, Sekerija M, Sepanlou SG, Sepehrimanesh M, Seyedmousavi S, Shaahmadi F, Shabaninejad H, Shahbaz M, Shaikh MA, Shamshirian A, Shamsizadeh M, Sharafi H, Sharafi Z, Sharif M, Sharifi A, Sharifi H, Sharma R, Sheikh A, Shirkoohi R, Shukla SR, Si S, Siabani S, Silva DAS, Silveira DGA, Singh A, Singh JA, Sisay S, Sitas F, Sobngwi E, Soofi M, Soriano JB, Stathopoulou V, Sufiyan MB, Tabarés-Seisdedos R, Tabuchi T, Takahashi K, Tamtaji OR, Tarawneh MR, Tassew SG, Taymoori P, Tehrani-Banihashemi A, Temsah MH, Temsah O, Tesfay BE, Tesfay FH, Teshale MY, Tessema GA, Thapa S, Tlaye KG, Topor-Madry R, Tovani-Palone MR, Traini E, Tran BX, Tran KB, Tsadik AG, Ullah I, Uthman OA, Vacante M, Vaezi M, Varona Pérez P, Veisani Y, Vidale S, Violante FS, Vlassov V, Vollset SE, Vos T, Vosoughi K, Vu GT, Vujcic IS, Wabinga H, Wachamo TM, Wagnew FS, Waheed Y, Weldegebreal F, Weldesamuel GT, Wijeratne T, Wondafrash DZ, Wonde TE, Wondmieneh AB, Workie HM, Yadav R, Yadegar A, Yadollahpour A, Yaseri M, Yazdi-Feyzabadi V, Yeshaneh A, Yimam MA, Yimer EM, Yisma E, Yonemoto N, Younis MZ, Yousefi B, Yousefifard M, Yu C, Zabeh E, Zadnik V, Moghadam TZ, Zaidi Z, Zamani M, Zandian H, Zangeneh A, Zaki L, Zendehdel K, Zenebe ZM, Zewale TA,

105

Ziapour A, Zodpey S, Murray CJL. Global, Regional, and National Cancer Incidence, Mortality, Years of Life Lost, Years Lived With Disability, and Disability-Adjusted Life-Years for 29 Cancer Groups, 1990 to 2017: A Systematic Analysis for the Global Burden of Disease Study. JAMA Oncol. 2019 Dec 1;5(12):1749-1768. doi: 10.1001/jamaoncol.2019.2996. Erratum in: JAMA Oncol. 2020 Mar 1;6(3):444. Erratum in: JAMA Oncol. 2020 May 1;6(5):789. Erratum in: JAMA Oncol. 2021 Mar 1;7(3):466. PMID: 31560378; PMCID: PMC6777271.

44. Global, regional, and national comparative risk assessment of 79 behavioural, environmental and occupational, and metabolic risks or clusters of risks, 1990–2015: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2015, Forouzanfar, Mohammad H et al., The Lancet, Volume 388, Issue 10053, 1659 - 1724

45. Guo Y, Warren Andersen S, Shu XO, Michailidou K, Bolla MK, Wang Q, Garcia-Closas M, Milne RL, Schmidt MK, Chang-Claude J, Dunning A, Bojesen SE, Ahsan H, Aittomäki K, Andrulis IL, Anton-Culver H, Arndt V, Beckmann MW, Beeghly-Fadiel A, Benitez J, Bogdanova NV, Bonanni B, Børresen-Dale AL, Brand J, Brauch H, Brenner H, Brüning T, Burwinkel B, Casey G, Chenevix-Trench G, Couch FJ, Cox A, Cross SS, Czene K, Devilee P, Dörk T, Dumont M, Fasching PA, Figueroa J, Flesch-Janys D, Fletcher O, Flyger H, Fostira F, Gammon M, Giles GG, Guénel P, Haiman CA, Hamann U, Hooning MJ, Hopper JL, Jakubowska A, Jasmine F, Jenkins M, John EM, Johnson N, Jones ME, Kabisch M, Kibriya M, Knight JA, Koppert LB, Kosma VM, Kristensen V, Le Marchand L, Lee E, Li J, Lindblom A, Luben R, Lubinski J, Malone KE, Mannermaa A, Margolin S, Marme F, McLean C, Meijers-Heijboer H, Meindl A, Neuhausen SL, Nevanlinna H, Neven P, Olson JE, Perez JI, Perkins B, Peterlongo P, Phillips KA, Pylkäs K, Rudolph A, Santella R, Sawyer EJ, Schmutzler RK, Seynaeve C, Shah M, Shrubsole MJ, Southey MC, Swerdlow AJ, Toland AE, Tomlinson I, Torres D, Truong T, Ursin G, Van Der Luijt RB, Verhoef S, Whittemore AS, Winqvist R, Zhao H, Zhao S, Hall P, Simard J, Kraft P, Pharoah P, Hunter D, Easton DF, Zheng W. Genetically Predicted Body Mass Index and Breast Cancer Risk: Mendelian Randomization Analyses of Data from 145,000 Women of European Descent. PLoS Med. 2016 Aug 23;13(8):e1002105. doi: 10.1371/journal.pmed.1002105. PMID: 27551723; PMCID: PMC4995025.

46. Harbeck N, Penault-Llorca F, Cortes J, Gnant M, Houssami N, Poortmans P, Ruddy K, Tsang J, Cardoso F. Breast cancer. Nat Rev Dis Primers. 2019 Sep 23;5(1):66. doi: 10.1038/s41572-019-0111-2. PMID: 31548545.

47. Harrison S, Davies AR, Dickson M, Tyrrell J, Green MJ, Katikireddi SV, Campbell D, Munafò M, Dixon P, Jones HE, Rice F, Davies NM, Howe LD. The causal effects of health conditions and risk factors on social and socioeconomic outcomes: Mendelian randomization in UK Biobank. Int J Epidemiol. 2020 Oct 1;49(5):1661-1681. doi: 10.1093/ije/dyaa114. PMID: 32808034; PMCID: PMC7746412.

48. Harvie M, Hooper L, Howell AH. Central obesity and breast cancer risk: a systematic review. Obes Rev. 2003 Aug;4(3):157-73. doi: 10.1046/j.1467-789x.2003.00108.x. PMID: 12916817.

49. Haycock PC, Burgess S, Wade KH, Bowden J, Relton C, Davey Smith G. Best (but oft-forgotten) practices: the design, analysis, and interpretation of Mendelian randomization studies. Am J Clin Nutr. 2016 Apr;103(4):965-78. doi: 10.3945/ajcn.115.118216. PMID: 26961927; PMCID: PMC4807699.

50. Hernandez AV, Guarnizo M, Miranda Y, Pasupuleti V, Deshpande A, et al. (2014) Association between Insulin Resistance and Breast Carcinoma: A Systematic Review and Meta-Analysis. PLOS ONE 9(6): e99317. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0099317

51. Houghton SC, Eliassen H, Tamimi RM, Willett WC, Rosner BA, Hankinson SE. Central Adiposity and Subsequent Risk of Breast Cancer by Menopause Status. J Natl Cancer Inst. 2021 Jul 1;113(7):900-908. doi: 10.1093/jnci/djaa197. PMID: 33367714; PMCID: PMC8491796.

