DFG€¦ · Die DFG stellte den Antragstellern am Zentrum für Molekulare Biologie, Universität Heidelberg (ZMBH) ein Elektrospray-Quadrupol-Time of Flight Hybrid Massenspektrometer

Berichte der geförderten

Wissenschaftlerinnen und Wissenschaftler

zur

DFG – Großgeräteinitiative

Hochleistungs-Massenspektrometer

in den Biowissenschaften

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Im Jahr 1999 hatte der Apparateausschuss der DFG in einer

Großgeräteinitiative biowissenschaftliche Arbeitsgruppen in Deutschland aufgerufen, moderne Hochleistungs-Massenspektrometer - darunter insbesondere die Fourier-Transform- und Time-of-Flight-Hybrid-Geräte mit Ionenquellen (ICP, ESI, MALDI) - zu beantragen. In diesem Rahmen wurden in den Jahren 1999 und 2000 mehr als 30 erfolgreichen Antragstellerinnen und Antragstellern aus verschiedenen Bereichen der Biowissenschaften und Analytischen Chemie entsprechende Geräte bereitgestellt. Die Wissenschaftlerinnen und Wissenschaftler wurden im Herbst 2003 zu einem Symposium eingeladen, um über ihre Projekte und insbesondere ihre Erfahrungen mit den entsprechenden Geräten und deren Einsatzmöglichkeiten in den speziellen Forschungsgebieten zu berichten. Diese Berichte finden sich nun in dem vorliegenden Tagungsband als Kurzfassungen der Vorträge wieder. Zu dem Symposium wurden auch Gutachter und Berichterstatter der Großgeräte-initiative eingeladen, die im Anschluss an die Kurzfassungen ihren Abschlussbericht vorlegen.

Seiten 4 – 60: Berichte zu den geförderten Projekten:

�� Be 482/1-1: De novo Sequenzierung von Peptiden mit einem Q-TOF Massenspektrometer, K. Beyreuther, C. Clayton, D. Görlich, R. Herrmann, G. Multhaup, M. Stitt, Biomolekulare Chemie, ZMBH, Heidelberg

�� Bu 617/13-1: Nutzung des LC-MS/MS-Spektrometers QStar des SFB 388 an der Universität Freiburg, Fakler, B. et al., Physiologisches Institut II, Universität Freiburg

�� Ei 272/9-1: Innovative Isotopenanalyse von geochemischen und klimatologischen Archiven mittels MC-ICPMS, Eisenhauer, A., GEOMAR, Forschungszentrum für Marine Geowissenschaften, Kiel

�� Ei 304/1-1: Sequenzierung integraler Membranproteine aus 2D-Nativer/SDS-PAGE, Eichacker, L.A., Department für Biologie I, Universität München

�� Fi 253/16-1: Massenspektrometrische Detektion der posttranslationalen C(alpha)-Formylglycin-Bildung in Sulfatasen, Thomas Dierks, Bernhard Schmidt, Jianhe Peng, Kurt von Figura, Abteilung Biochemie II, Universität Göttingen

�� Ge 386/3-1: Strukturanalyse von Glykokonjugaten und anderen Biomolekülen durch ESI-MS, Rudolf Geyer, Biochemisches Institut, Justus-Liebig-Universität Gießen

�� He 1383/9-1: Überblick über die MS-Analytik mit dem Q-STAR XL an der Heinrich-Heine Universität Düsseldorf, Sabine Metzger, Johannes H. Hegemann, Biologisch Medizinisches Forschungszentrum (BMFZ) Institut für Mikrobiologie, Heinrich-Heine Universität Düsseldorf

�� He 1887/6-3: Kurzbericht über die mit dem Tandem-Hybrid-Massenspektrometer QSTAR erarbeiteten Ergebnisse, Michael Hecker, Dörte Becher, et al., Institut für Mikrobiologie, Universität Greifswald

�� Ho 1311/3-1: N-dimensionale Proteomanalyse mit Parallelchromatographie und offline-Identifikation und Quantifizierung mittels Mikroplattentechnik, Kreusch, S., Hoppe, H., Bublitz, R., Rhode, H., Moore, T., Cumme, G. A., Ditze, G., Schulze, M. und A. Horn, Klinikum der FSU Jena, Institut für Biochemie I, Cybio AG, Jena, Klinikum der FSU Jena, Werkstatt der MTI, Jena

�� Ho 2222/2-1: Analyse des humanen Tau-Proteins, Ralf Hoffmann, Biotechnologisch-Biomedizinisches Zentrum, Fakultät für Chemie und Mineralogie, Universität Leipzig

�� Ka 783/3-1: FTe or not FTe MS – das ist hier die Frage, Karas, M., Bahr, U. et al., Institut für Pharmazeutische Chemie, JW Goethe-Universität Frankfurt

�� Le 597/3-1: Proteinidentifizierung und Identifizierung von Phosphorylierungen mit MALDI-TOF MS, Pfannstiel, J. et

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al., Biochemisches Zentrum, Universität Heidelberg �� Li 309/19-1: Erste Erfahrungen mit dem LTQ-FT MS: Die hochauflösende Ionenfalle, Sebastian Beck, Timo

Hagemeister, Michael W. Linscheid, Institut für Chemie, Humboldt Universität zu Berlin �� Li 448/1-1: Analyse von Glycokonjugaten mittels FT-ICR MS: Beiträge zur Struktur – Wirkungsbeziehung bakterieller

Zellwandkomponenten, Buko Lindner, LG Biophysik, Forschungszentrum Borstel �� Me 765/8-1: Einsatz des FTICR am Medical Proteom-Center Bochum, Helmut E. Meyer, Moritz Bernd, André van

Hall, et al., Medical Proteom-Center, Ruhr-Universität Bochum �� Mo 479/4-1: Proteomanalysen zur Charakterisierung zellulärer Funktionen pflanzlicher Trichome, Amme, Steffen;

Schlesier, Bernhard; Rutten, Twan; Melzer, Michael; Mock, Hans-Peter, Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung, Gatersleben

�� Ne 427/10-1: Hochleistungs-Massenspektrometrie in der Analytik von pharmazeutischen Wirkstoffen und Biomolekülen, Klaus Raith und Reinhard H.H. Neubert, Institut für Pharmazeutische Technologie und Biopharmazie, Martin Luther Universität Halle-Wittenberg

�� No 113/11-1: Das QTOF II im Zentrum für Biochemie der Universität zu Köln, Stefan Müller, Angelika A. Noegel, Mats Paulsson, Zentrum für Biochemie, Medizinische Fakultät, Universität zu Köln

�� No 120/11-1: Proteomanalyse für Mikrobiologie, Tumorbiologie und Molekulargenetik: Tübinger Perspektive, A. Nordheim, Interfakultäres Institut für Zellbiologie, Eberhard-Karls-Universität Tübingen

�� Pe 415/14-1: Biomedizinische Analytik mit 9.4T FT-ICR Massenspektrometrie, Jasna Peter-Kataliniæ, Institut für Medizinische Physik und Biophysik, Universität Münster

�� Pr 175/4-1/5-1: Hochauflösende FT-ICR-Massenspektrometrie in der Biopolymer-Strukturanalytik: Analytische Entwicklung, neue biochemische und medizinische Anwendungen, Michael Przybylski, Fachbereich Chemie, Laboratorium für Analytische Chemie, Universität Konstanz

�� Re 837/7-1: Moos Proteomik, Eric Sarnighausen, Dimitri Heintz, Stefan A. Rensing, Ralf Reski, Pflanzenbiotechnologie, Universität Freiburg

�� Ri 192/22-1: Untersuchung von Protein-Komplexen in Neuronen durch Affinitätsreinigung und massenspektrometrische Identifizierung, Friedrich Buck, Hans-Jürgen Kreienkamp, Stefan Schumacher und Dietmar Richter, Institut für Zellbiochemie und Klinische Neurobiologie, Universitäts-Klinikum Hamburg-Eppendorf

�� Sa 257/20-1: Proteingebundene Lipide beim Aufbau der Wasserbarriere der Haut, Barbara Pierstorff, Ingo Damm, Heike Hupfer und Konrad Sandhoff, Kekulé-Institut für Organische Chemie und Biochemie, Universität Bonn

�� Sche 235/11-1: MALDI-TOF-MS-gestützte Analyse von an der Ausprägung pflanzlicher Stressantworten und Sekundärstoffwechselprozesse beteiligten Peptiden und Proteinen, Dierk Scheel, Stephan Clemens, et al., Institut für Pflanzenbiochemie, Halle/Saale

�� Schi 416/1-1: Der Einsatz eines Q-TOF II Massenspektrometers am Fachbereich Biochemie der Martin-Luther- Universität Halle-Wittenberg, Angelika Schierhorn, FB Biochemie/Biotechnologie, Martin-Luther-Universität Halle- Wittenberg

�� Schn 254/11-1: FT/ICR-MS als Werkzeug zur Untersuchung der Bildungsmechanismen und der Bindungsverhältnisse von metalloiden Clustern, Katharina Weiß, Ralf Burgert und Hansgeorg Schnöckel, Institut für Anorganische Chemie, Universität Karlsruhe (TH)

�� Schn 317/6-9: The Smaller the Better – 25µ-Columns for Protein and Peptide Analysis, Andreas Schlosser, Jens Schneider-Mergener, Institut für Medizinische Immunologie, Charité, Universitätsmedizin Berlin

�� Schr 305/2-1: Antimikrobielle Peptide und Proteine der menschlichen Haut, Jens-Michael Schröder, Klinik für Dermatologie, Venerologie und Allergologie, Universitätsklinikum Schleswig-Holstein, Campus Kiel und SFB 617

�� Schw 221/15-1: Entwicklung eines SIFT/GIB-Massenspektrometers für die Grundlagenforschung, Detlef Schröder und Helmut Schwarz, Institut für Chemie Technische Universität Berlin

�� Se 263/17-1: Massenspektrometrische Analytik der Eicosanoide und ihrer Pharmakomodulatoren in der Pädiatrie, Bernhard Watzer, Hannsjörg W. Seyberth, Horst Schweer, Rolf Nüsing, Andreas Leonhardt, Günter Klaus, Medizinisches Zentrum für Kinder- und Jugendmedizin, Philipps-Universität Marburg

�� Se 435/7-1: ESI FT-ICR Massenspektrometrie für die Analyse von molekularen Erkennungsmechanismen in regulatorischen Membranproteinen, Ernst Conzelmann, Walter Sebald, et al., Physiologische Chemie II, Würzburg

�� Sp 314/3-1: FT-ICR-Massenspektrometrie in der bioanalytischen Methodenentwicklung, Bernhard Spengler, Dieter �� Kirsch, Werner Bouschen, Institut für Anorganische und Analytische Chemie, Justus-Liebig-Universität Gießen �� We 888/15-1: Vom Proteinkomplex zur Aminosäure: LC-MS/MS in den Pflanzenwissenschaften, Elmar W. Weiler,

Markus Piotrowski, Fakultät für Biologie, Ruhr-Universität Bochum

Seiten 61 – 63: Stellungnahme der eingeladenen Gutachter

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Be 482/1-1

De novo Sequenzierung von Peptiden mit einem Q-TOF Massenspektrometer

K. Beyreuther, C. Clayton, D. Görlich, R. Herrmann, G. Multhaup, M. Stitt Biomolekulare Chemie - ZMBH - Heidelberg Die DFG stellte den Antragstellern am Zentrum für Molekulare Biologie, Universität Heidelberg (ZMBH) ein Elektrospray-Quadrupol-Time of Flight Hybrid Massenspektrometer (ESI-QTOF-MS: QSTAR) zur Verfügung. Gleichzeitig wurde dem Biochemiezentrum der Universität Heidelberg ein Flugzeitmassenspektrometer (MALDI-TOF MS) zur Verfügung gestellt. Den Forschungsgruppen am ZMBH und am Biochemiezentrum standen somit zwei komplementäre Hochleistungs-Massenspektrometer zur Verfügung, die zur Beantwortung der wissenschaftlichen Fragestellungen alternativ verwendet werden konnten: Das MALDI-TOF MS ermöglicht die schnelle und sehr sensitive Proteinidentifizierung anhand des peptide mass fingerprints (PMF). Im Gegensatz dazu sind die Untersuchungen an einem ESI-QTOF MS relativ zeitaufwendig. Der Informationsgehalt solcher Messungen ist jedoch wesentlich höher, da exakte Informationen zur Aminosäuresequenz von Peptiden und deren Modifikationen erhalten werden. Das ESI-QTOF-MS wurde in der Zentraleinheit Biomolekulare Chemie am ZMBH im Herbst 2000 installiert. Da bereits Erfahrung in der Identifizierung von Proteinen und Peptiden vorhanden war, konnte dieses Massenspektrometer rasch für Routineuntersuchungen eingesetzt werden. In der Regel werden Proteine charakterisiert, die mittels 1-D oder 2-D Gelelektrophorese aufgetrennt wurden. In solchen Fällen wird zunächst ein proteolytischer Verdau mittels Trypsin im Gel durchgeführt und die generierten Peptide aus dem Gel extrahiert. Diese werden anschließend alternativ mittels Festphasenextraktion entsalzt und nach statischer nanoElektrospay Ionisation (nanoESI) massenspektrometrisch analysiert oder nach nanoHPLC-Trennung und dynamischer nanoESI untersucht. Anhand eines Modellproteins (Glutamatdehydrogenase) wurde gezeigt, daß weniger als 10 fmol für die statische nanoESI-Methode und 25 fmol für die dynamische nanoESI-Methode ausreichend waren zur eindeutigen Identifizierung des Proteins. Der Zeitaufwand für die Interpretation der Daten ist in der Regel wesentlich höher als die Zeitdauer der Datenaufnahme. Das ESI QTOF MS ist trotzdem voll ausgelastet, da es von mittlerweilen ca. 10 Personen aus 4 verschiedenen Forschungsgruppen zur Lösung unterschiedlichster Fragestellungen eingesetzt wird (De novo Sequenzierung zur Identifizierung unbekannter Proteine, posttranslationale Proteinprozessierung, Proteinphosphorylierung, Proteinkonformation, Analyse der Lipidzusammensetzung von Zellmembranen). Exemplarisch soll hier auf ein Forschungsprojekt eingegangen werden, das die Leistungsfähigkeit dieses ESI-QTOF MS zeigen: Antonio Estevez aus der Forschungsgruppe C. Clayton untersuchte die Zusammensetzung des Exosome-Komplexes in Trypanosoma brucei. Nach Affinitätsreinigung und Auftrennung im SDS-Polyacrylamidgel konnten die meisten Untereinheiten mittels MALDI-TOF MS rasch identifiziert werden, wobei auffiel, daß die Sequenzhomologie zu homologen Untereinheiten aus z.B. Hefe sehr gering war. Eine weitere, nur schwach mittels kolloidalem Coomassie anfärbbare Bande kam als Kandidat für eine weitere Untereinheit in Frage. Die mittels MALDI-TOF MS erhaltenen PMF-Daten führten zu keinen Ergebnis bei der Datenbanksuche. Daher wurde diese Probe mit der nanoESI-QTOF-MS Technik weiter analysiert. Obwohl diese Technik weniger sensitiv ist, wird sie zur Identifizierung von Proteinen in der Regel erfolgreicher eingesetzt aufgrund des hohen Informationsgehaltes der Fragmentierungsspektren, anhand derer die Peptide sequenziert werden können. Die hohe Massengenauigkeit des ESI-QTOF MS ermöglicht die Unterscheidung aller Aminosäuren bis auf die isobaren Aminosäuren Leucin und Isoleucin. So konnten drei längere Peptide dieses Proteins sequenziert werden (VVCAVHHPQQLLDEYR, ..LALEGVVEQAVVLEK und TALDLVTAALK). Mit Hilfe degenerierter Oligonukleotide war es schließlich möglich, die c-DNA und damit die komplette Sequenz des entsprechenden Proteins von Trypanosoma

