Diplomarbeit Sören Werner

Institut für Lebensmittel- und

Bioverfahrenstechnik

Untersuchung von Nährmedien zur Untersuchung von Nährmedien zur biotechnologischen Herstellung des biotechnologischen Herstellung des kommensalen kommensalen Escherichia coli Escherichia coli L2000L2000

Diplomarbeit

Sören Werner

Betreuer: Prof. Dr. rer. nat. habil. Th. BleyProf. Dr.-Ing. D. EiblDr. rer. nat. D. Grimmecke



Untersuchung von Nährmedien zur biotechnologischen Herstellung des kommensalen Escherichia coli L2000Folie 2

Dresden

04/21/23

Sören Werner

EinleitungEinleitung

TheorieTheorie

Material und Material und MethodenMethoden

ErgebnisseErgebnisse

FazitFazit

• Escherichia coli Wildstamm mit weitestgehend unbekannter Physiologie

• Bisher identifizierte Eigenschaften liefern Anhaltspunkte für eine mögliche probiotische Nutzung zur Prävention und Akutbehandlung entzündlicher Darmerkrankungen

• Gestiegene Anzahl antibiotikaresistenter Krankheitserreger stärkt das Marktpotential probiotischer Pharmakons in Human- und Veterinärmedizin

• Zusätzlich sind Nebenwirkungen von Antibiotika unerwünscht

Ziel → Kultivierung des Stammes mit einer hohen Zelldichte und einer Anpassung an das Milieu „Verdauungstrakt“

1 Einleitung




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TheorieTheorie



FazitFazit

Escherischia coli

• Fakultativ anaerobes, gramnegatives, stäbchenförmiges, nichtsporenbildendes und peritrisch begeißeltes Bakterium aus der Familie der Enterobacteriaceae

• Medizinische Mikrobiologie unterscheidet kommensale, nichtpathogene und pathogene Stämme

• Diagnostische Differenzierung beruht auf der serologischen Einteilung von Kauffmann nach O-, H- und K-Antigen

2 Theoretischer Überblick




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TheorieTheorie



FazitFazit

Wachstum von E. coli

• Heterotrophe Mikroorganismen → Energie aus Oxidation energiereicher

organischer Verbindungen

• Bei E. coli Kohlenhydrate, organische Säuren oder Aminosäuren als Energie- und Kohlenstoffquelle

• Ammoniumverbindungen oder Aminosäuren als Stickstoffquelle

• Makroelemente wie Magnesium, Kalium, Eisen und Phosphor essentiell

• Mikroelemente wie Bor, Mangan, Kupfer, Cobalt, Molybdän in spezifischen Funktionen





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TheorieTheorie



FazitFazit

Stressantwort von E. coli

• Allgemeine Stressantwort geregelt durch alternativen -Faktor S→ veränderte RNA-Synthese

• Säurestressantwort durch Bildung biogener Amine aus korrespondierenden Aminosäuren →dadurch Verbrauch eines Wasserstoffions

• Aminosäure/Amin-Paare: Glutaminsäure/-Aminobuttersäure (GABA), Arginin/Agmatin/Putrescin, Ornithin/Putrescin und Lysin/Cadaverin





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TheorieTheorie



FazitFazit

Kultivierungen

• Komplexes Nährmedium (Pepton) anaerob in Schüttelkultur (37 °C, 150 rpm, pH-ungeregelt)

• Komplexes Nährmedium (Pepton, LB) aerob im 15L Bioreaktor von Braun (37 °C, 400-800 rpm, 1-2 vvm, pH 6,8)

• Wachstum, Substratverbrauch und Produktbildung aufgezeichnet

• Bildung biogener Amine als Zeichen der Stressadaption durch HPLC-Analyse ermittelt

→ Physiologie in Bezug auf Stressantwort und Wachstum

• Nach Medienoptimierung Validierung des Mineralmediums durch Versuche in Analogie zu Komplexmedium

3 Material und Methoden




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FazitFazit

Medienoptimierung

• Ableitung chemisch definiertes Mineralmedium aus Erkenntnissen von Wachstumsversuchen und Literaturangaben

• Optimierung in einem Mikrotiterplattenphotometer (Thermo Electron)

• Mineralmedium aus Glucose, Ammoniumchlorid, Phosphatpuffer, Magnesiumsulfat und Spurenelementen





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FazitFazit

Analysen

• Zellzahl und Biotrockenmassekonzentration über Korrelation zur optischen Dichte ermittelt