52. Houghton SC, Eliassen H, Tamimi RM, Willett WC, Rosner BA, Hankinson SE. Central Adiposity and Subsequent Risk of Breast Cancer by Menopause Status. J Natl Cancer

106

Inst. 2021 Jul 1;113(7):900-908. doi: 10.1093/jnci/djaa197. PMID: 33367714; PMCID: PMC8491796.

53. https://gco.iarc.fr/today/data/factsheets/populations/908-europe-fact-sheets.pdf 54. Jack Bowden, Fabiola Del Greco M, Cosetta Minelli, Qingyuan Zhao, Debbie A Lawlor,

Nuala A Sheehan, John Thompson, George Davey Smith, Improving the accuracy of two-sample summary-data Mendelian randomization: moving beyond the NOME assumption, International Journal of Epidemiology, Volume 48, Issue 3, June 2019, Pages 728–742, https://doi.org/10.1093/ije/dyy258

55. James R Staley, et al. PhenoScanner: a database of human genotype-phenotype

associations. Bioinformatics 2016; 32(20):3207-3209

56. James WP. WHO recognition of the global obesity epidemic. Int J Obes (Lond). 2008 Dec;32 Suppl 7:S120-6. doi: 10.1038/ijo.2008.247. PMID: 19136980..

57. Johnson AM, Olefsky JM. The origins and drivers of insulin resistance. Cell. 2013 Feb 14;152(4):673-84. doi: 10.1016/j.cell.2013.01.041. PMID: 23415219.

58. Kelesidis I, Kelesidis T, Mantzoros CS. Adiponectin and cancer: a systematic review. Br J Cancer. 2006;94(9):1221-1225. doi:10.1038/sj.bjc.6603051

59. Kershaw EE, Flier JS. Adipose tissue as an endocrine organ. J Clin Endocrinol Metab. 2004 Jun;89(6):2548-56. doi: 10.1210/jc.2004-0395. PMID: 15181022.

60. Keum N, Greenwood DC, Lee DH, Kim R, Aune D, Ju W, Hu FB, Giovannucci EL. Adult weight gain and adiposity-related cancers: a dose-response meta-analysis of prospective observational studies. J Natl Cancer Inst. 2015 Mar 10;107(2):djv088. doi: 10.1093/jnci/djv088. PMID: 25757865.

61. Kuchenbaecker KB, Hopper JL, Barnes DR, Phillips KA, Mooij TM, Roos-Blom MJ, Jervis S, van Leeuwen FE, Milne RL, Andrieu N, Goldgar DE, Terry MB, Rookus MA, Easton DF, Antoniou AC; BRCA1 and BRCA2 Cohort Consortium, McGuffog L, Evans DG, Barrowdale D, Frost D, Adlard J, Ong KR, Izatt L, Tischkowitz M, Eeles R, Davidson R, Hodgson S, Ellis S, Nogues C, Lasset C, Stoppa-Lyonnet D, Fricker JP, Faivre L, Berthet P, Hooning MJ, van der Kolk LE, Kets CM, Adank MA, John EM, Chung WK, Andrulis IL, Southey M, Daly MB, Buys SS, Osorio A, Engel C, Kast K, Schmutzler RK, Caldes T, Jakubowska A, Simard J, Friedlander ML, McLachlan SA, Machackova E, Foretova L, Tan YY, Singer CF, Olah E, Gerdes AM, Arver B, Olsson H. Risks of Breast, Ovarian, and Contralateral Breast Cancer for BRCA1 and BRCA2 Mutation Carriers. JAMA. 2017 Jun 20;317(23):2402-2416. doi: 10.1001/jama.2017.7112. PMID: 28632866.

62. Kyrgiou M, Kalliala I, Markozannes G, Gunter MJ, Paraskevaidis E, Gabra H, Martin-Hirsch P, Tsilidis KK. Adiposity and cancer at major anatomical sites: umbrella review of the literature. BMJ. 2017 Feb 28;356:j477. doi: 10.1136/bmj.j477. PMID: 28246088; PMCID: PMC5421437.

63. Lanari C, Molinolo AA. Progesterone receptors--animal models and cell signalling in breast cancer. Diverse activation pathways for the progesterone receptor: possible implications for breast biology and cancer. Breast Cancer Res. 2002;4(6):240-3. doi: 10.1186/bcr539. Epub 2002 Sep 12. PMID: 12473170; PMCID: PMC137940.

64. Lauby-Secretan B, Scoccianti C, Loomis D, Grosse Y, Bianchini F, Straif K; International Agency for Research on Cancer Handbook Working Group. Body Fatness and Cancer--Viewpoint of the IARC Working Group. N Engl J Med. 2016 Aug 25;375(8):794-8. doi: 10.1056/NEJMsr1606602. PMID: 27557308; PMCID: PMC6754861.

65. Lawlor DA, Harbord RM, Sterne JA, Timpson N, Davey Smith G. Mendelian randomization: using genes as instruments for making causal inferences in epidemiology. Stat Med. 2008 Apr 15;27(8):1133-63. doi: 10.1002/sim.3034. PMID: 17886233.

66. Lawlor DA. Commentary: Two-sample Mendelian randomization: opportunities and

challenges. Int J Epidemiol. 2016;45(3):908-915. doi:10.1093/ije/dyw127 67. Lawlor, D. A., Harbord, R. M., Sterne, J. A. C., Timpson, N. J., & Smith, G. D. (2008).

Mendelian randomization: Using genes as instruments for making causal inferences in epidemiology. Statistics in Medicine, 27(8), 1133-1163. https://doi.org/10.1002/sim.3034

