DIPARTIMENTO DI CHIMICA “G. CIAMICIAN” – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Next topics…. Next topics…. Orario data n° ore LC-MS – Prof. Zattoni 11-12 12-11 1 Introduzione alla proteomica Approcci analitici all’analisi di macromolecole biologiche. Progetti “-omics” Obiettivi dell’indagine proteomica. Proteomica sistematica, funzionale, differenziale. 11-13 16-11 2 Spettrometria di massa per l’analisi di proteine Analizzatori di massa a quadrupolo, a tempo di volo, a trasformata di Fourier. Principi di doppia spettrometria di massa: modalità di acquisizione del segnale e modalità di scansione. Spettrometri di massa ibridi. Scelta della tecnica di ionizzazione e dell’analizzatore di massa. Considerazioni sulla risoluzione dello spettrometro: massa monoisotopica e massa media. 11-13 18-11 2 Approcci separativi multidimensionali Accoppiamento tra tecniche separative. Tecniche ortogonali, tecniche “in tandem”, “hyphenation”. Approcci all’analisi proteomica: Approcci top-down, bottom-up, shotgun. Frammentazione dei peptidi. Digestione enzimatica. Interpretazione dello spettro di massa di peptidi. 11-12 19-11 1 Strategie di indagine proteomica Approcci gel-based e gel-free. 2D PAGE MS/MS. 2D LC MS/MS. Sequenziamento “de novo” e identificazione da banca dati. 11-13 23-11 2 Accoppiamento della MS con tecniche separative multidimensionali per la proteomica. Approcci gel-based e gel- free. 2D PAGE MS/MS. 2D LC MS/MS. Sequenziamento “de novo” e identificazione da banca dati. Totale ore 8
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DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Next topics…. Orariodatan° ore LC-MS – Prof. Zattoni 11-1212-111 Introduzione alla.
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11-13 16-11 2 Spettrometria di massa per l’analisi di proteineAnalizzatori di massa a quadrupolo, a tempo di volo, a trasformata di Fourier. Principi di doppia spettrometria di massa: modalità di acquisizione del segnale e modalità di scansione. Spettrometri di massa ibridi. Scelta della tecnica di ionizzazione e dell’analizzatore di massa. Considerazioni sulla risoluzione dello spettrometro: massa monoisotopica e massa media.
11-13 18-11 2 Approcci separativi multidimensionali Accoppiamento tra tecniche separative. Tecniche ortogonali, tecniche “in tandem”, “hyphenation”.Approcci all’analisi proteomica: Approcci top-down, bottom-up, shotgun. Frammentazione dei peptidi. Digestione enzimatica. Interpretazione dello spettro di massa di peptidi.
11-12 19-11 1 Strategie di indagine proteomicaApprocci gel-based e gel-free. 2D PAGE MS/MS. 2D LC MS/MS. Sequenziamento “de novo” e identificazione da banca dati.
11-13 23-11 2 Accoppiamento della MS con tecniche separative multidimensionali per la proteomica. Approcci gel-based e gel-free. 2D PAGE MS/MS. 2D LC MS/MS. Sequenziamento “de novo” e identificazione da banca dati.
Totale ore 8
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Analisi di macromolecole biologicheAnalisi di macromolecole biologiche
Classi di macromolecole biologicheClassi di macromolecole biologiche
(rimozione di interferenti, separazione degli analiti)
Tecniche di caratterizzazione(identificazione e
quantificazione degli analiti)
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Tecniche separativeTecniche separative• HPLC, SEC, CZE, elettroforesi su gel.
