Die Rolle des CD137-/CD137-Ligand-Systems in der anti-Tumor-Immunantwort Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) der naturwissenschaftlichen Fakultät III - Biologie und vorklinische Medizin - der Universität Regensburg vorgelegt von Margarethe Wittmann aus Hof/Saale 2003
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Die Rolle
des CD137-/CD137-Ligand-Systems
in der anti-Tumor-Immunantwort
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften
(Dr. rer. nat.)
der naturwissenschaftlichen Fakultät III
- Biologie und vorklinische Medizin -
der Universität Regensburg
vorgelegt von
Margarethe Wittmann
aus Hof/Saale
2003
Promotionsgesuch eingereicht am: 10. 12. 2003
Die Arbeit wurde angeleitet von: Prof. Dr. H. R. Kalbitzer (fakultätsintern)
w/otm; dargestellt sind die Mittelwerte von Dreifachbestimmungen ± Standardabweichung.
Gezeigt ist jeweils eines von drei unabhängigen Experimenten. Die Überstände, die in Teil-
abbildung B verwendet wurden, sind die aus den in Abb. 3.-33. und 3.-34. gezeigten Experi-
menten.
Diskussion
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4. Diskussion
4.1. Screening des CLL-Patientenmaterials hinsichtlich der
Expression von CD137
Das in dieser Studie betrachtete Kollektiv von B-CLL-Patienten umfaßte 25 Personen. Sechs
davon waren weiblich, 13 männlich, vom Rest war die Geschlechtszugehörigkeit nicht be-
kannt. Das entspricht einem Verhältnis von etwa 2:1 männlichen zu weiblichen Patienten;
dieses Geschlechterverhältnis ist für die CLL charakteristisch (BERGER D. P. et al., 1997). Das
durchschnittliche Alter der Patienten betrug 65,6 Jahre. Auch das ist typisch für CLL-Patien-
ten. Bei der CLL handelt es sich um eine Erkrankung des höheren Lebensalters, die im Mittel
in einem Lebensalter von 65 Jahren auftritt (BERGER D. P. et al., 1997). Das betrachtete Kollektiv
spiegelt folglich die Epidemiologie der CLL gut wieder.
CLL-Patienten haben eine stark erhöhte Anzahl an weißen Blutkörperchen im peripheren
Blut, die vorwiegend aus CD5-positiven B-Zellen besteht (vgl. Kap. 2.1.1.2., Tab. 2.-1.). Der
Anteil an B-Lymphozyten ist in den untersuchten CLL-Patientenproben auf 65 bis 97,5 % der
Blutleukozyten erhöht. Durchschnittlich steigt der B-Zell-Anteil der Lymphozytenaliquots auf
87,5 %. Beim gesunden Probanden beträgt der B-Zell-Anteil 20 bis 30 % (PSCHYREMBEL, 1998).
Für das Würzburger Patientenkollektiv konnte gezeigt werden, daß für alle untersuchten Pro-
ben nach Stimulation durch PMA/Kalziumionophor die mRNA für die membrangebundene
Form von CD137 nachweisbar war (Kap. 3.1.2.1., Abb. 3.-1.). Dies entspricht früheren Beob-
achtungen, nach denen die CD137-mRNA auf gesunden, EBV-transformierten B-Zellen und
B-Zellinien nach Stimulation nachgewiesen werden kann (SCHWARZ H. et al., 1995; KIENZLE G. et
al., 1997).
Bisher konnte die Expression von CD137-Protein auf humanen B-Lymphozyten selbst nach
Stimulation nicht detektiert werden (KIENZLE G. et al., 1997; KIENZLE G. und VON KEMPIS J., 2000; MI-
CHEL J.: unveröffentlichte Daten). Die PBMCs aller untersuchten CLL-Patienten exprimieren nach
Stimulation mCD137, wie über die FACS-Analyse mit anti-CD137-Antikörpern nachgewie-
sen werden konnte (Kap. 3.1.2.1., Abb. 3.-2.). Dieses Ergebnis hielt auch einer Überprüfung
durch Immunfluoreszenzdoppelfärbung stand: 8 von 10 untersuchten Proben zeigten Koex-
pression des B-Zell-Markers CD19 mit CD137 auf denselben Zellen (Kap. 3.1.2.1., Abb. 3.-
3.). Damit konnte erstmalig gezeigt werden, daß mCD137 auf Proteinebene von humanen B-
Zellen exprimiert werden kann. Dabei muß berücksichtigt werden, daß B-CLL-Lymphozyten
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entartete Zellen sind, die ein gegenüber gesunden B-Zellen verändertes Expressionsmuster an
zellulären Proteinen aufweisen (KIPPS T. J., 1998; JURLANDER J., 1989).
Die diskrete, eng begrenzte Expression von mCD137 auf der Zelloberfläche, die in der Im-
munfluoreszenzfärbung sichtbar wird, kann dahingehend gedeutet werden, daß CD137 in der
Membran in clustern vorliegt. Mitglieder der TNFR-Familie aggregieren und bilden für die
Signalübertragung Multimere aus (BANNER D. W. et al., 1993; JONES E. Y. et al., 1990; ECK J. M. und
SPRANG S. R., 1989). Daher kann diese Beobachtung als erster Hinweis auf die Teilnahme von
raft-Strukturen an der aktiven Signaltransduktion durch CD137 gewertet werden. Hierfür
sprechen auch die Daten mit pcDNA-ILA-trunc- und pcDNA-ILA-w/otm-transfizierten Zel-
len (Kap. 3.3.3.4. und 3.4.2.). Das trunkierte bzw. das lösliche Protein kann in Zellinien, die
endogen mCD137 exprimieren, den zytolysesenkenden Effekt aufheben, der durch das konsti-
tutiv exprimierte CD137 vermittelt wird (Kap. 3.3.3.4., Abb. 3.-28. und Kap. 3.4.2., Abb. 3.-
33.). Die dominant-negativ Inhibition Signalübertragung durch sCD137 oder CD137trunc der
ist nur möglich, wenn das native mCD137 zusammen mit dem trunkierten oder löslichen Pro-
tein Oligo- oder Multimere ausbilden kann. Für einen endgültigen Beweis sind jedoch weitere
Studien nötig.
Die Ergebnisse aus Kapitel 3.1.2.1. zeigen, daß B-CLL-Lymphozyten CD137 als Neoantigen
synthetisieren, da bislang für native B-Zellen eine Proteinexpression nicht nachgewiesen wer-
den konnte. Die Expression von Neoantigenen – Molekülen, die auf der Ursprungszellpopula-
tion von entarteten Zellen nicht exprimiert werden – ist bei Tumoren, auch der CLL, ein
bekanntes Phänomen (KIPPS T. J., 1998; JURLANDER J., 1989).
In der Regel verschafft die Neusynthese bestimmter Moleküle auf entarteten Zellen diesen
einen Überlebens- oder Wachstumsvorteil. Auch Mitglieder der TNFR- und der TNF-Familie
werden von Tumoren als Neoantigene synthetisiert. Ein bekanntes Beispiel stellen die
Mitglieder der TNF-Familie TNF und FasL dar, die durch Tumorzellen verstärkt exprimiert
werden und in infiltrierenden T-Zellen über den TNFR1 bzw. Fas Apoptose induzieren
können (JURLANDER J., 1989; SUDA T. et al., 1997; VILLUNGER A. et al., 1997; OSORIO L. M. und AGUILAR-
SANTELISES M., 1998; BUZYN A. et al., 1999; O’CONNELL J. et al., 1999; HOLTZMANN M. J. et al., 2000;
RESTIFO N. P., 2000). Dieser Mechanismus ist auch für die CLL beschrieben (TINHOFER I. et al.,
1998).
M. FURTER konnte in seiner Dissertation in den Seren von CLL-Patienten die lösliche Form
von CD137 nachweisen und fand, daß die Konzentration des vorhandenen sCD137 mit der
Leukozytenzahl korreliert (FURTNER M., 2001).
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In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, daß die PBMCs von 10 von 12 CLL-Patienten in der
RT-PCR ein positives Signal für sCD137 geben – sie synthetisieren die mRNA für sCD137
(Kap. 3.1.3.1., Abb. 3.-4.). sCD137-Protein konnte in den Überständen von 14 von 17 unter-
suchten Patientenzellaliquots detektiert werden (Kap. 3.1.3.2.1.). In allen untersuchten Seren
konnte sCD137 nachgewiesen werden, bei fünf von 10 Patienten lag die Konzentration an
sCD137 über der Grenze von 0,512 ng/ml. Dieser Wert entspricht dem Mittelwert an sCD137
im Serum von 100 gesunden Probanden zzgl. der doppelten Standardabweichung (Kap.
3.1.3.2.2.).
Die Konzentration an sCD137 in den Patientenseren korreliert mit der Anzahl an Leukozyten
im Blut (Kap. 3.1.3.2.1., Abb. 3.-5.A). Dies bestätigt die frühere Aussage von M. FURTNER
(FURTNER M., 2001).
Es besteht außerdem eine Korrelation zwischen den Konzentrationen an sCD137 und ß2-
Mikroglobulin im Serum (Kap. 3.1.3.2.1., Abb. 3.-2.D). ß2-Mikroglobulin dient als einer der
wenigen zuverlässigen Marker für den klinischen Verlauf der CLL. Ist der Spiegel an ß2-Mi-
kroglobulin im Serum erhöht, stellt dies einen Hinweis auf einen progressiven Krankheitsver-
lauf dar (KEATING M. J., 1999; KIPPS T. J., 1998; ZWIEBEL J. A. und CHESON B. D., 1998; JURLANDER J.,
1989). Die sCD137-Konzentration im Serum von CLL-Patienten könnte daher in der Zukunft
für die Prognose der CLL an Bedeutung gewinnen.
Die im Blut der CLL-Patienten zirkulierenden Leukozyten sind im wesentlichen CD5-posi-
tive, maligne B-Lymphozyten. Daher liegt die Vermutung nahe, eine Korrelation des Serum-
CD137 mit der Leukozytenzahl könnte mit einer Korrelation zwischen Serum-CD137 und
malignen B-Zellen einhergehen (Kap. 3.1.3.2.1., Abb. 3.-5.B). Diese Annahme konnte jedoch
nicht bestätigt werden.
Auch eine Korrelation zwischen der Konzentration an sCD137 im Serum und dem Anteil
bzw. der Anzahl an T-Zellen konnte nicht hergestellt werden. Allerdings besteht eine negative
Korrelation zwischen der Serumkonzentration an sCD137 und dem Anteil und der Anzahl an
HLA-DR-positiven, aktivierten T-Lymphozyten (Kap. 3.1.3.2.1., Abb. 3.-5.C). Je mehr akti-
vierte T-Zellen in den Patientenproben enthalten waren, desto weniger sCD137 konnte im Se-
rum nachgewiesen werden.