• Medienbestandteile mit Bioprofile 300 (Nova Biomedical) untersucht

• Konzentration biogener Amine und korrespondierender Aminosäuren mittels HPLC (Dionex) bestimmt





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FazitFazit

Komplexmedium anaerob

• Wachstum bis zu einer Zelldichte von 0,35 g·L-1

• pH-Wert sinkt auf 4,0

• Glucoseverbrauch von insgesamt 2,5 g·L-1 (teils auch nach Wachstumsstop)

→ Metabolismusaktivität

• Acetat- und Ethanolausschüttung (1,3 g·L-1 bzw. 0,35 g·L-1) auch nach Wachstumsstop

• Aminausschüttung equimolar und zeitgleich zu Aufnahme von Aminosäuren als Zeichen der Säurestressantwort

4 Ergebnisse




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FazitFazit

Komplexmedium aerob

• Wachstum bis zu einer Zelldichte von 2,5 g·L-1

• pH-Wert geregelt (pH 6,8)

• Hohe Acetatausschüttung (1,3 g·L-1) trotz ausreichender Sauerstoffsättigung aufgrund hoher Glucosekonzentration (36 g·L-1)

• Ausschüttung von Cadaverin und Putrescin trotz physiologischem pH-Wert

• Keine Bildung von -Aminobuttersäure und Agmatin

4 Ergebnisse




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FazitFazit

Medienentwicklung und -optimierung

• pH-Wert ungeregelt

• optimales Wachstum bei Glucosekonzentration von 7,2 g·L-1

• Ammoniumchlorid als bevorzugte Stickstoffquelle

• Aminosäuren mit teils negativen Auswirkungen

• Zugabe von Vitaminen nahezu ohne Einfluss auf Wachstum

4 Ergebnisse




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FazitFazit

Mineralmedium anaerob

• Wachstum bis zu einer Zelldichte von ca. 0,15 g·L-1

• pH-Wert sinkt auf 4,0

• Keine Stressantwort in Form von biogenen Aminen nachweisbar

→ unbekannte Cofaktoren müssen analysiert werden

4 Ergebnisse




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TheorieTheorie



FazitFazit

4 Ergebnisse

Mineralmedium aerob

• Wachstum bis zu einer Zelldichte von 5 g·L-1


• Kaum Acetatausschüttung

• Vollständiger Verbrauch von Glucose (7,2 g·L-1)

• Parameter: µmax=0,79 h-1 , YX/Gluc=0,76 g·g-1, KGluc=0,003 g·L-1, YX/NH4+=0,13

g·mmol-1




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FazitFazit

Aerobe fed-batch-Strategie

• Wachstum bis zu einer Zelldichte von 60 g·L-1


• Acetatausschüttung bei Limitierung durch Sulfatmangel (Stunde 18)

• Ausschüttung von Cadaverin, Putrescin und -Aminobuttersäure trotz physiologischem pH-Wert

→ teilweise konstitutive Bildung

• Weitere Parameter: YX/PO43+=3,55 g·mmol-1, YX/SO4

2+=14 g·mmol-1

4 Ergebnisse




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TheorieTheorie



FazitFazit

5 Fazit

Zusammenfassung

• Ausgeprägte Stressantwort durch Biosynthese biogener Amine im Komplexmedium unter anaeroben, nicht pH-geregelten Bedingungen

• Aufnahme von Aminosäure und Export der korrespondierenden Amine nahezu equimolar und zeitgleich

• Unter aeroben, pH-konstanten Bedingungen keine Beziehung

• Medienoptimierung im Mikrotiterplattenphotometer ist ressourcenschonend

• Optimale Glucosekonzentration 7,2 g·L-1

• Mineralmedium mit gutem aerobem Wachstum

• Säurestressantwort auch bei Zugabe der benötigten Precursoren kaum vorhanden

• Bei höheren Zelldichten (fed-batch bis 60 g·L-1) unter pH-konstanten Bedingungen Bildung von Aminen

→ teils konstitutiver Charakter




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Sören Werner


TheorieTheorie



FazitFazit

Ausblick

• Säurestressantwort im Mineralmedium

• Assay zur Bestimmung der allgemeinen Stressantwort (s)

• Vitalitätsbestimmung

• Verbesserte Prozessführung mit online-Messung

5 Fazit




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TheorieTheorie



FazitFazit

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