• Approcci multidimensionali con tecniche ortogonali o “in tandem”
Tecniche MSTecniche MS• Sorgenti: a bassa frammentazione ESI, MALDI• Analizzatori: adatti all’analisi di valori m/z elevati (TOF, quadrupolo (con ESI), FT ICR.• Spettrometria di massa tandem con analizzatori ibridi
Tecniche analiticheTecniche analitiche
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I progetti -OMICII progetti -OMICI
GenomaGenomaIdentificare tutta la serie di ordini che il codice genetico può impartire ad una cellula, per comprendere e prevenire situazioni patologiche
TrascrittomaTrascrittomaIdentificare e quantificare tutta la serie di ordini che il genoma impartisce effettivamente alla cellula, per comprendere ed eventualmente correggere le modalità di regolazione genica
ProteomaProteomaCaratterizzare e quantificare il contenuto proteico di un sistema cellulare, mediante la determinazione di profili di espressione differenziati nel tempo e nello spazio, comprensivi delle informazioni sulle interazioni molecolari
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Ruolo della MS in proteomicaRuolo della MS in proteomica
Proteomica sistematicaProteomica sistematicaIdentificazione e sequenziamento di tutte le proteine contenute in un tessuto. (analisi di miscele di peptidi e proteine intere)
Proteomica strutturale (o differenziale)Proteomica strutturale (o differenziale)Studio delle differenze di espressione (qualitative o quantitative) rilevabili nel proteoma al variare delle condizioni del tessuto (es. cellula sana vs. cellula malata (determinazione di mutazioni nella sequenza, modifiche post-traduzionali, modifiche conformazionali, sovra o sottoespressione)
Proteomica funzionaleProteomica funzionaleStudio della funzione biologica delle proteine e delle loro interazioni con proteine e peptidi (Separazione in condizioni non denaturanti e caratterizzazione allo stato nativo)
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Proteomica sistematicaProteomica sistematica
Cellule, fluidi biologici
Lisi, 2D-Gel
Sequenziamento eidentificazione (anche per confronto con il genoma)
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Proteomica differenzialeProteomica differenziale
Cellule patogene, trattate, ecc…
Cellule sane, non trattate, ecc…
Lisi, 2D-Gel
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Proteomica funzionaleProteomica funzionale
Interazioni Proteina-Peptide
Legame covalente irreversibile
Legame covalente reversibile
Variazione del peso molecolare
Nessuna variazione del peso molecolare
Variazioni della conformazione Nessuna interazione
Interazioni non covalenti
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Schema di uno spettrometro di massaSchema di uno spettrometro di massa
Sistema diintroduzione
Sorgentedi ioni
Analizzatoredi massa
Sistema di vuoto
Rivelatore
SegnaleComputer
Campione
10-5-10-8 torrCampione Ioni Ioni
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Criteri per la scelta della sorgenteCriteri per la scelta della sorgente
Caratteristiche del campioneCaratteristiche del campioneStato di aggregazione: solido, liquido.Metodo di introduzione: in flusso/discontinuo.Dimensione del campioneConcentrazione dell’analita nel campione
Caratteristiche dell’analitaCaratteristiche dell’analitaPeso molecolareComplessità della molecolaPolarità (ionizzabilità)
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Sorgenti ioniche a pressione atmosfericaSorgenti ioniche a pressione atmosferica
Stato del campione Sorgente a flusso
Liquido Elettrospray (ESI) – nanospray
APCI (atmospheric pressure chemical ionization)
APPI (atmospheric pressure photoionization)
LC: flussi ~ 0.1 – 1 cm3 min-1.
Se l’eluente è acqua, 0.1 cm3 min-1 = 5.6 mmol min-1 = 135 cm3 min-1 (c.n.)
Nano-HPLC: flussi ~ 10-4 cm3 min-1 0.1 cm3 min (c.n.)
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Classificazione delle sorgenti ionicheClassificazione delle sorgenti ioniche
Applicabilità delle sorgenti a pressione atmosfericaApplicabilità delle sorgenti a pressione atmosferica
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ESI vs APCI - SensibilitàESI vs APCI - Sensibilità
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Flusso (µL/min)
La ESI è sensibile alla concentrazione dell’analita, la APCI alla sua quantità assoluta. Per questo la ESI si presta ad essere accoppiata alla micro e nano HPLC per applicazioni in cui il campione sia disponibile in quantità molto ridotte.