107

68. Ligthart S, Vaez A, Võsa U, Stathopoulou MG, de Vries PS, Prins BP, Van der Most PJ, Tanaka T, Naderi E, Rose LM, Wu Y, Karlsson R, Barbalic M, Lin H, Pool R, Zhu G, Macé A, Sidore C, Trompet S, Mangino M, Sabater-Lleal M, Kemp JP, Abbasi A, Kacprowski T, Verweij N, Smith AV, Huang T, Marzi C, Feitosa MF, Lohman KK, Kleber ME, Milaneschi Y, Mueller C, Huq M, Vlachopoulou E, Lyytikäinen LP, Oldmeadow C, Deelen J, Perola M, Zhao JH, Feenstra B; LifeLines Cohort Study, Amini M; CHARGE Inflammation Working Group, Lahti J, Schraut KE, Fornage M, Suktitipat B, Chen WM, Li X, Nutile T, Malerba G, Luan J, Bak T, Schork N, Del Greco M F, Thiering E, Mahajan A, Marioni RE, Mihailov E, Eriksson J, Ozel AB, Zhang W, Nethander M, Cheng YC, Aslibekyan S, Ang W, Gandin I, Yengo L, Portas L, Kooperberg C, Hofer E, Rajan KB, Schurmann C, den Hollander W, Ahluwalia TS, Zhao J, Draisma HHM, Ford I, Timpson N, Teumer A, Huang H, Wahl S, Liu Y, Huang J, Uh HW, Geller F, Joshi PK, Yanek LR, Trabetti E, Lehne B, Vozzi D, Verbanck M, Biino G, Saba Y, Meulenbelt I, O'Connell JR, Laakso M, Giulianini F, Magnusson PKE, Ballantyne CM, Hottenga JJ, Montgomery GW, Rivadineira F, Rueedi R, Steri M, Herzig KH, Stott DJ, Menni C, Frånberg M, St Pourcain B, Felix SB, Pers TH, Bakker SJL, Kraft P, Peters A, Vaidya D, Delgado G, Smit JH, Großmann V, Sinisalo J, Seppälä I, Williams SR, Holliday EG, Moed M, Langenberg C, Räikkönen K, Ding J, Campbell H, Sale MM, Chen YI, James AL, Ruggiero D, Soranzo N, Hartman CA, Smith EN, Berenson GS, Fuchsberger C, Hernandez D, Tiesler CMT, Giedraitis V, Liewald D, Fischer K, Mellström D, Larsson A, Wang Y, Scott WR, Lorentzon M, Beilby J, Ryan KA, Pennell CE, Vuckovic D, Balkau B, Concas MP, Schmidt R, Mendes de Leon CF, Bottinger EP, Kloppenburg M, Paternoster L, Boehnke M, Musk AW, Willemsen G, Evans DM, Madden PAF, Kähönen M, Kutalik Z, Zoledziewska M, Karhunen V, Kritchevsky SB, Sattar N, Lachance G, Clarke R, Harris TB, Raitakari OT, Attia JR, van Heemst D, Kajantie E, Sorice R, Gambaro G, Scott RA, Hicks AA, Ferrucci L, Standl M, Lindgren CM, Starr JM, Karlsson M, Lind L, Li JZ, Chambers JC, Mori TA, de Geus EJCN, Heath AC, Martin NG, Auvinen J, Buckley BM, de Craen AJM, Waldenberger M, Strauch K, Meitinger T, Scott RJ, McEvoy M, Beekman M, Bombieri C, Ridker PM, Mohlke KL, Pedersen NL, Morrison AC, Boomsma DI, Whitfield JB, Strachan DP, Hofman A, Vollenweider P, Cucca F, Jarvelin MR, Jukema JW, Spector TD, Hamsten A, Zeller T, Uitterlinden AG, Nauck M, Gudnason V, Qi L, Grallert H, Borecki IB, Rotter JI, März W, Wild PS, Lokki ML, Boyle M, Salomaa V, Melbye M, Eriksson JG, Wilson JF, Penninx BWJH, Becker DM, Worrall BB, Gibson G, Krauss RM, Ciullo M, Zaza G, Wareham NJ, Oldehinkel AJ, Palmer LJ, Murray SS, Pramstaller PP, Bandinelli S, Heinrich J, Ingelsson E, Deary IJ, Mägi R, Vandenput L, van der Harst P, Desch KC, Kooner JS, Ohlsson C, Hayward C, Lehtimäki T, Shuldiner AR, Arnett DK, Beilin LJ, Robino A, Froguel P, Pirastu M, Jess T, Koenig W, Loos RJF, Evans DA, Schmidt H, Smith GD, Slagboom PE, Eiriksdottir G, Morris AP, Psaty BM, Tracy RP, Nolte IM, Boerwinkle E, Visvikis-Siest S, Reiner AP, Gross M, Bis JC, Franke L, Franco OH, Benjamin EJ, Chasman DI, Dupuis J, Snieder H, Dehghan A, Alizadeh BZ. Genome Analyses of >200,000 Individuals Identify 58 Loci for Chronic Inflammation and Highlight Pathways that Link Inflammation and Complex Disorders. Am J Hum Genet. 2018 Nov 1;103(5):691-706. doi: 10.1016/j.ajhg.2018.09.009. PMID: 30388399; PMCID: PMC6218410.

69. Liu LY, Wang M, Ma ZB, Yu LX, Zhang Q, Gao DZ, Wang F, Yu ZG. The role of adiponectin in breast cancer: a meta-analysis. PLoS One. 2013 Aug 22;8(8):e73183. doi: 10.1371/journal.pone.0073183. PMID: 23991180; PMCID: PMC3749999.

70. Mahajan A, Taliun D, Thurner M, Robertson NR, Torres JM, Rayner NW, Payne AJ, Steinthorsdottir V, Scott RA, Grarup N, Cook JP, Schmidt EM, Wuttke M, Sarnowski C, Mägi R, Nano J, Gieger C, Trompet S, Lecoeur C, Preuss MH, Prins BP, Guo X, Bielak LF, Below JE, Bowden DW, Chambers JC, Kim YJ, Ng MCY, Petty LE, Sim X, Zhang W, Bennett AJ, Bork-Jensen J, Brummett CM, Canouil M, Ec Kardt KU, Fischer K, Kardia SLR, Kronenberg F, Läll K, Liu CT, Locke AE, Luan J, Ntalla I, Nylander V, Schönherr S, Schurmann C, Yengo L, Bottinger EP, Brandslund I, Christensen C, Dedoussis G, Florez JC, Ford I, Franco OH, Frayling TM, Giedraitis V, Hackinger S, Hattersley AT, Herder C,

108

Ikram MA, Ingelsson M, Jørgensen ME, Jørgensen T, Kriebel J, Kuusisto J, Ligthart S, Lindgren CM, Linneberg A, Lyssenko V, Mamakou V, Meitinger T, Mohlke KL, Morris AD, Nadkarni G, Pankow JS, Peters A, Sattar N, Stančáková A, Strauch K, Taylor KD, Thorand B, Thorleifsson G, Thorsteinsdottir U, Tuomilehto J, Witte DR, Dupuis J, Peyser PA, Zeggini E, Loos RJF, Froguel P, Ingelsson E, Lind L, Groop L, Laakso M, Collins FS, Jukema JW, Palmer CNA, Grallert H, Metspalu A, Dehghan A, Köttgen A, Abecasis GR, Meigs JB, Rotter JI, Marchini J, Pedersen O, Hansen T, Langenberg C, Wareham NJ, Stefansson K, Gloyn AL, Morris AP, Boehnke M, McCarthy MI. Fine-mapping type 2 diabetes loci to single-variant resolution using high-density imputation and islet-specific epigenome maps. Nat Genet. 2018 Nov;50(11):1505-1513. doi: 10.1038/s41588-018-0241-6. Epub 2018 Oct 8. PMID: 30297969; PMCID: PMC6287706.

71. Michels KB, Solomon CG, Hu FB, Rosner BA, Hankinson SE, Colditz GA, Manson JE; Nurses' Health Study. Type 2 diabetes and subsequent incidence of breast cancer in the Nurses' Health Study. Diabetes Care. 2003 Jun;26(6):1752-8. doi: 10.2337/diacare.26.6.1752. PMID: 12766105.

72. Mihir A Kamat, et al. PhenoScanner V2: an expanded tool for searching human

genotype-phenotype associations. Bioinformatics 2019; 35(22):4851-4853

73. Morris AP. Transethnic meta-analysis of genomewide association studies. Genet Epidemiol. 2011;35(8):809-822. doi:10.1002/gepi.20630

74. Munsell MF, Sprague BL, Berry DA, Chisholm G, Trentham-Dietz A. Body mass index and breast cancer risk according to postmenopausal estrogen-progestin use and hormone receptor status. Epidemiol Rev. 2014;36(1):114-36. doi: 10.1093/epirev/mxt010. PMID: 24375928; PMCID: PMC3873844.