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brucei zu erhalten. Voraussetzung für den Erfolg war, daß die über massenspektrometrische Sequenzierung ermittelten Aminosäuresequenzen fehlerlos waren. Wie diese Beispiele zeigen ist das QSTAR ein ausgezeichnetes Gerät bezüglich Empfindlichkeit und Auflösung. Insbesondere für die de novo Sequenzierung von Peptiden ist es sehr geeignet. Der Einsatz lohnt sich jedoch wegen des hohen Zeitaufwands nur für spezielle Projekte. Bedingt ist der hohe Zeitaufwand nur zum Teil durch die nanoESI-Technik selbst. Datenauswertung und Interpretation mittels der zu wenig ausgereiften Software erfordern einen zusätzlichen Zeitaufwand. Weiterhin sind die Betriebskosten erheblich. Das QSTAR ist somit eher ein Gerät für die Forschung. Für die rasche Routineanalytik ist es meines Erachtens zu aufwendig zu betreiben. Gerade daher war es außerordentlich wichtig, auf das MALDI-TOF MS am BZH zurückgreifen zu können.

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Bu 617/13-1

Nutzung des LC-MS/MS-Spektrometers QStar des SFB 388 an der Universität Freiburg

Fakler, B. et al. Physiologisches Institut II Universität Freiburg Die grundsätzliche Thematik des SFB 388 ('Zelluläre Funktionen dynamischer Proteinwechselwirkungen') liegt in der Identifizierung und funktionellen Charakterisierung von Multiproteinkomplexen sowie den ihnen zugrundeliegenden Protein-Protein Wechselwirkungen. Die fundamentale Bedeutung des o.g. Massenspektrometers für diese proteom-analytischen Arbeiten soll nachfolgend kurz anhand der Untersuchungen 'Ionenkanal-assoziierter Multiproteinkomplexe' (Projektleiter Prof. Dr. B. Fakler) skizziert werden. Nach neuesten Erkenntnissen sind diese integralen Membranproteine in größere Signalkomplexe integriert, die über Proteinwechselwirkungen die Funktion der Kanäle steuern und verantwortlich sind für deren perfekte Anpassung an die physiologischen Erfordernisse verschiedener Zellentypen. Nach Isolierung aus nativen Membranen zentraler Neuronen konnten wir mittels LC-gekoppelter Nanospray-MS/MS-Spektroskopie die Zusammensetzung der Multiproteinkomplexe Ca2+-aktivierter Kaliumkanäle des SK-typs sowie spannungsgesteuerter Kv1.1 Kanäle ermitteln. Die Menge an Protein, die für diese MS-Analysen zur Verfügung steht, liegt dabei typischerweise im Bereich von 10 - 100 ng. Die Ergebnisse zeigten, dass die porenbildenden SK �-Untereinheiten über ihre zytoplasmatischen Domänen mit dem Ca2+-Bindungsprotein Calmodulin, der Proteinkinase CK2 (regulatorische und katalytische Untereinheit), der Proteinphosphatase PP2A (regulatorische und katalytische Untereinheit), zytoskelettalen Proteinen (Aktin, Internexin, Tubulin � und �) sowie zwei Isoformen der 14-3-3-Proteine verbunden sind. Calmodulin, CK2 und PP2A bilden dabei die 'Gating'-Maschinerie, die den Kanal auf einen Anstieg des intrazellulären Kalziumspiegels hin öffnet. Die Ca2+-Sensitivität dieser Gating-Maschinerie wird durch Phosphorylierung/Dephosphorylierung des Calmodulin am Threoninrest 80 via CK2 und PP2A reguliert, wodurch Amplitude und Zeitverlauf der SK-getragenen Nachhyperpolarisation zentraler Neuronen effektiv kontrolliert und an die zellspezifischen Erfordernisse angepasst werden können. Als Komponenten der molekularen Mikrodomäne von Kv1.1 Kanälen wurden neben weiteren a-Untereinheiten der Kv1 Familie, 3 verschiedene b-Untereinheiten, synaptische Proteine, Adapterproteine (PSD95, Caspr), sowie neue Proteine mit bislang unbekannter Funktion identifiziert. Ähnlich den SK-Kanälen kontrollieren die genannten Proteine die subzelluläre Lokalisation, die Prozessierung sowie die Gating-Maschinerie der Kv1.1 Kanäle. Weitere Projekte des SFB, für die die Massenspektroskopie von fundamentaler Bedeutung ist, sind die Analyse und Charakterisierung: - der Protein-Importkomplexe in der mitochondrialen Aussen- und Innenmembrane (Projektleiter Prof. Dr. N. Pfanner, Drs. Meisinger, Rehling, Truscott) - der Rop GTPasen gekoppelten Signalkaskaden in Arabidopsis thaliana

(Projektleiter Prof. Dr. K. Palme) - des ZWILLE Proteinkomplexes aus Arabidopsis (Projektleiter Prof. Dr. T. Laux) - des FtsZ-Protein-assoziierten Proteinkomplexes des Mooses Physcomitrella (Projektleiter Prof. Dr. R. Reski), sowie - der Multiprotein-Signalkaskade des B-Zell Antigenrezeptors (Prof. Dr. M. Reth).

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Ei 272/9-1

Innovative Isotopenanalyse von geochemischen und klimatologischen Archiven mittels MC-ICP-MS

Eisenhauer, A. GEOMAR Forschungszentrum für Marine Geowissenschaften, Kiel Das Ziel des Vorhabens Ei272/9-1 (MEIKE) war es, unter Anwendung eines neuartigen Massenspektrometers (MC-ICP-MS = Multi-Collector-Ionization-Coupled-Plasma-Mass-spectrometer) lange und exakt datierte Zeitreihen (U/Th, Th/Ra) simultan gemessener Proxie-Daten (Ba/Ca, Cd/Ca, Mg/Ca, Mn/Ca, Pb/Ca, Sr/Ca, U/Ca, �11B, 44Ca/40Ca, 230Th/234U, 226Ra/230Th, 207Pb/206Pb, etc.) in marin-geochemischen Archiven zu erstellen, diese zu vergleichen und zu modellieren. Mit diesem neuen „Multi-Proxie“-Ansatz soll die marin-geochemische/klimatologische Variabilität mit Perioden im Bereich von Dekaden bzw. von Jahrhunderten untersucht werden. Das Projekt war in verschiedene Phasen unterteilt, wobei die 1. Phase mit dem Aufbau und erfolgreichen Inbetriebnahme des MC-ICPMS erfolgreich abgeschlossen werden konnte. In der 2. Phase soll die Maschine dazu verwendet Zeitreihen von klimarelevanten Proxies zu gewinnen. Während der 1. Phase ist es uns insbesondere gelungen, die Messung von 44Ca/40Ca Isotopenverhältnissen zu etablieren und die Bestimmung der U/Th-Isotope um einen Faktor 100 gegenüber den herkömmlichen TIMS (Thermal Ionisation Mass-Spectrometry) Messungen zu verbessern. Unsere Gruppe ist somit weltweit die erste, welche in der Lage ist, 44Ca/40Ca Verhältnisse an einer MC-ICPMS mittels der sogenannten „cool plasma“-Technik präzise zu bestimmen. Der Messung von 44Ca/40Ca Verhältnissen wird in naher Zukunft eine große Bedeutung zukommen, da es sich in verschiedenen Arbeiten gezeigt hat, dass es ein robustes „Proxie“ für die Rekonstruktion von vergangenen Temperaturschwankungen der Meeresoberflächentemperatur ist. 1. Bestellung, Aufstellung und Inbetriebnahme der MC-ICPMS Die Chronologie des Projektes ist in der Tabelle zusammengefasst. Die Maschine wurde am 10.06.2002 vorbehaltlich abgenommen, da die wichtigsten der geforderten Spezifikationen erreicht wurden. Projekt Chronologie

Datum Vorgang

10.05.2000

Bewilligung des Projektes (MEIKE) zur Anschaffung einer MC-ICPMS durch die DFG (Ei272/9). Beginn umfangreicher Umbaumaßnahmen in den Laboren. Installation eines Argon Tanks auf dem GEOMAR Gelände zur kontinuierlichen Argon Versorgung des anzuschaffenden Gerätes.

02.10.2000

Europaweite Ausschreibung für eine MC-ICPMS entsprechend unseren Anforderungen. Drei Firmen beteiligten sich an der Ausschreibung. Nach Erhalt des Leistungsheftes gaben jedoch nur zwei Firmen ein Angebot ab.

30.11.2000 Erteilung des Auftrages zur Lieferung einer MC-ICPMS (AXIOM)

01.04.2001 bis 04.08.2001

Werksabnahme des Gerätes

04.12.2001 Lieferung der AXIOM MC-ICPMS 15.01.2002 bis

10.06.2002 Installations-, Kalibrations- und Optimierungsarbeiten an der AXIOM

10.06.2002 Vorbehaltliche Abnahme der AXIOM Spezifikationen

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Abb. 1 Abb. 2

Die Abb. 1 und 2 zeigen das AXIOM MC-ICPMS Gerät von zwei Seiten. In Abb. 1 ist im Vordergrund der sogenannte Aridus Zerstäuber im „Laminar Flow“ Gehäuse zu erkennen. Abb. 2 zeigt zeigt im Hintergrund den Laminar-Flow welcher einen kontaminationsfreies Einleiten der Lösungen in die Ionenquelle ermöglicht. 2. Die Messung von 44Ca/40Ca Isotopenverhältnissen an der MC-ICPMS (AXIOM) Die für die Messung der Ca-Isotope verwendete Methode beruht auf der sogenannten „Cool-Plasma-Technik“. Bei dieser Methode wird die Energie für die Erzeugung eines Plasmas von üblicherweise ca. 1250 Watt auf ca. 400 Watt reduziert. Durch diese drastische Reduktion der eingesetzten Energie wird die Bildungsrate von 40Ar+-Ionen um mehrere Größenordnungen reduziert, da die mittels Hochfrequenzgenerator eingestrahlte Energie für eine Stoßionisation der Ar-Atome zu gering ist. Dies bedeutet, dass der Isobareneffekt von 40Ar+ und 40Ca+, der die simultane Messung der Intensitäten von 40Ar+ und 40Ca+ Ionen normalerweise behindert, fast vollständig ausgeblendet werden kann. Das unter „hot-plasma“-Bedingungen vorliegende 40Ar+/40Ca+-Verhältnis wird von ca. 0.1 auf ca. 0.001 unter „cool-plasma“ Bedingungen reduziert. Die nun erstmalig mögliche Messung von 44Ca/40Ca-Isotopenverhältnissen an einer MC-ICPMS hat gegenüber der herkömmlichen TIMS-Technik deutliche Vorteile, da man auf die Verwendung eines 43Ca/48Ca-Doppelspikes verzichten kann. Für die Messung der 44Ca/40Ca Verhältnisse an der MC-ICPMS wird das sogenannte „bracketing-standard“-Verfahren verwendet, indem die gemessene Probe auf einen gewählten Standard normalisiert wird. Für Karbonatproben verwenden wir den allgemein üblichen SRM915a Standard. Neben dem Ar können jedoch noch weitere Isobareneffekte mit Molekül-Ionen wie MgO+, NaOH+ (mit 40Ca) und MgOH2

+ (mit 44Ca) auftreten. Diese Isobareneffekte können umgangen werden, indem die „Peak“-Intensität nicht in der Mitte sondern um ca. 0.02 amu (atomic mass unit) zur Niederenergie-Seite versetzt gemessen wird (siehe Abb. 2b in Manuskript Nr. 2 der Anlagen). Weitere Isobareneffekte mit doppelt geladenen 88Sr2+-Ionen können durch die Messung der Ionenintensität bei 43.5 amu, was die doppelt geladene 87Sr2+-Ionen rerpräsentiert, korrigiert werden. Erste Messung von Standardmaterialien ergeben hinsichtlich der Richtigkeit der Werte und der Reproduzierbarkeit der Messungen mit TIMS vergleichbare Messwerte. Deutliche Abweichungen zwischen der herkömmlichen TIMS Technik und der neuen, für die MC-ICPMS entwickelten Technik ergaben sich bei einigen kalzitischen Proben. Die Ursache hier lag bei unterschiedlichen Säurenormalitäten der für die Normalisierung verwendeten Standards. Für die zukünftige Messung von Ca-Isotopenverhältnissen muss daher darauf geachtet werden, dass die Säurenormalität der Proben als auch der Standards einheitlich sind. 3. Zusammenfassung hinsichtlich der Arbeiten zur Verbesserung der Nachweisgrenzen für

U-, Th und Ra-Isotope Die neue Messtechnik für die Bestimmung von U- und Th-Isotopen an einer MC-ICP-MS beinhaltet die Zugabe eines U- bzw. Th-Spikes bekannter Zusammensetzung. Das

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230Th/229Th und 230Th/229Th wird dann unter der simultanen Benutzung der Faraday-Cups und der Multiplier gemessen, wobei das 234U/235U die Multiplier/Cup Eichung widerspiegelt und das 235U/238U Verhältnis, gemessen auf den Faraday Cups, dazu dient, die Massendiskriminierung des MC-ICP-MS festzustellen. Unsere ersten Messungen zeigen, dass mit der neuen MC-ICPMS eine um den Faktor 100 gesteigerte Präzision gegenüber den herkömmlichen TIMS-Massenspektrometern erreicht werden kann. Dies bedeutet, dass entweder die U/Th Alter sehr viel genauer statistisch erfasst werden können, oder dass die für die U/Th-Datierungen notwendige Probenmenge um einen Faktor 100, bei gleich bleibender Präzision, verringert werden kann. Diese neuen technischen Optionen eröffnen wiederum neue Möglichkeiten, die Dynamik klimatischer, geochemischer und geologischer Prozesse mit einer bisher unerreichten Hochauflösung zu erfassen. Erste Anwendungen dieser neuen Methode soll der zeitlich hochauflösenden Erfassung von klimatischen und geochemischen Proxies in corallinen Spongien aus der Karibik und schnellwachsenden Mn/Fe-Krusten aus der Ostsee gelten. Beide Archive eignen sich hervorragend für die Rekonstruktion des klimatischen Geschehens während der Kleinen Eiszeit. Letztere ist von besonderem Interesse, da sie die letzte klimatische Phase war, welche wahrscheinlich nicht anthropogen beeinflusst gewesen ist.

