Aus dem Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene der Medizinischen Universität zu Lübeck Direktor: Prof. Dr. med. W. Solbach Die Interaktion von Granulozyten mit intrazellulären Krankheitserregern am Beispiel der Infektion mit Leishmania major Inauguraldissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Medizinischen Universität zu Lübeck – Aus der Medizinischen Fakultät – vorgelegt von Helmut Laufs aus Göttingen Lübeck 2001
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Die Interaktion von Granulozyten mit intrazellulären ... · Leishmania tropica Leishmania major Leishmania mexicana Leishmania braziliensis Leishmania donovani andere Genus Leishmania
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Aus dem Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene
Tag der mündlichen Prüfung: ...................................................................................................................................................
Zum Druck genehmigt, Lübeck, den ..................................................................................................................................
gez. der Dekan der medizinischen Fakultät,....…………………………………………………………………….......
4 ERGEBNISSE .......................................................................................................................... 40 4.1 DIE INTERAKTION NEUTROPHILER GRANULOZYTEN MIT LEISHMANIA MAJOR IN VITRO ................ 40 4.2 DER EINFLUß DER LEISHMANIEN AUF DIE ZYTOKINSEKRETION DURCH GRANULOZYTEN............. 51
• Stark eingeschränkte Phagozytose • Verminderte Degranulationsfähigkeit • Herabgesetzte MPO-Freisetzung • Produktion von Superoxidanionen
• Herabgesetzt bei Stimulation mit fMLP oder opsonisiertem Zymosan
• Erhalten bei Stimulation mit PMA Tabelle 1: Morphologische und funktionelle Charakteristika der Apoptose neutrophiler Granulozyten. Zusammengestellt nach (Savill, Wyllie et al. 1989) und (Whyte, Meagher et al. 1993).
Einleitung 17
Verminderung der Neutrophilenzahl lassen sich die Funktionsstörungen unterscheiden. Zur
gestörten Abwehr intrazellulärer Erreger wie Mykobakterien, Salmonellen und Listerien
kommt es zum Beispiel bei unzureichender Produktion von ROI (Lekstrom-Himes und
Gallin 2000).
1.2.2 Die Funktion von Granulozyten als afferente Zellen des Immunsystems
Bisher wurden die Effektorfunktionen der Granulozyten dargestellt, die in der Literatur gut
beschrieben sind. Wesentlich jünger ist das Verständnis von Granulozyten als afferentes
Glied im Immunsystem. Sie sind aktive Mitglieder im Kommunikationsnetzwerk der
Abwehrzellen (Lloyd und Oppenheim 1992).
1.2.2.1 Zytokine
Zytokine sind zentrale Bindeglieder zwischen der unspezifischen und der spezifischen
Abwehr. Zytokine sind kleine lösliche Proteine und Peptide mit einer Halbwertzeit von
Stunden, die auto- oder parakrin auf Zielzellen wirken (Kirchner 1994). Dabei hängt die
Wirkung nicht nur vom Botenstoff ab, sondern auch von der Zielzelle, von deren Zustand
und eventuellen weiteren auf diese Zelle wirkenden Zytokinen. Daraus ergibt sich eine
große Komplexität. Dennoch lassen sich bestimmten Immunphänomenen charakteristische
Zytokinmuster zuordnen.
Reife Granulozyten behalten ihre Fähigkeit, ein begrenztes, aber signifikantes Spektrum
von messenger RNA (mRNA) und Proteinen zu synthetisieren. Bedeutsam für die afferente
Funktion ist jedoch ihre Fähigkeit, Zytokine zu produzieren (Lloyd und Oppenheim 1992).
Es gibt zahlreiche Belege, daß Granulozyten Chemokine, Wachstumsfaktoren und
Interferone sowohl in vitro als auch in vivo produzieren (Tabelle 2, Seite 18). Darüber
hinaus wurde gezeigt, daß die Interaktion Neutrophiler mit einem gegebenen Agonist nicht
nur zur Sekretion eines spezifischen Musters von Zytokinen führt, sondern daß diese
Antwort auch durch immunregulatorische Zytokine wie Interleukin-10 und Interferon-γ
moduliert werden kann. Wenngleich ihre Vielzahl vor allem in vitro demonstriert wurde,
weisen die Neutrophilenzytokine darauf hin, daß nicht nur die Immunantwort von
Einleitung 18
Granulozyten beeinflußt werden kann, sondern gleichfalls Prozesse der Hämatopoese, der
Wundheilung, der Angiogenese und der Virusabwehr (Cassatella 1999).
Am Anfang einer Infektion stehen Zytokine, die eine Entzündungsreaktion stimulieren und
von Zellen gebildet werden, die früh am Ort der Infektion sind. Von Granulozyten werden
eine Reihe von Zytokinen produziert, die in Tabelle 2 zusammengestellt sind.
IL2-8 Andere GRO5-α Fas-Ligand GRO5-β m CD30-Ligand CINC6-1 Oncostatin M CINC6-2α GDF20 IP7-10 NGF21 m MIG8 BDNF22 m I-TAC9 m NT23-4 m MIP10-1α MIP10-1β MCP11-1 ?!
Tabelle 2: Zusammenstellung von Zytokinen oder Zytokin-mRNA, die durch neutrophile Granulozyten in vitro produziert werden. Nach (Cassatella 1999); Ausführung der Abkürzungen auf Englisch, soweit die Zytokine in dieser Arbeit näher erwähnt werden, findet sich eine deutsche Übersetzung im Text.
Einleitung 19
1.3 Granulozyten und Leishmania major
Lange Zeit galten Makrophagen als die fast ausschließlichen Wirtszellen für L. major.
Einzelheiten der Makrophagen-Parasit-Interaktion sind gut beschrieben (Solbach und
Laskay 2000). Minuten nach der Phagozytose von L. major durch Makrophagen bildet sich
um die Leishmanien eine parasitophore Vakuole, die u.a. lysosomale Hydrolasen enthält
(Lang, Hellio et al. 1994; Antoine, Prina et al. 1998). Nach diversen Teilungen des
Parasiten wird die Wirtszelle schließlich lysiert, und die freigesetzten Leishmanien können
dann weitere Zellen befallen und sich ausbreiten (Russell und Talamas-Rohana 1989),
wenn sie nicht von den Makrophagen durch NO und Sauerstoffradikale (Murray und
Nathan 1999) vernichtet werden. Neben Makrophagen im engeren Sinne können aber alle
Zellen der Monozyten-Makrophagen-Linie mit L. major infiziert werden, inklusive
Langerhans- und dendritische Zellen (Locksley, Heinzel et al. 1988; Blank, Fuchs et al.
1993; Moll, Flohé et al. 1995). Demgegenüber haben nur wenige Studien Granulozyten als
mögliche parasitäre Zielzellen zum Inhalt. In vitro-Untersuchungen zeigten die Aufnahme
und Vernichtung von L. donovani durch Granulozyten (Chang 1981; Pearson und
Steigbigel 1981). Eine andere Arbeitsgruppe demonstrierte die L. major-Infektion muriner
Knochenmarkzellen, die einen Granulozytenmarker an ihrer Oberfläche exprimierten, und
erhielt Hinweise dafür, daß ein frühes Erscheinen von Granulozyten am Ort der Infektion
ursächlich für eine Ausweitung der Infektion war (Sunderkotter, Kunz et al. 1993).
Ebenfalls als dem Überleben des Parasiten dienlich wurde die Infektion von 25% aller
Leukozyten aus Humanblut mit Leishmanien gesehen (Dominguez und Torano 1999). Bei
Hunden wurde die Infektion von Granulozyten mit L. infantum und eine resultierende
Hemmung der ROI-Produktion beschrieben (Brandonisio, Panunzio et al. 1996).
Die existierenden Vorarbeiten, die Neutrophile in der Infektion mit Leishmanien
untersuchen, sind rar. Die Erkenntnisse entstammen vor allem Tiermodellen und
Untersuchungen in vitro, während wenig Erkenntnisse zur humanen Situation vorliegen:
Bei humanen Granulozyten sind die Aufnahmemechanismen und –bedingungen für L.
major, die folgenden intrazellulären Prozesse und das Schicksal der Parasiten noch
weitgehend unbekannt. Zur Frage der Zytokinproduktion durch mit Leishmanien infizierte
Granulozyten liegen bisher keine Daten vor. Die Interaktionen zwischen menschlichen
Granulozyten und L. major bedürfen somit weiterer Untersuchung. Dies ist besonders
Einleitung 20
deshalb relevant, da Granulozyten ein entscheidendes Bindeglied zwischen angeborener
und adaptiver Immunantwort sind.
Ferner sind Granulozyten in den ersten Stunden nach der Infektion mit L. major die mit
Abstand vorherrschende Zellpopulation am Ort der Läsion (Müller, van Zandbergen et al.
2001). Experimente belegen, daß zu dieser Zeit und an diesem Ort entscheidende
immunologische Weichen im Infektionsverlauf gestellt werden. Über die Rolle der
Granulozyten während dieser Frühphase der Infektion ist nur wenig bekannt.
Fragestellung 21
1.4 Fragestellung
In dieser Arbeit wird zum einen die Bedeutung von Granulozyten als efferente Zellen und
zum anderen als afferente Zellen des Immunsystems in der Infektion mit dem
intrazellulären Erreger L. major untersucht.
Im ersten Teil werden mittels zellbiologischer und immunologischer Methoden folgende
drei Fragen bearbeitet:
• Besteht eine Interaktion zwischen Granulozyten und L. major (Erregeraufnahme)?
• Welche Auswirkungen hat diese Interaktion auf die Granulozyten und deren
Zur Untersuchung der Lebendigkeit von L. major im Zellinneren von Granulozyten wurde
das Titrationskulturverfahren angewandt (Laskay, Röllinghoff et al. 1993). Das Prinzip
dieses Verdünnungskulturverfahrens (Limiting dilution, LD) ist, eine Verdünnungsreihe
Methoden 35
einer Leishmanien enthaltenden Lösung anzufertigen, zu inkubieren und zu bestimmen, bis
zu welcher Verdünnung unter Kulturbedingungen noch Parasitenwachstum feststellbar ist.
Während der Inkubationszeit teilen sich lebendige Parasiten, und in Verdünnungsstufen,
die vor Inkubation mindestens einen (bzw. 10, siehe unten) teilungsfähigen Parasiten
enthielten, kann die Teilungsaktivität mikroskopisch nachgewiesen werden.
Die Zellen wurden in eine Zweierverdünnungsreihe (n-te Verdünnung = 2-n) in 96-Loch-
Flachbodenplatten im Dreifachansatz zu je 100 µl Medium gegeben zu Kulturbedingungen
für L. major wie unter 3.1.2 beschrieben. Die Platten wurden dann bei 27°C (s. 3.1.2) für
eine Woche inkubiert, um L. major die Teilung zu ermöglichen. Das Parasitenwachstum
wurde dann für jedes Loch (= jede Verdünnungsstufe) mikroskopisch erfaßt. Die Zahl
lebendiger Leishmanien im Inneren der sortierten Granulozyten wurde dann anhand der
letzten positiven Verdünnungsstufe bestimmt. Die Verdünnungsstufe galt als positiv, wenn
in mindestens zwei der drei Parallelansätze L. major Promastigote nachweisbar waren. Bei
der Berechnung der Ausgangszahl der lebendigen Leishmanien wurde davon ausgegangen,
daß erst ab 10 Promastigoten in einer Vertiefung Wachstum lichtmikroskopisch erfaßt wird
(Solbach, Forberg et al. 1986).
3.6.2 Sortierung nach Größe und Granularität
Granulozyten wurden mit L. major in einem Granulozyten : L. major Verhältnis von 1 : 5
für 3 Stunden bei 37°C in 1 ml Medium mit Zusatz von 20% autologem Serum, 20% FCS
oder Medium allein inkubiert. Die Zellen wurden anschließend gewaschen und in PBS
resuspendiert. Die freien Parasiten wurden nach der Inkubation mittels des
Abbildung 5: Selektion von Granulozyten anhand Größe und Granularität in der Durchflußzytometrie. Alle Zellen, die innerhalb des gestrichelt markierten Bereiches lagen, wurden positiv selektiert und aussortiert. Freie Promastigote bilden sich entsprechend ihrer geringen Größe und Granularität v.a. links unten im Dot Plot ab.
Methoden 36
Zellsortierapparates (cell sorter) von den Granulozyten abgesondert. Die freien
Promastigoten wurden anhand ihrer geringen Größen- und Granularitätsintensität
identifiziert (Abbildung 5). Zellaggregate sowie Zellen, an deren Oberfläche Leishmanien
lediglich adhärierten, konnten nicht völlig ausgeschlossen werden. Im Anschluß an die
Sortierung wurden die Zellen für 24 Stunden in 10% FCS Medium bei 37°C weiter
inkubiert (s. 3.3.2.1) und anschließend dem Titrationskulturverfahren zugeführt.