75. NCD Risk Factor Collaboration (NCD-RisC). Trends in adult body-mass index in 200 countries from 1975 to 2014: a pooled analysis of 1698 population-based measurement studies with 19·2 million participants. Lancet. 2016 Apr 2;387(10026):1377-1396. doi: 10.1016/S0140-6736(16)30054-X. Erratum in: Lancet. 2016 May 14;387(10032):1998. PMID: 27115820.

76. Nelson HD, Zakher B, Cantor A, Fu R, Griffin J, O'Meara ES, Buist DS, Kerlikowske K, van Ravesteyn NT, Trentham-Dietz A, Mandelblatt JS, Miglioretti DL. Risk factors for breast cancer for women aged 40 to 49 years: a systematic review and meta-analysis. Ann Intern Med. 2012 May 1;156(9):635-48. doi: 10.7326/0003-4819-156-9-201205010-00006. PMID: 22547473; PMCID: PMC3561467.

77. Ni H, Liu H, Gao R (2015) Serum Lipids and Breast Cancer Risk: A Meta-Analysis of Prospective Cohort Studies. PLOS ONE 10(11): e0142669. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0142669

78. Niu J, Jiang L, Guo W, Shao L, Liu Y, et al. (2013) The Association between Leptin Level and Breast Cancer: A Meta-Analysis. PLOS ONE 8(6): e67349. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0067349

79. Ooi BNS, Loh H, Ho PJ, Milne RL, Giles G, Gao C, Kraft P, John EM, Swerdlow A, Brenner H, Wu AH, Haiman C, Evans DG, Zheng W, Fasching PA, Castelao JE, Kwong A, Shen X, Czene K, Hall P, Dunning A, Easton D, Hartman M, Li J. The genetic interplay between body mass index, breast size and breast cancer risk: a Mendelian randomization analysis. Int J Epidemiol. 2019 Jun 1;48(3):781-794. doi: 10.1093/ije/dyz124. PMID: 31243447; PMCID: PMC6659372.

80. Pan WW, Myers MG Jr. Leptin and the maintenance of elevated body weight. Nat Rev Neurosci. 2018 Feb;19(2):95-105. doi: 10.1038/nrn.2017.168. Epub 2018 Jan 11. PMID: 29321684.

81. Petrelli F, Cortellini A, Indini A, et al. Association of Obesity With Survival Outcomes in Patients With Cancer: A Systematic Review and Meta-analysis. JAMA Netw Open. 2021;4(3):e213520. doi:10.1001/jamanetworkopen.2021.3520

82. Picon-Ruiz M, Morata-Tarifa C, Valle-Goffin JJ, Friedman ER, Slingerland JM. Obesity and adverse breast cancer risk and outcome: Mechanistic insights and strategies for

109

intervention. CA Cancer J Clin. 2017 Sep;67(5):378-397. doi: 10.3322/caac.21405. Epub 2017 Aug 1. PMID: 28763097; PMCID: PMC5591063.

83. Poorolajal J, Heidarimoghis F, Karami M, Cheraghi Z, Gohari-Ensaf F, Shahbazi F, Zareie B, Ameri P, Sahraee F. Factors for the Primary Prevention of Breast Cancer: A Meta-Analysis of Prospective Cohort Studies. J Res Health Sci. 2021 Jul 20;21(3):e00520. doi: 10.34172/jrhs.2021.57. PMID: 34698654.

84. Premenopausal Breast Cancer Collaborative Group, Schoemaker MJ, Nichols HB, Wright LB, Brook MN, Jones ME, O'Brien KM, Adami HO, Baglietto L, Bernstein L, Bertrand KA, Boutron-Ruault MC, Braaten T, Chen Y, Connor AE, Dorronsoro M, Dossus L, Eliassen AH, Giles GG, Hankinson SE, Kaaks R, Key TJ, Kirsh VA, Kitahara CM, Koh WP, Larsson SC, Linet MS, Ma H, Masala G, Merritt MA, Milne RL, Overvad K, Ozasa K, Palmer JR, Peeters PH, Riboli E, Rohan TE, Sadakane A, Sund M, Tamimi RM, Trichopoulou A, Ursin G, Vatten L, Visvanathan K, Weiderpass E, Willett WC, Wolk A, Yuan JM, Zeleniuch-Jacquotte A, Sandler DP, Swerdlow AJ. Association of Body Mass Index and Age With Subsequent Breast Cancer Risk in Premenopausal Women. JAMA Oncol. 2018 Nov 1;4(11):e181771. doi: 10.1001/jamaoncol.2018.1771. Epub 2018 Nov 8. PMID: 29931120; PMCID: PMC6248078.

85. Pulit SL, Stoneman C, Morris AP, Wood AR, Glastonbury CA, Tyrrell J, Yengo L, Ferreira T, Marouli E, Ji Y, Yang J, Jones S, Beaumont R, Croteau-Chonka DC, Winkler TW; GIANT Consortium, Hattersley AT, Loos RJF, Hirschhorn JN, Visscher PM, Frayling TM, Yaghootkar H, Lindgren CM. Meta-analysis of genome-wide association studies for body fat distribution in 694 649 individuals of European ancestry. Hum Mol Genet. 2019 Jan 1;28(1):166-174. doi: 10.1093/hmg/ddy327. PMID: 30239722; PMCID: PMC6298238.

86. Qian F, Wang S, Mitchell J, McGuffog L, Barrowdale D, Leslie G, Oosterwijk JC, Chung WK, Evans DG, Engel C, Kast K, Aalfs CM, Adank MA, Adlard J, Agnarsson BA, Aittomäki K, Alducci E, Andrulis IL, Arun BK, Ausems MGEM, Azzollini J, Barouk-Simonet E, Barwell J, Belotti M, Benitez J, Berger A, Borg A, Bradbury AR, Brunet J, Buys SS, Caldes T, Caligo MA, Campbell I, Caputo SM, Chiquette J, Claes KBM, Margriet Collée J, Couch FJ, Coupier I, Daly MB, Davidson R, Diez O, Domchek SM, Donaldson A, Dorfling CM, Eeles R, Feliubadaló L, Foretova L, Fowler J, Friedman E, Frost D, Ganz PA, Garber J, Garcia-Barberan V, Glendon G, Godwin AK, Gómez Garcia EB, Gronwald J, Hahnen E, Hamann U, Henderson A, Hendricks CB, Hopper JL, Hulick PJ, Imyanitov EN, Isaacs C, Izatt L, Izquierdo Á, Jakubowska A, Kaczmarek K, Kang E, Karlan BY, Kets CM, Kim SW, Kim Z, Kwong A, Laitman Y, Lasset C, Hyuk Lee M, Won Lee J, Lee J, Lester J, Lesueur F, Loud JT, Lubinski J, Mebirouk N, Meijers-Heijboer HEJ, Meindl A, Miller A, Montagna M, Mooij TM, Morrison PJ, Mouret-Fourme E, Nathanson KL, Neuhausen SL, Nevanlinna H, Niederacher D, Nielsen FC, Nussbaum RL, Offit K, Olah E, Ong KR, Ottini L, Park SK, Peterlongo P, Pfeiler G, Phelan CM, Poppe B, Pradhan N, Radice P, Ramus SJ, Rantala J, Robson M, Rodriguez GC, Schmutzler RK, Hutten Selkirk CG, Shah PD, Simard J, Singer CF, Sokolowska J, Stoppa-Lyonnet D, Sutter C, Yen Tan Y, Teixeira RM, Teo SH, Terry MB, Thomassen M, Tischkowitz M, Toland AE, Tucker KM, Tung N, van Asperen CJ, van Engelen K, van Rensburg EJ, Wang-Gohrke S, Wappenschmidt B, Weitzel JN, Yannoukakos D; GEMO Study Collaborators; HEBON; EMBRACE, Greene MH, Rookus MA, Easton DF, Chenevix-Trench G, Antoniou AC, Goldgar DE, Olopade OI, Rebbeck TR, Huo D. Height and Body Mass Index as Modifiers of Breast Cancer Risk in BRCA1/2 Mutation Carriers: A Mendelian Randomization Study. J Natl Cancer Inst. 2019 Apr 1;111(4):350-364. doi: 10.1093/jnci/djy132. PMID: 30312457; PMCID: PMC6449171.