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Ei 304/1-1

Sequenzierung integraler Membranproteine aus 2D-Nativer/SDS-PAGE Eichacker, L.A. Department für Biologie I, Universität München Die Identifikation von integralen Membranproteinen gelingt nur mit sehr geringen Ausbeuten nach 2D-IEF/SDS-PAGE. Es wurde deshalb die Methode der Blau-Nativen/SDS-PAGE (Schägger and Jagow (1991) Anal. Biochem. 199, 223-231) als eine alternative 2D-PAGE Trenntechnik weiterentwickelt. Wir zeigen, dass Untereinheiten von Membranproteinen mit einem Gravy index > 0.5 in diesem System mit hoher Auflösung und Ausbeute getrennt werden können. Die Sequenzierung interner Peptid-Sequenzen mit einem Q-TOF ESI-Massenspektrometer zeigt, dass Membranproteine gegenwärtig mittels der Proteinbereiche identifiziert werden, die außerhalb der Transmembranregionen liegen. Die mittels 2D-PAGE aufgetrennten und identifizierten Protein-Untereinheiten erlauben es, den Assemblierungszustand von Membranprotein-Komplexen zu bestimmen. Vergleiche der Protein-Muster von solubilisierten Thylakoidmembranen aus Wildtyp und Mutante zeigen, dass mit der 2D-Native/SDS-PAGE eine herausragende Trenntechnik vorliegt, die in Verbindung mit Massenspektrometrie zur Kartierung von funktionellen Proteinkomplexen herangezogen werden kann. Die Technik wird entsprechend als Werkzeug für funktionelle Proteomics von Membranproteinen diskutiert.

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Fi 253/16-1

Massenspektrometrische Detektion der posttranslationalen C(alpha)-Formylglycin-Bildung in Sulfatasen

Thomas Dierks, Bernhard Schmidt, Jianhe Peng und Kurt von Figura Abteilung Biochemie II Universität Göttingen Sulfatasen tragen in ihrer aktiven Tasche eine einzigartige, für die enzymatische Funktion essentielle Aminosäure, C(alpha)-Formylglycin (FGly), die posttranslational aus einem Cystein (Eu- und Prokaryoten) oder einem Serin (Prokaryoten) generiert wird. FGly als Aldehyd-haltige Aminosäure wurde mittels Massenspektrometrie tryptischer Sulfatase-Peptide identifiziert, wobei die Verwendung Glycerol- oder p-Nitroanilin-haltiger Matrices zu Aldol-Kondensation bzw. zur Bildung Schiff'scher Basen führte (1). Kürzlich haben wir eine MALDI-TOFMS Methode ausgearbeitet, bei der die Verwendung von Dinitrophenylhydrazin als Matrix zu einer effizienten FGly-Dinitrophenylhydrazon-Bildung führt. Die Hydrazon-Derivate desorbieren und ionisieren mit hoher Effizienz und lassen sich in einem tryptischen Verdau im sub-femtomol-Bereich nachweisen. Die Anwesenheit von FGly lässt sich durch ein Masseninkrement von 180.13 u sowie durch ein charakteristisches zyklisches Fragment-Ion in MALDI-PSD-Spektren erkennen, das indikativ für Sulfatasen ist, auch wenn die Sequenz der Sulfatase noch unbekannt ist (2, 3). Diese Methode wurde außerdem genutzt, um einen qualitativen in vitro Assay für die FGly-Bildung durch zelluläre Extrakte zu entwickeln, wobei als Substrate GST-Fusionsproteine mit einem C-terminalen, die FGly-Bildung determinierenden Sequenzmotiv verwendet wurden (4). Für die Quantifizierung der FGly-Bildung nach in vitro Modifizierung synthetischer Peptide wurde alpha-Cyano-4-hydroxyzimtsäure als Matrix verwendet, was zu vergleichbarer Desorption/Ionisation von Substrat- und Produktpeptid führte. Dies ermöglichte es uns, die Kinetik und Enzymologie des FGly-bildenden Enzyms (FGE) zu untersuchen und schließlich FGE aus Rinderhoden zu reinigen. Seine molekulare Identifizierung gelang durch fingerprint-Analyse der tryptischen Peptide, wobei die Sequenz zweier zwischen Rind und Mensch konservierter Peptide durch MALDI-PSD und durch MS/MS Analyse mittels nano-ESI Ionenfallen-Massenspektrometrie bestätigt wurde (5). Der verwendete in vitro Assay wird gegenwärtig zu einer Routine-Methode weiterentwickelt, die unter Verwendung von Hautfibroblasten eine schnelle und zuverlässige Diagnose der Multiplen Sulfatasedefizienz ermöglicht, einer seltenen, aber fatalen Erbkrankheit, die durch die genetische Defizienz des FGE verursacht wird. Literatur 1. Schmidt, B., Selmer, T., Ingendoh, A. & von Figura, K. (1995) Cell 82, 271-278. 2. Peng, J., Schmidt, B., von Figura, K. & Dierks, T. (2003) J. Mass Spec. 38, 80-86. 3. Marquordt, C., Fang, Q., Will, E., Peng, J., von Figura, K. & Dierks, T. (2003) J. Biol. Chem. 278, 2212-2218. 4. Fang, Q., Peng, J., von Figura, K. & Dierks, T. (2003), submitted. 5. Dierks, T., Schmidt, B., Borissenko, L. V., Peng, J., Preusser, A., Mariappan, M. & von Figura, K. (2003) Cell

113, 435-444.

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Ge 386/3-1

Strukturanalyse von Glykokonjugaten und anderen Biomolekülen durch ESI-MS Rudolf Geyer, R. Biochemisches Institut Justus-Liebig-Universität Gießen Die bewilligte nano-LC-ESI-Ion Trap (IT)-MS-Anlage wurde vor allem zur Strukturanalyse der Kohlenhydrateinheiten von Glykoproteinen [1] und Glykolipiden [2-4] genutzt, wobei letztere zum Teil auch als intakte Glykokonjugate [4,5] eingesetzt wurden. Daneben diente das Gerät der Zuordnung einzelner Kohlenhydratketten zu distinkten N-Glykosylierungsstellen [6], der Lokalisierung von O-Glykanen sowie der Identifizierung anderweitig post-translational modifizierter Proteine (Manuskripte in Vorbereitung). Das Gerät wurde sowohl im "off-line nanospray-mode" als auch im "on-line mode" in Kombination mit der nano-LC-Anlage betrieben. Im folgenden sollen drei Anwendungen beispielhaft vorgestellt werden: I. Strukturanalyse von Glykolipiden aus Parasiten Parasitische und freilebende Nematoden zeichnen sich dadurch aus, dass sie Glykolipide und Glykoproteine exprimieren, die Phosphorylcholin(PC)-Substituenten tragen. Derartige Moleküle sind insofern interessant, als gezeigt werden konnte, dass sie in der Lage sind, die Immunantwort des Wirtes zu modulieren. Sie scheinen damit eine wichtige Rolle für das Überleben des Parasiten im Wirt zu spielen. Um biologische Aktivitäten mit strukturellen Parametern korrelieren zu können, haben wir die in ihren Kohlenhydratanteilen PC-substituierten Glykolipide des Schweinespulwurms Ascaris suum genauer untersucht. Nach enzymatischer Freisetzung der Kohlenhydratketten und Trennung durch zweidimensionale HPLC wurden die Glykane vor allem durch "off-line" nano-ESI-IT-MSn charakterisiert [2]. Dabei erwies sich insbesondere die Möglichkeit, multiple MS/MS-Experimente durchführen zu können, als unabdingbar, da nur so relevante Informationen über die Monosaccharid-Sequenz, das Verzweigungsmuster und die Substitutionsposition des PC-Restes zu ermitteln waren. Im Fall des Trematoden-Erregers Schistosoma mansoni konnten analoge Untersuchungen [3] zeigen, dass dieser Parasit im Ei-Stadium bevorzugt mehrfach fucosylierte Glykolipid-Spezies exprimiert, die sich in ihrer Struktur von den Glykolipid-Hauptkomponenten des Cercarien-Stadiums unterscheiden, was auf eine stadienspezifische Synthese dieser Glykokonjugate schließen läßt. Auch hier erwies sich die Möglichkeit, im "nanospray-mode" multiple MS/MS-Experimente durchführen zu können, als besonders wertvoll. Ausgehend von Glykolipiden des Leberegels Fasciola hepatica, der ebenfalls zu den Trematoden zählt, führten entsprechende Untersuchungen zur Identifizierung eines neuartigen Kohlenhydrat-Epitops, das im Endwirt zu einer gegen dieses Epitop gerichteten, spezifischen Immunantwort führt und daher für diagnostische Zwecke einsetzbar sein sollte [4]. In diesem Fall wurden die intakten Lipide bzw. Glykolipide im "off-line mode" durch nano-ESI-IT-MSn analysiert, was eine gleichzeitige Charakterisierung der jeweiligen Lipidanteile gestattete. Insgesamt konnte durch diese Studien der Kenntnisstand hinsichtlich des Glykoms dieser Parasiten maßgeblich erweitert werden. II. Lokalisierung O-glykosidisch gebundener Kohlenhydrate im M-Protein des humanen

Hepatitis B Virus (HBV) In dieser Untersuchung sollte geprüft werden, inwieweit O-Glykosylierung ein generelles Charakteristikum des HBV M-Proteins darstellt. Dazu wurden drei verschiedene HBV-Genotypen, die sich in der Aminosäuresequenz ihrer M-Proteine partiell unterscheiden, vergleichend untersucht. Lag eine derartige Modifikation vor, so wurden die jeweiligen O-Glykane mittels Massenspektrometrie lokalisiert. Hierzu wurden zunächst die entsprechenden Glykopeptide isoliert und danach durch "on-line" nano-LC-ESI-IT-MS/MS untersucht. Das erhaltene Fragmentionenspektrum erlaubte dann eine eindeutige Identifizierung der O-Glykosylierungsposition. Darüber hinaus war eine nahezu vollständige

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Abdeckung der Aminosäuresequenz durch die anfallenden Fragmentionen feststellbar. (Schmitt et al., Manuskript in Vorbereitung).

III. Identifizierung post-translational modifizierter Proteine bei Caenorhabditis elegans Die Proteine des Modellnematoden C. elegans tragen zum Teil PC-Substituenten als post-translationale Modifikationen. Frühere Untersuchungen hatten bereits gezeigt, dass Antigene mit solchen PC-Epitopen während der Embryogenese des Wurms offensichtlich nur von spezifischen Zellen exprimiert werden. Im Rahmen unserer Untersuchungen zur Identifizierung und Charakterisierung derartig modifizierter Proteine wurde ein solches im Überstand von C. elegans-Kulturen nachgewiesen. Nach zweidimensionaler SDS-PAGE und in situ-Verdau mit Trypsin konnte dieses Protein durch "on-line" nano-LC-ESI-IT-MS der tryptischen Peptide sowie durch MS/MS-Analyse eines ausgewählten Peptids als Aspartylprotease Asp-6 von C. elegans identifiziert werden (J. Grabitzki, Diplomarbeit, Universität Gießen, 2003; entsprechendes Manuskript in Vorbereitung). Auch in diesem Fall konnte anhand der detektierten Fragmentionen eine hohe Sequenzabdeckung erzielt werden. Die angeführten Beispiele belegen, dass die bewilligte nano-LC-ESI-IT-MS-Anlage bereits erfolgreich für Fragestellungen auf dem Gebiet der Analytik von Glykokonjugaten und anderweitig post-translational modifizierten Proteinen eingesetzt werden konnte. Publikationen mit Daten, die mit dem bewilligten Gerät erhalten wurden: 1. Kurokawa, T., Wuhrer, M., Lochnit, G., Geyer, H., Markl, J. and Geyer, R. (2002). Hemocyanin

from the keyhole limpet Megathura crenulata (KLH) carries a novel type of N-glycans with Gal(ß1-6)Man-motifs. Eur J Biochem. 269, 5459-73.

2. Friedl, C.H., Lochnit, G., Zähringer, U., Bahr, U. and Geyer, R. (2003). Structural elucidation of zwitterionic carbohydrates derived from glycosphingolipids of the porcine parasitic nematode Ascaris suum., Biochem J. 369, 89-102.

3. Wuhrer, M., Kantelhardt, S.R., Dennis, R.D., Doenhoff, M.J., Lochnit, G. and Geyer, R. (2002). Characterization of glycosphingolipids from Schistosoma mansoni eggs carrying Fuc(�1-3)GalNAc-, GalNAc(ß1-4)[Fuc(�1-3)]GlcNAc- and Gal(ß1-4)[Fuc(�1-3)]GlcNAc- (Lewis X) terminal structures. Eur J Biochem. 269, 481-93.

4. Wuhrer, M., Grimm, C., Zähringer, U., Dennis, R.D., Berkefeld, C.M., Idris, M.A. and Geyer, R. (2003). A novel GlcNAc�1-HPO3-6Gal(1-1)ceramide antigen and alkylated inositol-phosphoglycerolipids expressed by the liver fluke Fasciola hepatica. Glycobiology. 13, 129-37.