3.7 ELISA
Zur Untersuchung von Granulozyten als mögliche Produzenten von Zytokinen wurden die
Konzentrationen des proinflammatorischen Zytokins IL-8 und des antiinflammatorischen
Botenstoffes IL-1ra im Zellüberstand mittels enzymgekoppelten Immunabsorptionstest
(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) gemessen. Der IL-1ra-ELISA wurde gemäß
dem Protokoll des Testkits durchgeführt. Gleiches gilt für den IL-8-ELISA, wobei das
Prinzip sowie die Beschichtung der Platten hier kurz skizziert werden.
Eine 96-Loch-Mikrotiterplatte für ELISA wurde mit 100 µl Fangantikörperlösung (4 µg/ml
Maus anti-human IL-8 Antikörper in PBS) befüllt, die Platte abgedeckt und über Nacht bei
Raumtemperatur inkubiert. Im Anschluß wurde die Platte dreimal mit Waschpuffer (0,05%
Tween 20 in PBS, pH 7,4) gewaschen. Zur Blockade wurden 300 µl Blockierungspuffer
(1% BSA und 0,05% NaN3 in PBS ) in jede Vertiefung gegeben. Nach einer Inkubation für
60 min bei Raumtemperatur folgte ein weiterer Waschschritt.
Zur Bestimmung des freigesetzten IL-8 wurden 100 µl der IL-8 Standardverdünnung (0;
L32 und GAPDH. Das Gel wurde vakuumgetrocknet und im Anschluß auf einem Kodak
Film exponiert. Zur quantitativen Erfassung wurde eine Phosphoimaging Platte ebenfalls
aktivitätsabhängig exponiert und eingelesen.
Ergebnisse 40
4 Ergebnisse
In den folgenden funktionellen Experimenten wurde sowohl Kulturmedium mit autologem
Spenderplasma als auch -serum eingesetzt. Die Beobachtungen der Plasmaansätze
unterschieden sich nicht signifikant von denen der Serumansätze. Deshalb wird im
folgenden vereinheitlichend von Serum gesprochen.
4.1 Die Interaktion neutrophiler Granulozyten mit Leishmania major in vitro
Die Bedeutung von Granulozyten für die Abwehr extrazellulärer Erreger ist hinreichend
bekannt. So gut wie nicht untersucht ist ihre Funktion bei Infektion mit intrazellulär
wachsenden Mikroorganismen. Am Beispiel der Interaktion mit L. major sollen
wesentliche Merkmale dieser Interaktion beschrieben werden.
4.1.1 Die etablierte Isolierungsmethode liefert reine, nichtaktivierte Granulozyten
Abbildung 6: Aufgereinigte Granulozyten. Granulozyten wurden wie in 3.2.1 beschrieben aufgereinigt, und anschließend wurde ein Zytozentrifugenpräparat nach Giemsa gefärbt.
Ergebnisse 41
Die lichtmikroskopisch kontrollierte Reinheit der isolierten Granulozyten betrug über 99%
(Abbildung 6, S. 40). Die durchflußzytometrische Analyse der Oberflächenmarker für
Aktivierung, CD62-L und CD63, belegte, daß die Zellen durch die Aufreinigung nicht
aktiviert wurden (s. Abschnitt 4.1.6 auf Seite 46, Abbildung 11). Die folgenden Ergebnisse
dieser Arbeit wurden somit weder durch verunreinigende Zellen noch durch eine
Aktivierung der Zellen bereits vor Versuchsbeginn verfälscht. Einen zusätzlichen Beweis
der Reinheit der isolierten Granulozyten stellt die fehlende Nachweisbarkeit der mRNA
von IL-6 dar (4.2.4, S. 56), einem typischen Zytokin monozytärer Phagozyten, welches
normalerweise in stimulierten Monozyten- aber nicht in Granulozytenpräparationen
nachgewiesen werden kann (Bazzoni und Beutler 1996).
4.1.2 Granulozyten phagozytieren L. major
Es ist bekannt, daß Makrophagen L. major phagozytieren (Solbach und Laskay 2000). In
den ersten Experimenten dieser Arbeit sollte gezeigt werden, daß auch Granulozyten L.
major aufnehmen. Dazu wurden Granulozyten mit L. major koinkubiert. Es wurde
Abbildung 7: Granulozyten nach Inkubation mit L. major. Granulozyten in Medium mit 20% FCS-Zusatz wurden mit Leishmanien koinkubiert (Granulozyten : L. major = 1 : 5, T=37°C, t=90 min). Zur Verdeutlichung ist links ist eine Zelle dargestellt, die nicht als L. major-positiv gewertet wurde, da L. major als Promastigote lediglich mit der Zelle assoziiert erscheint, aber nicht sicher intrazellulär liegt. In der Mitte ist ein L. major-positiver Granulozyt abgebildet mit einem internalisierten Erreger (Amastigote) nach Aufnahme, rechts eine Zelle nach Aufnahme von mehr als drei Parasiten.
Ergebnisse 42
4.1.3 Granulozyten besitzen Mechanismen für die serumabhängige sowie die serumunabhängige Phagozytose von L. major.
Die folgenden Experimente sollten das Aufnahmeverhalten in einer Kinetik darstellen und
weiter untersuchen, ob Opsonine für die Phagozytose von Bedeutung sind. Dazu wurden
Granulozyten mit L. major Promastigoten in Zellkulturmedium mit unterschiedlichen
Zusätzen inkubiert (Abbildung 8). Die Zusätze unterschieden sich u.a. in der An- oder
Abwesenheit von Faktoren des Komplementsystems, die wesentliche Opsonine darstellen.
In allen Ansätzen konnte eine Aufnahme von Leishmanien beobachtet werden. Allerdings
zeigten sich unter den unterschiedlichen Inkubationsbedingungen verschiedene
Aufnahmekinetiken.
In der Gegenwart frischen Serums mit intaktem Komplementsystem, nahm der Großteil
25
30 90 180
75
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10Zeit [min]
% P
MN
mit
intr
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ren
Leis
h ma n
i en
20% Serum20% hi-Serum20% hi-FCSohne Serum
25
30 90 180
75
50
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% P
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Leis
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20% Serum20% hi-Serum20% hi-FCSohne Serum
20% Serum20% hi-Serum20% hi-FCSohne Serum
Abbildung 8: Kinetik der Phagozytose von L. major Promastigoten durch Granulozyten in vitro. Granulozyten wurden mit L. major Promastigoten bei 37°C in einem Granulozyten : L. major Verhältnis von 1 : 5 in Medium mit Zusatz von entweder 20% frischem autologem Spenderserum oder 20% hitzeinaktiviertem („hi-“) Serum oder 20% hitzeinaktiviertem FCS oder ohne Serumzusatz inkubiert. Der Prozentsatz von Granulozyten, die mindestens einen intrazellulären Parasiten aufwiesen, wurde zu den angegebenen Zeitpunkten mikroskopisch an nach Giemsa gefärbten Zytozentrifugenpräparaten bestimmt. Die gezeigten Daten stammen aus einem Experiment, welches repräsentativ für fünf durchgeführte Experimente ist.
Ergebnisse 43
der Granulozyten innerhalb weniger Minuten L. major auf (Abbildung 8). Dieser Anteil
der Granulozyten mit intrazellulären Parasiten stieg während der folgenden dreistündigen
Inkubation lediglich geringfügig weiter an.
Hitzeinaktivierung des Serums führte zu deutlich langsamerer Aufnahme von L. major
durch Granulozyten. Innerhalb der ersten 10 Minuten enthielten höchstens 10% der Zellen
Leishmanien. Jedoch nahmen über 50% der Zellen während der folgenden Inkubation über
3 Stunden Parasiten auf (Abbildung 8). Im Ansatz mit hitzeinaktiviertem FCS nahmen
knapp 30% der Granulozyten Leishmanien innerhalb von 3 Stunden auf.
Um zu untersuchen, ob Granulozyten auch Mechanismen für die opsoninunabhängige,
direkte Erkennung und Aufnahme von Leishmanien besitzen, wurden
Phagozytoseexperimente in Medium ohne Serumzusatz durchgeführt. Unter serumfreien
Bedingungen waren 10% der Granulozyten dazu in der Lage, innerhalb von 3 Stunden
Leishmanien zu phagozytieren (Abbildung 8).
Diese Versuche zeigen, daß Granulozyten in Abhängigkeit von der Zusammensetzung des
sie umgebenden Mediums unterschiedliche Mechanismen zur Phagozytose von L. major
verwenden. In Anwesenheit hitzelabiler Serumfaktoren kam es sehr schnell zur Aufnahme,
aber auch in Abwesenheit von Serum nahmen Granulozyten Leishmanien auf.
Hitzeinaktivierung von Serumfaktoren führte zu verlangsamter Aufnahme. Dies weist
darauf hin, daß Granulozyten sowohl über Mechanismen zur opsoninabhängigen als auch
zur opsoninunabhängigen Phagozytose von L. major Promastigoten verfügen.
4.1.4 Der Komplementrezeptor CR3 (Mac-1) ist von Bedeutung bei der serumunabhängigen wie auch der serumabhängigen Aufnahme von L. major durch Granulozyten.
Wie gezeigt, reduzierte die Hitzeinaktivierung des Serums die Aufnahmerate von L. major
innerhalb der ersten Minuten auf ein Minimum (Abbildung 8, S. 42). Setzt man das Serum
einer Hitzebehandlung mit 56°C aus, führt dies zur Inaktivierung hitzelabiler
Serumfaktoren, darunter Komponenten des Komplementsystems. Dies könnte dazu führen,
daß nicht genügend C3 an den entsprechenden Rezeptor CR3 auf Granulozyten binden
Ergebnisse 44
kann. Aus diesem Grunde untersuchten wir, ob CR3 an der schnellen serumvermittelten
Aufnahme von L. major durch Granulozyten beteiligt ist. Dazu wurde CR3 auf der
Oberfläche von Granulozyten in vitro mittels anti-CD11b mAk blockiert. Dies führte
annähernd zur Halbierung der Phagozytoserate von L. major durch Granulozyten im
Vergleich zu den mit Kontrollantikörper behandelten Granulozyten (Abbildung 9 A).
Neben der Vermittlung der Aufnahme mit Komplement opsonisierter Bakterien ist der
CR3 auch entscheidend an der opsoninunabhängigen Bindung von Mikroorganismen an
Phagozyten beteiligt (Wright, Weitz et al. 1988; Talamas-Rohana, Wright et al. 1990). Aus
diesem Grund wurde der Effekt von anti-CR3 mAk auch auf die komplementunabhängige
Aufnahme von L. major durch Granulozyten analysiert, d.h. in Abwesenheit von Serum. In
vitro-Blockade des CR3 führte in Medium ohne Serum zu einer Reduktion der Aufnahme
von L. major durch Granulozyten um 30% bis 70% (Abbildung 9 B).
Diese Befunde zeigen, daß der Komplementrezeptor Typ 3 an der Vermittlung der
Aufnahme von Leishmanien durch Granulozyten wesentlich beteiligt ist. Die Phagozytose
konnte durch anti-CR3 mAk jedoch nicht komplett blockiert werden. Dies spricht dafür,
daß weitere Moleküle des Serums an der Aufnahme beteiligt sind.
0
40
80
Experiment I Experiment II
Kontrollantikörperanti-CR3 mAb
% G
ranu
lozy
ten
mit
intra
zellu
läre
n Le
ishm
anie
n
20% Serum
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0
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n Kontrollantikörperanti-CR3 mAb
ohne Serum
B
Experiment I Experiment II
0
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Experiment I Experiment II
Kontrollantikörperanti-CR3 mAb
% G
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20% Serum
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Experiment I Experiment II
Kontrollantikörperanti-CR3 mAbKontrollantikörperKontrollantikörperanti-CR3 mAbanti-CR3 mAb
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n Kontrollantikörperanti-CR3 mAb
ohne Serum
B
Experiment I Experiment II
0
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n Kontrollantikörperanti-CR3 mAbKontrollantikörperKontrollantikörperanti-CR3 mAbanti-CR3 mAb
ohne Serum
B
Experiment I Experiment II
Abbildung 9: Auswirkung der Rezeptorblockade durch anti-CR3 mAk auf die Aufnahme von L. major durch Granulozyten. Granulozyten wurden mit anti-CR3 mAk für 20 min bei 37°C präinkubiert, die Kontrollansätze wurden mit einem Kontrollantikörper inkubiert. Die Granulozyten wurden dann für 2 Stunden mit L. major Promastigoten in einem Granulozyten : L. major Verhältnis von 1 : 5 bei 37°C in Medium mit 20% frischem Serum (A) bzw. ohne Zusatz von Serum (B) inkubiert. Die Aufnahme der Parasiten wurde mikroskopisch durch die Auswertung nach Giemsa gefärbter Zytozentrifugenpräparate erfaßt.