87. Quail DF, Dannenberg AJ. The obese adipose tissue microenvironment in cancer development and progression. Nat Rev Endocrinol. 2019 Mar;15(3):139-154. doi: 10.1038/s41574-018-0126-x. PMID: 30459447; PMCID: PMC6374176.

88. Rees JMB, Wood AM, Burgess S. Extending the MR-Egger method for multivariable Mendelian randomization to correct for both measured and unmeasured pleiotropy. Stat Med. 2017 Dec 20;36(29):4705-4718. doi: 10.1002/sim.7492. Epub 2017 Sep 27. PMID: 28960498; PMCID: PMC5725762.

110

89. Reeves GK, Pirie K, Beral V, Green J, Spencer E, Bull D; Million Women Study Collaboration. Cancer incidence and mortality in relation to body mass index in the Million Women Study: cohort study. BMJ. 2007 Dec 1;335(7630):1134. doi: 10.1136/bmj.39367.495995.AE. Epub 2007 Nov 6. PMID: 17986716; PMCID: PMC2099519.

90. Renehan AG, Tyson M, Egger M, Heller RF, Zwahlen M. Body-mass index and incidence of cancer: a systematic review and meta-analysis of prospective observational studies. Lancet. 2008 Feb 16;371(9612):569-78. doi: 10.1016/S0140-6736(08)60269-X. PMID: 18280327.

91. Richardson TG, Sanderson E, Elsworth B, Tilling K, Davey Smith G. Use of genetic variation to separate the effects of early and later life adiposity on disease risk: mendelian randomisation study. BMJ. 2020 May 6;369:m1203. doi: 10.1136/bmj.m1203. PMID: 32376654; PMCID: PMC7201936.

92. Rose DP, Vona-Davis L. Biochemical and molecular mechanisms for the association between obesity, chronic inflammation, and breast cancer. Biofactors. 2014 Jan-Feb;40(1):1-12. doi: 10.1002/biof.1109. Epub 2013 Jul 16. PMID: 23857944.

93. Sánchez-Jiménez F, Pérez-Pérez A, de la Cruz-Merino L, Sánchez-Margalet V. Obesity and Breast Cancer: Role of Leptin. Front Oncol. 2019 Jul 18;9:596. doi: 10.3389/fonc.2019.00596. PMID: 31380268; PMCID: PMC6657346.

94. Sanderson E, Windmeijer F. A weak instrument [Formula: see text]-test in linear IV models with multiple endogenous variables. J Econom. 2016 Feb;190(2):212-221. doi: 10.1016/j.jeconom.2015.06.004. PMID: 29129953; PMCID: PMC5669336.

95. Sanderson E. Multivariable Mendelian Randomization and Mediation. Cold Spring Harb Perspect Med. 2021 Feb 1;11(2):a038984. doi: 10.1101/cshperspect.a038984. PMID: 32341063; PMCID: PMC7849347.

96. Sanderson, Eleanor. (2020). Multivariable Mendelian Randomization and Mediation. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 11. a038984. 10.1101/cshperspect.a038984.

97. Shu X, Wu L, Khankari NK, Shu XO, Wang TJ, Michailidou K, Bolla MK, Wang Q, Dennis J, Milne RL, Schmidt MK, Pharoah PDP, Andrulis IL, Hunter DJ, Simard J, Easton DF, Zheng W; Breast Cancer Association Consortium. Associations of obesity and circulating insulin and glucose with breast cancer risk: a Mendelian randomization analysis. Int J Epidemiol. 2019 Jun 1;48(3):795-806. doi: 10.1093/ije/dyy201. PMID: 30277539; PMCID: PMC6734940.

98. Shungin D, Winkler TW, Croteau-Chonka DC, Ferreira T, Locke AE, Mägi R, Strawbridge RJ, Pers TH, Fischer K, Justice AE, Workalemahu T, Wu JMW, Buchkovich ML, Heard-Costa NL, Roman TS, Drong AW, Song C, Gustafsson S, Day FR, Esko T, Fall T, Kutalik Z, Luan J, Randall JC, Scherag A, Vedantam S, Wood AR, Chen J, Fehrmann R, Karjalainen J, Kahali B, Liu CT, Schmidt EM, Absher D, Amin N, Anderson D, Beekman M, Bragg-Gresham JL, Buyske S, Demirkan A, Ehret GB, Feitosa MF, Goel A, Jackson AU, Johnson T, Kleber ME, Kristiansson K, Mangino M, Leach IM, Medina-Gomez C, Palmer CD, Pasko D, Pechlivanis S, Peters MJ, Prokopenko I, Stančáková A, Sung YJ, Tanaka T, Teumer A, Van Vliet-Ostaptchouk JV, Yengo L, Zhang W, Albrecht E, Ärnlöv J, Arscott GM, Bandinelli S, Barrett A, Bellis C, Bennett AJ, Berne C, Blüher M, Böhringer S, Bonnet F, Böttcher Y, Bruinenberg M, Carba DB, Caspersen IH, Clarke R, Daw EW, Deelen J, Deelman E, Delgado G, Doney AS, Eklund N, Erdos MR, Estrada K, Eury E, Friedrich N, Garcia ME, Giedraitis V, Gigante B, Go AS, Golay A, Grallert H, Grammer TB, Gräßler J, Grewal J, Groves CJ, Haller T, Hallmans G, Hartman CA, Hassinen M, Hayward C, Heikkilä K, Herzig KH, Helmer Q, Hillege HL, Holmen O, Hunt SC, Isaacs A, Ittermann T, James AL, Johansson I, Juliusdottir T, Kalafati IP, Kinnunen L, Koenig W, Kooner IK, Kratzer W, Lamina C, Leander K, Lee NR, Lichtner P, Lind L, Lindström J, Lobbens S, Lorentzon M, Mach F, Magnusson PK, Mahajan A, McArdle WL, Menni C, Merger S, Mihailov E, Milani L, Mills R, Moayyeri A, Monda KL, Mooijaart SP, Mühleisen TW, Mulas A, Müller G, Müller-Nurasyid M, Nagaraja R, Nalls MA, Narisu N, Glorioso N, Nolte IM, Olden M, Rayner NW, Renstrom F, Ried JS, Robertson NR, Rose LM, Sanna S, Scharnagl H, Scholtens S, Sennblad B, Seufferlein T, Sitlani CM, Smith AV, Stirrups