5. Houston, K.M., Lochnit, G., Geyer, R. and Harnett, W. (2002). Investigation of the nature of potential phosphorylcholine donors for filarial nematode glycoconjugates. Mol Biochem Parasitol. 123, 55-66.

6. Wuhrer, M., Geyer, H., von der Ohe, M., Gerardy-Schahn, R., Schachner, M. and Geyer, R. (2003). Localization of defined carbohydrate epitopes in bovine polysialylated NCAM. Biochimie. 85, 207-18.

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He 1383/9-1

Überblick über die MS-Analytik mit dem Q-STAR XL an der Heinrich-Heine Universität Düsseldorf

Sabine Metzger, Johannes H. Hegemann Biologisch Medizinisches Forschungszentrum (BMFZ) Institut fuer Mikrobiologie Heinrich-Heine Universität Düsseldorf Das ESI-QqTOF steht seit April 2003 als Nachfolgegerät des 1999 bewilligten Gerätes im Analytischen Zentrallabor des Biologisch-Medizinischen Forschungszentrum (BMFZ) der Heinrich-Heine Universität Düsseldorf. Das QSTAR XL wird sowohl in der Forschung als auch in der Routineanalytik eingesetzt. Im Verlauf der vergangenen drei Jahren war es ein wesentlicher Bestandteil von Kooperationsprojekten innerhalb und außerhalb der Universität Düsseldorf. Im nachfolgenden wird ein kurzer Überblick über drei dieser Kooperationsprojekte gegeben. Analyse des myokardialen Proteom von Myoglobin Knockout-Mäusen (Kooperation mit Prof. Schrader und Dr. Laussman, Heinrich-Heine Universität) Myoglobin gehört zu den sauerstoffbindenden Häm-Proteinen. In Vertebraten ist es in den langsamen Muskelfasern wie z.B. dem Herzmuskel lokalisiert. Die Hauptaufgabe des Myoglobins ist das Speichern und Puffern von Sauerstoff, der Transport des Sauerstoffs innerhalb der Muskelzelle und das Einfangen von NO und anderen Radikalen. Berücksichtigt man diese zentrale Funktion des Myoglobins für den Muskel, so erstaunt es, dass Myoglobin Knockout-Mäuse keine nennenswerte Beeinträchtigung ihres Phänotyps zeigen. Histologische Untersuchungen des Herzmuskels zeigen allerdings, dass das Fehlen von Myoglobin durch eine Erhöhung der Kapillargefässdichte um 20-46% und einen verringerten Durchmesser der Herzmuskelzellen kompensiert wird. Durch eine vergleichende Untersuchung des myokardialen Proteoms von Myoglobin Knockout-Mäusen (myo-/-) und Wildtyp-Mäusen (WT) wurden Mechanismen aufgeklärt, die die Myoglobin Defizienz auf der Proteinebene kompensieren. Myokardiales Gewebe von Myoglobin defizienten (Mb-KO) Mäusen wurde einer differentiellen Proteomanalyse durch zweidimensionale Gelektrophorese unterzogen (n = 12 Mb-KO Mäuse versus n = 12 Wildtyp (WT)-Mäuse). Es wurden 450 +/- 25 Proteinspezies durch die 2D-PAGE erfaßt, hiervon zeigten insgesamt 21 Proteine signifikant unterschiedliche Expression (t-test: p<0.005). Diese Proteine wurden durch ESI-MS/MS Analysen identifiziert. 10 der 21 differentiell exprimierten Proteine sind im Fettsäurestoffwechsel involviert. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass bei Myoglobin-Mangel eine Umstellung der Substratutilisation von Fettsäuren zu Glucose stattfindet. Dies würde die Sauerstoffbilanz der Mb-KO Herzen günstig beeinflussen, da die Oxidation von Glucose weniger Sauerstoff pro Mol produziertes ATP benötigt als die Oxidation von Fettsäuren. Es gibt also auch auf der Proteinebene eine Reaktion der Myoglobin-Knockout-Maus auf die Myoglobin Defizienz. De novo Sequenzierung der IP7-Kinase aus Dictyostelium discoideum (Kooperation mit Prof. Vogel und Ch. Trautwein, Universität Wuppertal)

Inositolphosphate spielen eine zentrale Rolle bei der intrazellulären Signalvermittlung. Vom myo-Inositol abgeleitete Verbindungen sind beteiligt an fundamentalen zellulären Prozessen wie Zellmotilität, Endocytose, Chemotaxis sowie Zelldifferenzierung. Dictyostelium besitzt einen komplexen Inositolphosphatstoffwechsel, der in vielen Gesichtspunkten dem von Säugerzellen ähnelt, ist aber experimentell besser zugänglich. Neben Inositolphosphaten wurde von der Arbeitsgruppe Vogel in Dictyostelium zusätztlich die neue in Eukaryonten ubiquitäre Klasse von Diphosphoinositolphosphaten gefunden.

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Dictyostelium discoideum bildet aus 6-Diphosphoinositol Pentakisphosphat (6-PP-InsP5) unter Anwesenheit von ATP 5,6-Bisdiphosphoinositol Tetrakisphosphat (5,6-Bis-PP-InsP4). Das dafür verantwortliche Enzym ist die Diphosphoinositol Pentakisphosphat Kinase (InsP7 Kinase). Um neue Einsichten in mögliche physiologische Funktionen von höher phosphorylierten Inositolphosphaten zu erlangen, welche einmalig für Dictyostelium discoideum sind, ist es notwendig das codierende Gen zu identifizieren. Dafür wurde die IP7-Kinase aus Dictyostelium discoideum isoliert und mittels ESI-MS/MS sequenziert. Bei Beginn des Projektes lagen keine Proteinsequenzdaten von Dictyostelium discoideum vor, auch das Genom war nur zu ca. 30% sequenziert. Somit war eine de novo Sequenzierung erforderlich. Nach Isolierung des Enzyms und tryptischen In-Gel Verdau wurden 16 Peptide vollständig sequenziert. Davon konnten acht Peptide dem cDNA-Klon VFM264 zugeordnet werden mit einer Sequenzabdeckung von 32%. Sechs Peptide konnten dem hypothetischen Protein AAO50847 codiert von einem Gen, das auf Chromosom 2 lokalisiert ist, zugeordnet werden. Hier wird eine Sequenzabdeckung von 21% erreicht. Dieses Protein zeigt eine 40-50 % ige Sequenzhomologie zu bekannten Polyphosphat Kinasen anderer Organismen. Allerdings codiert diese DNA ein wesentlich kleineres Protein mit einem niedrigerem isoelektrischen Punkt. Die Sequenz des anderen Proteins hingegen stimmt in Grösse und isoelektrieschem Punkt mit dem isolierten Protein gut überein, zeigt aber keine Sequenzhomologie zu bekannten in dem Inositolphosphatstoffwechsel involvierten Enzymen. Das Genomprojekt von Dictyostelium ist noch nicht beendet, so dass nicht ausgeschlossen werden kann, dass am Ende alle gefundenen Aminosäuresequenzen einem einzigen Protein zugeordnet werden können. Identifizierung des Proteoms von Hydrogenosomen aus Trichomonas vaginalis (Dr. Katrin Henze, Heinrich-Heine Universität) Viele eukaryotische Pathogene bestreiten ihre ATP-Synthese entweder während des gesamten Lebenszyklus oder während bestimmter Entwicklungsphasen gänzlich ohne Sauerstoff. Solche anaerobe Parasiten umfassen sowohl Protisten wie Trypanosoma brucei oder Trichomonas vaginalis (ein Infektionserreger im Urogenitaltrakt), aber auch vielzellige Parasiten wie Ascaris suum, Fasciola hepatica oder Schistosoma mansonii. Essentiell für die anaerobe ATP-Synthese bei den o.g. Parasiten sind die biochemischen Stoffwechselleistungen ihrer anaeroben Mitochondrien bzw. ihrer Hydrogenosomen - H2-produzierende Organellen der anaeroben ATP-Synthese bei amitochondrialen Eukaryoten. Die zurzeit verfügbaren Indizien sprechen eindeutig dafür, dass Mitochondrien und Hydrogenosomen aus ein und demselben, fakultativ anaeroben eubakteriellen Endosymbionten hervorgegangen sind. Demnach sollten die biochemischen Spuren dieser fakultativ anaeroben Lebensweise jeweils in den Mitochondrien bzw. Hydrogenosomen erhalten geblieben sein. Ziel des Projektes ist die Identifizierung des vollständigen Proteom isolierter Hydrogenosomen von Trichomonas vaginalis um die Stammesgeschichte und Biochemie dieser anaerob funktionierenden Organellen besser zu verstehen. Ein erstes interessantes Ergebnis ist die Identifizierung von Rubrerythrin, dass zum ersten Mal in aneroben Eukaryoten gefunden wurde. Die Funktion von Rubrerythrin ist noch nicht vollständig aufgeklärt. Vermutet wird, dass es vor reaktivem Sauerstoff schütz. Es hätte somit eine ähnliche Funktion wie Katalasen. Die wiederum bis dato nicht in Amitochondriaten nachgewiesen wurden. Amitochondriaten bilden aber nachweislich reaktiven Sauerstoff.

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He 1887/6-3

Kurzbericht über die mit dem Tandem-Hybrid-Massenspektrometer QSTAR erarbeiteten Ergebnisse

Michael Hecker, Dörte Becher, et al. Institut für Mikrobiologie Universität Greifswald Das QSTAR wurde hauptsächlich in zwei Arbeitsfeldern eingesetzt:

- der Identifizierung von Proteinen aus 2D-Gelen, die mit einem MALDI-TOF-Massenspektrometer gar nicht oder nur unsicher identifiziert werden können

- der detaillierten Charakterisierung posttranslationaler Modifikationen. Beide Arbeitsfelder sind essentieller Bestandteil unseres Forschungsschwerpunktes der „funktionellen“ oder „physiologischen Proteomics“, mit deren Hilfe wir zu neuen Erkenntnissen über die Bakterienphysiologie ganz allgemein gelangen möchten. Die Identifizierung von Proteinen mit einem MALDI-TOF stößt bei bestimmten Proteinen an objektive Grenzen, die durch die physikochemischen Eigenschaften ebendieser Proteine bedingt sind. Die wichtigste Gruppe stellen dabei die kleinen Proteine dar, die nach einem enzymatischen Verdau keine oder nur eine sehr geringe Anzahl von analysierbaren Peptiden ergeben, so dass eine sichere Identifizierung mittels eines einfachen Peptide Mass Fingerprints schwierig oder unmöglich ist. Mit dem QSTAR kann man in dieser Situation einzelne Peptide durch MS/MS-Experimente sequenzieren und damit eine sichere Identifizierung gewährleisten. Weiterhin ermöglichen die Kopplung mit einer Nano-HPLC und die vom MALDI verschiedene Art der Ionisierung die Vermessung von zusätzlichen Peptiden, die man mit dem MALDI-TOF nicht finden kann. Diese Arbeiten laufen sehr stabil und sind bereits als Routine zu bezeichnen. Die detaillierte Charakterisierung posttranslationaler Modifikationen ist wesentlich schwieriger. In jedem Falle ist die modifizierte Aminosäure mittels Sequenzierung exakt zu ermitteln. Da der experimentelle Ansatz der Nutzung von 2D-Gelen aber die Beobachtung von bisher völlig unbekannten posttranslationalen Modifikationen ermöglicht, sind auch Modifikationen zu ermitteln, bei denen die modifizierende funktionale Gruppe vorher nicht bekannt ist und demzufolge auch ihr chemischer Charakter erst zu ermitteln ist. Aufgrund der immensen physiologischen Bedeutung und der auf diesem Sektor technisch nahezu einzigartigen Stellung von Proteomics interessiert uns dies in besonderem Maße und ist uns bisher in folgenden Fällen gelungen:

- bei der Sulfonylierung des Proteins Gap in Staphylococcus aureus - bei derN-terminalen Formylierung einer Anzahl von Proteinen in Bacillus subtilis - bei der Succinylierung des Proteins MetA in Escherichia coli

Damit sind wir in der Lage komplexe Regulationsvorgänge der Zelle wesentlich besser zu verstehen bei:

- der oxidativen Schädigung von Proteinen (Sulfonylierung) - der Neusynthese von Proteinen und ihrer Funktionalisierung (Formylierung und

Deformylierung) - der direkten Analyse eines Enzym-Substrat-Komplexes (Succinylierung)

Die Nutzung eines Tandem-Hybrid-Massenspektrometers ist bei derartigen Untersuchungen unverzichtbar. Andere Techniken sind nicht oder nur sehr beschränkt dafür geeignet.