Das nach Stimulation in Kulturüberstände sekretierte sCD137 stammt von den T-Zellen der
Patienten (Kap. 3.1.3.2.2., Abb. 3.-6. und Abb. 3.-7.). In den Überständen reiner B-CLL-Zel-
len ohne T-Lymphozyten konnte sCD137 nur knapp oberhalb der Nachweisgrenze detektiert
werden. Dies deutet darauf hin, daß auch das in den Seren gefundene sCD137 von T-Lym-
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phozyten synthetisiert wurde. Dieser Befund deckt sich mit den Daten von J. MICHEL, der hu-
manes sCD137 in den Überständen aktivierter PBMCs und aufgereinigter, aktivierter CD4-
und CD8-positiver T-Zellen nachweisen konnte, nicht aber in B-Zell-Überständen (MICHEL J.,
1998).
J. MICHEL weißt in seiner Dissertation nach, daß sCD137 durch aktivierte PBMCs bei Aktiva-
torkonzentrationen exprimiert wird, die bereits eine Hemmung der Proliferation nach sich zie-
hen. Zudem konnte er eine starke Korrelation zwischen sCD137-Freisetzung und AICD fest-
stellen (MICHEL J., 1998). Dies kann erklären, warum in den späten Stadien der CLL mehr
CD137, sowie weniger aktivierte T-Lymphozyten vorhanden sind. Die „überaktivierten“ T-
Zellen begehen demnach aktivierungsabhängig Apoptose, die mit einer erhöhten sCD137-
Freisetzung einhergeht. Diese Sekretion von sCD137 durch stark aktivierte T-Zellen kann
durch dominant-negative Interaktionen mit dem mCD137 der T-Lymphozyten eine weitere
Aktivierung der Zellen durch CD137 unterbinden. Im Falle der anti-Tumor-Immunantwort
könnten so spezifische anti-Tumor-T-Zellen vor dem AICD bewahrt werden.
4.2. Die Funktion von mCD137 in der CLL
Werden CLL-Zellen auf immobilisiertem CD137-Fc-Fusionsprotein kultiviert, so leben nach
einem definierten Zeitraum signifikant mehr Zellen als auf einem Kontrollprotein. Zellen in
den CD137-Fc-beschichteten wells einer Kulturplatte überleben länger als Kontrollzellen
(Kap. 3.1.2., Tab. 3.-2. und Abb. 3.-8.). Die höhere Anzahl an lebenden Zellen geht nicht auf
eine gesteigerte Proliferation zurück (Kap. 3.2.1., Abb. 3.-10.).
Die CLL ist eine Erkrankung, bei der die Zellakkumulation in vivo nicht in erster Linie auf
eine Fehlregulation der Proliferation zurückzuführen ist, sondern auf eine Anreicherung der
B-Lymphozyten in die Folge einer gestörten Apoptoseregulation. Diese läßt sich zurückfüh-
ren auf ein verschobenes Gleichgewicht von Bcl-2 und Bcl-xL zu Bax. Die apoptose-inhibie-
renden Moleküle Bcl-2 und Bcl-xL werden in der CLL überexprimiert und die Apoptose der
entarteten B-Zellen unterdrückt (MEINHARDT G. et al., 1999; KIPPS T. J., 1998; OSORIO L. M. und
AGUILAR-SANTELISES M., 1998; OSORIO L. M. et al., 1998; REED J. C., 1998; SÖDERBERG O., 1998; ZWIEBEL J.
A. und CHESON B. D., 1998; JURLANDER J., 1989). Die Vernetzung von CD137-Ligand führt zur
Induktion des Transkriptionsfaktors NF-kB (SÖLLNER L., 2001). In B-CLL-Zellen ist die NF-
kB-Aktivität gegenüber normalen B-Lymphozyten konstitutiv erhöht und schützt diese Zellen
vor Apoptose (FURMAN R. R. et al., 2000; OSORIO L. M. und AGUILAR-SANTELISES M., 1998) Über NF-
kB wird u.a. die Transkription der Gene bcl-2 und bcl-x reguliert (BUI N. T. et al., 2001; SEVILLA
L. et al., 2001; KHOSHNAN A. et al., 2000; ROTHSTEIN T. L., 2000). Über diesen Weg wäre eine Verlän-
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gerung des Überlebens der CLL-Zellen in vitro möglich: Das immobilisiertes CD137 vernetzt
auf den entarteten B-Zellen deren konstitutiv exprimierten CD137-Ligand (PAULY S., 2000; AL-
DERSON M. R. et al., 1994). Durch diesen werden NF-kB-vermittelt Bcl-2 und Bcl-xL induziert.
Dies wiederum führt zu einer verminderten Apoptoserate und einem erhöhten Überleben der
CLL-Zellen. Dafür spricht auch die Beobachtung, daß in vivo direkter Zell-Zell-Kontakt für
das Überleben von B-CLL-Zellen essentiell ist (LAGNEAUX L. et al., 1999; SÖDERBERG O., 1998).
Die Synthese von mCD137 bietet CLL-Zellen so die Möglichkeit, sich gegenseitig Überle-
benssignale zu übermitteln. Das bedeutet für die entarteten Zellen einen Vorteil.
Bei Zugabe des löslichen CD137-Fc-Proteins zu kultivierten CLL-Zellen kann dieser überle-
bensfördernde Effekt von CD137 nicht beobachtet werden. Dies ist darauf zurückzuführen,
daß für eine Signalübertragung durch CD137-Ligand nicht nur die Bindung des Rezeptor-
moleküls sondern auch die Vernetzung durch CD137-Rezeptormultimere essentiell ist. Ein-
zelne Fusionsproteine in Lösung binden zwar den Liganden, verhindern jedoch die Vernet-
zung und so die Übertragung des überlebensfördernden Signals in die Zelle.
Daß sCD137 keinen überlebensfördernden Effekt auf die B-CLL-Zellen besitzt (Kap. 3.2.1.,
Abb. 3.-9.), paßt zu den Daten, die zeigen, daß das in den Überständen von Patientenzellen
detektierte sCD137 nicht von den CLL- sondern von den T-Lymphozyten herrührt. Für den
Organismus würde es einen Nachteil darstellen, wenn die zellvermittelte anti-Tumor-Antwort
des Körpers einen Tumor durch Überlebensfaktoren unterstützte (Kap. 3.2.1., Abb. 3.-9.).
4.3. Die Rolle von mCD137 in der LAK-Antwort
4.3.1. Der Effekt von mCD137 in der LAK-Antwort
Um Aufschluß über das Zusammenspiel zwischen anti-Tumor-Immunzellen und Tumorzellen
sowie der Funktion von mCD137 in diesem Kontext zu erhalten, wurden LAK-Assays ange-
fertigt. So war es möglich, die Expression von mCD137 durch die eingesetzten Tumorzellen
mittels Transfektion zu modulieren und die daraus resultierenden Auswirkungen auf die zyto-
toxische Lyse durch die LAK-Zellen zu betrachten.
Daß die Modulation der CD137-Expression verschiedener Zellinien durch die Transfektion
mit CD137-sense- und/oder -antisense-codierenden Vektoren möglich ist, konnte in Kapitel
3.3.1., Abb. 3.11. für COS-, K562-, Jurkat- und Raji-Zellen gezeigt werden.
Exprimieren Tumorzellen CD137 auf ihrer Oberfläche, werden sie im LAK-Assay weniger
stark lysiert (Kap. 3.3.1., Abb 3.12.). Die Reduktion der Lyse ist – wie die Experimente zei-
gen – nur zum Teil von der Dichte der mCD137-Expression abhängig: mCD137-transfizierte
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Raji-Zellen exprimieren weniger mCD137 als mCD137-transfizierte COS-Zellen. Trotzdem
erfahren auch diese Zellen einen wirksamen Schutz vor der LAK-Lyse.
Um die Spezifität des zytolysesenkenden Effekt durch mCD137 zu verfizieren, wurden zwei
verschiedene Strategien angewandt:
Zum einen wurde die mCD137-Expression auf den Zielzellen durch Transfektion mit einem
sense- oder einem antisense-Konstrukt moduliert. Die Modulation von mCD137 konnte über
Antikörperfärbung per FACS gezeigt werden (Kap. 3.3.1., Abb. 3.-11. und Kap. 3.3.2.1., 3.-
15.). Die so transfizierten K562- bzw. Raji-Zellen wurden in LAK-Assays eingesetzt. Es ließ
sich nachweisen, daß die Lysehemmung durch mCD137 auf den Targetzellen der Dichte des
Rezeptors auf der Oberfläche dieser Zellen abhängig ist (Kap. 3.3.2.1., Abb. 3.-14.).
mCD137 ist ein Membranprotein. Starke Expression von Membranproteinen kann zu Verän-
derungen der Zellmembran führen. Membranveränderungen können das Verhalten der trans-
fizierten Zellen im LAK-Assay unspezifisch beeinflussen, da CTL- und LAK-Lyse auf Zell-
Zell-Interaktionen beruhen. LAKs und CTLs induzieren im direkten Kontakt zu ihrer Ziel-
zelle Poren in deren Membran durch Porine, wie Perforin. Dies führt zum raschen Absterben
der Targetzelle durch Wasser- und Salzverlust. Daher mußte die verminderte Lyserate der
mCD137-transfizierten Zellen durch eine weitere Methode verifiziert werden, die keinen Ein-
fluß auf die Höhe der Expression des membrangebundenen Proteins hat.
Dafür wurden mCD137- sowie kontrolltransfizierte COS-Zellen nach der Transfektion mit
dem blockierenden anti-CD137-Antikörper bbk-2 (LEE U. H. et al., 2002) inkubiert. bbk-2 bindet
an mCD137 auf der Zelloberfläche und verhindert dadurch die Interaktion mit CD137-Li-
gand-Molekülen auf den Nachbarzellen. Außerdem unterbindet der gebundene Antikörper im
LAK-Assay die Wechselwirkung zwischen dem mCD137 auf den Zielzellen und CD137-Li-
gand-Molekülen auf den LAK-Zellen. Im Falle transfizierter COS-Zellen hebt der anti-
CD137-Antikörper bbk-2 die Zytolyseminderung durch mCD137 teilweise auf. Dies wird aus
einem Vergleich zwischen der Lyserate CD137-transfizierter, Antikörper-behandelter Zellen
mit der kontrolltransfizierter, bbk-2-behandelter Zellen ersichtlich (Kap. 3.3.2.2., Abb. 3.-
16.).