Ergebnisse 45
4.1.5 Opsonisierung mittels Mannanbindendem Lektin (MBL) trägt nicht zur serumvermittelten Aufnahme von L. major durch Granulozyten bei.
Ein Kandidat für ein solches Molekül ist das hitzelabile Mannanbindende Lektin (MBL),
das den Lektinaktivierungsweg von Komplement vermittelt (Thiel, Vorup-Jensen et al.
1997; Walport 2001).
Die mögliche Beteiligung von MBL wurde in zwei Versuchsreihen untersucht. Zuerst
wurde die Aufnahme von L. major durch Granulozyten in der Gegenwart von Serum
gesunder Spender im Vergleich zu Serum MBL-defizienter Spender verglichen. Abbildung
10 zeigt keine wesentlichen Unterschiede zwischen Normalserum und Serum mit niedriger
MBL-Konzentration. Um die Möglichkeit auszuschließen, daß die evt. vorhandene geringe
Restmenge an MBL ausreichend ist, eine MBL-abhängige Aufnahme zu vermitteln, wurde
serumfreiem Medium aufgereinigtes MBL zugesetzt. Die Anwesenheit von MBL im
Kulturmedium führte nicht zu einer erhöhten Aufnahme von L. major durch Granulozyten
(Abbildung 10). Somit sind zusätzlich zu Komplementfaktoren, die an CR3 binden,
ohne Serum 20% hi-FCS
B
% G
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lozy
ten
mit
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zellu
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n Le
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Normalserum ohne MBL
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ohne Serum 20% hi-FCS
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MBL defizientes Serum
NormalserumA
1 2 3 4
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20
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% G
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läre
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n
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MBL defizientes Serum
Normalserum
MBL defizientes SerumMBL defizientes Serum
NormalserumNormalserum ohne MBL
mit MBL
ohne MBLohne MBL
mit MBLmit MBL
Abbildung 10: Auswirkung von MBL auf die Aufnahme von L. major durch Granulozyten. Granulozyten wurden für 10 min mit L. major Promastigoten in einem Granulozyten : L. major Verhältnis von 1 : 5 bei 37°C inkubiert. A) Koinkubation in Medium mit Zusatz von 20% Normalserum zweier gesunder Spender ( ) mit 2.3 µg/ml MBL (Serum 1) bzw. 2.8 µg/ml MBL (Serum 2), oder in Medium mit Zusatz von 20% Serum zweier Patienten mit MBL-Defizienz ( ) mit 16 ng/ml (Serum 3, Allotyp LYPB/HYPD) bzw. 12 ng/ml MBL (Serum 4, Allotyp LXPA/LYPB). B) Koinkubation ohne ( ) bzw. mit 3.3 µg/ml aufgereinigtem MBL ( ) in Medium ohne Serumzusatz oder mit Zusatz von 20% hitzeinaktiviertem FCS (hi-FCS). Die Daten stammen aus einem repräsentativen von zwei durchgeführten Experimenten.
Ergebnisse 46
weitere und von MBL verschiedene hitzelabile Serumfaktoren an der serumvermittelten
Phagozytose von L. major durch Granulozyten beteiligt.
4.1.6 Nur die opsoninabhängige Aufnahme von Leishmanien aktiviert die Granulozyten.
Nachdem gezeigt war, daß Granulozyten prinzipiell zur Aufnahme von Leishmanien in der
Lage sind, untersuchten wir, ob mit Parasiten infizierte Granulozyten auch antimikrobielle
Effektormechanismen aktivieren können. Zunächst wurde die Oberflächenexpression von
A
100 101 102 103 104
100
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100 101 102 103 104
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101
102
103
104
100 101 102 103 104
100
101
102
103
104
92%
7%
91%92%
87%91%
3%
12%8%
96%8%7%
∅L. m
ajor+ L. m
ajor
ohne Serum 20% hi-FCS 20% Serum
BCD66b
CD
62-L
CD66b (mittlere Fluoreszenz) ohne Serum 20% hi-FCS 20% Serum
CD66b (mittlere Fluoreszenz) ohne Serum 20% hi-FCS 20% Serum
260 401 474 ∅ L. major 246 376 1306 + L. major
Abbildung 11: Auswirkungen von L. major auf die Oberflächenexpression von CD62-L und CD66b auf Granulozyten. Granulozyten wurden für 90 min mit L. major Promastigoten in einem Granulozyten : L. major Verhältnis von 1 : 5 bei 37°C in Medium mit Zusatz von entweder 20% frischem Spenderserum oder 20% hitzeinaktiviertem FCS oder ohne Serumzusatz inkubiert. Die Granulozyten wurden anschließend mit FITC-konjugiertem mAk gegen CD66b und mit PE-konjugiertem mAk gegen CD62-L markiert und mittels Durchflußzytometrie analysiert. Gemäß der Quadranteneinteilung bezeichnen die Prozentwerte rechts oben die CD62-L-positiven Granulozyten, die Prozentzahlen rechts unten die CD62-L-negativen (A). Die Werte der mittleren Fluoreszenz der CD66b-Färbung sind unter B dargestellt.
Ergebnisse 47
CD62-L und CD66b auf Granulozyten analysiert. CD62-L gilt als
Standardaktivierungsmarker für Granulozyten. Nichtaktivierte Zellen sind CD62-L positiv,
während aktivierte Zellen CD62-L negativ sind. Umgekehrt wird CD66b nach Aktivierung
auf höherem Niveau exprimiert. Die Daten in Abbildung 11 A (obere Reihe, „Ø L. major“,
S. 46) zeigen, daß in der Tat die in den Experimenten eingesetzten Granulozyten nicht
aktiviert waren, da sie zu rund 90% CD62-L positiv waren, bei gleichzeitig relativ
niedriger Expression von CD66b (Abbildung 11 A und B, S. 46).
Die Koinkubation der Granulozyten mit L. major führte in der Gegenwart von
Spenderserum zur Aktivierung der Granulozyten (Verlust von CD62-L-Expression,
verstärkte Ausprägung von CD66b, Abbildung 11, S. 46) zeigen konnten. Im Gegensatz
hierzu führte die Koinkubation von L. major mit Granulozyten in der Gegenwart
hitzeinaktivierten FCS oder in serumfreiem Medium nicht zur Zellaktivierung. Die
Granulozyten behielten die starke CD62-L-Expression bei (Abbildung 11 A), die von
CD66b (Abbildung 11 B) war nicht erhöht. Der ausgeprägte Aktivierungsgrad korrelierte
in den Serumansätzen mit der hohen Zahl phagozytierter Leishmanien, die niedrige
Aufnahmerate in Abwesenheit von Serumfaktoren mit der ausbleibenden Aktivierung der
Granulozyten. Die Daten in Abbildung 11 zeigen somit, daß die Aufnahme von L. major
nur dann zur Neutrophilenaktivierung führte, wenn Serumfaktoren als Opsonine zur
Verfügung standen.
4.1.7 Die opsoninabhängige Aufnahme von Leishmanien führt zur Sauerstoffradikalproduktion in Granulozyten.
Nach Aufnahme von Bakterien durch Granulozyten kommt es in der Regel zur Produktion
reaktiver Sauerstoffintermediate (oxidative burst), die zur Vernichtung der phagozytierten
Bakterien führt. Um zu überprüfen, ob dies auch in der Infektion mit eukaryonten Erregern
wie L. major der Fall ist, wurde nach Koinkubation von Granulozyten mit L. major die
Produktion intrazellulärer Sauerstoffradikale mittels Durchflußzytometrie gemessen. In der
Gegenwart frischen Serums reagierten gut 40% der Zellen mit einer oxidativen Antwort
auf die Stimulation mit Promastigoten (Abbildung 12, S. 48). Nur rund 15% der Zellen
dagegen zeigten eine erhöhte Sauerstoffradikalproduktion, wenn dem Medium
hitzeinaktiviertes Serum zugesetzt wurde. In Abwesenheit von Serum unterblieb die
oxidative Antwort nahezu gänzlich (Abbildung 12).
Ergebnisse 48
4.1.8 Der oxidative burst tötet Leishmanien ab.
Es stellte sich anschließend die Frage, welche Konsequenz die Induktion der
Sauerstoffradikalproduktion von Granulozyten für die Parasiten hat. Zur Beantwortung
dieser Frage wurde die Lebendigkeit der intrazellulären Leishmanien untersucht. Nach
zweistündiger Koinkubation von Granulozyten mit L. major (im Verhältnis 1 : 5) wurden
die freien, nicht phagozytierten Parasiten von Granulozyten mittels FACS-Sortierung
getrennt. Anschließend wurde die Zahl der lebendigen Parasiten mittels des Limiting-
Dilution-Verfahrens (3.6.1, S. 34) bestimmt. In der Gegenwart von Serum war der Anteil
der lebendigen Leishmanien sehr gering. Diese wenigen Parasiten wurden nach Inkubation
20% hi-FCS 20% SerumOhne Serum0 % 0.1 %
14 %14 % 43 %43 %
0.2 %
2 %
(O2-
Rad
ikal
prod
uktio
n)
∅L. m
ajor+ L. m
ajor
SSC
FL-1
20% hi-FCS 20% SerumOhne Serum0 % 0.1 %
14 %14 % 43 %43 %
0.2 %
2 %
(O2-
Rad
ikal
prod
uktio
n)
∅L. m
ajor+ L. m
ajor
SSC
FL-1
Abbildung 12: Auswirkungen von L. major auf die Induktion der Sauerstoffradikalproduktion durch Granulozyten. Granulozyten wurden bei 37°C mit L. major Promastigoten in einem Granulozyten : L. major Verhältnis von 1 : 5 für 10 min in Medium inkubiert mit Zusatz von entweder 20% frischem Spenderserum oder 20% hitzeinaktiviertem FCS oder ohne Serumzusatz. Die Sauerstoffradikalproduktion durch Granulozyten wurde untersucht mittels des fluorogenen Substrats Dihydrorhodamin 123, welches nach Interaktion mit Sauerstoffradikalen zu einem fluoreszierendem Produkt oxidiert wird und durchflußzytometrisch (FL-1) quantifiziert werden kann. In der linken oberen Ecke ist der Prozentteil der sauerstoffradikalpositiven Zellen angegeben. Zur Bestimmung des Schwellenwertes in FL-1, ab dem Granulozyten als ‚burst-positiv’ galten, dienten mit Phorbol-12-myristyl-13-azetat (PMA) stimulierte Granulozyten (Phagoburst®-Protokoll), in denen zu 99% - 100% die Sauerstoffradikalproduktion induziert wird. Im dargestellten Experiment resultierte als Schwellenwert eine relative Fluoreszenz von 103.
Ergebnisse 49
der infizierten Granulozyten bei 37°C für einen weiteren Tag nahezu vollständig eliminiert
(Abbildung 13). In der Gegenwart von hitzeinaktiviertem FCS war der Anteil der
lebendigen Leishmanien hoch, und 50% der intrazellulären Parasiten waren nach weiterer
Inkubation der infizierten Granulozyten für einen Tag noch lebendig (Abbildung 13).
Obwohl sich nur eine niedrige Aufnahme von L. major unter serumfreien Bedingungen
fand, war der Grad Lebendigkeit nach eintägiger Fortinkubation bei 37°C hoch (Abbildung
13).
Diese Ergebnisse zeigen eindeutig, daß die Mehrheit der Parasiten, die in Anwesenheit von
Serum aufgenommen worden waren, sofort von den Granulozyten getötet wurde. Die
wenigen überlebenden Parasiten wurden dann innerhalb eines weiteren Tages nahezu
vollständig eliminiert. Dagegen überlebten die intrazellulären Leishmanien in Ansätzen mit
hitzeinaktiviertem Serum oder in Medium ohne Serumzusatz.
Abbildung 13: Die Lebendigkeit intrazellulärer Leishmanien in Granulozyten.