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Ho 1311/3-1

N-dimensionale Proteomanalyse mit Parallelchromatographie und offline-Identifikation und Quantifizierung mittels Mikroplattentechnik

Kreusch, S.*), Hoppe, H.*), Bublitz, R.*), Rhode, H.*), Moore, T.+), Cumme, G. A.*), Ditze, G.#), Schulze, M. *) und A. Horn*) *) Klinikum der FSU Jena, Institut für Biochemie I, Jena +) Cybio AG, Jena #) Klinikum der FSU Jena, Werkstatt der MTI, Jena Die zentrale Technik für die Proteomanalyse, die 2D-Elektrophorese, hat eine Reihe bekannter Nachteile, wie begrenzte Trennkapazität (Menge, isoelektrischer Punkte und Größe), Produktion von Modifikationsartefakten, Denaturierung der Proteine und Schwierigkeiten bei der Automatisierung. Um diese Nachteile zu überwinden haben wir ein mehrdimensionales Trenn-und Analyseverfahren für die Proteine des Proteoms entwickelt, welches die gut etablierte Mikroplattentechnologie mit ihren Umfeldtechniken nutzt und zu einem digitalisierten Abbild des Proteoms in flüssigen, leicht zugänglichen Proben in Mikroplatten führt (Abb.1). Die Großgeräteinitiative der DFG ermöglichte die Beschaffung eines API QSTAR Pulsar i für das Vorhaben. Der Nachweis der prinzipiellen Funktionsfähigkeit des Verfahrens wurde anhand einer zweidimensionalen Analyse eines normalen Serumproteoms geführt. Die erste Trennung erfolgte nach der Größe unter nicht denaturierenden Bedingungen mittels Gelchromatographie, gefolgt von Anionenaustauschchromatographie mit Hilfe eines Polychromatographiemoduls, der eine Parallelchromatographie mit im 8x12-Raster angeordneten Mikrosäulen erlaubt. Spezielle Module die in Kombination mit der Cybio-Liquid-Handling-Technik das effektive Trennen und Analysieren einer grosser Probenzahl erlaubt, sowie Software zum Hantieren großer Datenmengen aus der Massenspektrometrie wurden entwickelt und erprobt. Durch den Einsatz der Software wurde als bester diskriminierender Parameter für die Identifikation von Proteinen mit MALDI-MS nach tryptischem Verdau die Summe der Peakhöhen der Peptide für das relevante Protein (nach Filterung von Isopeptiden aus dem Proteinsuchraum) erhalten. Die Proteinbestimmung erfolgt mit großem dynamischen Bereich durch Absorbanzmessung bei 205, 215 und 280 Nanometern in Mikroplatten. Beispielproteine in niedrigen Konzentrationen wurden über Enzymaktivität und ELISA charakterisiert. Zur Charakterisierung von Lipoprotein-Interaktomen wurden niedermolekulare Marker (Triglyceride und Cholesterol) in Verbindung mit den zugehörigen Apolipoproteinen bestimmt. Mit Hilfe des von der DFG erhaltenen Gerätes wurden durch LC-ESI-MS-MS nach tryptischen Verdau 130528 Peptide gefunden mit denen 617 Proteinen nach stringenten Filterkriterien identifiziert wurden. Das Verfahren wird hinsichtlich Anzahl der Trennschritte, Trennschärfe und Erhöhung des Automatisierungsgrades weiter entwickelt. Erwähnt werden müssen neben den vorhandenen guten Eigenschaften (z.T. besser als in den Spezifikationen genannt), folgende Schwachpunkte des erhaltenen Gerätes. Es wurde mit einer vorläufigen Softwareversion geliefert, die unzuverlässig war. Updates und Einweisung ermöglichten ab September 02 die vorgesehene automatische LC-MS-MS-Analytik. Unzureichend war auch das mitgelieferte Manual und die zunächst abwesende Onlinehilfe. Die Fehlercodes sind oft auch für die Applikationschemikern der Firma kryptisch. Auffällig häufig musste innerhalb von zweieinhalb Jahren die sehr teuren Turbopumpen gewechselt werden. Wenn diese Schwachpunkte noch durch die Firma beseitigt werden, kann das Gerät im vollem Umfang den Erwartungen entsprechen.

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THIRD DIMENSION

DIMENSION: N

Abb. 1: Schema mit dem Prinzip der Trennung in dem Verfahren. Die Proteine des Proteoms werden n verschiedenen Trennschritten unter standardisierten Bedingungen unterworfen, wobei jede der m1 nach der Trennung anfallenden Fraktionen im nächsten Trennschritt m2 Fraktionen liefert, so dass am Ende der Trennung m1*m2 *......* mn Fraktionen vorliegen, die offline mit bekannten Quantifizierungsmethoden (Proteinbestimmung, ELISA, RIA, Aktivitätstests) und Identifikationsmethoden (MALDI, ESI) charakterisiert werden.

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Ho 2222/2-1

Analyse des humanen Tau-Proteins

Ralf Hoffmann Biotechnologisch-Biomedizinisches Zentrum Fakultät für Chemie und Mineralogie Universität Leipzig Der eigenständige und meist progressive Verlauf neurodegenerativer Erkrankungen ist in vielen Fällen durch pathologische, hochmolekulare Ablagerungen in den betroffenen Hirn-arealen gekennzeichnet. Zentrale Fragestellung unserer Forschung ist die Aufklärung der chemischen und strukturellen Eigenschaften von Protein-Ablagerungen in den neuro-fibrillären Tangles (NFT) bei der Alzheimer-Krankheit. Die Hauptkomponente dieser NFT ist das Tau-Protein (�), das entsprechend seinem Vorkommen in den „paired helical filaments” (PHF) als PHF-� bezeichnet wird. Ziel der Arbeiten ist die Analyse der posttranslationalen Modifikationen des �-Proteins und deren relative Quantifizierung. Neben PHF-� untersuchen wir auch � aus Kalbshirn als Modellsystem. Modifiziertes � wurde nach unterschiedlichen Methoden (Gesamt-�, „twice-cycled“ �) aus Kalbshirn präpariert. Dabei wurden mittels SDS-PAGE und zweidimensionaler Gelelektro-phorese (IEF/ SDS-PAGE) die einzelnen Fällungs- und Reinigungsschritte der Aufarbeitung bezüglich der enthaltenen �-Varianten charakterisiert. Während Gesamt-� sehr stark mit Fremdproteinen verunreinigt war, enthielt das mit Tubulin zweimal selektiv gefällte und danach wieder gelöste � („twice-cycled“) nur wenige weitere Proteine im 2D-Gel. Die �-Muster beider Präparationen waren sehr ähnlich, so dass im Vergleich beider Präparations-methoden offensichtlich keine �-Varianten diskriminiert wurden. Zudem ähnelt das bovine � Muster dem PHF-� sehr stark, auch bezüglich der stark modifizierten Varianten. Interessant und wichtig für unsere Arbeiten ist die Tatsache, dass alle �-Präparationen in der 2D-Gelelektrophorese in einzelne diskrete Spots getrennt wurden. Dies legt den Schluss nahe, dass den Varianten des PHF-� mit unterschiedlichem Phosphorylierungsgrad in vivo eine Bedeutung zukommt und kein unspezifisches Phosphorylierungsmuster in den abgelagerten Filamenten vorliegt. Nach elektrophoretischer Charakterisierung wurde das von Prof. Dr. P. Davies (Einstein College, Bronx, U.S.A.) zur Verfügung gestellte PHF-� enzymatisch (Trypsin, Arg-C Protease) gespalten und massenspektrometrisch analysiert. Dabei wurde sowohl eine statische nano ESI- als auch eine nano LC-ESI-Kopplung verwendet. Insgesamt wurden über 140 Peptide im tryptischen Verdau nachgewiesen (Tabelle 1), von denen wiederum 85 Peptide durch MS/MS-Spektren identifiziert wurden. Tabelle 1: Massenspektrometrische Analyse von PHF-� nach enzymatischer

Spaltung

Protease Anzahl Peptide Identifizierte Sequenzen

Trypsin 140 85

Arg-C Protease 31 10 Während beim Rind fünf verschiedene �-Isoformen durch unterschiedliches „Splicing” entstehen können, liegen beim Menschen sechs Isoformen vor. Die als Isoform A bis F bezeichneten Varianten werden in der SDS-PAGE in sechs Banden im Bereich von 45 bis 65 kDa getrennt. Die erwarteten spezifischen Peptide der einzelnen Isoformen wurden mittels Massenspektrometrie ebenfalls in der tryptischen Spaltung identifiziert (Tabelle 2). Tabelle 2: Identifizierte tryptische Spaltpeptide der PHF-� Präparation, die

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charakterstisch für eine der sechs humanen Isoformen (A bis E) sind.

Peptid 1 Peptid 2 Peptid 3 Peptid 4 Peptid 5 Peptid 6

[M+H]+ 1387,96 u 3009,64 u 3031,50 u 3428,40 u 3954,85 u 4570,50 u

Isoform A, B, C B, E B, F B, E C, F A, D Von den identifizierten 85 �-Peptiden der tryptischen Spaltung waren insgesamt 45 Peptide modifiziert (Tabelle 3). Die Asparaginreste in den Positionen 165 und 255 (bezogen auf humanes � mit 441 Resten) sind offenbar vollständig deamidiert und liegen als Asparagin-säure vor. Es gibt zudem eine N-terminal um 5 Reste verkürzte �-Variante mit einem Pyro-glutamatrest (pGlu). Da vor der Glu-Position ein Lysin vorliegt, kann aber nicht ausgeschlossen werden, dass hier erst nach der tryptischen Spaltung bei der Aufarbeitung und Reinigung ein pGlu gebildet wurde. Dies erscheint jedoch unwahrscheinlich. Zusätzlich haben wir eine Formylierung des Thr245 beobachtet, die jedoch ein Artefakt der Reinigung in Gegenwart von Ameisensäure war. Dabei wurde dieser Threoninrest innerhalb weniger Stunden quantitativ formyliert. Tabelle 3: Identifizierte Modifikationen in PHF-� (Formyl ist wahrscheinlich ein Artefakt

der Aufarbeitung mit Ameisensäure).

Modifikation Asn → Asp pGlu Formyl Phosphoryl

Anzahl Peptide 3 1 1 40

Position 165, 255 6 Thr245 Ser,Thr Nach unserem gegenwärtigen Kenntnisstand liegen in PHF-� definierte Phosphory-lierungsmuster vor, wobei bestimmte Phosphorylierungsstellen nur in Kombination auftreten und andere sich offenbar gegenseitig ausschließen. Im Zusammenhang mit der Alzheimer-Krankheit sind insbesondere die �-Regionen 230-240 und 210-220 von großem Interesse. In früheren Arbeiten mit monoklonalen Antikörpern haben wir gezeigt, dass beide Regionen in PHF-� ein Alzheimer-spezifisches Phosphorylierungsmuster aufweisen, das von diagnosti-schem Interesse sein könnte. Die Regionen �230-240 in PHF-� sind einfach (231P), zweifach (231P+235P, 231P+237P, 235P+237P) und dreifach (231P+235P+237P) phosphoryliert (Tabelle 4), obwohl theoretisch acht verschiedene Stellungsisomere möglich wären. In der Spaltung mit Arg-C Protease war die Tau-Region 210-221 mit den potentiellen Phosphory-lierungsstellen Ser210, Thr212, Ser214 und Thr217 enthalten. Entsprechend wurden neben dem unphosphorylierten auch ein-, zwei-, drei- und vierfach phosphorylierte Peptide identifiziert. Welche Stellungsisomere bei jedem einzelnen Phosphorylierungsgrad vorliegen und ob neben der Hauptvariante noch weitere Isomere vorliegen soll in weitergehenden Arbeiten genauer untersucht werden.

Tabelle 4: Identifizierte Phosphorylierungsmuster in PHF-� nach tryptischer Spaltung

Sequenzabschnitt 175-181 212-217 231-238 396-404

Phosphorylierungsgrad 1P, 2P 1P, 2P, 3P, 4P

1P, 2P, 3P 1P, 2P, 3P

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Ka 783/3-1

FTe or not FTe MS – das ist hier die Frage Karas, M., Bahr, U. et al. Institut für Pharmazeutische Chemie JW Goethe-Universität Frankfurt Das Ende Oktober 1999 von der DFG bewilligte FT-ICR Massenspektrometer wurde Ende 2001 ausgeliefert. Grund für die Verzögerung waren Lieferprobleme der Firma, deren Gerät bestellt worden war, so dass die Bestellung schliesslich rückgängig gemacht werden musste und das zu dieser Zeit einzig auf dem Markt verfügbare FT-MS (APEX III) bestellt wurde. Bis ca Ende des Jahres 2002 war ein regelmäßiger Betrieb dieses Gerätes aufgrund massiver Hard- und Softwarefehler nicht möglich. Die häufigsten Probleme waren Abstürze von Turbopumpen und in Folge dessen Defekte an elektronischen Bauteilen und systematische Kommunikationsprobleme zwischen Instrumentensteuerung und Software, was zu permantenen Software-Abstürzen führte. Aber auch nach Behebung der gröbsten Mängel muss festgestellt werden, dass das Gerät nicht zuverlässig läuft und viele der geplanten Projekte nicht durchgeführt werden können. So scheitert die Untersuchung intakter Proteine oder Glykoproteine (z.B.auf Disulfidbrücken oder posttranslationale Modifikationen, die Untersuchung nicht-kovalenter Komplexe) daran, dass der Ionentransfer nicht für hohe m/z-Werte ausgerüstet ist und kein zuverlässiger, reproduzierbarer Betrieb in NanoESI, erst recht nicht im negativen Ionenmodus möglich ist. Die Strukturaufklärung intakter Biomoleküle mittels ECD-Technik scheitert daran, daß bis heute immer noch kein ECD-Flansch geliefert wurde, der ohne aufwendigen Umbau des Geräts sowohl die Fragmentierung mittels IRMPD und ECD erlaubt. Der Einsatz der MALDI Quelle war für uns insbesondere vielversprechend als Ergänzung zu unseren Proteom-Analysen mittels MALDI-TOF-MS. Hier schien uns vor allem die MS/MS-Technik sehr attraktiv. Leider hat sich herausgestellt, dass die Empfindlichkeit im MALDI Betrieb im Vergleich zu den TOF-Geräten wesentlich geringer ist und dass die Fragmentierung im MS/MS-Betrieb ineffizient ist, so dass nur wenige substanzspezifische Fragmente erhalten werden. Eine vergleichende Analyse von MHC-Peptiden mit dem Ziel der Identifizierung von Proteinen wurde an verschiedenen MALDI-MS/MS-Geräten durchgeführt. Neben dem FT-MS wurden ein TOF-Gerät im PSD-Betrieb (Voyager STR), ein TOF/TOF-MS (Proteomics Analyzer 4700), und ein Atmospheric-pressure-MALDI Ionenfallen-Gerät (MSD) eingesetzt. Hier zeigte sich, dass die Anzahl der gefundenen Peptidfragmente beim FT-MS am geringsten war, allerdings wird dieses Manko durch eine höhere Massengenauigkeit wettgemacht, so dass eine Identifizierung der Proteine mit vergleichbarer Signifikanz wie bei den anderen Geräten gelingt. Dies bedeutet umgekehrt natürlich auch , dass keine Vorteile aus der FTMS-Technik gezogen werden können. Die bisherige Zwischenbilanz ist folgende: das Gerät funktioniert nur im Prinzip, leider führen die geringe Empfindlichkeit im MALDI- und MS/MS-Betrieb und die geringe Zuverlässigkeit dazu, dass dieses Gerät nicht wie erwartet routinemäßig für unsere Arbeiten genutzt wird, sondern nur für Spezialfälle, wie z.B. Präzisionsmessungen (um z.B. zwischen isobaren Peptiden zu unterscheiden) oder für Hochauflösungs-Messungen. Die Frage stellt sich hier, inwieweit die hohen Anschaffungs- und auch Folgekosten durch das eher geringe Verhältnis von Aufwand zu Nutzen gerechtfertigt sind.