L’applicazione di un potenziale elettrico ad alto voltaggio ad una goccia di liquido ne provoca la frammentazione in goccioline fini. La causa e’ la repulsione elettrostatica tra le cariche che si generano nella goccia.
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Sistema di nebulizzazione elettrospraySistema di nebulizzazione elettrospray
Cono diTaylor
Punta dell’ago
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Sistema di desolvatazione per elettrospraySistema di desolvatazione per elettrospray
Campione
Liquido ditrasporto
Gas ditrasporto
Cono di Taylor
Capillare riscaldato
Gas didesolvatazione
2-6 kV+ -
Gocce dicirca 1 µm
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Meccanismo di deplezione degli ioniMeccanismo di deplezione degli ioni
Soluzione del campione
4000 V
Pressione atmosferica
Calore o gassecco
Il calore e/o il gas secco causano lariduzione delle dimensioni delle gocce
Vapori del solvente
Spettrometro di massa Livelli successivi di vuoto(2 torr – 0.1 torr – 0.01 torr)
Limite di Rayleigh:Limite di dimensioni della al quale si prevede la frammentazione della goccia.
Esplosione Coulombiana
q2 = 8π2ε0γd3
q = carica totale della goccia ε0 = permittività elettrica del mezzo γ = tensione superficiale della goccia d = diametro della goccia
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L’elettrospray genera spettri multicaricaL’elettrospray genera spettri multicarica
m/z
La carica degli ioni è dovuta agli ioni metallici (es Na+) o ai protoni associati alla molecola. Gli addotti carichi sono quindi della forma:
(M + H)+, (M + 2H)2+, …, (M + nH)n+
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MALDI: vantaggi e limitazioniMALDI: vantaggi e limitazioni
Sorgente a flusso sensibile alla concentrazione, ideale per l’accoppiamento online con tecniche separative miniaturizzate e per l’analisi quantitativa
Ionizzazione soft (nessuna frammentazione) di molecole polari ad alto peso molecolare.
= Produce spettri multicarica
La ionizzazione è un processo competitivo, per cui la simultanea presenza di più analiti o di sali può dare luogo ad interferenze.
La complessità degli spettri multicarica limita l’interpretazione degli spettri ottenuti da miscele complesse
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Sorgenti ioniche a desorbimentoSorgenti ioniche a desorbimento
• L’analita viene codepositato su un bersaglio con una matrice, scelta per favorire la vaporizzazione dell’analita.
• Caratteristiche della matrice:– Elevata assorbività alla lunghezza d’onda del
laser.– Massa molare abbastanza bassa da sublimare
facilmente.– Bassa reattività chimica.– Stabilità al vuoto.
• Le matrici più utilizzate sono acidi aromatici
Desorbimento/ionizzazione laser assistiti da matrice Desorbimento/ionizzazione laser assistiti da matrice (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization, MALDI)(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization, MALDI)
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Il processo MALDIIl processo MALDI
Il bersaglio viene colpito da un impulso laser che viene assorbito dalla matrice e provoca la formazione di un plasma contenente gli atomi dell’analita ed atomi e ioni della matrice.
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MALDI-TOF MSMALDI-TOF MS
Range di massa fino a 106 Analizzatore a tempo di volo.
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Lo spettro di massaLo spettro di massa
Spettro di massa di ioni monocarica (MALDI/TOFMS)Spettro di massa di ioni monocarica (MALDI/TOFMS)
Spettro di massa del batterio intero Escherichia coli
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MALDI: vantaggi e limitazioniMALDI: vantaggi e limitazioni
Poco sensibile alle contaminazioni (sali, tamponi, detergenti ecc.) Solitamente non richiede complessi passaggi di purificazione del campione.
Può analizzare velocemente miscele complesse di analiti (lo spettro è facile da interpretare)
= Non è una sorgente a flusso
La ionizzazione è un processo competitivo, per cui la simultanea presenza di più analiti può dare luogo ad interferenze.