Anza
hl le
bend
iger
Lei
shm
anie
n in
104
Gra
nulo
zyte
n
1000
2000
ohne Serum 20% hi-FCS 20% Serum
Anza
hl le
bend
iger
Lei
shm
anie
n in
104
Gra
nulo
zyte
n
1000
2000
ohne Serum 20% hi-FCS 20% Serum
Granulozyten wurden für 2 Stunden mit L. major Promastigoten in einem Granulozyten : L. major Verhältnis von 1 : 5 bei 37°C in Medium mit Zusatz von entweder 20% frischem Spenderserum oder 20% hitzeinaktiviertem FCS oder ohne Serumzusatz inkubiert. Granulozyten wurden anschließend von nicht phagozytierten Promastigoten mittels FACS-Sortierung getrennt, anschließend in 10% FCS Medium bei 37°C für 24 h weiter inkubiert, um die intrazelluläre Abtötung der Parasiten durch die Granulozyten zu ermöglichen. Die Vitalität von L. major wurde dann mittels eines Titrationskulturverfahrens (LimitingDilution, LD) bestimmt (s. 3.6.1). Die Ordinate zeigt die aus dem LD-Verfahren berechnete Anzahl der lebendigen Parasiten pro 104
Granulozyten (Mittelwert aus 3 parallelen Ansätzen (± SD)).
Ergebnisse 50
4.1.9 In Abwesenheit von Serumfaktoren zögert Leishmania major die Apoptose der Granulozyten hinaus.
Die Lebenszeit von Granulozyten im Körper beträgt maximal ein bis zwei Tage (Lloyd
und Oppenheim 1992). In vivo weisen die Zellen bereits nach 24 Stunden Zeichen der
Apoptose auf (Savill, Wyllie et al. 1989). In vitro zeigen Granulozyten schon nach
wenigen Stunden in Zellkulturmedium Merkmale der Apoptose (Abbildung 14, rechts).
Bei den mikroskopischen Auswertungen der bisherigen Experimente war wiederholt
aufgefallen, daß in Anwesenheit von Leishmanien nach wenigen Stunden dagegen kaum
morphologisch apoptotische Granulozyten zu finden waren (Abbildung 15). Um dies
23
123
123
1Abbildung 14: Unterschied zwischen nicht apoptotischen (links) und apoptotischen (rechts) Granulozyten. (1) Chromatin, bei Apoptose kondensiert; (2) Kernbrücken, bei Apoptose aufgehoben; (3) Zelldurchmesser, bei Apoptose vermindert
ohne L. major mit L. major
Abbildung 15: Das Apoptoseverhalten von Granulozyten in Medium mit und ohne L. major. Granulozyten wurden allein bzw. mit L. major Promastigoten in einem Granulozyten : Leishmanien Verhältnis von 1 : 5 für 12 Stunden bei 37°C in Medium inkubiert, anschließend die nach Giemsa gefärbten Präparate fotografiert.
Ergebnisse 51
weiter zu untersuchen, wurden Granulozyten in unterschiedlichen Ansätzen mikroskopisch
auf morphologische Charakteristika der Apoptose untersucht.
Nach 24 Stunden Inkubation in Medium mit Zusatz von 20% hitzeinaktiviertem FCS
zeigten Granulozyten ohne L. major zu 86% (± 1%) morphologische Merkmale der
Apoptose. Dagegen reduzierte sich die Apoptoserate nach Koinkubation der Granulozyten
mit Leishmanien auf 11% bis 54% (Abbildung 16).
Die dargestellten Ergebnisse zeigen, daß Leishmanien offenbar in das Apoptoseprogramm
der sonst kurzlebigen Granulozyten eingreifen und deren Eintreten in die Apoptose
hinauszögern.
4.2 Der Einfluß der Leishmanien auf die Zytokinsekretion durch Granulozyten
Die bisher gezeigten Ergebnisse haben belegt, daß Granulozyten Leishmanien aufnehmen
und dies Konsequenzen für die Zellfunktionen der Granulozyten hat, wie etwa für die
Produktion von Sauerstoffradikalen oder die Veränderung des Apoptoseverhaltens. In den
folgenden Experimenten ging es darum zu untersuchen, wie die Zytokinproduktion durch
die Infektion verändert wird.
20% hi-FCS
ohne L. majormit L. major
% a
popt
otis
che
Gra
nulo
zyte
n
0
20
40
60
80
100
Exp. I Exp. II Exp. III
20% hi-FCS
ohne L. majormit L. majorohne L. majorohne L. majormit L. majormit L. major
% a
popt
otis
che
Gra
nulo
zyte
n
0
20
40
60
80
100
Exp. I Exp. II Exp. III
Abbildung 16: Apoptoserate infizierter und nicht infizierter Granulozyten. Granulozyten wurden ohne (□) bzw. mit (■) L. major für 24 Stunden bei 37°C in einem Granulozyten : L. major Verhältnis von 1 : 5 in Medium mit Zusatz von 20% hitzeinaktiviertem FCS (hi-FCS) inkubiert. An nach Giemsa gefärbten Zytospinpräparaten wurde mikroskopisch der Prozentsatz von Granulozyten bestimmt, die morphologische Apoptosemerkmale aufwiesen. Dargestellt sind drei voneinander unabhängige Experimente (Exp. I-III), es wurden jeweils mindestens 100 Zellen gezählt.
Ergebnisse 52
4.2.1 L. major induziert die Bildung proinflammatorischer Zytokine durch Granulozyten.
Es ist bekannt, daß die frühe entzündliche Reaktion des infizierten Gewebes für die
Ausbildung einer spezifischen Immunantwort auf L. major bestimmend ist (Solbach und
Laskay 2000). Granulozyten bilden den Großteil des frühen entzündlichen Infiltrats. Sie
sind zur Produktion verschiedener Zytokine fähig (Cassatella 1999) und spielen somit eine
mögliche Rolle bei der Entwicklung einer spezifischen Immunantwort. Um dies zu
untersuchen, wurde die durch L. major induzierte Erzeugung pro- bzw.
antiinflammatorischer Zytokine durch Granulozyten geprüft.
Zunächst wurden die Sekretion sowie die mRNA-Expression des proinflammatorischen
chemotaktischen Zytokins (Chemokin) IL-8 untersucht. Dazu wurden Granulozyten mit
und ohne L. major für 2 bzw. 24 Stunden inkubiert. In Medium ohne Zusatz oder mit
hitzeinaktiviertem FCS blieb die Sekretion von IL-8 nach 2 Stunden mit und ohne L. major
mit unter 80 pg/ml niedrig (Tabelle 3, obere Zeilen, links und Mitte), in der Gegenwart von
Serum lag sie mit bis zu 211 pg/ml höher (Tabelle 3, obere Zeilen, rechts). Nach 24
Stunden ließ sich im Kulturüberstand in Gegenwart von L. major innerhalb aller drei
Ansatzgruppen eine deutliche Steigerung des Gehalts an IL-8 nachweisen (Tabelle 3,
untere Zeilen). Am deutlichsten war diese Steigerung in der Gegenwart von Serum mit
einer Steigerung auf über 3400 pg/ml in den Ansätzen mit L. major gegenüber den 24-
Stunden-Kontrollen ohne L. major (maximal 85 pg/ml, Tabelle 3, untere Zeilen, rechts).
Im FCS-Ansatz war diese Steigerung ebenfalls deutlich (Tabelle 3, Mitte), in der Gruppe
IL-8 Gehalt in pg/ml im Kulturüberstand von Granulozyten in Medium
ohne Serum mit 20% hi-FCS mit 20% Serum Inkubations-zeit ∅ +L. major ∅ +L. major ∅ +L. major
Exp I
2
3
72
11
85
211
2 Stunden Exp II 2 17 2 52 2 97 Exp III 18 283 47 1892 25 3994 24 Stunden
Exp IV
41 349 65 2433 85 3438
Tabelle 3: L. major stimuliert die Sekretion von IL-8 durch Granulozyten. Granulozyten wurden mit L. major Promastigoten für 2 und 24 Stunden bei 37°C in einem Granulozyten : L. major Verhältnis von 1 : 5 in Medium ohne Zusatz oder mit Zusatz von entweder 20% hitzeinaktiviertem FCS oder 20% frischem Spenderserum inkubiert. Der IL-8 Gehalt des Kulturüberstands wurde mittels ELISA bestimmt.
Ergebnisse 53
mit Medium ohne Zusatz blieb der gemessene Gehalt von IL-8 im Kulturüberstand auch in
Anwesenheit von Leishmanien mit unter 350 pg/ml vergleichsweise niedrig (Tabelle 3,
links).
Dieses beobachtete Sekretionsverhalten der Granulozyten zeigt, daß innerhalb von 24
Stunden die Freisetzung von IL-8 durch L. major induziert wird. Dies ist insbesondere in
der Gegenwart von Serum der Fall.
Es wäre möglich, daß die Dauer der Proteinbiosynthese von IL-8 ursächlich für diese
Latenzzeit ist. Deshalb wurde untersucht, ob L. major die IL-8-Produtkion auch auf
mRNA-Ebene stimuliert.
Dazu wurden Granulozyten für 3 Stunden mit bzw. ohne L. major inkubiert. Im Anschluß
daran wurde die RNA der Zellen isoliert, parallel auch RNA von frisch isolierten
Granulozyten ohne Inkubation. Die RNA wurde schließlich mittels RNase Protection
Assay (RPA) untersucht, einem semiquantitativem Verfahren, mit welchem mRNA-
Sequenzen wie z.B. von IL-8 mittels einer radioaktiv markierten Sonde spezifisch
nachgewiesen werden können (3.8, S. 37). Sowohl in frischen als auch in inkubierten
Granulozyten fand sich IL-8-mRNA (Abbildung 17, S. 54). Zur relativen Quantifizierung
wurden die detektierten Aktivitäten von IL-8 mit der jeweiligen Aktivität von L32
verglichen, einem Gen, dessen Expression konstant angenommen wird (housekeeping
gene). Es zeigte sich, daß sich die detektierten mRNA-Mengen von IL-8 für Granulozyten
nach Koinkubation mit und ohne Leishmanien kaum voneinander unterschieden und auch
ohne Inkubation die gleiche IL-8-mRNA-Menge nachzuweisen war (Abbildung 17). Somit
führt die Koinkubation von Granulozyten mit L. major zur Sekretion präformierten IL-8.
IL-1 ist ein weiteres proinflammatorisches Zytokin, das wie IL-8 u.a. chemotaktisch auf
Neutrophile wirkt. Im Gegensatz zum hauptsächlich membrangebundenen IL-1α wird IL-
1β sezerniert. Die Produktion von IL-1β-mRNA wurde parallel mit der von IL-8
untersucht.
Ergebnisse 54
Im Gegensatz zu IL-8 war in der RNA nichtinkubierter Granulozyten keine mRNA von IL-
1β zu detektieren (Abbildung 17). Nach 3 stündiger Inkubation ohne L. major wurde IL-
1β-mRNA nachgewiesen, in Gegenwart von Leishmanien war die Aktivität zudem deutlich
erhöht (Abbildung 17).
Dies bedeutet, daß Leishmanien die Produktion von IL-8 mRNA durch Granulozyten nicht
induzieren, sondern daß IL-8-mRNA konstitutiv in Granulozyten vorliegt. Dagegen liegt
die IL-1β-mRNA nicht konstitutiv vor, sondern wird durch L. major induziert. Somit
wurde nachgewiesen, daß L. major auf zwei unterschiedlichen Wegen die Kommunikation
von Granulozyten mit dem Immunsystem beeinflußt: erstens können Leishmanien eine
Steigerung der Sekretion eines Proteins, wie im Falle von IL-8 gezeigt, bewirken, und
zweitens wird die Proteinbiosynthese auf mRNA-Ebene stimuliert, wie z. B. im Falle von
IL-1β.
StundenL. major
0Ø
3Ø
3+
0Ø
L32
IL-1β
IL-1ra
IL-8
MIP-1β
MIP-1α
L32
3Ø
3+
PMN PMN
StundenL. major
0Ø
3Ø
3+
0Ø
L32
IL-1β
IL-1ra
IL-8
MIP-1β
MIP-1α
L32
3Ø
3+
PMN PMN
Abbildung 17: Zytokingenexpression von Granulozyten nach Inkubation mit L. major. Granulozyten wurden mit bzw. ohne L. major Promastigoten für 0 und 3 Stunden bei 37°C in einem Granulozyten : L. major Verhältnis von 1 : 5 in Medium mit Zusatz von 20% hitzeinaktiviertem FCS inkubiert. Die Zytokingenexpression wurde mittels RNase-Protection-Assay (RPA) untersucht. Als Mengenbezug diente das Housekeeping Gen L32. Zu diesem sind die einzelnen Zytokinbanden in Bezug zu setzen: obwohl die IL-8-Bande nach dreistündiger Inkubation mit L. major (ganz rechts) absolut schwächer ist als die der Ansätze ohne Inkubation mit L. major (links daneben) so ist der Quotient aus den Grauwerten von IL-8 und L32 desselben Ansatzes größer als in den Ansätzen ohne L. major. Die absoluten Zahlen wurden mittels der Phosphoimaging Software TINA 2.0® ermittelt (nicht dargestellt).