Daß die CD137-transfizierten Zellen nach Antikörperbehandlung nicht so empfindlich auf die
LAK-Lyse reagieren wie kontrolltransfizierte Zellen, kann daran liegen, daß auf den COS-
Zellen die mCD137-Expression durch die starken viralen Promotoren der Expressionsvekto-
ren so hoch ist, daß die eingesetzte bbk-2-Konzentration nicht sättigend ist, d.h. nicht alle
mCD137-Moleküle neutralisiert werden können. Deshalb wurden diese Experimente mit Raji-
Diskussion
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Zellen wiederholt, die konstitutiv geringe Mengen an CD137 in der Membran tragen. So
konnte auf die Transfektion und die damit verbundene Überexpression von CD137 verzichtet
werden. Zudem war es eher möglich, sättigende Antikörperkonzentrationen zu erreichen. Um
die Spezifität der Blockierung durch bbk-2 mit zu überprüfen, wurden Antikörperkonzentra-
tionen von 0,5 bis 5,0 µg/ml eingesetzt. Steigende Konzentrationen an bbk-2 führen zu einer
steigenden Empfindlichkeit der Raji-Zellen gegenüber der LAK-Lyse (Kap. 3.3.2.2., Abb. 3.-
17.). Die Blockierung der Wechselwirkung zwischen CD137 und seinem Liganden hebt den
schützenden Effekt der mCD137-Expression vor zytotoxischer Lyse auf.
Für einige Moleküle ist bekannt, daß ihre Expression auf der Zelloberfläche Zielzellen vor
LAK-Lyse schützen kann. Zu diesen zählen MHC II- (LOBO P. I. und PATEL H. C., 1994), MHC I-
(PALUCKA K. A. et al., 1998) und nichtklassische MHC-Moleküle (CHANG C. S. et al., 1999; CHIANG E.
Y. et al., 2002), sowie HSP70 (DRESSEL R. et al., 2000) und ICAM-1 (TRIOZZI P. L. et al., 1992). Für
Mitglieder der TNFR-Familie gab es hierfür jedoch bisher keine Hinweise. Das von den
Tumorzellen exprimierte mCD137 könnte insofern auf die LAKs wirken, als die Ligation des
Liganden auf aktivierten T-Zellen zur Anergie bzw. Apoptose führt (SCHWARZ H. et al., 1996; MI-
CHEL J. et al., 1999).
Im Falle der CLL könnte die ektopische Neoexpression von mCD137 den entarteten Zellen
durch den vermittelten Schutz vor tumorreaktiven T-Zellen einen weiteren Vorteil bieten,
zusätzlich zu dem überlebensfördernden Effekt, der durch den CD137-Liganden in die CLL-
Zellen übertragen werden kann (vgl. Kap. 3.2.1.).
4.3.2. Untersuchungen zum Mechanismus der Verminderung der
LAK-Lyse – direkte Vermittlung des zytolysesenkenden Effekts
Weder für CD137 noch für andere Mitglieder der TNFR-Familie war bisher bekannt, daß sie
in ihrer membrangebundenen Form Schutz vor zytotoxischer Lyse vermitteln können. Daher
versuchten wir Aufschluß über den Mechanismus gewinnen, über den die LAK-Lyse redu-
ziert wird.
Das CD137-/CD137-Ligand-System kann seinen zytolysesenkenden Effekt entweder direkt
oder indirekt vermitteln: Eine direkte Vermittlung wäre gegeben, wenn das durch CD137 oder
CD137-Ligand übertragene Signal unmittelbar zu einer Reaktion der Zelle führt, z.B. NF-kB-
Aktivierung und erhöhte Expression von Bcl-xL nach der Ligation von CD137 (DEBENDETTE M.
A. et al., 1997; LEE H. W. et al., 2002; BUKZYNSKI J. et al., 2003) oder Apoptoseinduktion nach der
Vernetzung des CD137-Liganden auf LAK-Zellen (SCHWARZ H. et al., 1996; MICHEL J. et al., 1999).
Diskussion
113
Eine indirekte Zytolyseminderung bestünde darin, daß durch das CD137 bzw. CD137-Li-
gand-vermittelte Signal weitere Moleküle induziert werden, die ihrerseits die LAK-Lyse hem-
men. Dies kann beispielsweise durch die Freisetzung antiinflammatorischer Zytokine gesche-
hen.
In dieser Arbeit wurden zuerst die direkten Effekte betrachtet, da bekannt war, daß immobili-
siertes bzw. membrangebundenes CD137 in ruhenden und aktivierten T-Lymphozyten Apo-
ptose induzieren kann (SCHWARZ H. et al., 1996; MICHEL J. et al., 1999).
Apoptoseinduktion in anti-Tumor-T-Zellen durch Tumorzellen ist ein Mechanismus für das
Entkommen eines Tumors aus der Immunüberwachung. In Leukämien und anderen Krebsar-
ten ist die Expression apoptoseinduzierender Moleküle wie FasL beschrieben (VILLUNGER A. et
al., 1997; BUZYN A. et al., 1999; O’CONNELL J. et al., 1999). Dieses Mitglied der TNF-Familie ist in
der Lage, Fas auf aktivierten T-Lymphozyten zu binden und diese dadurch in die Apoptose zu
treiben (SUDA T. et al., 1997; HOLTZMANN M. J. et al., 2000; RESTIFO N. P., 2000). Dies ist auch für die
CLL beschrieben (OSORIO L. M. und AGUILAR-SANTELISES M., 1998; TINHOFER I. et al., 1998): Das
pathologische Zusammenspiel zwischen Fas und FasL besitzt klinische Relevanz: Eine hohe
Fas-Expression auf T-Lymphozyten korreliert mit einem niedrigerem Überleben der CLL-
Patienten GRONEBERG C. et al., 2003).
Apoptose, der programmierte Zelltod, ist ein energieabhängiger, definierter Prozeß der Zelle,
der im gesunden Organismus bei der Differenzierung und Beibehaltung der Integrität von Ge-
weben von Bedeutung ist. Gegenüber der Nekrose ist Apoptose dadurch gekennzeichnet, daß
die Kern-DNA durch endogene Nukleasen fragmentiert wird und der Zellkern kondensiert.
Die Zellproteine werden durch Proteasen abgebaut und die Zelle schrumpft, indem sie mem-
branumgebene Vesikel abgibt, die von phagozytischen Zellen aufgenommen und abgebaut
werden. In der frühen Apoptose erscheinen Phosphatidylserinreste auf der Zellaußenseite. An
diese bindet AnnexinV. In dieser frühen Phase der Apoptose ist die Zellemembran normaler-
weise noch „dicht“: Ein DNA-Farbstoff, wie PI, kann nicht in die Zelle eindringen. Dies
konnte auch in dieser Arbeit gezeigt werden. Im Laufe der Zeit wurden die Zellmembranen
der verwendeten apoptotischen Zellen jedoch undicht. Die in dieser Arbeit betrachteten Zellen
treten nach einer AnnexinV-positiven, PI-negativen frühen Apoptosephase, in eine späte ein,
in der beide Färbungen positiv werden.
Die LAK-Zellen, die mit mCD137-exprimierenden Zielzellen kultiviert worden waren, wur-
den mittels AnnexinV-/PI-Färbung im FACS analysiert. LAK-Zellen, die mit CD137-sense-
transfizierten Zielzellen inkubiert wurden, zeigten nur wenig mehr Apoptose, als solche, die
mit kontrolltransfizierten Zellen kokultiviert wurden (Kap. 3.3.3.1., Tab. 3.-3. und Abb. 3.-
Diskussion
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20.). Die Färbungen wurden nach 6 bzw. 20 h Kokultur durchgeführt. Die Bedingungen der
LAK-Assays wurden – bis auf die verlängerten Inkubationszeiten – beibehalten. Parallel
durchgeführte LAK-Assays zeigten das gewohnte Ergebnis einer starken Lyseminderung,
wenn mCD137-transfizierte Zellen als Targetzellen eingesetzt wurden (nicht gezeigt).
Zusätzlich angefertigte Caspase3-Aktivitätsassays ergaben ein ähnliches Bild (Kap. 3.3.3.1.,
Abb. 3.-20.): LAK-Zellen, die immobilisiertem oder membrangebundenem CD137 ausgesetzt
waren, zeigen eine geringfügig höhere Caspase3-Aktivität als Kontrollzellen. Caspase3 ist
eine der Effektorcaspasen, die während der Induktion der Apoptose aktiviert wird. Caspase3
integriert zusammen mit Caspase7 den rezeptorvermittelten und den mitochondrialen Weg der
Apoptoseinduktion und wird in beiden Fällen aktiviert.
Interessant ist die Tatsache, daß K562- und Rajizellen in der FACS-Analyse bei Effek-
tor:Target-Verhältnissen von 1:2,5 und 1:5 in einem höheren Anteil an LAK-Zellen Apoptose
zu induzieren vermögen als COS-Zellen, die nach der Transfektion weitaus höhere Mengen
an CD137 exprimieren. Da man davon ausgehen muß, daß die LAK-Zellen in allen Experi-
menten vergleichbar viel CD137-Ligand exprimieren, muß der Unterschied zelltypspezifisch
zu erklären sein. Möglicherweise verfügen diese Zellen über Oberflächenmoleküle oder se-
kretieren Zytokine, die eine Apoptoseinduktion durch mCD137 in CTLs supplementieren
können. Da K562 und Rajis in Suspension wachsen, konnten für Kokulturen aus LAK-Zellen
und diesen Zellen keine Caspase3-Aktivitätstests durchgeführt werden. Die ebenfalls lösli-
chen LAK-Zellen konnten nicht mehr abgetrennt und einzelnen analysiert werden.
Die stärkere Apoptoseinduktion durch K562- und Raji-Zellen in den LAKs kann als Hinweis
gelten, daß in vivo dieser Weg bei der Lysehemmung durch entartete Zellen eine größere Rol-
le spielt, als dies in vitro der Fall ist. In der CLL spielen die Mikroumgebung und akzes-
sorische Zellen für das Überleben und Wachstum des malignen B-Zell-Klons eine entschei-
dende Rolle (DECKER T. et al.,1995; OSORIO L. M. und AGUILAR-SANTELISES M., 1998; SÖDERBERG O.,
1998; LAGNEAUX L. et al., 1999). Die Mikroumgebung des LAK-Assays ist gegenüber der in vivo-
Situation sehr reduziert: So wird als Medium PBS mit 5 % FKS eingesetzt und es interagieren
lediglich zwei Zelltypen. Unterstützende Zytokine oder Zellen werden in den LAK-Assays
nicht berücksichtigt.