L’analisi quantitativa è limitata dalla ridotta omogeneità del campione.
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Schema di uno spettrometro di massaSchema di uno spettrometro di massa
Sistema diintroduzione
Sorgentedi ioni
AnalizzatoreAnalizzatoredi massadi massa
Sistema di vuoto
Rivelatore
SegnaleComputer
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10-5-10-8 torrCampione(gassoso) Ioni Ioni
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RisoluzioneRisoluzione
La capacità di uno spettrometro di massa di differenziare le masse è generalmente espressa dalla risoluzione R definita come:
R = m/Δm
dove Δm è la differenza di massa tra due picchi adiacenti risolti e m è la massa nominale del primo picco (o la media delle masse dei due picchi). Due picchi sono considerati separati se l’altezza della valle tra di essi è inferiore ad una certa percentuale della loro altezza (di solito il 10%).
Uno spettrometro con una risoluzione di 4 000 risolverà due picchi con valori di m/z 400,0 e 400,1 (o di 40,00 e 40,01).
Gli spettrometri commerciali hanno R che variano circa tra 500 e 500 000.
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RisoluzioneRisoluzione
Picchi risolti al 10% della valle
Picchi risolti al 80% della valle
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Definizione alternativaDefinizione alternativa
La risoluzione di un picco isolato si può anche definire come larghezza δm del picco al x% dell’altezza.Spesso si prende x = 50%, e δm è la larghezza a metà altezza.
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Classi di analizzatori di massaClassi di analizzatori di massa
• A settore magnetico• A doppia focalizzazione• A quadrupolo lineare (Q)• Trappola ionica a quadrupolo (QIT)• A tempo di volo (TOF)• A risonanza ciclotronica e trasformata
di Fourier (FT-ICR)
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Analizzatore di massa a quadrupoloAnalizzatore di massa a quadrupolo
Potenziale nel quadrupoloPotenziale nel quadrupolo
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Traiettorie dello ioneTraiettorie dello ione
piano xz
piano yz
piano xz
piano yz
Traiettoria instabile lungo x, stabile lungo y
Traiettoria stabile sia lungo x che lungo y
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Traiettorie ioniche nella trappola a quadrupoloTraiettorie ioniche nella trappola a quadrupolo
Moto degli ioni in direzione z
Moto degli ioni in direzione r
tempo
Gli ioni vengono intrappolati forzandoli su traiettorie chiuse stabili all’interno della trappola. Quando la traiettoria di uno ione diventa instabile, questo esce dalla trappola e viene rivelato.
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Analizzatore di massa a quadrupoloAnalizzatore di massa a quadrupolo
• Massimo valore m/z ~ 4 000 (applicabile alla MS di proteine solo in accoppiamento con la ESI)
• Risoluzione ~ 3 000– I quadrupoli sono strumenti a bassa risoluzione– Si lavora normalmente alla risoluzione di una unità di
massa.
• Leggero, di dimensioni contenute• Facile da accoppiare alla cromatografia• Efficiente trasmissione degli ioni• Necessaria una elevata precisione
nell’allineamento delle barre degli elettrodi
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Analizzatore a tempo di volo (TOF)Analizzatore a tempo di volo (TOF)
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Zona di accelerazione con campo elettrostatico E
V = 0
dE = V0 = 20 000 V V = V0
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Reflectron TOFReflectron TOF
Sorgente
Metodo per correggere la distribuzione di velocità, diminuendo Δt
Reflectron TOF a stadio singoloReflectron TOF a stadio singolo
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Analizzatore di massa a tempo di voloAnalizzatore di massa a tempo di volo
• Massimo valore m/z > 200 000• Risoluzione fino a 105.• Il reflectron consente di:
– Ridurre le dimensioni– Aumentare la risoluzione
• Ideale accoppiamento con sorgenti pulsate (ma adattabile anche a sorgenti continue)
• Efficiente trasmissione degli ioni
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Principi della ICRFT MSPrincipi della ICRFT MS
Gli ioni in un campo elettromagnetico si muovono su traiettorie circolari (o a spirale), generando esse stesse una radiazione elettromagnetica, la cui frequenza dipende dal rapporto m/z dello ione.Tale r.e.m. può essere rivelata da un’antenna, generando un segnale che contiene le radiofrequenze di tutti gli ioni in funzione del tempo.