Ergebnisse 55
4.2.2 L. major induziert die Produktion von mRNA der Chemokine MIP-1α und MIP-1β, aber nicht von Ltn, RANTES, IP-10, MCP-1 und I-309.
Zur genaueren Beschreibung der Rolle von Granulozyten als Produzenten chemotaktischer
Zytokine wurde das Spektrum der untersuchten Chemokin-mRNA erweitert. Dazu wurde
analog zur mRNA-Untersuchung von IL-8 und IL-1β aus Granulozyten direkt nach
Aufreinigung bzw. nach 3 stündiger Koinkubation mit und ohne Leishmanien mRNA
isoliert und mittels RPA analysiert.
Die mRNA der Chemokine MIP-1α und MIP-1β wurde nicht konstitutiv exprimiert. Eine
leichte Expression der Zytokin-mRNA war jedoch nach dreistündiger Kultivierung der
Granulozyten in vitro ohne L. major nachweisbar (Abbildung 17, S. 54). Koinkubation von
Granulozyten mit L. major für drei Stunden führte zu hochgradiger Expression von MIP-
1α und MIP-1β (Abbildung 17). Dagegen konnte in keinem der Ansätze mRNA der
Chemokine Ltn, RANTES, IP-10, MCP-1 oder I-309 nachgewiesen werden (nicht
dargestellt).
Dies belegt, daß in Granulozyten die mRNA-Produktion weiterer Chemokine wie MIP-1α
und MIP-1β durch L. major induziert wird. Die fehlende Induktion von Ltn, RANTES, IP-
10, MCP-1 und I-309 zeigt, daß es sich nicht um eine generelle Aktivierung der
Zytokingentranskription handelt, sondern selektiv proinflammatorische Botenstoffe
gebildet werden.
4.2.3 Granulozyten exprimieren die mRNA des antiinflammatorischen Zytokins IL-1-Rezeptorantagonist (IL-1ra) konstitutiv und unabhängig von L. major.
Analog zur Sekretion der proinflammatorischen Zytokine wurde auch der
antiinflammatorische Botenstoff IL-1ra untersucht. Die ELISA-Experimente ergaben, daß
Leishmanien die IL-1ra-Freisetzung durch Granulozyten nicht signifikant beeinflussen
(nicht dargestellt).
Ergebnisse 56
Demgegenüber konnte die konstitutive Produktion von IL-1ra-mRNA mittels RPA
eindeutig nachgewiesen werden. Es kam aber nicht zur Induktion der mRNA durch
dreistündige Inkubation mit oder ohne L. major (Abbildung 17, S. 54).
Aus den dargestellten Ergebnissen läßt sich ableiten, daß Granulozyten grundsätzlich in
der Lage sind, den antiinflammatorischen Botenstoff IL-1ra zu produzieren und somit
entzündungsbegrenzende Kapazität haben. Infektion mit L. major fördert aber weder auf
RNA- noch auf Proteinebene die IL-1ra-Produktion, anders als bei den gegensätzlich
wirkenden proinflammatorischen Zytokinen IL-1β bzw. IL-8.
4.2.4 mRNA von IL-6, IL-10, IL-12 oder IFN-γ in Granulozyten lag weder konstitutiv noch durch L. major induziert vor.
Die L. major-Infektion ist Modell für die Etablierung einer TH1- bzw. TH2-
Immunantwort, die jeweils durch ein bestimmtes Zytokinprofil charakterisiert sind
(Solbach und Laskay 2000). Dazu gehören auf der TH1-Seite u.a. IFN-γ und IL-12 und auf
der TH2-Seite IL-6 und IL-10. NK-Zellen, Monozyten und Makrophagen sind als
Produzenten der jeweiligen immunologischen Botenstoffe gut charakterisiert. Ob
Granulozyten eventuell selbst direkt an der Ausbildung des einen oder anderen Typs der
Immunreaktion beteiligt sind, sollte durch die mRNA-Analyse spezifischer TH1- bzw.
TH2-Zytokine beleuchtet werden.
Mittels RPA wurde mRNA untersucht, die aus Granulozyten unmittelbar nach
Aufreinigung aus dem Blut oder nach Inkubation mit oder ohne L. major für 3 Stunden
isoliert worden war. Es fand sich kein Signal für IL-6, IL-10, IL-12 oder IFN-γ (nicht
dargestellt).
Somit stellen Granulozyten allein und auch nach Stimulation mit L. major keine Quelle der
genannten Zytokine dar, bilden also nicht unmittelbar die charakteristischen Zytokine, die
für die Ausbildung einer TH1- bzw. TH2-Immunantwort verantwortlich sind. Darüber
hinaus spricht der fehlende Nachweis von mRNA des monozytentypischen IL-6 gegen eine
Kontamination der Kulturen mit Monozyten und somit für einen granulozytenspezifischen
Nachweis aller vorhandenen mRNA.
Diskussion 57
5 Diskussion
In dieser Arbeit wurde die Interaktion von Granulozyten mit dem intrazellulären
Krankheitserreger L. major untersucht. Dies geschah vor dem Hintergrund, daß erstens die
Interaktion von Granulozyten mit intrazellulären Krankheitserregern im Gegensatz zu
extrazellulären kaum untersucht ist, und zweitens Granulozyten als Regulatorzellen der
unspezifischen Abwehr wenig erforscht sind. Die Bedeutung der Interaktion zwischen
Granulozyten und L. major wird durch die Tatsache unterstrichen, daß innerhalb der ersten
Stunden Granulozyten sehr schnell an den Ort einer subkutanen Infektion der Maus
rekrutiert werden (Müller, van Zandbergen et al. 2001), aber erstaunlicherweise nur wenig
über ihre Bedeutung bei der menschlichen Infektion bekannt ist.
In dieser Arbeit wurde gezeigt, daß Granulozyten in der Interaktion mit dem intrazellulären
Krankheitserreger L. major eine vielfältige Rolle spielen. Die hier dargestellten Ergebnisse
zeigen, daß opsonisierte Leishmanien von Granulozyten phagozytiert werden und diese
aktivieren. Die Aktivierung wurde funktionell durch den Nachweis der Produktion von
Sauerstoffintermediaten (ROI) belegt. Aktivierte Granulozyten sind in der Lage, innerhalb
von 24 Stunden die Mehrzahl der Parasiten abzutöten. Nicht opsonisierte Leishmanien
werden ebenfalls aufgenommen, jedoch langsamer. Die Granulozyten werden dabei nicht
aktiviert, die ROI-Produktion bleibt aus, und der Großteil der intrazellulären Erreger
überlebt. Die Untersuchungen führten zu der neuen Erkenntnis, daß die Infektion mit L.
major die Apoptose der kurzlebigen Granulozyten um 24 bis 48 Stunden hinauszögert.
Weiter wurde erstmalig gezeigt, daß L. major die Sekretion von IL-8 durch Granulozyten
hervorruft und die mRNA-Produktion des proinflammatorischen Zytokins IL-1β sowie der
Chemokine MIP-1α und MIP-1β induziert.
Die Experimente erwiesen, daß Granulozyten über unterschiedliche
Phagozytosemechanismen verfügen. Aus den Ergebnissen geht hervor, daß die Funktion
der Granulozyten und damit auch das Schicksal der Parasiten davon abhängt, wie L. major
in die Zelle aufgenommen wird. Welcher dieser Mechanismen sich die Granulozyten zur
Aufnahme von L. major hauptsächlich bedienen, liegt in der Zusammensetzung des
Milieus begründet, das sie umgibt. Während beispielsweise in Medium ohne Serum keine
Komplementfaktoren enthalten sind, stehen diese bei Zusatz frischen Serums zur
Diskussion 58
Verfügung. Zusammen mit anderen hitzelabilen Faktoren können sie für die schnelle
Aufnahme von L. major durch Granulozyten verantwortlich gemacht werden.
Es ist bekannt, daß an der komplementvermittelten Phagozytose durch Neutrophile der
Komplementrezeptor CR3 beteiligt ist (Witko-Sarsat, Rieu et al. 2000). Durch Blockierung
dieses Rezeptors mittels Antikörper wurde die Aufnahme von Leishmanien durch
Granulozyten deutlich reduziert. Dies belegt, daß CR3-abhängige Mechanismen an der
Phagozytose von L. major durch Granulozyten wesentlich beteiligt sind. Die Aktivierung
des alternativen Wegs der Komplementkaskade mit resultierender Ablagerung von C3b auf
der Oberfläche von L. major Promastigoten wurde beschrieben (Mosser und Edelson 1987;
Puentes, Da Silva et al. 1990) ebenso wie deren CR3-vermittelte Aufnahme durch
Makrophagen (Mosser, Vlassara et al. 1987). Die hier dargestellten Resultate zeigen, daß
offenbar nicht nur Makrophagen, sondern auch Granulozyten über vergleichbare CR3-
bedingte Aufnahmemechanismen verfügen.
Die Blockierung von CR3 auf Granulozyten führte zu einer Reduktion der Phagozytoserate
um 30% bis 70%. Dies bedeutet, daß dieser Rezeptor nicht nur an der oben diskutierten
opsoninabhängigen, sondern auch an der opsoninunabhängigen Ingestion von L. major
durch Granulozyten beteiligt ist. Von Makrophagen ist eine serumunabhängige Bindung
des Oberflächenmoleküls LPG von Leishmania mexicana an eine CR3-Untereinheit
bekannt (Talamas-Rohana, Wright et al. 1990). Für Granulozyten wurde die Fähigkeit zur
opsoninunabhängigen, aber CR3-vermittelten Phagozytose bei Streptokokken der Gruppe
B gezeigt (Antal, Cunningham et al. 1992). Die CR3-Beteiligung an der
opsoninunabhängigen Aufnahme von L. major durch Granulozyten ist allerdings hier
erstmals direkt belegt.
Auf der anderen Seite zeigten die Blockierungsexperimente, daß zusätzlich zu CR3 weitere
Oberflächenmoleküle an der Aufnahme von L. major und deren Bindung an die
Granulozytenoberfläche beteiligt sein müssen, da die Zugabe von anti-CR3-Antikörper zu
Granulozyten nur zur teilweisen Blockierung der Phagozytose von L. major führte. Ein
weiterer, serumabhängiger Mechanismus, der zu einer CR3-unabhängigen Aufnahme von
L. major durch Granulozyten führt, könnte die Opsonisierung der Parasiten mit natürlichen
Antikörpern sein, die an Fcγ-Rezeptoren auf Granulozyten binden. Eine solche
Phagozytose mit Antikörpern opsonisierter Mikroorganismen durch Granulozyten wurde
Diskussion 59
bereits beschrieben (Witko-Sarsat, Rieu et al. 2000), und natürliche Antikörper, die an
Leishmanien binden, konnten in frischen Seren nachgewiesen werden (Schmunis und
Herman 1970).
Die langsamere Phagozytoserate von L. major durch Granulozyten nach Hitzeinaktivierung
des Serums zeigte, daß hitzelabile Komponenten die schnelle Aufnahme vermitteln. Dazu
gehören Komplementfaktoren, aber auch das Mannanbindende Lektin (MBL), eine
hitzelabile Serumkomponente, deren wichtige Rolle bei der Komplementaktivierung und
der Phagozytose von Mirkoorganismen durch Phagozyten bereits gezeigt wurde (Vorup-
Jensen, Jensenius et al. 1998). MBL hat einen opsonisierenden Effekt und erhöht die
Aufnahmerate mannosereicher Pathogene durch Granulozyten (Kuhlman, Joiner et al.
1989). Es bindet an endständige Mannosereste des Lipophosphoglykans auf der Oberfläche
von Leishmanien und wirkt als Aktivator der Komplementkaskade. Die Anheftung des
MBL an die Oberfläche promastigoter Leishmanien stellt einen zusätzlichen Mechanismus
der C3b-Bildung dar, welche die Bindung an Makrophagen mitbewirkt (Green, Feizi et al.
1994). Experimente in dieser Arbeit mit MBL-defizienten Seren und aufgereinigtem MBL
unterstützten allerdings diese Bedeutung von MBL für die Opsonisierung bei der
serumabhängigen Aufnahme von L. major durch Granulozyten nicht. Also müssen neben
Komplementfaktoren, die an CR3 binden, weitere hitzelabile Serumfaktoren existieren, die
sich von MBL unterscheiden und an der serumvermittelten Aufnahme promastigoter
Leishmanien durch Granulozyten beteiligt sind.