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Le 597/3-1

Proteinidentifizierung und Identifizierung von Phosphorylierungen mit MALDI-TOF MS Pfannstiel, J. et al. Biochemisches Zentrum Universität Heidelberg Im Rahmen der Großgeräteinitiative der DFG wurde dem Biochemiezentrum Heidelberg (BZH) ein MALDI-TOF Massenspektrometer (Reflex III) zur Verfügung gestellt, das im März 2000 in Betrieb genommen wurde. Nach Beseitigung einiger Mängel, insbesondere der defekten Probeneinzugsmechanik, war das Gerät im März 2001 voll einsatzfähig. Das Reflex III wurde am BZH vorrangig für folgende Anwendungen eingesetzt: �� Proteinidentifizierung durch Peptidmassen-Fingerprint �� Proteinidentifizierung nach Peptidfragmentierung mittels Post source decay (PSD) �� Identifizierung von post-translationalen Modifizierungen (Phosphorylierungen) �� Identifizierung von Protein-Protein Wechselwirkungsdomänen �� Verifizierung synthetischer Peptide und Lipopeptide Im Folgenden werden exemplarisch zwei Studien dargestellt, in denen diese Techniken zum Einsatz kamen: a) Arbeitsgruppe Prof. Dr. Ed Hurt: Biogenese der ribosomalen 60S Untereinheit von S.cerevisiae Ausgangspunkt der Untersuchungen war ein ein stabiles Zwischenprodukt des S.cerevisiae 60S Pre-Ribosoms, das mittels TAP-Affinitäschromatographie isoliert werden konnte (Baßler et al., 2001). Ausgehend von der Idee, daß Proteine, die in diesem Komplex vorhanden waren, auch Bestandteil früherer bzw. späterer Stadien der Biogenese des 60S Ribosoms sind, wurde eine Strategie entwickelt, die es ermöglichte, die Veränderungen in der Zusammensetzung des 60S Pre-Ribosoms auf seinem Weg vom Nucleolus zum Cytosol zu untersuchen. Dazu wurden 6 nicht-ribosomale Proteine aus dem bereits bekannten Zwischenprodukt ausgewählt, die in Immunfluoreszenz-Analysen vorwiegend im Nucleolus, im Nucleus bzw. im Cytosol lokalisiert waren. Diese wurden C-terminal mit einem TAP-Tag versehen und die jeweiligen Komplexe über Protein A- und Calmodulin-Affinitätschromatographie gereinigt. Die Analyse der Proteinzusammensetzung der 60 S Precursor erfolgte mittels 1D-Gradientengelen und anschließendem Peptidmassenfingerprint oder in Einzelfällen auch über Peptidfragmentierung (PSD). Im Rahmen dieser Studie wurden über 50 nicht-ribosomale Proteine, die vorwiegend mit den „frühen“, nucleoplasmatischen 60S Pre-Ribosomen assoziiert waren, identifiziert. Auf dem Weg vom Nucleoplasma zum Cytosol nahm die Komplexizität der 60S Partikel ab, wobei die Zusammensetzung der ribosomalen Proteine weitgehend konstant blieb. Einige der nicht-ribosomalen Proteine konnten bereits mit dem Export oder Reifung der 60S Untereinheit in Verbindung gebracht werden, für andere Proteine konnte bisher noch keine Funktion spezifiziert werden. Sie sind Ziel weitergehender Untersuchungen. Dieser Ansatz ermöglichte die Erstellung eines neuen Models für die Biogenese und den Export der 60S Untereinheit (Nissan et al., 2002). b) Arbeitsgruppe PD Dr. Johannes Lechner: Identifizierung von Phosphorylierungsstellen in S.cerevisae Kinetochorproteinen Das Kinetochor von S.cerevisiae ist ein Multiproteinkomplex, der aus mindestens 40 verschiedenen Proteinen besteht und sich auf der centromeren DNA assembliert. Dieser Multiproteinkomplexes vermittelt bei der Segregation der Chromosomen die Anheftung der Schwesterchromatiden an die mitotische Spindel und enthält zudem einen

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Kontrollmechanismus (Checkpoint), der eine bipolare Anheftung der Schwesterchromatiden sicherstellt. Einer der Regulationsmechanismen, der bei der Chromosomen-Segregation von entscheidender Bedeutung ist, ist die reversible Phosphorylierung von Kinetochorproteinen. Aus vorherigen Arbeiten war bekannt, daß sich ein Kinetochor-Subkomplexs, bestehend aus Centromer-DNA und mindestens 13 Proteinen, durch Affinitätschromatographie eines bekannten Kinetochorproteins (Okp1) reinigen ließ. Um Phosphorylierungsstellen in diesem Subkomplexs zu identifizieren, wurden die Banden aus einem 1D-Gel ausgeschnitten und tryptisch verdaut. Die Komplexizität des Peptidgemisches nach dem Verdau wurde durch IMAC (Immobilized metal chelate chromatography)-Affinitätschromatographie reduziert, wodurch gleichzeitig eine Anreicherung der phosphorylierten Peptide erzielt wurde. Die Eluate der IMAC-Affinitätschromatographie wurden mittels MALDI-TOF analysiert. Die Identifizierung der phosphorylierten Peptide erfolgte im Falle von Serin- und Threonin-phosphorylierten Peptiden über den Vergleich von Spektren, die im Linear-Modus bzw. im Reflektor-Modus aufgenommen wurden. Letztere zeigten zusätzliche Signale, die durch die Abspaltung von Phosphorsäure (�-Eliminierung) entstanden und im linearen Modus nicht zu beobachten waren. Auf diese Weise konnten insgesamt 9 Phosphorylierungsstellen in 2 Proteinen (Okp1, Ame1) dieses Subkomplexes identifiziert werden. Die Funktion dieser Phoshorylierungen ist Gegenstand zukünftiger Untersuchungen. Liste der Publikationen: Bassler, J., Grandi, P., Gadal, O., Lessmann, T., Petfalski, E., Tollervey, D., Lechner, J. and Hurt, E. (2001) Identification of a 60S preribosomal particle that is closely linked to nuclear export. Mol Cell, 8, 517-529. Fischer, T., Strasser, K., Racz, A., Rodriguez-Navarro, S., Oppizzi, M., Ihrig, P., Lechner, J. and Hurt, E. (2002) The mRNA export machinery requires the novel Sac3p-Thp1p complex to dock at the nucleoplasmic entrance of the nuclear pores. Embo J, 21, 5843-5852. Gommel, D.U., Memon, A.R., Heiss, A., Lottspeich, F., Pfannstiel, J., Lechner, J., Reinhard, C., Helms, J.B., Nickel, W. and Wieland, F.T. (2001) Recruitment to Golgi membranes of ADP-ribosylation factor 1 is mediated by the cytoplasmic domain of p23. Embo J, 20, 6751-6760. Janke, C., Ortiz, J., Tanaka, T.U., Lechner, J. and and Schiebel, E. (2002) Four new subunits of the Dam1-Duo1 complex reveal novel functions in sister kinetochore biorientation. Embo J, 21, 181-193. Milkereit, P., Strauss, D., Bassler, J., Gadal, O., Kuhn, H., Schutz, S., Gas, N., Lechner, J., Hurt, E. and Tschochner, H. (2003) A noc complex specifically involved in the formation and nuclear export of ribosomal 40 s subunits. J Biol Chem, 278, 4072-4081. Nissan TA, Bassler J, Petfalski E, Tollervey D, Hurt E. (2002) 60S pre-ribosome formation viewed from assembly in the nucleolus until export to the cytoplasm. EMBO J. 20, 5539-47. Scharfenberger, M., Ortiz, J., Grau, N., Janke, C., Schiebel, E. and Lechner J. (2003) Nsl1p, a novel component of the S. cerevisiae kinetochore, is essential for the establishment of bipolarity and the kinetochore localization of the Dam-Duo complex., submittd to Embo J. Seelenmeyer, C., Wegehingel, S., Lechner, J. and Nickel, W. (2003) The cancer antigen CA125 represents a novel counter receptor for galectin-1. J Cell Sci, 116, 1305-1318. Stemmann, O., Neidig, A., Köcher, T., Wilm, M. and Lechner, J. (2002) Hsp90 enables Ctf13p/Skp1p to nucleate the budding yeast kinetochore. Proc Natl Acad Sci, 99, 8585-8590. Strasser, K., Masuda, S., Mason, P., Pfannstiel, J., Oppizzi, M., Rodriguez-Navarro, S., Rondon, A.G., Aguilera, A., Struhl, K., Reed, R. and Hurt, E. (2002) TREX is a conserved complex coupling transcription with messenger RNA export. Nature, 417, 304-308.

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O

m/z 806

∆=0,0599amu

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Li 309/19-1

Erste Erfahrungen mit dem LTQ-FT MS: Die hochauflösende Ionenfalle Sebastian Beck, Timo Hagemeister, Michael W. Linscheid Institut für Chemie Humboldt Universität zu Berlin, Der Arbeitsbericht zum Antrag mit dem ursprünglichen Titel „Strukturen von chemisch modifizierten DNA Oligomeren : Beiträge mit hochauflösender Massenspektrometrie“ muss gänzlich anders ausfallen als eigentlich vorgesehen. Die Gründe, die vermutlich in den Grundzügen allgemein bekannt sind, sollen hier nur kurz aufgeführt werden. Der Beginn des Projektes war für Februar 2000 vorgesehen, durch Probleme bei der Lieferfirma wurde das eigentlich bestellte Gerät nicht mehr lieferbar. Nach Abwarten der nötigen Fristen wurde das Projekt mit einer anderen Firma abgeschlossen, wobei eine Entwicklungszeit in der Firma und zusammen mit der Firma an den Prototypen mit in Kauf genommen wurde. Allerdings war der Mitarbeiter (Postdoc) zum Zeitpunkt des Scheiterns der ersten Bestellung schon eingestellt. In der Zeit ohne FTMS wurde uns von eine Ionenfalle vom Typ Deca XP zur Verfügung gestellt, mit der wir Messungen an einer „normalen“ Ionenfalle durchführen konnten. Zusätzlich haben wir einen Prototyp eines Ionenmobilitätsspektrometers gebaut, der schon den Anforderungen an eine MS Kopplung – besondere Hochspannungsausführungen, hoher Temperaturen, große Dimensionen – genügte. Eine zweiter Version, die erheblich höhere Auflösung zeigen wird und auch an die lineare Ionenfalle koppelbar sein wird, ist gerade im entstehen. Der Mitarbeiter aus dem Projekt schied aber schon im September 2002 aus der Gruppe aus, eine Verlängerung wurde angesichts des noch nicht vorhandenen FTMS nicht beantragt. Das FTMS wurde im Juni dieses Jahres geliefert und nach dreitägiger Installation abgenommen. Der Status bezüglich der Hardware ist sehr gut und nicht auf Prototyp Ebene, die Software ist in Beta-Version und die dritte Version steht vor der Übergabe an uns. Wir haben das Gerät in zwei verschiedenen Projekten verwendet die nun kurz dargestellt sein sollen. Zum einen haben wir modifizierte Dinucleotide untersucht, deren Verhalten wir schon in 3D Traps studiert haben, einige Fragen aber wegen isobarer Abspaltungen nicht klären konnten. Dies haben wir nun durch die Hochauflösung klären können, wobei diese Messungen auch dazu dienten, die Spezifikationen zu überprüfen. Das Ergebnis ist sehr zufrieden stellend. In der nebenstehen-den Abbildung ist eine derartige Fragmentierung gezeigt; die Spektren des FTMS (Abb.2) klären die Frage der Reaktionswege eindeutig. Es wird eine Ribose zuerst abgespalten. Eine zweite Reaktionsfolge konnte durch MS2 und MS3 Experimente geklärt werden,

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bei denen der Messfehler unter 1 ppm lag. Hier konnten wir zeigen, dass zwei Reaktionswege, die zu Fragmenten mit einer Differenz von 18 amu führten, gänzlich unterschiedlich ablaufen. Abb.2: Hochauflösungsdaten gemessen(oben) und zwei berechnete Möglichkeiten Abb.3 : Fragmentierung des cis Platin-adduktes an dApdG; die Messgenauigkeit lag bei ca. 1ppm In einer zweiten Serie von Experimenten beschäftigten wir uns mit Membran-Proteinen aus Bdellovibrio, einem kleinen räuberischen Bakterium, das gram negative Bakterien angreift und zerstört. Die folgenden Abbildungen zeigen ein Basispeak-Chromatogramm (Nano-HPLC, Pumpe Agilent nano1100) von Membranproteinen des HD 100 Stammes von Bdellovibrio ohne vorgeschaltete PAGE Trennung (Abb. 4). Abb.4: Basepeak Massenchromato-gramm der Peptide aus dem äußeren Membranprotein von Bdellovibrio HD100 Dann folgt aus dieser Trennung ein Massenchromatogramm des Peptides mit der Sequenz MGEWTWGVTAK und die Molekülionengruppe, die eine Genauigkeit von 0.37 ppm bei einer berechneten Auflösung von 39,304 zeigt (bei Masse 1266) zeigt. Die Qualität der Daten in dieser Trennung ist durchgehend so hoch. Der letzte Vergleich zeigt zwei Massenchromatogramme, eines in einem 1 amu Fenster, das zweite bei 0.4 mmu, um

Pt

H2N NH2

p !346 348 350 352 354 356 358 360

m/z

352.0020350.9999

353.0022

355.0052

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H2N NH2

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The difference is 18 amu, but not H20

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The difference is 18 amu, but not H20

RT: 0.00 - 119.97 SM: 3G

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68.25

45.72

53.3937.56

61.86

79.4078.21 95.71 106.1793.63 110.25

NL:2.73E6Base Peak F: FTMS + p ESI Full ms [ 320.00-2000.00] MS omp_hi_1zu10

671 672 673 674 675 676 677 678 679m/z

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674.0583673.0562675.0585

676.0619

674.1182673.1161

675.1183

676.1217

Isotopic pattern of fragment m/z 674 (measured)

Isotopic pattern of A-Pt-G-s-p(calculated)

Isotopic pattern of s-A-Pt-G-s(calculated)

671 672 673 674 675 676 677 678 679m/z

0671 672 673 674 675 676 677 678 679

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675.1183

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die Stabilität der Messung aufzuzeigen. Auch das zweite Chromatogramm ist vollständig und zeigt kein relevanten Einbrüche.