Mediante trasformata di Fourier il segnale viene passato dal dominio del tempo al dominio delle frequenze, e di conseguenza al dominio delle masse (o meglio di m/z).
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Analizzatore a risonanza ciclotronicaAnalizzatore a risonanza ciclotronica
Piano di ricezione
Piano di emissione
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Analisi di massa a trasformata di FourierAnalisi di massa a trasformata di Fourier
Segnale nel dominio del tempo Segnale trasformato nel dominiodelle frequenze m/z
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Analizzatore di massa a ICR FTAnalizzatore di massa a ICR FT
• Massimo valore m/z > 50 000• Risoluzione fino a 106.• Possibilità di intrappolare gli ioni.• Massima accuratezza nella
determinazione delle masse.• Semplicità nel passaggio da ioni positivi
a ioni negativi.• Prezzi ancora proibitivi per molte
Il risultato è evidentemente una separazione bidimensionale.I due processi separativi si sviluppano ortogonalmente
Domande:Domande:- Tutti gli accoppiamenti fra tecniche separative danno origine a separazioni multidimensionali?- Come si definisce l’ortogonalità di due tecniche separative?
1) Il risultato che si ottiene è un cromatogramma monodimensionale 2) La separazione ottenuta nella prima colonna può essere distrutta nella seconda. Non è una separazione bidimensionale
Per realizzare l’accoppiamento bidimensionale fra due colonne cromatografiche (o altre tecniche separative a flusso) è necessario un dispositivo che isoli le frazioni ottenute in prima separazione, in modo che non possano mescolarsi durante la seconda separazione.Il risultato è una mappa cromatografica bidimensionale
• Si definisce multidimensionale la combinazione di tecniche il cui risultato sia la “dislocazione” dell’informazione rispetto a più di una variabile. Il segnale analitico può essere rappresentato come una funzione di almeno due variabili di dislocazione.
Definizione generale di multidimensionalitàDefinizione generale di multidimensionalità
Dislocazione
tempo volume λ distanza
m/z potenziale massa
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Doppia spettrometria di massa (MS/MS)Doppia spettrometria di massa (MS/MS)
Ionizzazione eframmentazione
analisidi massa
m/z
decomposizione
m1 analisidi massa
m/z
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Applicazioni della MS/MSApplicazioni della MS/MS
• Maggior contenuto di informazioni• Studio della struttura
– Informazioni addizionali per determinare la struttura di uno ione
• Rivelazione selettiva di uno ione– Drastica riduzione delle interferenze
• Studio delle reazioni ione-molecola
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MS/MS nello spazio e nel tempoMS/MS nello spazio e nel tempo
MS/MS nello spazio
MS/MS nel tempo
Scansione delloione prodotto
Cella dicollisione
Tempo 1 Tempo 2 Tempo 3
ScansioneSelezione m/z
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Combinazioni strumentali per MS/MSCombinazioni strumentali per MS/MS
MS/MS nello spazioMS/MS nello spazioSettori elettrico-magnetico: EB/EB o BE/BE (max MS4).Triplo quadrupolo: QqQTempo di volo lineare/reflectron: TOF/TOF.