In den Experimenten ohne frisches Serum war eine Aufnahme zu beobachten, die im Fall
von Granulozyten in Medium mit hitzeinaktiviertem FCS zwar langsam war, aber
letztendlich zu einer hohen Aufnahmerate führte. In verschiedenen Untersuchungen konnte
die Aufnahme von Bakterien durch Granulozyten in Abwesenheit von Antikörpern und
Komplement demonstriert werden (Ofek, Goldhar et al. 1995; Dong und Murphy 1997;
Estabrook, Zhou et al. 1998) ebenso die serumunabhängige Aufnahme von Leishmanien
durch deren direkte Bindung an den Mannoserezeptor auf Makrophagen (Wilson und
Pearson 1986; Wilson und Pearson 1988). Aber da Granulozyten den Mannoserezeptor
nicht exprimieren, ist ein davon verschiedener Mechanismus der Leishmanienbindung an
Granulozyten unter serumfreien Bedingungen noch zu erforschen.
Diskussion 60
Granulozyten sind somit in der Lage, Leishmanien in den verschiedenen Milieus auf
unterschiedliche Art und Weise aufzunehmen. Dabei konnten zum Teil neue und zum Teil
im Zusammenhang mit anderen Erregern oder bei Makrophagen beschriebene
Mechanismen identifiziert werden. Es wurde gefunden, daß CR3 maßgeblich an der
Aufnahme von L. major durch Granulozyten beteiligt ist. Entscheidend für die
Interpretation dieser Ergebnisse ist allerdings die Frage, welche Konsequenzen sich aus
den unterschiedlichen Aufnahmewegen für die Abwehr der Parasiten ergeben.
Eine Granulozyten-Erreger-Interaktion hat in der Regel eine Aktivierung der Zelle zur
Folge. Eine artifizielle Aktivierung der Granulozyten durch die Aufreinigung mußte zur
weiteren funktionellen Untersuchung der Zellen zunächst ausgeschlossen werden, denn
Aktivierung und Degranulation durch unterschiedliche Isolierungsmethoden von
Granulozyten sind in der Literatur beschrieben (Haslett, Guthrie et al. 1985; Kuijpers, Tool
et al. 1991). Die in dieser Arbeit angewandte Methode zur Granulozytenaufreinigung
stellte den Einsatz nicht voraktivierter Granulozyten sicher, wie die hohe CD62-L-
Expression der isolierten Zellen bewies. Dies wurde durch die Vermeidung eines
hypotonen Lyseschritts zur Beseitigung der Erythrozyten erreicht, indem diese mittels
Dichtegradient separiert wurden. So konnte eine Stimulation der Granulozyten durch
Membranfragmente lysierter Erythrozyten verhindert werden, wie sie in der Literatur
beschrieben ist (Dominguez und Torano 1999).
Es wurde gezeigt, daß die Granulozyten bei Aufnahme von L. major in der Gegenwart von
Serum aktiviert werden, was zur Elimination der Erreger durch die Produktion toxischer
Sauerstoffintermediate führt. Dieser Befund entspricht früheren hinweisenden Berichten,
daß reaktive Sauerstoffintermediate Hauptmediatoren der Tötung von Leishmanien durch
Granulozyten sind (Chang 1981; Pearson und Steigbigel 1981; Murray und Nathan 1999).
Es wurde beschrieben, daß Granulozyten aus Kaninchenblut in der Gegenwart frischen
autologen Serums L. infantum aufnehmen und effizient töten, wofür ROI als Agens
vermutet wurden (Brandonisio, Panunzio et al. 1996). Ganz im Gegensatz dazu blieb in
den Experimenten dieser Arbeit eine Aktivierung der Granulozyten in Medium mit
hitzeinaktiviertem FCS oder ohne Zusatz von Serum aus, obwohl es auch in diesen
Ansätzen zu einer Aufnahme von L. major kam. Die fehlende Aktivierung war auch mit
einer fehlenden Sauerstoffradikalproduktion der Granulozyten verbunden. Das bedeutet,
daß die an der serumunabhängigen Aufnahme beteiligten Mechanismen den oxidative
Diskussion 61
burst nicht induzieren oder L. major in die Lage versetzen, die Sauerstoffradikalproduktion
zu verhindern. In der Konsequenz überlebt L. major die Phagozytose durch Granulozyten.
Dies ist ein interessanter Aspekt der Rolle von Granulozyten in der Abwehr eines
intrazellulären Erregers: statt zur Vernichtung führt die Interaktion von Granulozyten mit
L. major zu dessen Aufnahme ohne Abtötung. Bei der Humanen Granulozytären
Ehrlichiose (HGE) wurde kürzlich ebenfalls gezeigt, daß Ehrlichien die
Sauerstoffradikalproduktion von Granulozyten inhibieren (Mott und Rikihisa 2000). Zwar
ist die Fähigkeit der Leishmanien bekannt, der tödlichen Stickoxidproduktion durch
Makrophagen zu entgehen (Buchmüller-Rouiller und Mauël 1987; Passwell, Shor et al.
1994). Für L. donovani wurde auch beschrieben, daß eine membranständige saure
Phosphatase die ROI-Produktion von Neutrophilen inhibiert (Remaley, Glew et al. 1985).
Die Beobachtung aber, daß L. major seine Vernichtung durch die
Sauerstoffradikalproduktion von Granulozyten vermeiden kann, ist dagegen neu.
Die endgültige Wirtszelle der Leishmanien sind nicht Granulozyten, sondern Makrophagen
(Solbach und Laskay 2000). Somit könnten Granulozyten in der Frühphase der Infektion
einen „Übergangswirt“ bis zur Ankunft der Makrophagen an der Infektionsstelle darstellen
und eine pathologische Rolle in der Entzündung spielen. Diese Sichtweise erscheint um so
attraktiver vor dem Hintergrund des Befundes, daß L. major die Apoptose der
Granulozyten hinauszögert. Dies könnte L. major Zeit geben, sich wie in einer
parasitophoren Vakuole vor toxischen Agenzien zu schützen, wie es in Makrophagen der
Fall ist (Solbach und Laskay 2000).
Die Verzögerung der Apoptose von Granulozyten durch L. major ist in den Experimenten
mit Medium und hi-FCS sicher belegt worden. Daß L. major die Apoptose der aktivierten
Granulozyten in der Gegenwart von Serum hinauszögert, ist unwahrscheinlich. Denn
Studien haben gezeigt, daß Phagozytose mittels CR3 die Apoptose Neutrophiler induziert.
Als Kandidat für das Bindeglied zwischen Phagozytose und Apoptose in Granulozyten
werden ROI angeführt (Coxon, Rieu et al. 1996; Oishi und Machida 1997). In
Granulozyten von Spendern mit NADPH-Oxidase-Defizienz (CGD-Patienten) kommt es
nicht zur Apoptose, was auch auf den Zusammenhang zwischen ROI und Apoptose
hinweist (Coxon, Rieu et al. 1996). Dies stützt die dargestellten Beobachtungen, daß L.
major das Leben derjenigen Granulozyten verlängert, in denen die ROI-Produktion nicht
induziert wird und die Parasiten nicht abgetötet werden.
Diskussion 62
Bereits in einem sehr frühen Apoptosestadium werden Granulozyten spezifisch von
Makrophagen erkannt und innerhalb von Minuten aufgenommen und abgebaut (Savill,
Wyllie et al. 1989). Der programmierte Zelltod von Granulozyten stellt eine das Gewebe
schonende Beseitigung der Granulozyten dar und kann als physiologisch vorgesehene
Begrenzung des Entzündungsprozesses verstanden werden. Granulozyten ohne L. major
werden natürlicherweise apoptotisch. Für diese spontane Apoptose ist eine
Proteinneusythese nicht erforderlich (Whyte, Savill et al. 1997). Dagegen ist die
Verhinderung der Apoptose von Granulozyten ein aktiver Prozeß bezüglich einer
notwendigen Neusynthese von ‚Überlebensproteinen‘ (Whyte, Savill et al. 1997).
Granulozyten zeigen darin ein gegensätzliches Verhalten zu anderen Zellarten. Somit
können die Befunde, daß L. major die Apoptoserate von Granulozyten senkt, dadurch
erklärt werden, daß die Granulozyten synthetisch aktiv werden. Die Produktion zweier
Kandidaten für ein solches ‚Überlebensprotein’ durch Granulozyten nach Koinkubation
mit L. major, wurde in dieser Arbeit demonstriert: Sowohl IL-8 als auch IL-1β haben eine
die Apoptose verzögernde Wirkung (Kettritz, Gaido et al. 1998). Colotta und Mitarbeiter
fanden unter In-Vitro-Bedingungen eine Steigerung der Überlebensrate von Granulozyten
nach Inkubation mit IL-1β um 89,5% (Colotta, Re et al. 1992).
Eine Möglichkeit der Apoptoseverzögerung durch Leishmanien wurde für Makrophagen
beschrieben. Intrazelluläre L. donovani verhindern den Eintritt von Makrophagen in die
Apoptose. Inkubation dieser Zellen mit LPG, welches auch auf L. major vorkommt,
resultierte ebenfalls in Hemmung der Apoptose (Moore und Matlashewski 1994). Auch
andere intrazelluläre Krankheitserreger, die Granulozyten infizierten, machten diese Zellen
gegen den programmierten Zelltod resistenter, wie zum Beispiel für den Erreger der HGE
gezeigt (Yoshiie, Kim et al. 2000). Somit hemmen verschiedene intrazelluläre
Mikroorganismen, die auf das Überleben ihrer Wirtszelle angewiesen sind, effektiv die
Mechanismen der Apoptose, darunter auch L. major.
Aus den Beobachtungen, daß L. major nach Aufnahme durch Granulozyten in Medium
nicht abgetötet wird, sondern im Gegenteil einen Übergangswirt in Granulozyten findet
und dessen Apoptose verzögert, erscheint ummittelbar vorteilhaft für den Parasit. Dagegen
werden die Leishmanien in aktivierten Granulozyten vernichtet. Diese unterschiedlichen
Auswirkungen auf den Krankheitserreger spiegeln die unterschiedlichen Funktionen der
Diskussion 63
Granulozyten wider, die diese in der Auseinandersetzung mit L. major haben können. Dies
verdeutlicht, daß Granulozyten nicht unflexible Effektorzellen des Immunsystems sind, die
mittels präformierter Botenstoffe immer die gleiche Abwehrfunktion ausüben, um dann
nach kurzer Aktivität durch Makrophagen abgeräumt zu werden. Die Befunde dieser
Arbeit zeigen vielmehr eine flexible Rolle der Granulozyten in der frühen Immunabwehr
von L. major.
Diese Tatsache wird durch die Identifikation der Zytokine, die von Granulozyten nach
Interaktion mit L. major spezifisch produziert wurden, unterstützt. Die kurzlebigen
Granulozyten wurden lange Zeit für reine Freßzellen gehalten, unfähig Proteine zu
synthetisieren. Das lag u.a. daran, daß sie ihre Fähigkeit zur Phagozytose aufrechterhalten
auch wenn experimentell die ohnehin spärlich ausgebildeten Organellen blockiert werden,
die an der Proteinsynthese beteiligt sind (Lloyd und Oppenheim 1992). Inzwischen ist aber
klar, daß Neutrophile über eine Kapazität zur Synthese einer – wenn auch begrenzten –
Palette sowohl von Effektorproteinen als auch von Zytokinen verfügen (Lloyd und
Oppenheim 1992). Durch die in dieser Arbeit nachgewiesene Produktion von Zytokinen
können Granulozyten auf den weiteren Verlauf der Immunantwort Einfluß nehmen und
spielen dadurch im Immunsystem zusätzlich zu ihrer Rolle als efferente Zellen eine Rolle
als Regulatorzellen (afferente Zellen) der sich aufbauenden spezifischen Immunreaktion.
Im Vergleich zu Monozyten ist bei Granulozyten der Besatz mit Ribosomen und
Organellen des Endoplasmatischen Retikulums dürftig. Im Rahmen der Experimente dieser
Arbeit fiel der geringe Gehalt ribosomaler RNA dieser Zellen auf. Deshalb mußten etwa
fünfmal so viele Neutrophile eingesetzt werden, um eine ausreichende RNA-Menge
isolieren zu können, wie Monozyten hätten eingesetzt werden müssen. Das
Ungleichgewicht der Potenz Neutrophiler und Monozyten, Zytokine in einer biologisch
relevanten Menge zu produzieren ist nur ein scheinbares. Berücksichtigt man das im
Gewebe herrschende Verhältnis von Granulozyten zu Makrophagen von mindestens 20 : 1,
wie es zehn Stunden nach Infektion am Ort der Läsion vorliegt (Müller, van Zandbergen et
al. 2001), müßte ein einzelner Granulozyt nur ein Zwanzigstel der Zytokinmenge eines
Monozyten produzieren, damit die absolute Menge – und damit die Bioaktivität – identisch
ist.