Es bleibt auch ein weiterer Punkt unberücksichtigt: Durch den Zell-Zell-Kontakt mit den
transfizierten Tumorzellen können LAK-Zellen möglicherweise in eine Anergie treten, die
dem endgültigen Eintritt der Apoptose vorangeht. Der Eintritt der Apoptose kann teilweise
erst Tage nach der Induktion erfolgen (BOSSU P. et al., 1993; MIXTER P. F. et al., 1994; SUDA T. et al.,
1997; DAS S. et al., 2000). So wäre die Fähigkeit der LAK-Zellen zur Lyse im Assay vermindert,
Diskussion
115
ohne daß nach 6 bis 20 h Apoptosekennzeichen nachweisbar wären. Zytotoxische T-Zellen in
der CLL weisen häufig Dysfunktionen bis hin zur Anergie auf. Die Gründe hierfür sind
bislang unklar (ZAKNOEN S. L. und KAY N. E., 1990; BARTIK M. M. et al., 1998; GOOLSBY C. L. et al.,
2000).
Ein weiterer direkter Effekt zum Schutz der Zielzellen kann die Induktion überlebensver-
längernder Moleküle, wie Bcl-xL, nach der Ligation von mCD137 sein (DEBENDETTE M. A. et al.,
1997; LEE H. W. et al., 2002; BUKZYNSKI J. et al., 2003). Bcl-xL ist ein Mitglied der zur Bcl-2-
Proteinfamilie. Diese Klasse von Proteinen ist an der Apoptoseregulation und der Regulation
der Permeabilität der Mitochondrienmembran beteiligt. Die antiapoptotischen Proteine Bcl-xL
und Bcl-2 können sich in die äußere Mitochondrienmembran einlagern und die Veränderun-
gen der Mitochondrienmembran, die zur Apoptose führen, verhindern (FUKUDA K. und YAMAMO-
TO M., 1999; HARRIS M. H. und THOMPSON C. B., 2000). Ob CD137-sense-transfizierte Zellen eine
höhere Bcl-xL-Expression zeigen, wurde im Rahmen dieser Arbeit nicht analysiert. Die
Zytolyse, die im LAK-Assay gemessen wird, geht nicht auf den Anteil an Tumorzellen ein,
die durch die LAK-Zellen in Apoptose getrieben wird. Sie mißt den Anteil an Zellen, die über
Perforine und GranzymB getötet wird. Diese Proteine bilden in der Membran der Targetzellen
Poren, über die das Zytosol – und damit das Farbreagenz mit dem die Zielzellen beladen
wur-den – ausläuft. Der Schutz, den Zielzellen vor CTL-vermittelter Apoptose erfahren, läßt
sich über die LAK-Assays nicht bestimmen.
4.3.2. Untersuchungen zum Mechanismus der Verminderung der
LAK-Lyse – indirekte Vermittlung des zytolysesenkenden Ef-
fekts
Die in vitro beobachtete CD137-vermittelte Senkung der Zytolyse wird vermutlich nur zu
einem Teil durch die Induktion von Apoptose bzw. Anergie in den T-Zellen bewirkt. Der nur
geringfügig höhere Anteil an apoptotischen LAK-Zellen nach Kontakt mit mCD137-trans-
fizierten Zielzellen läßt eine derart hohe Reduktion der Lyse innerhalb der LAK-Assay-Dauer
von 4 h unwahrscheinlich erscheinen. Wir untersuchten daher, ob der Schutz vor Zytotoxizität
durch ein mCD137- oder CD137-Ligand-induziertes Zytokin vermittelt wird.
Diskussion
116
4.3.2.1. Untersuchungen zum Mechanismus der Verminderung der LAK-Lyse –
indirekte Vermittlung des zytolysesenkenden Effekts durch IL-10
IL-10 ist ein wichtiges, antiinflammatorisches Zytokin, das im gesunden Organismus die Ak-
tivierung, Proliferation, Effektorfunktion und die Zytokinantworten von T-Zellen hemmt (AK-
DIS C. A. und BLASER K., 2001; AKDIS C. A. et al., 2001; MOORE K. W. et al., 2001). Es wird vorwiegend
von CD4-positiven Th2-, sowie B-Lymphozyten synthetisiert (OPAL S. M. und DE-PALO V. A.,
1999). IL-10 vermindert die Expression von Molekülen der TNF-Rezeptor-Familie auf Zellen
und fördert das shedding dieser Rezeptoren (OPAL S. M. und DEPALO V. A., 1999).
Tumoren verwenden IL-10, um durch Suppression des Immunsystems der Immunüberwa-
chung zu entkommen (SALAZAR-ONFRAY F., 1999). Die Funktion von IL-10 in der CLL wird kon-
trovers diskutiert: So soll es die Proliferation und das Überleben der B-CLL-Zellen unterstüt-
zen (JURLANDER J. et al., 1997) und sie vor Apoptose schützen (KITABAYASHI A. et al., 1995). Andere
Autoren finden in vitro eine Inhibition der Proliferation und die Induktion von Apoptose
durch IL-10 (SJÖBERG J. et al., 1995; TANGYE S. G. et al., 1998; MAINOU-FOWLER T. et al., 2001). Klinisch
korreliert die IL-10-Konzentration im Serum von CLL-Patienten negativ mit dem Krank-
heitsverlauf; d.h. eine hohe IL-10-Konzentration im Serum kommt nur in frühen Krankheits-
stadien vor. Schreitet die CLL voran ist kaum noch IL-10 detektierbar (SJÖBERG J. et al., 1995).
Für die mCD137-vermittelte Inhibition der Zytolyse spielt IL-10 keine Rolle.
LAK-Zellen sekretieren auf immobilisiertem CD137-Fc ebenso viel IL-10 wie auf Fc-Kon-
trollprotein bzw. auf unbeschichteten Platten (Kap. 3.3.3.2.1., Abb. 3.-21.). Die Freisetzung
von IL-10 durch die LAK-Zellen ist folglich unabhängig von der Gegenwart immobilisierten
CD137s.
Ein Zytokin, daß im LAK-Assay wirksam ist, muß nicht zwangsläufig von den LAK-Zellen
selbst synthetisiert werden. Daher wurde die IL-10-Konzentration in den Transfektions-
überständen der eingesetzten transfizierten Zielzellen untersucht: K562-Zellen produzieren –
gemäß ihrer Abstammung als myelotische Zellen – kein IL-10, unabhängig von der mCD137-
Dichte auf ihrer Oberfläche. Bei Raji-Zellen ist die IL-10-Sekretion unabhängig von der
mCD137-Expression (Kap. 3.3.3.2.1., Abb. 3.-22.).
CD137-sense, -antisense und kontrolltransfizierte Raji-Zellen wurden mit neutralisierenden
anti-IL-10-Antikörpern inkubiert und im LAK-Assay eingesetzt. Die Zellen zeigten eine er-
höhte Sensitivität gegenüber Zytolyse. Die Empfindlichkeit ist jedoch in allen Transfektions-
bedingungenleicht erhöht (Kap. 3.3.3.3., Abb. 3.-26.), unabhängig von der mCD137-Expres-
sion der Zellen. Das weist darauf hin, daß durch die Neutralisation von IL-10 ein durch dieses
Diskussion
117
Zytokin vermittelter Lyseschutz für die Targetzellen reduziert wird. Da aber die Freisetzung
unabhängig von der mCD137-Expression der Zellen erfolgt, hat auch die Neutralisa-tion nur
einen allgemeinen Effekt, und keinen Einfluß auf die durch mCD137-vermittelte Herabset-
zung der Lyse.
4.3.2.1. Untersuchungen zum Mechanismus der Verminderung der LAK-Lyse –
indirekte Vermittlung des zytolysesenkenden Effekts durch TGFß
TGFß ist ein weiteres potentes, immunsuppressives Molekül. TGFß supprimiert die Prolifera-
tion und Differenzierung von T- und B-Lymphozyten und ist in der Lage in lympoiden Zellen
Apoptose und Toleranz zu induzieren. Zudem hemmt es die IL-2-, IFN-g- und TNF-Produk-
tion (LETTERIO J. J. und ROBERTS A. B., 1997; OPAL S. M. und DEPALO M. D., 2000; CHEN W. et al., 2001;
KOLI K. et al., 2001; TOTTH A. et al., 2001).
Im gesunden Menschen wird TGFß1 von myelotischen Zellen, T-, und B-Lymphozyten expri-
miert (PASCHE B., 2001). LAK-Zellen, die auf immobilisiertem CD137-Fc-Fusionsprotein kulti-
viert wurden, sekretieren ebensoviel TGFß1 wie LAK-Lymphozyten, die auf Kontrollprotein
oder in unbeschichteten Platten inkubiert wurden. Die TGFß-Freisetzung liegt demnach nicht
auf der Seite der LAK-Zellen und ist unabhängig von der Vernetzung des CD137-Liganden
auf der Oberfläche dieser Zellen (Kap. 3.3.3.2., Abb. 3.-23.).
Während der Tumorentstehung und -progression spielt TGFß eine bedeutende Rolle. Von
Tumorzellen sezerniertes TGFß kann zu Tumorwachstum, -metastasierung und der Angioge-
nese beitragen; dazu kommt, daß viele Zellen während ihrer Entartung gegen die inhibitori-
schen Wirkungen von TGFß unempfindlich werden (DE VISSER K. E. und KAST W. M., 1999; HATA
A., 2001; WIESER R., 2001). Durch die immunsuppressive Wirkung bietet TGFß den Tumorzellen
darüber hinaus Schutz vor der Zerstörung durch CTLs und NK-Zellen (LETTERIO J. J. und RO-
BERTS A. B., 1997; BECK C. et al., 2001; PASCHE B., 2001; WIESER R., 2001).
Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Überstände CD137-sense-, -antisense- und kontroll-
transfizierter Tumorzellen auf ihre TGFß1-Freisetzung hin untersucht. Sowohl K562 als auch
Raji-Zellen sekretieren TGFß1. Nach der Transfektion mit dem CD137-sense-Expressions-
vektor steigt die freigesetzte TGFß1-Menge gegenüber der kontrolltransfizierter Zellen an.
Nach Transfektion mit dem antisense-Vektor fällt sie ab (Kap. 3.3.3.2., Abb. 3.-24.). Das be-
deutet, daß mit steigender Dichte an mCD137 auf der Oberfläche eine zunehmende Menge an
TGFß durch die entsprechenden Zellen sekretiert wird.
Die Funktionalität des von den Tumorzellen sekretierten TGFß wurde über Neutralisierungs-
experimente geprüft. Eine direkte Zugabe von neutralisierenden anti-TGFß1-Antikörpern zu
Diskussion
118
LAK-Assays mit transfizierten K562- und Raji-Zellen zeigte keine Wirkung auf die
Zytolyserate nach CD137-sense-Transfektion (Kap. 3.3.3.3., Abb. 3.-25.). Dies beruht ver-
mutlich darauf, daß in den LAK-Assays gewaschene Zellen eingesetzt werden; für die Frei-
setzung von löslichen Mediatoren, deren Bindung und die Induktion von Effekten stellt die
Assaydauer von 4 h eine zu kurze Zeitspanne dar.