MS/MS nel tempo (MSMS/MS nel tempo (MSnn))Trappola ionica a quadrupolo (max MS8)Risonanza ciclotronica (ICR FTMS)
Combinati: Combinati: Qq(trap) MSn nello spazio e/o nel tempo
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Modalità di scansione MS/MSModalità di scansione MS/MS
Scansione dello ione prodotto
ScansioneSelezione m/z
Scansione dello ione precursore
Scansione Selezione m/z
Scansione di perdita neutra
Monitoraggio di reazione selezionata
Scansionem/z = x
Scansionem/z = x-a
Selezione delprecursore
m/z = a
Selezione delframmento
m/z = b
Analizzatore di massa fissoSpettrometro di massa a scansioneScansione dello ione prodottoScansione dello ione precursoreScansione di perdita neutraMonitoraggio di reazione selezionata
Simbolismo alternativoSimbolismo alternativo
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Modalità di scansione MS/MSModalità di scansione MS/MS
1. Scansione dello ione prodotto: consiste nel selezionare uno ione precursore, di m/z fissato, e nella determinazione di tutti gli ioni prodotti dalla frammentazione attivata per collisione (CID).Se nella cella di collisione si usa un gas reagente, si osservano i prodotti di reazione attivate per collisione (CAR). Quando vengono prodotti solo ioni frammento, questa modalità di scansione è detta anche scansione di ioni frammento.
2. Scansione dello ione precursore: consiste nello scegliere uno ione prodotto e nel determinare gli ioni precursori. Permette di identificare gli ioni precursori di un certo frammento. Questa modalità di scansione, che non si può realizzare con la in time MS/MS, richiede la focalizzazione del secondo analizzatore su di uno ione selezionato, e la scansione di massa sul primo analizzatore. Vengono rivelati gli ioni precursori che per reazione o frammentazione producono ioni figlio della massa selezionata.
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Modalità di scansione MS/MSModalità di scansione MS/MS
3. Scansione di perdita neutra (NLS): consiste nello scegliere un frammento neutro e nel rivelare tutte le frammentazioni che portano alla perdita di tale frammento. Come nel caso della scansione dello ione precursore, questa modalità non è realizzabile in MS/MS nel tempo. La scansione richiede che entrambi gli analizzatori scandiscano contemporaneamente, ma con una differenza di massa fissa a fra di loro. Quando uno ione di massa m attraversa il primo analizzatore, viene rivelato solo se produce un frammento di massa m – a.
4. Monitoraggio di reazioni selezionate (SRM): consiste nel selezionare una reazione di frammentazione. In questa modalità, entrambi gli analizzatori sono focalizzati su masse selezionate. Non si ha quindi scansione. È analogo al “monitoraggio di ioni selezionati” in spettrometria di massa singola, ma in questo caso gli ioni selezionati dal primo analizzatore danno un segnale solo se producono un certo frammento mediante una certa reazione. L’assenza di scansione permette di aumentare la sensibilità, oltre che la selettività.
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Combinazioni strumentali per MS/MSCombinazioni strumentali per MS/MS
MS/MS con risoluzione nello spazioMS/MS con risoluzione nello spazioSettori elettrico-magnetico: EB/EB o BE/BE (max MS4).Triplo quadrupolo: QqQTempo di volo lineare/reflectron: TOF/TOF.
Combinati:Combinati: EBqQQqTOF
MS/MS con risoluzione nel tempo (MSMS/MS con risoluzione nel tempo (MSnn))Trappola ionica a quadrupolo (max MS8)Risonanza ciclotronica (ICR FTMS)
Combinati: Combinati: Qq(trap) MSn nello spazio e/o nel tempo
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Scelta dell’analizzatoreScelta dell’analizzatore
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Massa monoisotopica e massa chimicaMassa monoisotopica e massa chimica
Massa monoisotopica (picco 12C): 1085.55
Massa media (picco 12C): 1086.28
Per peptidi e proteine la differenza fra massa media (chimica) e massa mono-isotopica è circa 0.06%, distinguibile se lo spettrometro ha risoluzione pari a:
R = 100/0.06 = 1667 (nell’esempio sopra, R = 5000)
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Identificazione del picco Identificazione del picco 1212CC
Per piccoli peptidi il primo picco, relativo alla massa monoisotopica, è anche quello più intenso. Questo non è vero per proteine di massa maggiore, in cui il picco 12C può essere poco intenso o addirittura non rivelabile. Oltre un certo valore di massa, il dato analitico utile è la massa media, che si ricava dal centroide del picco.