111

K, Stringham HM, Sundström J, Swertz MA, Swift AJ, Syvänen AC, Tayo BO, Thorand B, Thorleifsson G, Tomaschitz A, Troffa C, van Oort FV, Verweij N, Vonk JM, Waite LL, Wennauer R, Wilsgaard T, Wojczynski MK, Wong A, Zhang Q, Zhao JH, Brennan EP, Choi M, Eriksson P, Folkersen L, Franco-Cereceda A, Gharavi AG, Hedman ÅK, Hivert MF, Huang J, Kanoni S, Karpe F, Keildson S, Kiryluk K, Liang L, Lifton RP, Ma B, McKnight AJ, McPherson R, Metspalu A, Min JL, Moffatt MF, Montgomery GW, Murabito JM, Nicholson G, Nyholt DR, Olsson C, Perry JR, Reinmaa E, Salem RM, Sandholm N, Schadt EE, Scott RA, Stolk L, Vallejo EE, Westra HJ, Zondervan KT; ADIPOGen Consortium; CARDIOGRAMplusC4D Consortium; CKDGen Consortium; GEFOS Consortium; GENIE Consortium; GLGC; ICBP; International Endogene Consortium; LifeLines Cohort Study; MAGIC Investigators; MuTHER Consortium; PAGE Consortium; ReproGen Consortium, Amouyel P, Arveiler D, Bakker SJ, Beilby J, Bergman RN, Blangero J, Brown MJ, Burnier M, Campbell H, Chakravarti A, Chines PS, Claudi-Boehm S, Collins FS, Crawford DC, Danesh J, de Faire U, de Geus EJ, Dörr M, Erbel R, Eriksson JG, Farrall M, Ferrannini E, Ferrières J, Forouhi NG, Forrester T, Franco OH, Gansevoort RT, Gieger C, Gudnason V, Haiman CA, Harris TB, Hattersley AT, Heliövaara M, Hicks AA, Hingorani AD, Hoffmann W, Hofman A, Homuth G, Humphries SE, Hyppönen E, Illig T, Jarvelin MR, Johansen B, Jousilahti P, Jula AM, Kaprio J, Kee F, Keinanen-Kiukaanniemi SM, Kooner JS, Kooperberg C, Kovacs P, Kraja AT, Kumari M, Kuulasmaa K, Kuusisto J, Lakka TA, Langenberg C, Le Marchand L, Lehtimäki T, Lyssenko V, Männistö S, Marette A, Matise TC, McKenzie CA, McKnight B, Musk AW, Möhlenkamp S, Morris AD, Nelis M, Ohlsson C, Oldehinkel AJ, Ong KK, Palmer LJ, Penninx BW, Peters A, Pramstaller PP, Raitakari OT, Rankinen T, Rao DC, Rice TK, Ridker PM, Ritchie MD, Rudan I, Salomaa V, Samani NJ, Saramies J, Sarzynski MA, Schwarz PE, Shuldiner AR, Staessen JA, Steinthorsdottir V, Stolk RP, Strauch K, Tönjes A, Tremblay A, Tremoli E, Vohl MC, Völker U, Vollenweider P, Wilson JF, Witteman JC, Adair LS, Bochud M, Boehm BO, Bornstein SR, Bouchard C, Cauchi S, Caulfield MJ, Chambers JC, Chasman DI, Cooper RS, Dedoussis G, Ferrucci L, Froguel P, Grabe HJ, Hamsten A, Hui J, Hveem K, Jöckel KH, Kivimaki M, Kuh D, Laakso M, Liu Y, März W, Munroe PB, Njølstad I, Oostra BA, Palmer CN, Pedersen NL, Perola M, Pérusse L, Peters U, Power C, Quertermous T, Rauramaa R, Rivadeneira F, Saaristo TE, Saleheen D, Sinisalo J, Slagboom PE, Snieder H, Spector TD, Stefansson K, Stumvoll M, Tuomilehto J, Uitterlinden AG, Uusitupa M, van der Harst P, Veronesi G, Walker M, Wareham NJ, Watkins H, Wichmann HE, Abecasis GR, Assimes TL, Berndt SI, Boehnke M, Borecki IB, Deloukas P, Franke L, Frayling TM, Groop LC, Hunter DJ, Kaplan RC, O'Connell JR, Qi L, Schlessinger D, Strachan DP, Thorsteinsdottir U, van Duijn CM, Willer CJ, Visscher PM, Yang J, Hirschhorn JN, Zillikens MC, McCarthy MI, Speliotes EK, North KE, Fox CS, Barroso I, Franks PW, Ingelsson E, Heid IM, Loos RJ, Cupples LA, Morris AP, Lindgren CM, Mohlke KL. New genetic loci link adipose and insulin biology to body fat distribution. Nature. 2015 Feb 12;518(7538):187-196. doi: 10.1038/nature14132. PMID: 25673412; PMCID: PMC4338562.

99. Simpson ER, Brown KA. Minireview: Obesity and breast cancer: a tale of inflammation and dysregulated metabolism. Mol Endocrinol. 2013 May;27(5):715-25. doi: 10.1210/me.2013-1011. Epub 2013 Mar 21. PMID: 23518927; PMCID: PMC5416759.

100. Smith GD, Ebrahim S. 'Mendelian randomization': can genetic epidemiology contribute to understanding environmental determinants of disease? Int J Epidemiol. 2003 Feb;32(1):1-22. doi: 10.1093/ije/dyg070. PMID: 12689998.

101. Stephen Burgess, Simon G Thompson, CRP CHD Genetics Collaboration, Avoiding bias from weak instruments in Mendelian randomization studies, International Journal of Epidemiology, Volume 40, Issue 3, June 2011, Pages 755–764, https://doi.org/10.1093/ije/dyr036

102. Sudlow C, Gallacher J, Allen N, Beral V, Burton P, Danesh J, Downey P, Elliott P, Green J, Landray M, Liu B, Matthews P, Ong G, Pell J, Silman A, Young A, Sprosen T, Peakman T, Collins R. UK biobank: an open access resource for identifying the causes of a wide range of complex diseases of middle and old age. PLoS Med. 2015 Mar

112

31;12(3):e1001779. doi: 10.1371/journal.pmed.1001779. PMID: 25826379; PMCID: PMC4380465.

103. Sung H, Ferlay J, Siegel RL, Laversanne M, Soerjomataram I, Jemal A, Bray F. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwide for 36 Cancers in 185 Countries. CA Cancer J Clin. 2021 May;71(3):209-249.

doi: 10.3322/caac.21660. Epub 2021 Feb 4. PMID: 33538338. 104. Suzuki R, Orsini N, Saji S, Key TJ, Wolk A. Body weight and incidence of breast

cancer defined by estrogen and progesterone receptor status--a meta-analysis. Int J Cancer. 2009 Feb 1;124(3):698-712. doi: 10.1002/ijc.23943. PMID: 18988226.

105. Swinburn BA, Sacks G, Hall KD, McPherson K, Finegood DT, Moodie ML, Gortmaker SL. The global obesity pandemic: shaped by global drivers and local environments. Lancet. 2011 Aug 27;378(9793):804-14. doi: 10.1016/S0140-6736(11)60813-1. PMID: 21872749.