Durch die mCD137-Expression transfizierter Zellen wird die TGFß1-Freisetzung verändert.
Deren Auswirkungen sind die transfizierten Tumorzellen bereits während der Inkubationspha-
se nach der Transfektion ausgesetzt. Daher wurden CD137-sense-, -antisense- und kontroll-
transfizierte Zellen mit neutralisierendem anti-TGFß1-Antikörper vorinkubiert. Die Antikör-
per bzw. ihre Isotypkontrolle wurde nach der Transfektion zusammen mit dem Serum den
Ansätzen zugefügt. Diese Versuche ergaben, daß die Vorbehandlung mit neutralisierenden
TGFß1-Antikörpern die CD137-vermittelte Lysesenkung aufhebt (Kap. 3.3.3.3., Abb. 3.-27.).
Die Lyseraten CD137-sense- und kontrolltransfizierter Zellen wurden auf das Niveau antisen-
se-transfizierter Zellen gesteigert. Der durch die mCD137-Expression vermittelte Schutz vor
zytotoxischer Lyse wurde also aufgehoben. Offensichtlich wird die in vitro beobachtete Inhi-
bition der zellvermittelten Lyse von Tumorzellen durch mCD137 mittels TGFß1 bewirkt.
In welcher Hinsicht TGFß den mCD137-tranfizierten Zellen ein Signal zum Schutz vor Lyse
vermittelt, ist in dieser Arbeit nicht näher untersucht. Doch gibt es in der Literatur Hinweise,
daß TGFß Tumorzellen mit hoher MHC I- und ICAM-1 Expression dahingehend verändert,
daß diese keine Entwicklung zytotoxischer T-Zellen zulassen (NAKY N. und VANKY F., 1998).
MHC I-Moleküle und ICAM-1 werden auch als schützend gegen die zytotoxische Lyse disku-
tiert (TRIOZZI P. L. et al., 1992; PALUCKA K. A. et al., 1998).
Auf den immunsuppressiven Anteil der TGFß-Wirkung gegen zytotoxische T- und NK-Zellen
geht diese Arbeit nicht näher ein, da sich dieser Teil der TGFß-Wirkung nur charakterisieren
ließe, wenn in den Überständen der LAK-Assays Unterschiede in der TGFß-Freisetzung
durch die eingesetzten Tumorzellen nachweisbar wären. Die TGFß1-Konzentrationen in den
Assay-Überständen der LAK-Assays lagen jedoch unterhalb der Nachweisgrenze (nicht ge-
zeigt).
TGFß selbst und Fehlsteuerungen des TGFß-Signalweges vermittelten Tumorgenese sowie
eine erhöhte Malignizität von Tumoren (JIRTLE R. L. und MEYER S. A., 1991; JACHIMCZAK P. et al.,
1996; MORINGA Y. et al., 1997; SIESE A. et al., 1999; STANDER M. et al., 1999; HATA A., 2001; PASCHE B.,
2001). So konnte u.a. eine enge Verzahnung des Smad2-, JNK- und Ras-pathways und die
nachfolgende NF-kB-Aktivierung nach TGFß1-induzierten Signalen nachgewiesen werden
(PARK J. I. et al., 2003). Über NF-kB werden eine Vielzahl aktivierender und überlebensför-
Diskussion
119
dernder Signale in Zellen übermittelt (KARIN M. et al., 2002; LI Q. und VERMA I. M., 2002). Auch
Synergismen mit der NF-kB-Aktivierung durch mCD137 und membrangebundenen CD137-
Ligand und den dadurch vermittelten physiologischen Funktionen (siehe Kap. 1.1.2.1.4. und
1.1.2.1.5.) sind denkbar.
Auch B-CLL-Zellen exprimieren hohe Mengen an TGFß (KREMER J. P. et al. 1992; SCHULER M. et
al., 1998). Die Effekte von TGFß auf CLL-Zellen sind jedoch nicht eindeutig: Einige Autoren
beschreiben eine antiproliferative Wirkung von endo- und exogenem TGFß auf CLL-Zellen.
Diese ist jedoch geringer als die Wirkung auf native B-Zellen (JURLANDER J., 1997; LAGNEAUX L.
et al., 1997; 1998; SCHULER M. et al., 1998). Dagegen finden L. LAGNEAUX et al. in einer Studie
keinerlei Proliferationsinhbition der CLL-Zellen bei sechs von 21 Patienten (LAGNEAUX L. et al.,
1997; 1998). In einem Artikel von G. MEINHARDT wird TGFß hinsichtlich seiner Funktion
während der CLL unter „Faktoren mit vermischten oder widersprüchlichen Effekten“ ange-
führt: Zum einen inhibiert TGFß die Proliferation der entarteten B-Lymphozyten, wenn auch
in geringerem Maße als die Zellteilung gesunder B-Zellen. Der maligne Klon erhält jedoch
einen proliferativen Vorteil durch seine verminderte Sensitivität gegenüber TGFß. So hemmt
die verstärkte Zytokinsekretion durch leukämische und Stromazellen während der CLL nor-
male Knochenmarkszellen, aber der entartete B-Zell-Klon kann expandieren (MEINHARDT G. et
al., 1999). Die gestörte Empfindlichkeit gegenüber der TGFß-Wirkung ist meist auf Mutatio-
nen der TGFß-Rezeptoren oder der Herabregulation ihrer Expression auf den CLL-Zellen zu-
rückzuführen (LAGNEAUX L. et al., 1998). B-CLL-Zellen zeigen sich resistent gegen TGFß-indu-
zierte Apoptose (DOUGLAS R. S. et al., 1989; LAGNEAUX L. et al., 1998).
Die Induktion von TGFß durch die mCD137-Expression kann so zusätzlichen Vorteil für das
Wachstum und Überleben der CLL-Zellen bedeuten, neben den überlebensfördernden und zy-
tolysesenkenden Wirkungen von mCD137 und einer möglichen Suppression der anti-Tumor-
Immunantwort durch TGFß.
4.3.2.3. Vermittlung der TGFß-Freisetzung durch CD137 oder CD137-Ligand
Bisher blieb die Frage unbeantwortet, ob die reduzierte Empfindlichkeit gegenüber der Zyto-
lyse von einem Signal durch CD137 oder durch CD137-Ligand vermittelt wird.
Die meisten LAK-Assays wurden mit transfizierten Zellen durchgeführt. In transfizierten Zel-
len wird das transfizierte Gen häufig sehr stark exprimiert, wenn es über einen viralen Promo-
tor, wie den CMV- oder RSV-Promotor in unserem System, transkripiert wird. Eine hohe Ex-
pression von Membranproteinen kann zur Folge haben, daß sich diese ohne weitere Stimula-
tion in der Membran zu Multimeren zusammenlagern und auf diese Weise entweder selbst
Diskussion
120
konstitutiv ein Signal in die sie tragende Zelle transduzieren oder auf einer Nachbarzelle vor-
kommende Liganden vernetzen und so ein Signal durch den Liganden in die Nachbarzelle
senden (FENG X. H. und DERYNCK R., 1996; LEONI C. und VALTORTA F., 2002; HUR E. M. et al., 2003).
Dies könnte zu einer Assoziation der CD137-Proteine in der Membran und u.U. der Trans-
duktion von Signalen in die transfizierten Zellen geführt haben. Die Ligation von CD137
kann zur NF-kB-Aktivierung und der Induktion der überlebensfördernden Proteine Bcl-xL
und Bfl-1 in den Tumorzellen führen (ARCH R. H. und THOMPSEN C. B., 1998; JANG I. K. et al., 1998;
LEE H. W. et al., 2002). Denkbar ist auch die Transkription und Freisetzung weiterer Moleküle
nach mCD137-Vernetzung, die das Überleben der Tumorzellen bzw. die Aktivität der LAK-
Zellen beeinflussen. Die durch mCD137 vermittelten physiologischen Funktionen in Zellen
außerhalb des Immunsystems sind kaum bekannt. Geht man von den Signalwegen aus, die
nach mCD137-Stimulation im Immunsystem beschritten werden, so sollte CD137-Ligation
eine eher aktivierende, überlebensfördernde Wirkung besitzen und entsprechende Oberflä-
chenmoleküle und Zytokine induzieren.
Zudem oder alternativ ist eine Wirkung des CD137-Moleküls über die Ligation von CD137-
Ligand-Molekülen auf den Tumorzellen möglich. Sowohl myeloide Zellen (K562), als auch
Lymphozyten (Jurkat, Raji) exprimieren CD137-Ligand (ALDERSON M. R. et al., 1994; PAULY S.,
2000; SALIH H. R. et al., 2001; SÖLLNER L., 2001). Die Vernetzung des CD137-Liganden auf ver-
schiedenen Karzinomzellinien führt zu einer deutlichen Steigerung der IL-8-Expression dieser
Zellen. IL-8 ist ein proinflammatorisches Zytokin (SALIH H. R. et al., 2000). Die Ligation von
CD137-Ligand auf Monozyten/Makrophagen hat ebenfalls aktivierende Wirkung (LANGSTEIN J.
et al., 1998; LANGSTEIN J., 1999; LANGSTEIN J. und SCHWARZ H., 1999; LANGSTEIN et al., 2000; SÖLLNER L.,
2001). Zudem hemmt eine Quervernetzung des CD137-Ligand-Proteins aktivierte T-Zellen
durch die Induktion von Apoptose (SCHWARZ H. et al., 1996; MICHEL J. et al., 1999).
Auch aus den antisense- und Blockierungsexperimenten kann nicht rückgeschlossen werden,
ob der CD137-Rezeptor oder der CD137-Ligand das Signal überträgt:
Steigt die Lyserate nach der Transfektion des CD137-antisense-Vektors an, kann dies darauf
zurückzuführen sein, daß durch die Herabregulation von CD137 in der Membran weniger
CD137-Ligand quervernetzt werden kann. Das führt zu einer Abschwächung der Lyseminde-
rung, wenn die Hemmung der Zytolyse durch ein CD137-Ligand-Signal vermittelt wird. Das
gleiche ist zu erwarten, wenn der Effekt über CD137 transduziert wird: Weniger CD137 in
der Membran entspricht weniger Signaltransduktion über dieses Molekül und damit einem ge-
ringeren „funktionellen“ Effekt (vgl. Abb. 3.-13., 3.-14. und 3.-15.).