Abb. 5 (a) Massenchromatogramm der Masse m/z 1265 (oben) , (b) Molekülionen des Peptides und berechnete Masse der Sequenz MGEWTWGVTAK (neben stehend) Abb.6 (unten) Massenchromatogramm bei m/z 874.43 mit einer Masse Breite, 873.93-874.93 (links) und mit 0.4 mmu , d.h. 874.4299-874.4303 (rechts) Die Proteine zeigen keinerlei Homologie zu bekannten Membranproteinen und werden gerade sequenziert. Die Arbeiten haben trotz der kurzen Zeit, die uns das Gerät zur Verfügung steht, schon zu mehreren Beiträgen auf Tagungen geführt und erste Publikationen sind in Vorbereitung. References 1. Structure Elucidation of Structural Proteins from Yersinia Phages using MALDI-ToF and ESI-FTMS Data Sebastian Beck 1; Eckhard Strauch 2; Stefan Hertwig 2; Iris Klein 2; Antje Konietzny 2; Bernd Appel 2; Andreas

Wieghaus 3; Wolfgang Metelmann-Strupat 3; Jens Griep-Raming 3; Michael W. Linscheid 1 1Humboldt Universität zu Berlin, Berlin, Germany; 2Robert Koch Institute, Berlin, Germany; 3Thermo

Finnigan, Bremen, Germany , ASMS 2002, Montreal,8.-12. Juni 2003 2. Fragmentation pathways of cisplatin adducts to dinucleotides determined by FT-ICR-MS Timo Hagemeister, M.W.Linscheid, Humboldt Universität zu Berlin, Germany, ASMS 2002, Montreal,8.-12.

Juni 2003 3. First Experiences with the New Finnigan LTQ FTMS, Michael Linscheid, Timo Hagemeister, Sebastian Beck,

Andreas Springer, Ludwig Schwarz, Humboldt Universität zu Berlin , Thermo Electron User Meeting, Montreal, 8.Juni 2003

4. High-Resolution High Accuracy Mass Spectrometry of Bioplolymers Using a New Hybrid Linear IonTrap-FTICR Mass Spectrometer, M.W: Linscheid, Dominik Schwudke, Sebastian Beck, Humboldt Universität zu Berlin, Mass Spectrometry in Health and Life Sciences, San Francisco, 24.-29.August, 2003

RT: 17.63 - 58.87 SM: 3G

20 25 30 35 40 45 50 55Time (min)

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32.68

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Li 448/1-1

Analyse von Glycokonjugaten mittels FT-ICR MS: Beiträge zur Struktur – Wirkungsbeziehung bakterieller Zellwandkomponenten

Buko Lindner, LG Biophysik Forschungszentrum Borstel Borstel

Glycokonjugate der bakteriellen Zellwand spielen bei der Interaktion von Bakterien und Wirtszellen eine wichtige Rolle. Da schon geringfügige Modifikationen der Makromoleküle (Glycolipide, Peptidoglycane, Lipolysaccharide) deren biologische Aktivität erheblich verändern können, ist eine detaillierte Charakterisierung ihrer chemischen Struktur von entscheidender Bedeutung für ein grundlegendes Verständnis von Wirkmechanismen. Die Analytik der isolierten Substanzen wird durch deren Komplexität, amphiphilen Eigenschaften und ihrer intrinsischen biologischen Heterogenität erschwert. Mit Hilfe des von der DFG bereitgestellten hochauflösenden FT-ICR Massenspektrometers (7 Tesla Apex II) konnten zahlreiche Beiträge zur Charakterisierung von komplexen Glycolipiden geliefert werden, die mit anderen massenspektrometrischen Verfahren nicht oder nur unzureichend hätten aufgeklärt werden können. Dies soll anhand einiger Beispiele dokumentiert werden:

Die hohe Massenauflösung des Gerätes (>100 000 im Breitbandmodus) führte zur Erkennung eines neuen Glycolipides, das sich von einem bereits bekannten nur um �m = 0.03 Masseneinheiten unterscheidet [1] und zur Identifizierung von Kernoligosacchariden, die bisher nicht eindeutig voneinander getrennt nachgewiesen werden konnten [2].

Die hohe und reproduzierbare Massengenauigkeit (~ 1 ppm) in Verbindung mit der effektiven Capillary Skimmer Dissociation erlaubte die Heterogenität des Lipid-Ankers und des Kernoligosaccharides verschiedener bakterieller Endotoxine ohne vorherige aufwendige Fraktionierung und Derivatisierung zu charakterisieren und ihre Abhängigkeit von äußeren Wachstumsbedingungen aufzuzeigen [3,4,5,6,7].

MS/MS Analysen mittels SORI-CID und besonders mittels IRMPD liefern auch Fragmentionen mit hoher Massengenauigkeit, so dass es möglich war, die ungewöhnliche Struktur eines biologisch nicht aktiven Lipid As, einschließlich der Verteilung der 6 unterschiedlichen Fettsäuren aufzuklären [8]. Die detaillierte MS/MS Analyse von LPS aus genetisch veränderten Mutanten führte zu einem besseren Verständsnis der LPS-Biosynthese [9,10]. Schließlich gelang es unter Einsatz von IRMPD-MS/MS, zwischen der strukturellen Variabilität im inneren und äußerem Kernoligosaccharid von Proteus OX Bakterien zu differenzieren und als Grundlage für ein Screening von Patientenstämmen dienen wird [11].

Veröffentlichungen: [1] Pasciak M, et al. Novel bacterial polar lipids containing ether-linked alkyl chains, the structures and biological

properties of the four major glycolipids from Propionibacterium propionicum PCM 2431 J Biol Chem 2003;278(6):3948-56.

[2] Müller-Loennies S, et al. Structural analysis of oligosaccharides from LPS of E. coli K 12 strain W3100 reveals a link between inner and outer core LPS biosynthesis. J Biol Chem. 2003; 278(36):34090-34101.

[3] Heine H, et al. Endotoxic activity and chemical structure of lipopolysaccharides from Chlamydia trachomatis serotypes E and L2 and Chlamydophila psittaci 6BC. Eur J Biochem. 2003; 270(3):440-50.

[4] Gremyakova TA, et al. The core structure of the lipopolysaccharide of Yersinia pestis strain KM218. Influence of growth temperature. Adv Exp Med Biol. 2003; 529:229-31

[5] Vinogradov EV, et al. The core structure of the lipopolysaccharide from the causative agent of plague, Yersinia pestis. Carbohydr Res. 2002; 337(9):775-7.

[6] Bystrova OV, et al. Structural studies on the core and the O-polysaccharide repeating unit of Pseudomonas aeruginosa immunotype 1 lipopolysaccharide. Eur J Biochem. 2002; 269(8):2194-203.

[7] Bystrova OV, et al. Structure of the biological repeating unit of the O-antigen of Pseudomonas aeruginosa immunotype 4 containing both 2-acetamido-2,6-dideoxy-D-glucose and 2-acetamido-2,6-dideoxy-D-galactose. Carbohydr Res. 2003; 338:1801-6.

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[8] Schwudke D, et al. The obligate predatory Bdellovibrio bacteriovorus possesses a neutral lipid A containing alpha-D-Mannoses that replace phosphate residues: similarities and differences between the lipid As and the LPS of the wild type strain and its host-independent derivative. J Biol Chem. 2003; 278:27502-12.

[9] Gronow S, et al. Construction of a deep-rough mutant of Burkholderia cepacia ATCC 25416 and characterization of its chemical and biological properties. J Biol Chem. 2003; 278(3):1647-55

[10] Müller-Loennies S, et al. Structural analysis of deacylated lipopolysaccharide of Escherichia coli strains 2513 (R4 core-type) and F653 (R3 core-type).Eur J Biochem. 2002; 269:5982-91.

[11] Kondakova AN, et al. Structural studies on the lipopolysaccharide core of Proteus OX strains used in Weil-Felix test: a mass spectrometric approach. Carbohydr Res. 2003 in press

Publikationen, für die das FT-ICR Massenspektrometer eingesetzt wurde 2003: 1. Gronow S, Noah C, Blumenthal A, Lindner B, Brade H.; Construction of a deep-rough mutant of Burkholderia cepacia ATCC 25416 and characterization of its chemical and biological properties. J Biol Chem. 2003; 278(3):1647-55. 2. Pasciak M, Holst O, Lindner B, Mordarska H, Gamian A.; Novel bacterial polar lipids containing ether-linked alkyl chains, the structures and biological properties of the four major glycolipids from Propionibacterium propionicum PCM 2431. J Biol Chem. 2003; 278(6):3948-56. 3. Bystrova OV, Lindner B, Moll H, Kocharova NA, Knirel YA., Zahringer U, Pier GB; Structure of the lipopolysaccharide of Pseudomonas aeruginosa O-12 with a randomly O-acetylated core region. Carbohydr Res. 2003; 338(18):1895-905. 4. Bystrova OV, Lindner B, Moll H, Kocharova NA, Knirel YA., Zahringer U, Pier GB; Structure of the biological repeating unit of the O-antigen of Pseudomonas aeruginosa immunotype 4 containing both 2-acetamido-2,6-dideoxy-D-glucose and 2-acetamido-2,6-dideoxy-D-galactose. Carbohydr Res. 2003; 338(17):1801-6. 5. Müller M, Scheel O, Lindner B, Gutsmann T, Seydel U.; The role of membrane-bound LBP, endotoxin aggregates, and the MaxiK channel in LPS-induced cell activation. J Endotoxin Res. 2003; 9(3):181-6. 6. Müller-Loennies S, Lindner B, Brade H.; Structural analysis of oligosaccharides from LPS of E. coli K 12 strain W3100 reveals a link between inner and outer core LPS biosynthesis. J Biol Chem. 2003; 278(36):34090-34101. 7. Gremyakova TA, Vinogradov EV, Lindner B, Kocharova NA, Senchenkova SN, Shashkov AS, Knirel YA, Holst O, Shaikhutdinova RZ, Anisimov AP.; The core structure of the lipopolysaccharide of Yersinia pestis strain KM218. Influence of growth temperature. Adv Exp Med Biol. 2003; 529:229-31. 8. Schwudke D, Linscheid M, Strauch E, Appel B, Zahringer U, Moll H, Müller M, Brecker L, Gronow S, Lindner B.; The obligate predatory Bdellovibrio bacteriovorus possesses a neutral lipid A containing alpha-D-Mannoses that replace phosphate residues: similarities and differences between the lipid As and the lipopolysaccharides of the wild type strain B. bacteriovorus HD100 and its host-independent derivative HI100. J Biol Chem. 2003; 278(30):27502-12. 9. Heine H, Müller-Loennies S, Brade L, Lindner B, Brade H.; Endotoxic activity and chemical structure of lipopolysaccharides from Chlamydia trachomatis serotypes E and L2 and Chlamydophila psittaci 6BC. Eur J Biochem. 2003; 270(3):440-50. 2002: 1. Müller-Loennies S, Lindner B, Brade H.; Structural analysis of deacylated lipopolysaccharide of Escherichia coli strains 2513 (R4 core-type) and F653 (R3 core-type). Eur J Biochem. 2002; 269(23):5982-91. 2. Müller-Loennies S, Grimmecke D, Brade L, Lindner B, Kosma P, Brade H.; A novel strategy for the synthesis of neoglycoconjugates from deacylated deep rough lipopolysaccharides. J Endotoxin Res. 2002; 8(4):295-305. 3. Ludwig A, Schiemann F, Mentlein R, Lindner B, Brandt E.; Dipeptidyl peptidase IV (CD26) on T cells cleaves the CXC chemokine CXCL11 (I-TAC) and abolishes the stimulating but not the desensitizing potential of the chemokine. J Leukoc Biol. 2002; 72(1):183-91. 4. Vinogradov EV, Lindner B, Kocharova NA, Senchenkova SN, Shashkov AS, Knirel YA, Holst O, Gremyakova TA, Shaikhutdinova RZ, Anisimov AP.; The core structure of the lipopolysaccharide from the causative agent of plague, Yersinia pestis. Carbohydr Res. 2002; 337(9):775-7. 5. Bystrova OV, Shashkov AS, Kocharova NA, Knirel YA, Lindner B, Zahringer U, Pier GB.; Structural studies on the core and the O-polysaccharide repeating unit of Pseudomonas aeruginosa immunotype 1 lipopolysaccharide. Eur J Biochem. 2002; 269(8):2194-203. 6. Puchkov EO, Zähringer U, Lindner B, Kulakovskaya TV, Seydel U, Wiese A. ; The mycocidal, membrane-active complex of Cryptococcus humicola is a new type of cellobiose lipid with detergent features. Bioch Biophys Acta 2002; 1558:161-170.

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Me 765/8-1

Einsatz des FTICR am Medical Proteom-Center Bochum Helmut E. Meyer, Moritz Bernd, André van Hall, et al. Medical Proteom-Center Ruhr-University of Bochum �� Hochaufgelöste LC-FTICR-MS Fingerprint-Analytik

Die ESI-Ionenquelle des FTICR-Massenspektrometers wurde online mit einer C18-Reversed Phase Chromatographie-Säule (180 µm I.D.) gekoppelt. Aufgetragen wurden 14 pmol der tryptisch verdauten Formaldehyde dehydrogenase aus Hyphomicrobium zavarzinii ZV 580 (MW=48.4 kDa). Bei dieser Peptid-Fingerprint Analyse konnten 9 Peptide mit einer Massenabweichung von unter 3 ppm detektiert werden, wobei eine Gesamtsequenzabdeckung von 33 % erzielt worden ist. Dies unterstreicht die hohe Massengenauigkeit, die mit diesem Gerätetyp erreicht werden kann.

�� Hochaufgelöste MALDI-FTICR-MS Fingerprint-Analytik

Seit Januar 2002 ist unser Gerät mit einer SCOUT 100 MALDI-Quelle ausgestattet. Zur Überprüfung der Leistungsfähigkeit der MALDI-FT-ICR Analytik hinsichtlich Empfindlichkeit und Massengenauigkeit wurden E.coli-Lysate 2-D gelelektrophoretisch aufgetrennt, schwach gefärbte Spots ausgestochen und diese tryptisch verdaut. So konnte u.a. Phosphofructokinase I identifiziert werden, wobei auch hier bei einer Sequenzabdeckung von 42 % eine Massengenauigkeit von sogar unter 2 ppm erreicht wurde.