Diskussion 64
Granulozyten in ihrer großen Zahl sind relevante Produzenten von Zytokinen und können
den Verlauf der Immunantwort beeinflussen, wie anhand der IL-8-Sekretion durch
Granulozyten gezeigt werden konnte. Obwohl IL-8 von verschiedenen Zellen sezerniert
wird, darunter T-Lymphozyten, Epithelzellen, Keratinozyten, Fibroblasten und
Endothelzellen, stellen Neutrophile eine der wichtigsten Quellen dieses Zytokins dar
(Cassatella 1999). Gleichzeitig sind sie selbst auch die Hauptzielzellen von IL-8, so daß
die IL-8-Produktion zu einer sich selbst fördernden Rückkopplung führt (Gainet, Chollet-
Martin et al. 1998). Neben seiner chemotaktischen Bedeutung aktiviert IL-8 noch weitere
Zellfunktionen wie beispielsweise die Phagozytose (Baggiolini, Walz et al. 1989). Die
durch Leishmanien hervorgerufene IL-8-Sekretion durch Granulozyten führt daher
wahrscheinlich zur beschleunigten Rekrutierung von Granulozyten an den Ort der
Infektion und verstärkt die Ingestion der Parasiten. Zudem könnte die chemotaktische
Wirkung von IL-8 auf T-Lymphozyten eine Rolle in der Entwicklung einer T-Zell-
vermittelten Immunreaktion gegen L. major spielen. Ob die IL-8-vermittelte T-Zell-
Rekrutierung an der kürzlich bei Mäusen beschriebenen granulozytenabhängigen
Ausbildung einer TH2-dominierten Immunantwort beteiligt ist (Tacchini-Cottier, Zweifel
et al. 2000), bleibt zu erforschen.
Neben IL-8 zählt auch IL-1 zu den wichtigen proinflammatorischen Zytokinen. IL-1 wurde
initial als potentes Pyrogen identifiziert, das seine Wirkung bereits im femtomolaren
Bereich entfaltet. Neben seiner Funktion als die Apoptose von Granulozyten verzögernder
Mediator ist für IL-1 u.a. die Erhöhung des oxidative burst in Granulozyten und die
Induktion proinflammatorischer Zytokine, darunter IL-8, beschrieben. IL-1 führt außerdem
zur vermehrten Expression von Zelladhäsionsmolekülen (Curfs, Meis et al. 1997). Die
dargestellten Experimente zeigten, daß L. major innerhalb von 3 Stunden die IL-1β-
Produktion der Granulozyten auf Ebene der Transkription induziert. Dies steht im Einklang
mit Befunden, daß Granulozyten nach Stimulation mit LPS zwei bis sechs Stunden zur
Transkription der mRNA von IL-1β benötigen (Lloyd und Oppenheim 1992). Im
Gegensatz dazu induziert L. major die IL-8-Sekretion auf posttranslationaler Ebene. IL-1β
kann seine ergänzende proinflammatorische Wirkung demzufolge erst zeitlich versetzt zu
IL-8 entfalten, fördert dann aber bereits speziellere Abwehrmechanismen wie die
Auslösung des oxidative burst. Somit konnten in dieser Arbeit Granulozyten als
Produzenten der immunologischen Botenstoffe IL-8 und IL-1β identifiziert werden, die
Diskussion 65
entscheidend an der Entstehung und Aufrechterhaltung einer akuten Entzündung beteiligt
sind.
Darüber hinaus ergibt sich aus den Experimenten, daß Granulozyten eine maßgebliche
Bedeutung für den Aufbau der frühen unspezifischen Entzündungsreaktion und der
nachfolgenden spezifischeren Immunantwort haben. L. major induziert die mRNA-
Produktion des inflammatorischen Makrophagenproteins (MIP) durch Granulozyten. Für
MIP-1α und MIP-1β ist vor allem eine chemotaktische Wirkung auf Monozyten, T-Zellen
und im Falle von MIP-1α auf alle Arten der Granulozyten beschrieben (Ben-Baruch,
Michiel et al. 1995; Curfs, Meis et al. 1997). Neben diesem allgemeinen
proinflammatorischen Effekt bewirken MIP-1α und MIP1-β eine Veränderung der
Zusammensetzung des zellulären Infiltrats am Ort der Entzündung. Während in der frühen
Phase der Entzündung Granulozyten vorherrschen, werden sie im eher chronischen Verlauf
durch mononukleäre Phagozyten und Lymphozyten abgelöst (Beil, Meinardus-Hager et al.
1992). Stimulierte Granulozyten haben als Produzenten des Chemokins MIP-1α an dem
Wechsel des zellulären Infiltrats von Granulozyten zu mononukleären Zellen den
Hauptanteil (Kasama, Strieter et al. 1993). Antikörperblockade von MIP-1α führte zur
Reduktion der gesamten durch Neutrophile bewirkten chemotaktischen Wirkung auf
Monozyten um 60% (Kasama, Strieter et al. 1993). Im Fall der Leishmanieninfektion in
vivo zeigte die immunhistologische Analyse der Läsionen von Patienten mit kutaner oder
viszeraler Leishmaniose eine moderate bzw. deutliche Erhöhung von MIP-1α. Innerhalb
der untersuchten Gruppe chemotaktischer β-Zytokine war MIP-1α als einziges deutlich
exprimiert, und die Autoren sehen es verantwortlich für die Rekrutierung von
Makrophagen und T-Zellen in der kutanen Leishmaniose (Ritter, Moll et al. 1996). In der
vorliegenden Arbeit wurde demgemäß gezeigt, daß Granulozyten als Produzenten von
MIP-1α eine afferente Rolle in der Immunantwort bei Infektion mit dem intrazellulären
Erreger L. major zukommt.
Die fehlende Induktion der Chemokin-mRNA von Ltn, RANTES, IP-10, MCP-1 und I-309
bedeutet, daß Granulozyten diese nicht ohne weiteres produzieren und daß die Aufnahme
von L. major zur differentiellen Produktion nur bestimmter Zytokine führt. Außer für IP-10
und MCP-1 gibt es für die Produktion der genannten Chemokine durch Granulozyten bis
heute keinen Hinweis in der Literatur.
Diskussion 66
Weder ohne noch mit Stimulation mit L. major konnte mRNA der Interleukine IL-6, IL-10,
IL-12 oder von IFN-γ nachgewiesen werden. Wie anhand eines Mausmodells in der
Infektion mit L. major erforscht, korreliert die Heilung der Infektion im Verlauf u.a. mit
einem erhöhten Spiegel von IL-12 und IFN-γ (TH1-dominierte Immunantwort), der fatale
Ausgang mit Erhöhung von IL-6 und IL-10 (TH2-dominierte Immunantwort) (Solbach und
Laskay 2000). Das in dieser Arbeit genutzte In-Vitro-System gibt keinen Hinweis auf
Granulozyten als direkte Quelle dieser Zytokine. Es ist aber möglich, daß andere durch
Granulozyten sezernierte Zytokine über die Stimulation unterschiedlicher Zellen des
Immunsystems die Weichenstellung der Immunantwort beeinflussen.
Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, daß die serumabhängige Aufnahme von L. major
zur schnellen Tötung der intrazellulären Leishmanien führt, wohingegen der Großteil der
intrazellulären Parasiten in Granulozyten überlebt, wenn L. major in Abwesenheit
hitzelabiler Serumfaktoren phagozytiert wird. Der Parasit ist dann in der Lage, die
Sauerstoffradikalproduktion der Granulozyten zu vermeiden. Diese Befunde legen eine
Doppelrolle der Granulozyten bezüglich ihrer Interaktion mit L. major nahe. Einerseits
üben Granulozyten eine Abwehrfunktion in der frühen Immunreaktion gegen diesen
Parasiten aus, indem sie L. major vernichten. Andererseits stellen Granulozyten
möglicherweise ein intrazelluläres Milieu für Leishmanien bereit, das den Parasiten ein
Überdauern der ersten Stunden bis Tage der Infektion ermöglicht. Das Überleben
intrazellulärer Pathogene wie L. major im Wirtsorganismus hängt von der Fähigkeit der
Phagozyten ab, diese Mikroorganismen zu erkennen und zu internalisieren. Letztere
können allen antimikrobiellen Substanzen des umgebenden Milieus entgehen, wenn es
ihnen gelingt, eine intrazelluläre Vakuole zu bilden. Myeloide Zellen wurden lange für
sichere Zielzellen (‚safe targets’) der Leishmanien gehalten (Mirkovich, Galelli et al.
1986). Es wurde nachgewiesen, daß Komplementaktivierung durch Membranbestandteile
promastigoter Leishmanien zum für die Infektion mit Leishmanien nötigen
Komplementverbrauch führt (Ilg, Stierhof et al. 1995; Peters, Kawakami et al. 1997).
Folglich könnte dieser lokale Komplementverbrauch nach Infektion mit Leishmanien ein
Milieu schaffen, in dem eine komplementunabhängige Aufnahme der Parasiten erfolgt, die
zu deren verlängerten Überleben führt. Da L. major in Granulozyten nach
opsoninunabhängiger Phagozytose in Granulozyten überleben kann, könnten diese Zellen
den Leishmanien als sichere Zielzellen (‚safe targets’) zum Überleben der Frühphase der
Diskussion 67
Infektion dienen. Dies stünde in Einklang mit der Ansicht, daß die schnelle Aufnahme
promastigoter Leishmanien durch Leukozyten nach der Infektion die früheste
Überlebensstrategie der Parasiten ist (Dominguez und Torano 1999).
Zwei mögliche Bedeutungen ergeben sich aus dem Überleben der Leishmanien in
Granulozyten, das mit der Lebensverlängerung der Wirtszelle assoziiert ist. Einerseits mag
dies die Überbrückung der Zeit bis zur Ankunft der Makrophagen ermöglichen, den
eigentlichen Wirtszellen von L. major. Deren Rekrutierung bewirken neben IL-8 und IL-1β
v. a. MIP-1α und MIP-1β, deren Synthese von L. major induziert wurde. Andererseits
bedeutet die verlängerte Lebensspanne und Rekrutierung der Granulozyten durch IL-8 und
IL-1β eine protrahierte Entzündungsreaktion und ermöglicht die Produktion
immunologischer Botenstoffe, die zur Ausbildung einer spezifischen Immunantwort zu
Ungunsten der Parasiten führen kann.
Die Antworten auf die Fragestellung dieser Arbeit werden in der folgenden Grafik noch
einmal zusammenfassend dargestellt.
Diskussion 68
Abbildung 18: Zusammenfassung. A: In Anwesenheit von Serumfaktoren führt die Interaktion von Granulozyten und L. major zur Phagozytose der Parasiten durch Neutrophile. Diese werden aktiviert, verlieren die Expression von CD62-L und verstärken jene von CD63 (A1). Gleichzeitig kommt es zur Sauerstoffradikalproduktion und konsekutiven Vernichtung der intrazellulären Erreger (A2). Durch die Sekretion von IL-8 und die Induktion der mRNA von MIP-1a, MIP-1ß und IL-1ß kommunizieren Granulozyten mit anderen Zellen der Immunabwehr (A3, B3). Ohne Serum werden Leishmanien langsamer aufgenommen, die Granulozyten werden nicht aktiviert und produzieren keine Sauerstoffradikale (B2), die IL-8-Sekretion ist niedrig. Bei Infektion mit L. major wird die natürliche Apoptose hinausgezögert (B2), und L. major könnte bis zur Ankunft von Makrophagen überleben und in diesen eine sichere Zielzelle (safe target) finden (B3).
Zusammenfassung 69
6 Zusammenfassung
Granulozyten sind die Hauptabwehrzellen bei Infektionen durch extrazelluläre
Krankheitserreger. Bei einer Infektion mit dem intrazellulären Pathogen Leishmania major
(L. major) sind Granulozyten die ersten Abwehrzellen am Ort der Infektion, aber ihre
Bedeutung für die Immunantwort ist kaum erforscht. In dieser Arbeit wurde die Interaktion
von humanen Granulozyten mit L. major in vitro untersucht. Dazu wurden Granulozyten
mit einer Reinheit von über 99% aus peripherem venösen Humanblut isoliert. Die
Expression der Oberflächenmarker CD62-L und CD63 belegte, daß die aufgereinigten
Zellen nicht aktiviert waren.
Koinkubation von Granulozyten mit Leishmanien führte zur Phagozytose der Parasiten
durch die Granulozyten, woran der Komplementrezeptor CR3 beteiligt war.