Diskussion
121
Das Blockieren der CD137-CD137-Ligand-Wechselwirkung durch neutralisierende Antikör-
per verändert das Verhältnis der CD137-Rezeptor- zu den Ligand-Molekülen in den Mem-
branen der beteiligten Zellen nicht nicht. An CD137 gebundener Antikörper verhindert je-
doch, daß dieses Protein seinen Ligand binden und vernetzen kann. Dadurch kann weder ein
Signal durch CD137 noch eines durch CD137-Ligand übertragen werden. Im Falle der Trans-
fektion bzw. weniger CD137-Moleküle ist es darüber hinaus denkbar, daß blockierende anti-
CD137-Antikörper an eben synthetisierte oder einzeln in der Membran schwimmende
CD137-Moleküle binden, und dadurch eine Zusammenlagerung von CD137 zu Multimeren
verhindert. Ohne Multimerisierung ist jedoch die Signaltransduktion durch CD137, wie sie als
Artefakt in CD137-sense transfizierten Zellen auftreten könnte, ebenfalls nicht möglich.
Um nachweisen zu können, über welches Molekül – CD137 oder CD137-Ligand – die Lyse-
inhibition durch mCD137 vermittelt wird, wurde der Vektor pcDNA-ILA-trunc konstruiert
und in der Transfektion eingesetzt. Dieses Konstrukt verfügt nur über die Extrazellulär- und
Transmembransequenz der codierenden Region von CD137. Dadurch ist ein von diesem Vek-
tor exprimiertes trunkiertes membranständiges Protein in der Lage, über den Extrazellulärbe-
reich zu multimerisieren und den CD137-Liganden zu vernetzen, nicht aber Signale in die
Zelle zu transduzieren. Durch Oligomerisierung mit intakten CD137-Proteinen entstehen do-
minant-negative Effekte, da eine effiziente Signalübertragung davon abhängt, daß alle kom-
plexierten CD137-Moleküle über Intrazellulärregionen verfügen.
Tumorzellen, die mit dem Vektor pcDNA-ILA-trunc transfiziert wurden, sind nicht mehr im-
stande sich gegen die LAK-Lyse zu schützen (Kap. 3.3.3.4., Abb. 3.-28.). Ein Signal über
CD137 ist für die Reduktion der Lyse folglich ebenso essentiell wie das Vorhandensein von
TGFß1.
Dennoch wird TGFß1 – wie weitere Versuche mit pcDNA-ILA-trunc ergaben – unabhängig
von der Anwesendheit einer intakten Intrazellulärsequenz von mCD137 freigesetzt (Kap.
3.3.3.4., Abb. 3.-29.). Die Experimente legen nahe, daß die Induktion der TGFß-Sekretion
durch den CD137-Liganden vermittelt wird, dessen Signalübertragung durch CD137trunc
nicht gestört ist. CD137-Ligand wird sowohl auf B-Lymphozyten (Raji), wie auch auf mye-
lotischen Zellen (K562) exprimiert (ALDERSON M. R. et al., 1994;; PAULY S., 2000; SALIH H. R. et al.,
2001; SÖLLNER L., 2001).
Zusammenfassend läßt sich sagen, daß für den CD137-vermittelten Schutz vor LAK-Lyse so-
wohl ein Signal durch CD137 als auch ein Signal durch CD137-Ligand essentiell ist. TGFß
wird auf das Signal durch CD137-Ligand hin freigesetzt. Um einen höchstmöglichen Schutz
Diskussion
122
vor zytotoxischer Lyse zu erreichen, müssen Tumorzellen sowohl CD137-Rezeptor als auch
CD137-Ligand exprimieren und die Fähigkeit zur TGFß-Sekretion besitzen. Um den Körper
bei der Tumorbekämpfung zu unterstützen, muß dieser parakrine Kreislauf unterbrochen wer-
den.
4.4. Die Rolle von sCD137 in der LAK-Antwort
Die Frage, warum sCD137 in den Seren von CLL-Patienten auftaucht, wurde bislang nicht
ausreichend betrachtet. Wie in Kapitel 3.1.3. nachgewiesen werden konnte, wird sCD137 in
der CLL von den T-Lymphozyten der Patienten sekretiert. Hier sind die wichtigsten Ergebnis-
se aus Kapitel 3.1.3. noch einmal zusammengefaßt:
(i) Je aggressiver die CLL verläuft und je weiter sie fortgeschritten ist, desto mehr
sCD137 ist im Serum der Patienten nachweisbar.
(ii) Je mehr aktivierte T-Lymphozyten im Blut der CLL-Patienten vorhanden sind, desto
weniger sCD137 kann im Serum Erkrankter detektiert werden.
(iii) Auf das Überleben der CLL-Zellen hat sCD137 keine positive Wirkung.
Das erscheint widersprüchlich: Die B-CLL-Zellen scheinen keinen Vorteil vom Vorhanden-
sein des löslichen CD137 zu haben, ebensowenig die aktivierten T-Lymphozyten. Dennoch
ist sCD137 ein Kennzeichen fortgeschrittener CLL.
Um die Wirkung von sCD137 auf die anti-Tumor-Immunreaktion zu charakterisieren, wurde
die Wirkung von löslichem CD137-Fc auf LAK-Zellen untersucht. Mit CD137-Fc-Fusions-
protein vorinkubierte LAK-Zellen vermögen fünffach effizienter Lyse zu induzieren als LAK-
Zellen, die mit Fc-Kontrollprotein vorinkubiert wurden, unabhängig von der Art der Ziel-
zellen (Kap. 3.4.1., Abb. 3.-31., bzw. nicht gezeigt).
Behandelt man dagegen die Zielzellen mit löslichem CD137-Fc vor, so ergibt sich eine Stei-
gerung der Lyseempfindlichkeit der Zellen abhängig von der eingesetzten Tumorzellinie
(Kap. 3.4.1., Abb. 3.-32.). Da die Inkubation der Zellen vor dem Einsatz im Assay erfolgte,
kann hierfür die Erhöhung der Lysekapazität der LAK-Zellen ausgeschlossen werden. Es muß
sich also um einen Effekt des löslichen CD137-Proteins auf die Targetzellen handeln.
Ein Problem bei der Verwendung von CD137-Fc-Fusionsprotein kann darin bestehen, daß
über den Fc-Teil des Proteins zwei CD137-Moleküle vernetzt sind, die u.U. die Ligation von
zwei Ligandmolekülen erlauben. Das kann eine Signalübertragung durch den CD137-Ligand
bewirken. Zudem sind durch den Fc-Anteil weitere Probleme bei der Interaktion zwischen
CD137-Fc, CD137, sowie CD137-Ligand denkbar.
Diskussion
123
Um lösliches CD137 zur Verfügung zu haben, das endogenem sCD137 entspricht aber den
CD137-Liganden nicht vernetzen kann, wurde der Vektor pcDNA-ILA-w/otm entwickelt, der
für sCD137 codiert. In mCD137-exprimierenden Zellinien, wie K562 und Jurkats, konnte die
Lyse gegenüber den CD137-negativen COS-Zellen durch lösliches CD137-Fc stärker gestei-
gert werden (Kap. 3.4.2., Abb. 3.-32.); daher wurden die Auswirkungen des endogen von
pcDNA-ILA-w/otm exprimierten sCD137 an mCD137-tragenden Zellen untersucht.
Kotransfektionen von CD137-sense- und sCD137-codierenden Vektoren in COS-Zellen re-
sultierten in einer vollständigen Rekonstitution der Lyseempfindlichkeit gegenüber CD137-
sense-transfizierten Zellen. pcDNA-ILA-w/otm-transfizierte K562 oder Raji-Zellen zeigten
eine gegenüber kontrolltransfizierten Zellen deutlich gesteigerte Sensibilität für die LAK-Ly-
se (Kap. 3.4.2., Abb. 3.-33.).
Lösliche Mitglieder der TNF-Rezeptor-Familie können durch folgenden Mechanismus wir-
ken: In der Extrazellulärdomäne tragen die TNFR-Moleküle die sog. plad-Domäne, die die
Oligomerisierung der Moleküle vermittelt. Diese Domäne ist bei löslichen Molekülen erhal-
ten, so daß diese mit membranständigen Isoformen Komplexe bilden können. Dies bewirkt
dominant-negatives Verhalten bzgl. der Signaltransduktion: Durch die gemischten Komplexe
kann wegen der fehlenden Intrazellulärbereiche der löslichen Proteine kein Signal in die Zelle
transduziert werden. Dies ist für die Mitglieder der TNF-Rezeptor-Familie TNFR1 und Fas
nachgewiesen (ORLINICK J. R. et al., 1997; PAPOFF G. et al., 1999; CHAN F. K.-M. et al., 2000; SIEGEL R. M.
et al., 2000). Auch für CD137 erscheint dieser Mechanismus wahrscheinlich.
Darüber hinaus können lösliche Moleküle der TNF-Rezeptorfamilie ihre membranständigen
Liganden blockieren, indem einzelne lösliche Rezeptormoleküle an Liganden(trimere) binden,
die in der Membran schwimmen. So kann eine Multimerisierung der Liganden und dadurch
eine Signalübertragung in die Ligand-tragende Zelle verhindert werden. Dies ist u.a. für Fas
beschrieben (OWEN-SCHAUB L. et al., 2000; KAMIHIRA S. und YAMADA Y., 2001). Das in Abb. 3.-33.
gezeigte LAK-Assay mit COS-Zellen steht jedoch in scheinbarem Widerspruch zu dieser
These, da die Anwesendheit von sCD137 auf kontrolltransfizierte Zellen keinen Einfluß hat.
Dies kann aber auch darauf zurückzuführen sein, daß die in diesem Assay verwendeten COS-
Zellen keine oder eine nur niedrige Konzentration an CD137-Ligand aufweisen.
Die Wirkung von sCD137 auf die Lyseempfindlichkeit der eingesetzten Tumorzellen kann
dadurch zum Teil erklärt werden, da in Kapitel 3.3. gefunden wurde, daß die schützende
TGFß-Induktion über ein CD137-Ligand-Signal vermittelt wird. Auch ist auf Zellen B-
lymphatischen und myelotischen Ursprungs, wie K562 und Raji-Zellen, eine deutlich höhere
konstitutive Expression an CD137-Ligand zu erwarten, als auf Nieren-Epithelzellen (COS).