Insulina Albumina bovina
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Risoluzione e sensibilitàRisoluzione e sensibilità
Quando non è possibile raggiungere risoluzione unitaria, ed identificare il picco di massa monoisotopica, è poco conveniente superare la risoluzione alla quale si può determinare la massa media con accuratezza. Questo è vero in particolare quando si deve raggiungere un compromesso fra risoluzione e sensibilità
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Strategie proteomiche basate sulla MSStrategie proteomiche basate sulla MS
• Si basa sulla determinazione della massa accurata (media) delle proteine in una matrice di complessità ridotta (ottenuta per purificazione con metodi biochimici o per separazione con tecniche non denaturanti)• Permette di determinare la conformazione delle proteine nel loro stato nativo, e le interazioni proteina-proteina (complessi proteici fra biomarker e proteine di trasporto, oligomeri funzionali)• Permette di determinare la composizione amminoacidica della proteina, ma non la loro sequenza•Non identifica la proteina in modo univoco in un proteoma complesso• Permette di studiare isoforme (mutazioni di singoli amminoacidi) e modificazioni post-traduzionali, ma non di localizzarle.
Spettro m/z in ESI/qTOF di perossidasiSpettro m/z in ESI/qTOF di perossidasidi rafano (HRP) allo stato nativodi rafano (HRP) allo stato nativo
Il software dello spettrometro di massa identifica le famiglie di picchi negli spettri multicarica sovrapposti, ne determina il valore di m/z medio (il centroide del picco) e calcola lo spettro di massa ricostruito
È la più comune procedura per l’identificazione dei peptidi mediante spettrometria di massa
La lista dei pesi molecolari ottenuta dall’analisi MALDI/TOFMS viene inserita in banca dati per l’identificazione della proteina incognita. Solitamente i segnali dei picchi a basso peso molecolare (< 500 Da) vengono esclusi dalla ricerca in quanto potrebbero essere segnali di matrice.
Procedura di identificazione automatizzataProcedura di identificazione automatizzata
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L’elettroforesi bidimensionale è oggi la più
potente tecnica separativa utilizzata per le proteine, tuttavia essa presenta una serie di svantaggi:
• E’ ristretta a proteine in un intervallo di masse molecolari tra 104 e 106 Da• Non è possibile rivelare proteine poco espresse (bassa sensibilità)• Bassa riproducibilità da gel a gel• Lo spettrometro di massa non può essere interfacciato on-line con la tecnica separativa.
Vantaggi e limiti dell’elettroforesiVantaggi e limiti dell’elettroforesi
Due (o più) tecniche “ortogonali” vengono combinate per migliorare la separazione fra i peptidi e facilitarne l’identificazione
1000 1500 2000 Mass (m/z)
Analisi di massa
(*) La digestione proteolitica può avvenire prima della separazione (approccio shotgun) o dopo la separazione delle proteine intere (approccio bottom-up gel-free)
(*)
Separazioni cromatografiche
Una alternativa alla 2D PAGE
Identificazione de novo o in banca dati
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LC/LC MSLC/LC MSnn per l’analisi di miscele di peptidi per l’analisi di miscele di peptidi
0 4 8 12 16 20
0
4000
8000
12000
16000
20000
0 4 8 12 16 20
0
1000
2000
3000
4000
5000
frazione 1
frazione 2
minuti
prima dimensione: cromatografiaa scambio ionico
diverse frazioni di peptidi vengono eluite effettuando un gradiente ditampone salino a valori crescentidi forza ionica.