Inkubationsexperimente mit und ohne Zusatz von Serum bzw. hitzeinaktiviertem Serum
zum Kulturmedium wiesen hitzelabilen Serumfaktoren eine entscheidende Bedeutung bei
der Interaktion zwischen Granulozyten und L. major zu: In Anwesenheit hitzelabiler
Serumfaktoren nahmen rund 50% der Granulozyten innerhalb von zehn Minuten L. major
auf. Dies führte zur Aktivierung der Granulozyten und zur konsekutiven intrazellulären
Produktion von Sauerstoffradikalen. Mikroskopische Analysen zeigten, daß infizierte
Granulozyten die Leishmanien innerhalb eines Tages nahezu vollständig eliminierten. In
Medium oder hitzeinaktiviertem (hi-) FCS dagegen, also in Abwesenheit hitzelabiler
Serumfaktoren, nahmen innerhalb von 10 Minuten weniger als 10% der Granulozyten
Leishmanien auf, nach drei Stunden rund 30% (hi-FCS). Die Zellen wurden nicht aktiviert,
die Sauerstoffradikalproduktion unterblieb, und die Parasiten wurden intrazellulär nicht
getötet.
Die natürlicherweise sehr kurzlebigen Granulozyten zeigten in Medium mit hi-FCS
innerhalb von 24 Stunden zu über 80% zellmorphologisch Zeichen der Apoptose, dagegen
nur etwa 10% bis 50% der Zellen nach Koinkubation mit Leishmanien.
Gegenüber nichtinfizierten Granulozyten steigerte die Infektion mit L. major die
granulozytäre Sekretion von IL-8 um rund 300 pg/ml ohne und rund 3000 pg/ml mit
hitzelabilen Serumfaktoren und induzierte die mRNA-Produktion der Zytokine MIP1α,
MIP-1β und IL-1β in Medium mit hi-FCS.
Zusammenfassung 70
Die Experimente zeigen, daß Granulozyten eine Doppelrolle in der Bekämpfung von L.
major zukommt. In Anwesenheit von hitzelabilen Serumfaktoren tragen sie als
Effektorzellen zur Reduktion der Parasitenlast bei. Andererseits dienen sie L. major in
Abwesenheit hitzelabiler Serumfaktoren als Wirtszelle. Durch die Produktion von
Zytokinen modulieren Granulozyten als Regulatorzellen die Immunantwort. Die Fähigkeit
der Leishmanien, die Granulozytenapoptose zu verzögern und intrazellulär zu überleben,
stellen wichtige Evasionsfaktoren dieses Erregers dar.
Literaturverzeichnis 71
7 Literaturverzeichnis
Antal, J. M., Cunningham, J. V., Goodrum, K. J.: Opsonin-independent phagocytosis of
group B streptococci: role of complement receptor type three. Infect Immun 60(3): 1114-21
(1992)
Antoine, J. C., Prina, E., Lang, T., Courret, N.: The biogenesis and properties of the
parasitophorous vacuoles that harbour Leishmania in murine macrophages. Trends
Microbiol 6(10): 392-401 (1998)
Baggiolini, M., Walz, A., Kunkel, S. L.: Neutrophil-activating peptide-1/interleukin 8, a
L.: Neutrophils: molecules, functions and pathophysiological aspects. Lab Invest 80(5):
617-53 (2000)
Wright, S. D. und Silverstein, S. C.: Receptors for C3b and C3bi promote phagocytosis
but not the release of toxic oxygen from human phagocytes. J Exp Med 158(6): 2016-23
(1983)
Wright, S. D., Weitz, J. I., Huang, A. J., Levin, S. M., Silverstein, S. C., Loike, J. D.:
Complement receptor type three (CD11b/CD18) of human polymorphonuclear leukocytes
recognizes fibrinogen. Proc Natl Acad Sci U S A 85(20): 7734-8 (1988)
Yoshiie, K., Kim, H. Y., Mott, J., Rikihisa, Y.: Intracellular infection by the human
granulocytic ehrlichiosis agent inhibits human neutrophil apoptosis. Infect Immun 68(3):
1125-33. (2000)
***
Eigene Veröffentlichungen 82
8 Eigene Veröffentlichungen
ORIGINALARBEITEN Laufs H.; Müller, K.; Fleischer, J.; Reiling, N.; Jahnke, N.; Jensenius J.C.; Solbach, W.; Laskay, T. Intracellular survival of Leishmania major in neutrophil granulocytes after opsonin-independent uptake. Infect Immun. (in press)
Müller, K.; van Zandbergen, G.; Hansen, B.; Laufs, H.; Jahnke, N.; Solbach, W.; Laskay, T. Chemokines, NK cells and granulocytes in the early course of Leishmania major infection in mice. Med Microbiol Immunol (Berl). (in press)
Laufs, H.; Nigrovic, P.; Schneider, L.; Oettgen, H.; del Nido, P.; Moskowitz, I.; Perez-Atayde, A. Giant cell myocarditis in a 12 year-old girl with common variable immunodeficiency. Mayo Clin Proc. (in press)
VORTRÄGE In vitro Untersuchungen zur Interaktion von Granulozyten und Leishmania major (4. Minisymposium „Infektion und Immunabwehr“ auf Burg Rothenfels, 1998)
Interactions of Leishmania major with human granulocytes in vitro (15. Frühjahrstagung der Deutschen Gesellschaft für Immunologie, Stuttgart, 1999)
DISSERTATIONSARBEIT Die Interaktion von Granulozyten mit intrazellulären Krankheitserregern am Beispiel der Infektion mit Leishmania major. Aus dem Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene der Medizinischen Universität zu Lübeck (http://www.hygiene.mu-luebeck.de)
http://www.laufs.com/helmut/dissertation.pdf
Danksagung 83
9 Danksagung
Herrn Prof. Dr. med. WERNER SOLBACH gilt mein besonderer Dank für die Vergabe des Themas der
Dissertation und seine jederzeit vorbildliche leitende Betreuung der Arbeit sowie seine ständige
Verfügbarkeit.
Herrn Prof. Dr. med. HOLGER KIRCHNER danke ich für die Beratung im Umfeld dieser Arbeit und im
gesamten Studium sowie für die großzügige Möglichkeit, zur Etablierung der Granulozytenaufreinigung auf
Buffy coats seines Instituts zurückgreifen zu dürfen. Herrn Privatdozent Dr. rer. nat. LOTHAR RINK danke ich
für die unterstützende Beratung zu Fragen der immunologischen Untersuchung von Granulozyten und die
initiale Bereitstellung von Antikörpern.
Frau NICOLE JAHNKE danke ich für die Einführung in allgemeine Verhaltensweisen im Labor, speziell das
molekularbiologische und das Arbeiten mit Zellkulturen und das geistige Salz in der und um die Laborsuppe
zu jedem Zeitpunkt der Arbeit.
Frau Diplom Biologin KERSTIN MÜLLER danke ich für die Weitergabe der Erfahrung im RPA sowie
unermüdlichen Diskurs.
Frau MAREN GERKE danke ich für die professionelle und freundschaftliche Einführung in eine Technik der
Granulozytenisolierung.
Den Mitarbeitern des Instituts für Biochemie danke ich für die Erlaubnis der Mitbenutzung ihrer
Phosphoimaging-Einrichtungen, dem Institut für Molekularbiologie für die Möglichkeit, im Radioaktivlabor
zu arbeiten.
Herrn Dr. JENS FLEISCHER und Herrn Dr. NORBERT REILING danke ich für die Durchführung der
Zellsortierung im Forschungszentrum Borstel.
Ganz besonders herzlich möchte ich mich bei Herrn Privatdozent Dr. rer. nat. TAMÁS LASKAY für seine
immer ausgezeichnete, engagierte und besonders freundschaftliche Betreuung in allen Phasen der Arbeit
bedanken. Ohne seine mitreißende Begeisterung für wissenschaftliches Arbeiten (und viele andere Dinge
darüber hinaus) und seine kompetente und konstruktive Kritik hätte die Arbeit nur halb so viel Spaß gemacht.
Die Versuche wurden mit finanzieller Unterstützung des Sonderforschungsbereichs 367/B10 der Deutschen
Forschungsgemeinschaft durchgeführt.
Stichwortverzeichnis 84
10 Stichwortverzeichnis
A
Amastigote 8, 41
Apoptose 16, 33, 50, 51, 61, 62
C
CD62-L 12, 33, 41, 46, 47, 60
CD63 33, 41
CD66b 33, 46, 47
CR3 32, 43, 44, 58
E
ELISA 36, 52
F
FCS-Medium Siehe Medium
Fragestellung 21, 67
G
Giemsafärbung 32
Granulozytenaufreinigung 29, 40, 60
H
Hitzeinaktivierung 31, 43
I
I-309 55, 65
IFN-γ 18, 56, 66
IL-1 18, 53, 64
IL-10 56, 66
IL-12 18, 56, 66
IL-1ra 18, 55
IL-6 18, 56, 66
IL-8 18, 36, 52, 53, 64
IP-10 18, 55, 65
K
Komplementsystem 13, 42, 43
L
Leishmania major 6, 28
Aufnahme 41, 42, 43, 44, 45, 59
Granulozyten, und 19
Identifikation 33
Inkubation 32
Krankheitsformen 9
Lebendigkeit Siehe Vitalität
Lebenszyklus 7, 8
Lipophosphoglykan Siehe LPG
opsoninunabhängige Aufnahme 42,
43, 62
Stamm 28
Taxonomie 7
Vitalität 34, 49
Leishmaniose 9, 10
Limiting dilution Siehe
Titrationskulturverfahren
LPG 8, 58, 62
L-Selektin Siehe CD62-L
Ltn 55, 65
M
Mac-1 Siehe CR3
Mannanbindendes Lektin Siehe MBL
MBL 14, 31, 45, 59
MCP-1 18, 55, 65
Stichwortverzeichnis 85
Medium 31, 42, 43, 45, 47, 50, 57
MIP 18, 55, 65
mRNA Siehe RNA
N
Neutrophile Granulozyten 10
Affektorfunktion 17, 63
Aktivierung 13, 41, 47, 60 Siehe
aufgereinigte 40
Effektorfunktion 12, 17, 60
Enzyme 12
Funktion 11, 17, 66
Funktionsstörungen 16
Isolierung Siehe
Granulozytenaufreinigung
Lebenszeit 50
Leishmania major, und 19, 40
Reinheit 30, 41
Sortierung 35
Zytokine 18, 51, 54, 55, 56
NNN Siehe Novy-Nicolle-MacNeal
Novy-Nicolle-MacNeal 28
O
Opsonine Siehe Komplementsystem
Opsonisierung 42, 45, 47
oxidative burst 15, 19, 34, 47, 48, 60
P
Parasit 28
Phagozytose 41, 42, 43, 59
Plasma Siehe Medium
polymorphkernige Leukozyten Siehe
Neutrophile Granulozyten
Promastigote 8, 41
Propagation 28
R
RANTES 55, 65
reactive oxygen intermediates Siehe
oxidative burst
RNA 37, 54, 55, 56, 63
RNase Protection Assay Siehe RPA
ROI Siehe oxidative burst
RPA 37, 38, 56
S
safe target 66, 68
Sauerstoffradikale Siehe oxidative burst
Serum Siehe Medium
Software 26
T
TH-Zellantwort 6, 56, 66
Titrationskulturverfahren 34, 48
Trypanosomatiden 7
Z
Zellen 29
Zellkultur 31, 32
Zusammenfassung 68, 69
Zytokine 17, 18, 51, 52, 54, 56, 63, 64
Lebenslauf 86
11 Lebenslauf
Name: Helmut Laufs
Geburtstag und -ort: 9. Juni 1975 in Göttingen
SCHULEN:
1985 – 1994 Kath. Jesuitengymnasium Sankt-Ansgar-Schule, Hamburg
08/1991 – 01/1992 Huron High School, Ann Arbor, Michigan, U.S.A.
1994 Abitur
STUDIENSTIFTUNG:
1994 Aufnahme in die Studienstiftung des Deutschen Volkes
STUDIUM:
1994 – 2001 Humanmedizin an der Medizinischen Universität zu Lübeck
1996 Ärztliche Vorprüfung
1995 – 1996 Informatik an der Fernuniversität Hagen Kurs: Konzepte imperativer Programmierung
10/1996 – 02/1997 Humanmedizin an der Universität Wien
1997 I. Staatsexamen, Humanmedizin
10/1998 Famulatur an der Harvard Medical School, Cardiovascular Division, Department of Medicine (Dr. J. K. Liao), Brigham and Women’s Hospital, Boston, U.S.A.
2000 Stipendium der Studienstiftung des Deutschen Volkes für ein PJ-Tertial an der Harvard Medical School, Boston, U.S.A.
PROMOTION:
1/1998 – 8/1999 Experimentelle Durchführung am Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene der Med. Universität zu Lübeck, Direktor: Prof. W. Solbach
BERUF:
seit 8/2001 Arzt im Praktikum an der Klinik für Neurologie der Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt am Main, Direktor: Prof. H. Steinmetz