106. Tabár L, Dean PB, Chen TH, Yen AM, Chen SL, Fann JC, Chiu SY, Ku MM, Wu WY, Hsu CY, Chen YC, Beckmann K, Smith RA, Duffy SW. The incidence of fatal breast cancer measures the increased effectiveness of therapy in women participating in mammography screening. Cancer. 2019 Feb 15;125(4):515-523. doi: 10.1002/cncr.31840. Epub 2018 Nov 8. PMID: 30411328; PMCID: PMC6588008.

107. Taylor AE, Davies NM, Ware JJ, VanderWeele T, Smith GD, Munafò MR. Mendelian randomization in health research: using appropriate genetic variants and avoiding biased estimates. Econ Hum Biol. 2014 Mar;13(100):99-106. doi: 10.1016/j.ehb.2013.12.002. Epub 2013 Dec 13. PMID: 24388127; PMCID: PMC3989031.

108. Templeman, N. M., Skovsø, S., Page, M. M., Lim, G. E., & Johnson, J. D. (2017). A causal role for hyperinsulinemia in obesity, Journal of Endocrinology, 232(3), R173-R183. Retrieved Jan 4, 2022, from https://joe.bioscientifica.com/view/journals/joe/232/3/R173.xml

109. Tsilidis K K, Kasimis J C, Lopez D S, Ntzani E E, Ioannidis J P A. Type 2 diabetes

and cancer: umbrella review of meta-analyses of observational studies BMJ 2015; 350

:g7607 doi:10.1136/bmj.g7607 110. van den Brandt PA, Ziegler RG, Wang M, Hou T, Li R, Adami HO, Agnoli C,

Bernstein L, Buring JE, Chen Y, Connor AE, Eliassen AH, Genkinger JM, Gierach G, Giles GG, Goodman GG, Håkansson N, Krogh V, Le Marchand L, Lee IM, Liao LM, Martinez ME, Miller AB, Milne RL, Neuhouser ML, Patel AV, Prizment A, Robien K, Rohan TE, Sawada N, Schouten LJ, Sinha R, Stolzenberg-Solomon RZ, Teras LR, Tsugane S, Visvanathan K, Weiderpass E, White KK, Willett WC, Wolk A, Zeleniuch-Jacquotte A, Smith-Warner SA. Body size and weight change over adulthood and risk of breast cancer by menopausal and hormone receptor status: a pooled analysis of 20 prospective cohort studies. Eur J Epidemiol. 2021 Jan;36(1):37-55. doi: 10.1007/s10654-020-00688-3. Epub 2020 Oct 30. PMID: 33128203; PMCID: PMC7847460.

111. Verbanck M, Chen CY, Neale B, Do R. Detection of widespread horizontal pleiotropy in causal relationships inferred from Mendelian randomization between complex traits and diseases. Nat Genet. 2018 May;50(5):693-698. doi: 10.1038/s41588-018-0099-7. Epub 2018 Apr 23. Erratum in: Nat Genet. 2018 Aug;50(8):1196. PMID: 29686387; PMCID: PMC6083837.

112. Visscher PM, Wray NR, Zhang Q, Sklar P, McCarthy MI, Brown MA, Yang J. 10 Years of GWAS Discovery: Biology, Function, and Translation. Am J Hum Genet. 2017 Jul 6;101(1):5-22. doi: 10.1016/j.ajhg.2017.06.005. PMID: 28686856; PMCID: PMC5501872.

113. Vithayathil M, Carter P, Kar S, Mason AM, Burgess S, Larsson SC. Body size and composition and risk of site-specific cancers in the UK Biobank and large international consortia: A mendelian randomisation study. PLoS Med. 2021 Jul 29;18(7):e1003706. doi: 10.1371/journal.pmed.1003706. PMID: 34324486; PMCID: PMC8320991.

113

114. Voight BF, Kang HM, Ding J, Palmer CD, Sidore C, et al. (2012) The Metabochip, a Custom Genotyping Array for Genetic Studies of Metabolic, Cardiovascular, and Anthropometric Traits. PLOS Genetics 8(8): e1002793. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002793

115. Vrieling A, Buck K, Kaaks R, Chang-Claude J. Adult weight gain in relation to breast cancer risk by estrogen and progesterone receptor status: a meta-analysis. Breast Cancer Res Treat. 2010 Oct;123(3):641-9. doi: 10.1007/s10549-010-1116-4. Epub 2010 Aug 15. PMID: 20711809.

116. Wada K, Nagata C, Tamakoshi A, Matsuo K, Oze I, Wakai K, Tsuji I, Sugawara Y, Mizoue T, Tanaka K, Iwasaki M, Inoue M, Tsugane S, Sasazuki S; Research Group for the Development and Evaluation of Cancer Prevention Strategies in Japan. Body mass index and breast cancer risk in Japan: a pooled analysis of eight population-based cohort studies. Ann Oncol. 2014 Feb;25(2):519-24. doi: 10.1093/annonc/mdt542. Epub 2014 Jan 10. PMID: 24412821.

117. Wang J, Yang DL, Chen ZZ, Gou BF. Associations of body mass index with cancer incidence among populations, genders, and menopausal status: A systematic review and meta-analysis. Cancer Epidemiol. 2016 Jun;42:1-8. doi: 10.1016/j.canep.2016.02.010. Epub 2016 Mar 3. PMID: 26946037.

118. .White AJ, Nichols HB, Bradshaw PT, Sandler DP. Overall and central adiposity and breast cancer risk in the Sister Study. Cancer. 2015 Oct 15;121(20):3700-8. doi: 10.1002/cncr.29552. Epub 2015 Jul 20. PMID: 26193782; PMCID: PMC4592412.

119. WHO/Europe/BMI: https://www.euro.who.int/en/health-topics/disease-prevention/nutrition/a-healthy-lifestyle/body-mass-index-bmi