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LC/LC MSLC/LC MSnn per l’analisi di miscele di peptidi per l’analisi di miscele di peptidi
Seconda dimensione: cromatografia a fase inversa (C4 – C18)
PEPB1_LCMS 263 (13.596) Cm (259:266) TOF MS ES+ 275501.2563
459.2601
413.2296
725.8798
501.7476
501.7715
688.8470679.8622
502.2749550.7875
502.7427
551.3024
624.3422561.2829
689.3666
689.8583
725.9087
726.3988
726.8892
752.3196 1001.5468834.4458
753.3177825.4760 835.4352
904.4541
1002.5290
1003.4948
Ciascuna frazione contenente i peptidi eluiti dalla colonna a scambio ionico viene ulteriormente separata su una colonna cromatografica a fase inversa e i singoli peptidi sono rivelati e identificati utilizzando uno spettrometro di massa ESI-Q/TOF in modalità MS/MS
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ESI-QqTOF MS/MSESI-QqTOF MS/MS
Ottica ditrasferimento
Quadrupolo Esapolo(cella di collisione)
Cono dicampionamento
Nel quadrupolo vengono rilevate e selezionate le masse dei peptidi, che sono poi frammentati nell’esapolo. La massa accurata dei frammenti è determinata nel tubo di volo.
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LC/LC MSLC/LC MSnn per l’analisi di miscele di peptidi per l’analisi di miscele di peptidi
• Si marcano le proteine nei due campioni da confrontare con reagenti “pesanti” o “leggeri”
Gruppo chimicamente reattivo: si lega covalentemente a proteine e peptidiIsotope-labeled linker: pesante o leggero, a seconda dell’isotopo usatoAffinity tag: permette la separazione della proteina o del peptide marcato mediante cromatografia di affinità
ISOTOPE-CODED AFFINITY TAG (ICAT)ISOTOPE-CODED AFFINITY TAG (ICAT)
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Esempio di un reagente ICATEsempio di un reagente ICAT
S OI
NH
**
* *
O
OON
H
O
O
NH
NH
Biotin Affinity tag: Si lega fortemente e selettivamente a una resina di agarosio-streptavidina
Linker: La versione pesante è deuterata in *
Gruppo reattivo: gruppo tiolico in grado di legarsi alle cisteine
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Come funziona l’ICAT?Come funziona l’ICAT?
Proteolisi (eg tripsina)
Lisi emarcatura
MIX
Isolamento peraffinità su
streptavidina
QuantificazioneMS
Identificazione
MS/MS
100
m/z200 400 600
0
100
550 570 5900
m/z
Leggero
Pesante
NH2-EACDPLR-COOH
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ICAT: Pro e controICAT: Pro e contro
• Stima le concentrazioni relative di proteine fra due campioni con un livello di accuratezza ragionevole (> 10%)
• Si può usare in miscele di proteine complesse
• La marcatura Cys-specifica reduce la complessità del campione
• È possibile sequenziare direttamente i peptidi in MS/MS
• Frammentazione del marcatore (problemi di resa e specificità)
• Leggere differenze cromatografiche fra gli isotopi
• Costoso• Difficile interpretazione
del risultato analitico• Impossibile quantificare
peptidi senza Cys o con Cys inaccessibili stericamente
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Imaging MALDIImaging MALDI
• Immagine molecolare di una sezione di tessuto
•Abbondanza e distribuzione di proteine e altre specie
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Imaging MALDIImaging MALDI
Considerazioni metodologiche
La dissezione deve preservare la localizzazione degli analitiLa matrice deve essere applicata omogeneamente in senso geometrico (superficie piatta) e chimico. Si utilizzano metodi automatizzati.La sezione del raggio laser è il limite della risoluzione in modalità raster.Le informazioni quantitative sono essenzialmente relative (fra zone diverse di tessuto).Si possono usare standard interni per una quantificazione semi-assoluta.L’impiego di un MALDI TOF/TOF o di QqTOF in modalità MS/MS permette il sequenziamento delle proteine.
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Imaging MALDIImaging MALDI
Whole body MALDI imaging: tomografia distruttiva.Eticamente accettabile?