Diskussion
124
Um zu überprüfen, ob sCD137 die Signaltransduktion durch den Liganden blockiert, wurden
die Überstände von K562- und Raji-Zellen auf ihre TGFß-Freisetzung hin untersucht. Die
Zellen wurden vorher mit löslichem CD137-Fc inkubiert. Im Vergleich zu Zellen, die mit Fc-
Kontrollprotein kultiviert wurden, nahm in CD137-Fc-behandelten Zellen die TGFß-Sekre-
tion ab (Kap. 3.4.2., Abb. 3.-34. A und B). In pcDNA-ILA-w/otm- transfizierten Zellen zeig-
te sich die Reduktion der TGFß-Freisetzung gegenüber kontroll- und CD137-sense-transfi-
zierten Zellen noch deutlicher (Kap. 3.4.2., Abb. 3.-34. C und D).
sCD137 hat in den LAK-Assays eine doppelte Funktion: Es unterbricht die schützenden Sig-
nale durch mCD137 durch dominant-negative Interaktion. Die CD137-vermittelten Signale
werden zusätzlich zu der CD137-Ligand vermittelten TGFß-Induktion benötigt, um den
Schutz gegenüber der Zytolyse zu bewirken. Die CD137-Ligand vermittelte TGFß-Induktion
vermag sCD137 durch die Blockierung des Liganden ebenfalls zu hemmen. Dies macht
sCD137 zu einem potenten Molekül, um die tumorschützenden Effekte des CD137-/CD137-
Ligand-Systems zu unterbrechen.
Dem sCD137 im Serum der CLL-Patienen scheint daher eine eher T-Zell-unterstützende Wir-
kung zu zuzukommen, da es den Schutzmechanismus durch den parakrinen loop zwischen
CD137- und CD137-Ligand-Signalen durchbricht, die zum Schutz der entarteten Zellen vor
Zytolyse führen. sCD137 greift jedoch auch auf der Seite der CTL-Zellen in die Regulation
der anti-Tumor-Antwort ein, da eine mCD137-vermittelte Stimulation in T-Zellen die Pro-
duktion proinflammatorischer Zytokine, die Entwicklung zytolytischer Immunantworten und
die anti-Tumor-Immunität erhöht (DEBENEDETTE M. A.. et al., 1995; HURTADO J. C. et al., 1995; DEBE-
NEDETTE M. A. et al., 1997; MELERO I. et al., 1997; 1998i; SHUFORD W. W. et al., 1997; MOGI S. et al., 2000;
KIM J. A. et al., 2001; DIEHL L. et al., 2002; MILLER R. E. et al., 2002; TARABAN V. Y. et al., 2002; WILCOX
R.A. et al., 2002ii; 2002iii; YOSHIDA H. et al., 2003).
Zusammengefaßt ergibt sich für B-Zell-Tumoren oder Leukämien myelotischen Ursprungs
folgende Situation:
Myelotische oder B-lymphatische Zellen exprimieren CD137-Ligand. Durch diesen kann die
betreffende Zelle mit mCD137 – beispielsweise auf einer aktivierten T-Zelle – interagieren.
Durch dieses Signal wird die Tumorzelle zur Sekretion von TGFß angeregt. TGFß wirkt auf
die anti-Tumor-Immunzellen supprimierend. Aktivierte anti-Tumor-T-Zellen tragen CD137
und CD137-Ligand auf ihrer Membran. Signale durch die Vernetzung von CD137 durch den
CD137-Ligand auf B- oder myelotischen Zellen, wie DCs oder Monozyten, führen zu einer
starken Aktivierung der T-Lymphozyten. Dies resultiert in einer gesteigerten Proliferation, er-
höhten zytotoxischen Effektorfunktionen und der Freisetzung proinflammatorischer Zytokine,
Diskussion
125
wie IL-2 oder TNF. Außerdem beginnen die aktivierten T-Zellen CD137-Ligand zu exprimie-
ren (Abb. 4.-1.). In dieser Phase der Tumorantwort liegen die Vorteile auf der Seite der anti-
Tumor-T-Zellen. Eine Vernichtung der entarteten Zellen scheint möglich.
Abb. 4.-1.: Potentielle Wirkung der CD137-Ligand-Expression durch die Tumorzelle auf die anti-
Tumor-Antwort. Die Vernetzung von CD137-Ligand auf Tumorzellen führt zur TGFß-Se-
kretion. TGFß supprimiert die anti-Tumor-Antwort. Anti-Tumor-T-Lymphozyten erhalten je-
doch durch den CD137-Ligand auf der Tumorzelle über CD137 ein starkes aktivierendes Sig-
nal. Dies führt zum Überleben, der Proliferation, einer Steigerung der Gedächtnisfunktion und
der Freisetzung proinflammatorischer Zytokine durch die T-Zellen. Dadurch werden diese pa-
rakrin stimuliert und exprimieren infolge ihrer starken Aktivierung CD137-Ligand. In dieser
Phase der Tumorentwicklung überwiegt das CTL-stimulierende Signal durch CD137 gegen-
über dem supprimierenden TGFß-Signal. In diesem Stadium ist eine Vernichtung der Tumor-
zellen noch möglich.
Stimulation durch den CD137-Ligand^ TGFß-Freisetzung, die aber ohne zusätzliches Signal durch CD137 ohne für die Tumorzelle von nur geringer Wirkung bleibt
CD137
CD137-Ligand
TumorzelleaktivierteT-Zelle
Aktivierung durch Stimulation von mCD137^ Steigerung der CTL-Funktion^ gesteigertes Überleben^ Steigerung der Gedächtnisfunktion
^
TGFß
TGFß
Wirkung von TGFß auf Tumorzellen^ eventuell Steigerung der Proliferation^ eventuell Verringerung der Apoptose-
rate (z. B. in der CLL)^ eventuell Induktion von Apoptose
Wirkung von TGFß auf aktivierte T-Lym-phozyten^ Suppression^ Induktion von Apoptose und Anergie
Diskussion
126
Die Tumorzelle exprimiert im Verlauf der weiteren Tumorentwicklung – z.B. durch ein Mu-
tationsereignis ausgelöst – mCD137 als Neoantigen. Via CD137-vermittelte Signaltransduk-
tion durch den mCD137-Ligand von Nachbartumorzellen erhält die entartete Zelle überle-
bensfördernde Signale, z.B. durch NF-kB-Aktivierung oder die Induktion von apoptosehem-
mender Proteine, wie Bcl-xL oder Bfl-1. mCD137 schützt die malignen Zellen zudem vor der
Zytolyse durch die anti-Tumor-T-Zellen. Außerdem ist die Tumorzelle in der Lage parakrin
die CD137-Liganden auf Nachbarzellen zu vernetzen und dadurch deren TGFß-Freisetzung
zu steigern. Das sekretierte TGFß wirkt einerseits – zusammen mit den mCD137-vermittelten
Signalen – überlebensfördernd auf die Tumorzellen, andererseits supprimiert es die anti-Tu-
mor-T-Zellen und treibt sie in Apoptose und Anergie. Durch mCD137 sind die entarteten
Zellen in der Lage über die Ligation des CD137-Liganden ein weiteres apoptoseinduzie-
rendes Signal in die T-Lymphozyten zu übermitteln. Durch ihren CD137-Rezeptor erhalten
die T-Zellen weiterhin stimulierende Signale, die aber bereits der Regulation durch die gleich-
zeitige Expression von CD137-Ligand unterliegen – die Zelle bekommt mehr Signale in Rich-
tung Apoptose und Anergie (Abb. 4.-2.).
In diesem Stadium zeigen sich deutliche Vorteile für die Tumorzellen: Sie sind vor der
Zytolyse durch die CTLs geschützt. Zusätzlich erhalten sie überlebensfördernde Signale.
Gleichzeitig supprimieren die Tumorzellen die Tumorabwehr durch die Induktion von
Anergie und Apoptose.
Diskussion
127
Abb. 4.-2.: Potentielle Wirkung der gleichzeitigen Expression von CD137 und CD137-Ligand
Expression durch Tumorzellen auf die anti-Tumor-Antwort. Die zusätzliche Expression
von CD137 durch die Tumorzelle schützt diese – zusammen mit dem nach CD137-Ligand-
Vernetzung induzierten TGFß – vor der Zytolyse durch tumorreaktive T-Zellen und fördert
das Überleben und die weitere TGFß-Produktion der entarteten Zellen. Die T-Lymphozyten
sind nicht nur vermehrt dem immunsuppressiv wirkenden TGFß ausgesetzt, sondern erhalten
durch die Ligation des CD137-Liganden Apoptosesignale. Die Vorteile hinsichtlich des
Überlebens liegen nun auf der Seite der Tumorzellen.
Um der Anergie und dem CD137-Ligand vermittelten AICD zu entgehen, exprimieren die T-
Lymphozyten sCD137. sCD137 blockiert zum einen die aktivierenden Signale durch CD137
in die T-Zellen durch dominant-negative Interaktion mit mCD137-Molekülen auf der T-Zell-
Oberfläche. Zum anderen hemmt es die Transduktion apoptosefördernder Signale durch
CD137-Ligand in die T-Zellen. Auf der Seite der Tumorzelle inhibiert das freigesetzte
sCD137 ebenfalls die Signaltransduktion durch das CD137-/CD137-Ligand-System: Der pa-
Stimulation durch den CD137-Ligand^ TGFß-Freisetzung
CD137
CD137-Ligand
TumorzelleaktivierteT-Zelle
Aktivierung durch Stimulation von mCD137^ Steigerung der CTL-Funktion^ gesteigertes Überleben^ Steigerung der Gedächtnisfunktion
TGFß
TGFß
Wirkung von TGFß auf Tumorzellen^ Zusammen mit dem CD137-Signal: Schutz vor Zytolyse
Wirkung von TGFß auf aktivierte T-Zellen^ Suppression^ Induktion von Apoptose und Anergie
Stimulation von CD137-Ligand^ Induktion von Anergie und Apoptose
Stimulation durch CD137^ Überleben^ Zusammen mit TGFß: Schutz vor Zytolyse
Diskussion
128
rakrine loop aus CD137-vermittelten Überlebenssignalen und tumorfördernden Wirkungen
von CD137-Ligand-induzierten TGFß wird unterbrochen (Abb. 4.-3).
Abb. 4.-3.: Potentielle Wirkung der sCD137-Expression durch die anti-Tumor-T-Lymphozyten auf
die Interaktion zwischen Tumor- und T-Zellen. Sowohl die Signaltransduktion durch
CD137 als auch durch CD137-Ligand wird unterbrochen. Dies hebt sowohl die tumorfördern-
den Signale durch CD137 und die CD137-Ligand vermit-telte TGFß-Freisetzung auf. Zum
anderen schützt es die T-Lymphozyten vor Apoptose. Jedoch ist eine Aktivierung der T-Zellen
durch mCD137 durch sCD137 gehemmt.
Aus den zusammenfassenden Schemata geht hervor, daß es sich bei der Tumorkontrolle durch
CD137/-CD137-Ligand-Signale um ein fein abgestimmtes Netzwerk handelt. In einer Viel-
zahl von Tumoren sind Signaltransduktionswege mutiert und die Empfindlichkeit gegenüber
regulatorischen Molekülen daher modifiziert. CD137 stellt einen Immunregulator dar. Seine
Neoexpression auf Tumorzellen vermittelt zusammen mit der TGFß-Induktion durch CD137-
Ligand einen starken Schutz vor CTL-Lyse.