120. WHO/Europe/WHR: Waist circumference and waist-hip ratio: report of a WHO expert consultation, 2008.

121. Willer CJ, Schmidt EM, Sengupta S, Peloso GM, Gustafsson S, Kanoni S, Ganna A, Chen J, Buchkovich ML, Mora S, Beckmann JS, Bragg-Gresham JL, Chang HY, Demirkan A, Den Hertog HM, Do R, Donnelly LA, Ehret GB, Esko T, Feitosa MF, Ferreira T, Fischer K, Fontanillas P, Fraser RM, Freitag DF, Gurdasani D, Heikkilä K, Hyppönen E, Isaacs A, Jackson AU, Johansson Å, Johnson T, Kaakinen M, Kettunen J, Kleber ME, Li X, Luan J, Lyytikäinen LP, Magnusson PKE, Mangino M, Mihailov E, Montasser ME, Müller-Nurasyid M, Nolte IM, O'Connell JR, Palmer CD, Perola M, Petersen AK, Sanna S, Saxena R, Service SK, Shah S, Shungin D, Sidore C, Song C, Strawbridge RJ, Surakka I, Tanaka T, Teslovich TM, Thorleifsson G, Van den Herik EG, Voight BF, Volcik KA, Waite LL, Wong A, Wu Y, Zhang W, Absher D, Asiki G, Barroso I, Been LF, Bolton JL, Bonnycastle LL, Brambilla P, Burnett MS, Cesana G, Dimitriou M, Doney ASF, Döring A, Elliott P, Epstein SE, Ingi Eyjolfsson G, Gigante B, Goodarzi MO, Grallert H, Gravito ML, Groves CJ, Hallmans G, Hartikainen AL, Hayward C, Hernandez D, Hicks AA, Holm H, Hung YJ, Illig T, Jones MR, Kaleebu P, Kastelein JJP, Khaw KT, Kim E, Klopp N, Komulainen P, Kumari M, Langenberg C, Lehtimäki T, Lin SY, Lindström J, Loos RJF, Mach F, McArdle WL, Meisinger C, Mitchell BD, Müller G, Nagaraja R, Narisu N, Nieminen TVM, Nsubuga RN, Olafsson I, Ong KK, Palotie A, Papamarkou T, Pomilla C, Pouta A, Rader DJ, Reilly MP, Ridker PM, Rivadeneira F, Rudan I, Ruokonen A, Samani N, Scharnagl H, Seeley J, Silander K, Stančáková A, Stirrups K, Swift AJ, Tiret L, Uitterlinden AG, van Pelt LJ, Vedantam S, Wainwright N, Wijmenga C, Wild SH, Willemsen G, Wilsgaard T, Wilson JF, Young EH, Zhao JH, Adair LS, Arveiler D, Assimes TL, Bandinelli S, Bennett F, Bochud M, Boehm BO, Boomsma DI, Borecki IB, Bornstein SR, Bovet P, Burnier M, Campbell H, Chakravarti A, Chambers JC, Chen YI, Collins FS, Cooper RS, Danesh J, Dedoussis G, de Faire U, Feranil AB, Ferrières J, Ferrucci L, Freimer NB, Gieger C, Groop LC, Gudnason V, Gyllensten U, Hamsten A, Harris TB, Hingorani A, Hirschhorn JN, Hofman A, Hovingh GK, Hsiung CA, Humphries SE, Hunt SC, Hveem K, Iribarren C, Järvelin MR, Jula A, Kähönen M, Kaprio J, Kesäniemi A, Kivimaki M, Kooner JS, Koudstaal PJ, Krauss RM, Kuh D, Kuusisto J, Kyvik KO, Laakso M, Lakka TA, Lind L, Lindgren CM, Martin NG, März W, McCarthy MI, McKenzie CA, Meneton P, Metspalu A, Moilanen L, Morris AD, Munroe PB, Njølstad I,

114

Pedersen NL, Power C, Pramstaller PP, Price JF, Psaty BM, Quertermous T, Rauramaa R, Saleheen D, Salomaa V, Sanghera DK, Saramies J, Schwarz PEH, Sheu WH, Shuldiner AR, Siegbahn A, Spector TD, Stefansson K, Strachan DP, Tayo BO, Tremoli E, Tuomilehto J, Uusitupa M, van Duijn CM, Vollenweider P, Wallentin L, Wareham NJ, Whitfield JB, Wolffenbuttel BHR, Ordovas JM, Boerwinkle E, Palmer CNA, Thorsteinsdottir U, Chasman DI, Rotter JI, Franks PW, Ripatti S, Cupples LA, Sandhu MS, Rich SS, Boehnke M, Deloukas P, Kathiresan S, Mohlke KL, Ingelsson E, Abecasis GR; Global Lipids Genetics Consortium. Discovery and refinement of loci associated with lipid levels. Nat Genet. 2013 Nov;45(11):1274-1283. doi: 10.1038/ng.2797. Epub 2013 Oct 6. PMID: 24097068; PMCID: PMC3838666.

122. Yang XR, Chang-Claude J, Goode EL, Couch FJ, Nevanlinna H, Milne RL, Gaudet M, Schmidt MK, Broeks A, Cox A, Fasching PA, Hein R, Spurdle AB, Blows F, Driver K, Flesch-Janys D, Heinz J, Sinn P, Vrieling A, Heikkinen T, Aittomäki K, Heikkilä P, Blomqvist C, Lissowska J, Peplonska B, Chanock S, Figueroa J, Brinton L, Hall P, Czene K, Humphreys K, Darabi H, Liu J, Van 't Veer LJ, van Leeuwen FE, Andrulis IL, Glendon G, Knight JA, Mulligan AM, O'Malley FP, Weerasooriya N, John EM, Beckmann MW, Hartmann A, Weihbrecht SB, Wachter DL, Jud SM, Loehberg CR, Baglietto L, English DR, Giles GG, McLean CA, Severi G, Lambrechts D, Vandorpe T, Weltens C, Paridaens R, Smeets A, Neven P, Wildiers H, Wang X, Olson JE, Cafourek V, Fredericksen Z, Kosel M, Vachon C, Cramp HE, Connley D, Cross SS, Balasubramanian SP, Reed MW, Dörk T, Bremer M, Meyer A, Karstens JH, Ay A, Park-Simon TW, Hillemanns P, Arias Pérez JI, Menéndez Rodríguez P, Zamora P, Benítez J, Ko YD, Fischer HP, Hamann U, Pesch B, Brüning T, Justenhoven C, Brauch H, Eccles DM, Tapper WJ, Gerty SM, Sawyer EJ, Tomlinson IP, Jones A, Kerin M, Miller N, McInerney N, Anton-Culver H, Ziogas A, Shen CY, Hsiung CN, Wu PE, Yang SL, Yu JC, Chen ST, Hsu GC, Haiman CA, Henderson BE, Le Marchand L, Kolonel LN, Lindblom A, Margolin S, Jakubowska A, Lubiński J, Huzarski T, Byrski T, Górski B, Gronwald J, Hooning MJ, Hollestelle A, van den Ouweland AM, Jager A, Kriege M, Tilanus-Linthorst MM, Collée M, Wang-Gohrke S, Pylkäs K, Jukkola-Vuorinen A, Mononen K, Grip M, Hirvikoski P, Winqvist R, Mannermaa A, Kosma VM, Kauppinen J, Kataja V, Auvinen P, Soini Y, Sironen R, Bojesen SE, Ørsted DD, Kaur-Knudsen D, Flyger H, Nordestgaard BG, Holland H, Chenevix-Trench G, Manoukian S, Barile M, Radice P, Hankinson SE, Hunter DJ, Tamimi R, Sangrajrang S, Brennan P, McKay J, Odefrey F, Gaborieau V, Devilee P, Huijts PE, Tollenaar RA, Seynaeve C, Dite GS, Apicella C, Hopper JL, Hammet F, Tsimiklis H, Smith LD, Southey MC, Humphreys MK, Easton D, Pharoah P, Sherman ME, Garcia-Closas M. Associations of breast cancer risk factors with tumor subtypes: a pooled analysis from the Breast Cancer Association Consortium studies. J Natl Cancer Inst. 2011 Feb 2;103(3):250-63. doi: 10.1093/jnci/djq526. Epub 2010 Dec 29. PMID: 21191117; PMCID: PMC3107570.

123. Yu Z, Tang S, Ma H, Duan H, Zeng Y. Association of serum adiponectin with breast cancer: A meta-analysis of 27 case-control studies. Medicine (Baltimore). 2019;98(6):e14359. doi:10.1097/MD.0000000000014359

124. Zhang, H., Ahearn, T.U., Lecarpentier, J. et al. Genome-wide association study identifies 32 novel breast cancer susceptibility loci from overall and subtype-specific analyses. Nat Genet 52, 572–581 (2020). https://doi.org/10.1038/s41588-020-0609-2

125.Βreast Tumours, WHO Classification of Tumours, 5th Edition,Volume2,WHOClassification of Tumours Editorial Board, 2019