Stimulation durch den CD137-Ligand^ durch sCD137 aufgehoben
CD137
CD137-Ligand
TumorzelleaktivierteT-Zelle
Aktivierung durch Stimulation von mCD137^ durch sCD137 aufgehoben
Wirkung von sCD137 auf aktivierte T-Lymphozyten^ hebt die Effekte von CD137- und CD137-Ligand auf
Stimulation von CD137-Ligand^ durch sCD137 aufgehoben Stimulation durch den CD137
^ durch sCD137 aufgehoben
sCD137
Wirkung von sCD137 auf Tumorzellen^ hebt die Effekte von CD137- und CD137-Ligand auf
Diskussion
129
4.5. Ausblick
Ein wichtiges Ziel bei der Aufklärung der Bedeutung des CD137-/CD137-Ligand-Systems
bei der Tumorantwort ist es, die Relevanz dieses Systems in vivo zu bestimmen. Denkbar sind
für diese Fragestellung Experimente mit Mäusen, denen syngene Tumoren injiziert werden,
die sich in ihrer mCD137-Expression unterscheiden. Solche Versuche sollten eine klare
Aussage darüber erlauben, ob die Expression von mCD137 auch in der in vivo-Situation das
Überleben und den Schutz des Tumors vor der Zytolyse durch Immunzellen vermitteln kann.
Die deutliche Rekonstitution der Zytolyseempfindlichkeit der Tumorzellen gegenüber den
zytotoxischen Immunzellen durch sCD137 läßt die Inhibition der CD137-/CD137-Ligand-
Wechselwirkung als einen Ansatzpunkt für eine Tumortherapie erscheinen. sCD137 stellt ein
potentes Molekül dar, um den Lyseschutz zu verhindern, da es die Signaltranduktion durch
CD137 sowie die durch den CD137-Ligand zu unterbrechen vermag. Inwieweit eine Thera-
pie mit sCD137 die Regulation der anti-Tumor-Antwort auf der Seite der zytotoxischen
Zellen stört, bedarf weiterer Forschung. Die mCD137-Stimulation in T-Zellen vermittelt nicht
nur die Produktion proinflammatorischer Zytokine sondern auch die Entwicklung der
zytolytischen und tumordestruktiven Immunantworten (DEBENEDETTE M. A.. et al., 1995; 1997; ME-
LERO I. et al., 1997; 1998i; SHUFORD W. W. et al., 1997; CANNONS J. L. et al., 2001; KIM J. A. et al., 2001;
DIEHL L. et al., 2002; MILLER R. E. et al., 2002; TARABAN V. Y. et al., 2002; W ILCOX R.A. et al., 2002iii;
YOSHIDA H. et al., 2003).
Zusammenfassung
130
5. Zusammenfassung
Das CD137-/CD137-Ligand-System spielt in der Regulation von anti-Tumor-Immunantwor-
ten eine wichtige Rolle. In dieser Arbeit wurden zu ersten Mal die Auswirkungen der Expres-
sion von mCD137 auf Tumorzellen untersucht.
Das Screening von Lymphozyten-Proben eines CLL-Patientenkollektivs ergab, daß die RNA
für mCD137 in den stimulierten Zellen aller daraufhin untersuchten Patienten exprimiert
wurde. Zudem konnte die Expression des membranständigen Proteins über FACS-Analysen
und Immunfluoreszenzdoppelfärbungen bei 16 von 21 Patienten nachgewiesen werden. Dabei
handelt es sich um den ersten Nachweis von mCD137-Expression auf Proteinebene in B-Zel-
len. Auf stimulierten B-Lymphozyten gesunder Spender ist mCD137 nicht detektierbar (MI-
CHEL J., 1998). mCD137 wird auf den CLL-Zellen demnach als Neoantigen exprimiert.
In den Seren der aller getesteten Patienten wurde die lösliche Form von CD137 in Konzen-
trationen zwischen 0,08 und 1,1 ng/ml gefunden. In den Überständen stimulierter B-CLL-
Zellen konnte bei 14 von 17 Proben zwischen 0,1 und 1,2 ng/ml sCD137 detektiert werden.
RT-PCRs ergaben, daß die Zellen der überwiegenden Mehrheit der untersuchten Patienten
(10/12) die mRNA für sCD137 exprimieren. Durch Depletionsexperimenten konnte nachge-
wiesen werden, daß sCD137 – im Gegensatz zu mCD137 – während der CLL nicht von den
entarteten B-Lymphozyten, sondern von T-Zellen freigesetzt wird. Die von M. FURTNER ge-
fundene Korrelation (FURTNER M., 2001) zwischen der Leukozytenzahl und der sCD137-Kon-
zentration in den Seren von CLL-Patienten konnte bestätigt werden. Darüber hinaus konnte
gezeigt werden, daß eine positive Korrelation mit dem Prognosemarker ß2-Mikroglobulin
besteht, sowie eine inverse Korrelation mit der Anzahl an aktivierten T-Lymphozyten der
Patienten.
mCD137 wirkt auf B-CLL-Zellen überlebensverlängernd ohne Proliferation zu initiiren.
mCD137-transfizierte Tumorzellen schützt die Expression von mCD137 vor LAK-Lyse. Die-
ser Effekt wird spezifisch durch mCD137 vermittelt: Sowohl die Transfektion mit einem
CD137-antisense-Vektor als auch die Neutralisation der CD137-/CD137-Ligand-Interaktion
durch Antikörper heben den Schutz vor der zytotoxischen Lyse durch die LAK-Zellen auf.
Für den schützenden Effekt durch die mCD137-Expression der Tumorzellen konnten
folgende Mechanismen ermittelt werden:
mCD137-tragende Zellen können in LAK-Zellen geringfügig mehr Apoptose induzieren als
Kontrollzellen. Dieser Mechanismus spielt zumindest in vitro jedoch eine eher untergeordnete
Rolle. Darüber hinaus sekretieren Raji- und K562-Zellen nach Transfektion mit einem
Zusammenfassung
131
CD137-sense-Vektor TGFß. IL-10 spielt im Zusammenhang mit der mCD137-spezifischen
Reduktion der Lyse keine Rolle. Der im LAK-Assay analysierte Schutz durch TGFß wird in
erster Linie parakrin zwischen den Tumorzellen vermittelt, wie durch Neutralisierungsexperi-
mente gezeigt werden konnte. Die Freisetzung dieses Zytokins erfolgt durch reverse Signal-
transduktion via CD137-Ligand. Dies konnte durch Experimente mit transfizierten Zellen
nachgewiesen werden, die ein trunkiertes CD137-Protein exprimieren. Diese CD137-trunc-
Moleküle können weiterhin den Liganden vernetzen, sind aber selbst nicht mehr zur Signal-
transduktion befähigt. Darüber hinaus supprimieren sie die Signalübertragung von endogenem
CD137 dominant-negativ.
sCD137 hebt den die mCD137-vermittelte Reduktion der Zytolyse vollständig auf. So hemmt
es dominant-negativ die Signalübertragung durch mCD137. Zum anderen blockiert es die
TGFß-Freisetzung durch CD137-Ligand.
Insgesamt bietet die Koexpression von CD137 und CD137-Ligand myelotischen und B-
lymphatischen Leukämiezellen Vorteile: Durch ein Signal durch mCD137 und die CD137-
Ligand-induzierte TGFß-Freisetzung wird ein starker Schutz gegen Zytolyse durch anti-
Tumor-Immunzellen vermittelt. Dieser Schutz kann durch die Bereitsstellung von sCD137-
Molekülen, die beide Signalwege hemmen, aufgehoben werden.
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Die Aminosäuren sind nach dem international gebräuchlichen Ein- oder Dreibuchstabencode
abgekürzt.
Danksagung
174
8. Danksagung
Mein besonderer Dank gilt:
Herrn Prof. Dr. Ferdinand Hofstädter, der die Anfertigung dieser Arbeit und ihre Weiterfüh-rung nach dem Weggang von Dr. Herbert Schwarz ermöglichte, indem ich die Räumlichkei-ten und Laboreinrichtungen an seinem Institut benutzen durfte.
Dr. Herbert Schwarz, der mir das interessante Thema für diese Arbeit zur Verfügung stellteund die Arbeit in Regensburg und von Cambridge aus in Theorie und Praxis engagiert betreu-te und begleitete. Er stand jederzeit mit Rat zur Verfügung, ließ mir aber auch die Freiheit,eigene Ideen umzusetzen. Ohne sein Engagement, seine Anregungen, Diskussionen und daszur Verfügung gestellte Fachwissen wäre diese Arbeit nicht das, was sie ist.
Dr. Rainer Apfel, der die Betreuung des praktischen Teils meiner Arbeit übernahm, als Dr.Herbert Schwarz nach England wechselte. Er hatte immer ein offenes Ohr für auftretende La-borprobleme und das Wissen und die Bereitschaft, diese zu lösen.
Dr. Pjotr Jachimczak für seine hervorragende Einführung in die LAK-Assays.
Allen Mitgliedern der AG Schwarz für die gute Zusammenarbeit. Besonders erwähnt seienSusanne Pauly und Liane Söllner, meine Mitdoktorandinnen, Gitte Krause, die mich im Laboranlernte und die dieser Arbeit am Ende noch einmal richtig Schwung verlieh und DanielaDrenkard, die die vollen vier Laborjahre Labor, Computer, Kaffee, wissenschaftliche undprivate Sorgen und Nöte mit mir teilte.
Allen Mitgliedern der AGs Männel, Bosserhoff und Apfel sowie den Mitglieder des Institutsfür Pathologie für ihre freundliche Unterstützung und Zusammenarbeit, wann immer Ideen,Protokolle und Material benötigt wurden. Herzlichen Dank an Dr. Bernd Echtenacher für diewissenschaftlichen und privaten Diskussionen im Labor und „am Berg“.
Meinen „gesunden männlichen Probanden“ Nils Pollak, Thorsten Lieb, Peter Müller, Chri-stoph Scherübel und Dr. Michael Woenckhaus für das Sillhalten beim Blutspenden.
Dr. Hagen Blasczik, Dr. Georg Richter, Dr. Ellen Obermann, Dr. Thomas Schubert für dasBlutabnehmen für die Lymphozytenpräparationen trotz „Schnellschnitt“ und anderer Ver-pflichtungen.
Meinen Eltern, die mir durch ihre Unterstützung Studium und Promotion ermöglichten undmich nicht nur in schwierigen Phasen unterstützten.
Meiner Tochter Friederike, die immer wieder unter dieser Arbeit litt und trotzdem sonntägli-che Besuche im Labor ertrug .
Thorsten, dessen Liebe und Geduld mich durch diese Arbeit begleitete.