�� Einsatz der MALDI FTICR MS für die quantitative Proteom-Analyse Um verschiedene Zustände einer Kultur von Mikroorganismen oder verschiedene Krankheitszustände eines Gewebes miteinander vergleichen zu können, wird eine Weiterentwicklung der quantitativen Proteom-Analyse auf Basis Iostopen-markierter Proteine immer wichtiger. Durch Analyse von Gemischen aus 14N- und 15N-markierten E.coli-Lysaten konnte gezeigt werden, dass sich die MALDI-FT-ICR-MS Technologie hervorragend für solche Untersuchungen eignet. Im Gegensatz zur MALDI-TOF-Analytik können durch MALDI-FT-ICR-MS auch eng benachbarte Peaks problemlos separat integriert werden. Innerhalb eines MALDI-FT-ICR-MS Fingerprint-Spektrums ergibt die Integration der Isotopen-Cluster verschiedener tryptischer Peptide des gleichen Proteins vergleichbare Resultate, wobei die Standardabweichung bei ungefähr 7 % liegt. Insgesamt konnten bisher bei verschiedenen Wachtumsraten von E. coli deutliche Unterschiede zwischen den intrazellulären Proteinkonzentrationen gefunden werden.

�� Bestimmung von Protein-Gesamtmassen

Mit Hilfe der ESI-FT-ICR-MS Technologie konnten Proteinmassen auch nach Dekonvolution Isotopen-aufgelöst dargestellt werden, wodurch die Ladungszahl der involvierten Protein-Spezies direkt ermittelt werden konnte. Dies ließ zudem eine sehr genaue Bestimmung der ´Most Abundand Masses´ und damit auch genauere Rückschlüsse auf die nicht detektierbaren monoisotopischen Massen zu. Zur Verdeutlichung wurde Troponin I aus Kanninchenmuskel sowohl durch ein Triple Quadrupolgerät (TSQ 7000), als auch durch unser FT-ICR Massenspektrometer analysiert. Durch Bestimmung der Protein-Gesamtmasse konnten in diesem Fall verschiedene Phosphorylierungszustände des Troponin I nachgewiesen werden. Das nicht phosphorylierte Troponin I hatte eine Gesamtmasse von 24035 Da. Durch FT-ICR-MS konnten zwei Proteinmassen mit ´Most Abundand Masses´ bei ca. 24355 und 24435 detektiert werden, welches einer 4 bzw. 5-fach Phosphorylierung entspricht. Im Falle der Triple-Quadrupol-Analyse wurde nur das 4-fach phosphorylierte Protein (24355) deutlich sichtbar, wobei im Gegensatz zur FTICR-MS eine isotopenaufgelöste Darstellung unmöglich war.

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Zudem konnten im seriellen Modus Protein-Gemische aufgetrennt werden und direkt online vermessen werden. Die isotopenaufgelöste Darstellung von Proteinen ermöglicht eine viel genauere Massen-Bestimmung, da nach Überlagerung durch ein theoretisches Protein, welches aus Durchschnittsaminosäuren besteht (Polyaverigine), die monoisotopische Masse bis auf eine Genauigkeit von �1 Da bestimmt werden kann. Bei Proteinen mit einer Masse über ca. 40 kDa wird jedoch die Anzahl der auftretenden Ladungszustände und die Anzahl der Isotope so groß, dass die Intensität, die für ein einzelnes Isotop zur Verfügung steht, unter das Sensitivitäts-Limit fällt. Die Verbreiterung der 13C Isotopencluster kann leicht durch die Binomial-Verteilung berechnet werden. Bei geringen zur Verfügung stehenden Probenmengen ist daher nur eine nicht-isotopenaufgelöste Darstellung möglicht, wie am Beispiel der cyclischen Diphophoglycerat-Kinase von Methanothermus fervidus gezeigt ist. Allerdings ist es trotz der hohen Ladungszustände, die dazu führen, dass die Isotopen-Peaks näher zusammenrücken, und der Verbreiterung der Isotopencluster mit der damit verbundenen Intensitäts-Abnahme durchaus möglich durch FTICR-MS eine Isotopen-Auflösung zu erzielen. Dies konnte am Beispiel von BSA gezeigt werden.

�� De novo-Sequenzierung Zur Peptid-Sequenz-Analyse stehen verschiedene Verfahren zur Verfügung. Beim IRMPD (Infrarot-Multiphoton Dissoziation) werden die in der FT-ICR-Zelle eingefangenen Ionen durch einen hochenergetischen Infrarot-Laser beschossen und dadurch fragmentiert. Alternativ steht auch CID (Collisionally Induced Dissociation) zur Verfügung, wobei Argon in die FT-ICR-Zelle eingeleitet wird. In diesem Fall zerbrechen die Peptid-Ionen nach Kollision mit Argon-Atomen. Stehen keine Sequenzinformationen aus Datenbanken zur Verfügung, wird die De-Novo-Sequenzierung aus MS/MS Fragmentspektren wichtig. Hierbei erwies sich die FT-ICR-Massenspektrometrie als besonders vorteilhaft, da inbesondere bei kompliziert brechenden Prolin-haltigen Peptiden (hier ALHSYPPPVMPR) leicht mehrere Interpretationsmöglichkeiten für ein und dasselbe Fragmentspektrum existieren. Bei scheinbar korrekten Sequenzen traten allerdings Massen-Abweichungen von bis zu 0,06 Da auf, welches anders als bei alternativen massenspektrometrischen Techniken wie MALDI-TOF-MS bei der FT-ICR-MS Technologie eine unakzeptabel hohe Massendifferenz ist. Bei der korrekten Sequenz lag die Abweichung der Fragmentionen-Masse bei maximal 0,01 Da, wodurch die richtige Sequenz leicht von den falschen Sequenzen unterschieden werden konnte.

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Mo 479/4-1

Proteomanalysen zur Charakterisierung zellulärer Funktionen pflanzlicher Trichome Amme, Steffen; Schlesier, Bernhard; Rutten, Twan; Melzer, Michael; Mock, Hans-Peter Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung Gatersleben Die Blattoberfläche der meisten Landpflanzen ist mit Trichomen bedeckt, die epidermale Anhänge darstellen. Trichome umfassen eine Vielfalt an Strukturen in unterschiedlicher Größe. Eine Pflanzenspezies kann unterschiedliche Trichomtypen besitzen und die Dichte der Trichome kann von Gewebe zu Gewebe variieren. Die Funktion von Trichomen liegt im Schutz vor abiotischem und biotischem Stress. So besitzen Trichome häufig Drüsenfunktion, durch die sekundäre Inhaltsstoffe abgesondert werden können, z.B. Alkaloide und andere Metaboliten bei Tabakpflanzen. Viele der Funktionen von Trichomen sind im Detail unverstanden. Mit Hilfe eines Proteomansatzes sollen deshalb die zellulären Mechanismen pflanzlicher Trichome aufgeklärt werden. Parallel zu den Arbeiten auf Proteinebene werden metabolische und molekulare Analysen durchgeführt. Als Objekt wurde Tabak (Nicotiana tabacum L.) gewählt, der mehrere Klassen an sekundären Inhaltsstoffen besitzt, die in Verbindung mit der Stressabwehr gebracht werden. Die Trichome wurden von Pflanzen mit ca. 12 –14 entwickelten Blättern isoliert; wobei von jungen und alten Blättern getrennt geerntet wurde. Die morphologische Charakterisierung durch Rasterelektronenmikroskopie zeigte mehrere Typen an Trichomen [1,2]: kurze Trichome mit einem einzelligen Stiel und einem mehrzelligen Köpfchen und lange Trichome mit einem mehrzelligen Stiel und Köpfchen. Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen zeigen eine Akkumulation von Chlorophyll in den Köpfchen der langstieligen Trichome, was auf eine Photosyntheseaktivität schließen lässt (Abb. 1). Die Trichome wurden mit Hilfe von Glasperlen mechanisch isoliert. Metabolische Analysen zeigten im Vergleich zum Blattgewebe mehrfach erhöhte Gehalte des Alkaloids Nikotin und einiger Phenylpropane wie Chlorogensäure und Rutin. Als ein neuer Weg zur Charakterisierung pflanzlicher Trichome wurde ein Proteomansatz gewählt. Blatt- bzw. Trichomproteine wurden über 2-D Gelelektrophorese getrennt und die Muster verglichen. Für die isolelektrische Fokussierung wurden pH-Gradienten von 4-7 und 3-10 verwendet. Die Bildanalyse zeigte 35 Spots, deren Intensität in den Trichomen im Vergleich mit Gesamtblattextrakten mindestens zweifach höher waren. Diese Proteine stellen Kandidaten für trichom-spezifische Funktionen dar, und wurden für die massenspektrometrische Identifizierung ausgestochen. Unter den ersten identifizierten Proteine waren mehrere Treffer für enzymatische Komponenten der Stressabwehr (Superoxid-Dismutase, Glutathion-Peroxidase, Pathogenesis-Related Protein). Die Ergebnisse konnten durch Western-Blot-Analysen und Enzymassays bestätigt und ausgeweitet werden. Zukünftige Analysen sollen die Bedeutung der enzymatischen und nicht-enzymatischen Komponenten der Stressabwehr im Detail untersuchen; dabei soll die Proteomanalyse von Trichomen auf Stress-behandelte Pflanzen erweitert werden. [1] Akers CP, Weybrew JA, Long RC (1978) Amer J Bot 65: 282-292 [2] Meyberg M, Krohn S, Brühmer B, Kristen U (1991) Flora 185: 357-363

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Abb. 1: Morphologie der Blattrichome von Nicotiana tabacum. A) Rasterelektronen-mikrosopische Aufnahme: Langstielige Trichome mit Köpfchen und kurze Trichome mit Köpfchen sind erkennbar. B) Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme von isolierten Trichomen. Die Köpfchen langstieliger Trichome zeigen eine ausgeprägte Chlorophyll-Fluoreszenz. Abb. 2: 2-D Gelelektrophorese zur Darstellung der Proteinmuster von Tabak-Blatttrichomen. A) 2-D Gel eines Proteinextraktes aus Trichomen unter Verwendung eines pH Gradienten von 3 - 10 bei der isolektrischen Fokussierung. Gekennzeichnet sind einige der Proteine mit mehrfach erhöhter Expression in Trichomen; a) Detail der Gesamtdarstellung mit den Trichom-spezifischen Spots 2 und 4; b) entsprechender Ausschnitt aus einem Gel mit Gesamtblattextrakt.

A B

2

4

a

b

1

2

5

A

9

3

7

46

8

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Ne 427/10-1

Hochleistungs-Massenspektrometrie in der Analytik von pharmazeutischen Wirkstoffen und Biomolekülen

Klaus Raith und Reinhard H.H. Neubert Institut für Pharmazeutische Technologie und Biopharmazie Martin Luther Universität Halle-Wittenberg Im Rahmen der DFG-Großgeräteinitiative „Hochleistungs-Massenspektrometrie in den Biowissenschaften“ aus dem Jahre 1999 erhielten wir ein Quadrupol-Flugzeit-Hybridmassenspektrometer Q-Tof 2, gekoppelt mit einem Micro-/Kapillar-/Nano-HPLC-Gerät Ultimate der Fa. LC Packings (jetzt Dionex). Beide Geräte konnten im März 2000 installiert werden und laufen seither im Wesentlichen sehr zuverlässig ohne größere Unterbrechungen. Im Rahmen des Rundgesprächss in Bochum am 24./25.09.2003 konnten wir Bericht erstatten über die Ergebnisse, die unter Beteiligung dieses Gerätesystems seither erzielt wurden. In unserer Arbeitsgruppe werden seit einigen Jahren in Zusammenarbeit mit der Universitätshautklinik die Lipide des Stratum corneum, welche eine entscheidende Rolle für die Barrierefunktion der Haut spielen, systematisch erforscht. Durch den Einsatz der Massenspektrometrie konnten hierbei wesentliche Fortschritte und neue Einsichten erzielt werden [1-3]. Dies gilt insbesondere für die molekulare Zusammensetzung der einzelnen Ceramidfraktionen, die sich durch eine ungewöhnliche strukturelle Vielfalt auszeichnen. MS/MS-Spektren erschließen dabei sowohl die Fettsäure- als auch die Sphingoidbasenkomponente der Moleküle, mit Hilfe der akkuraten Massenbestimmung ist eine Strukturzuweisung der Fragmente möglich. Im Bereich der Arzneistoffanalytik wurde u.a. ein LC/MS-Assay für Mycophenolat-moxetil entwickelt [4-5] sowie mittels ESI-MS/MS die Struktur von oxidativen Degradationsprodukten des Bufexamacs aufgeklärt, welche für den Wirkmechanismus eine Rolle spielen können [6]. Eine zunehmende Bedeutung erhält die Analytik pharmazeutischer Hilfsstoffe auf molekularer Ebene. Für Polyvinylpyrrolidon konnte gezeigt werden, dass sich Produkte verschiedener Hersteller z.T. so unterscheiden, dass eine Austauschbarkeit fraglich erscheint [7]. Verschiedene Cyclodextrine, die Einsatz finden als Lösungsvermittler und Komplexbildner, konnten ebenfalls charakterisiert werden [8]. Hyaluronsäurefragmente konnten mittels CE/MS charakterisiert sowie mittels LC/MS/MS [9] in pharmazeutischen Formulierungen quantifiziert werden [10]. Die Analytik von Peptiden wurde u.a. in Zusammenarbeit mit der AG Zenk (Biozentrum Halle) durchgeführt. Dabei gelang es u.a., Phytochelatine in der Azuki-Bohne nachzuweisen und strukturell zu charakterisieren [11-12]. Elastin ist ein wichtiges Protein des Bindegewebes. Strahlungsinduzierte oxidative Veränderungen am Elastin, insbesondere an seinen Crosslinks Desmosin und Isodesmosin, werden für Phänomene der Hautalterung verantwortlich gemacht. Eine neue LC/ESI-MS-Methode erlaubt deren Untersuchung [13]. In Zusammenarbeit mit der AG Zenk sowie dem Institut für Pflanzenbiochemie wurden Morphinane und deren biosynthetische Vorstufen, die Benzylisochinoline, erstmals umfassend mit ESI-MS/MS untersucht und dabei Vergleiche gezogen zwischen der Fragmentierung an einer Ionenfalle, einem Triple-Quad-MS, einem Q-Tof sowie FT-MS mit IRMPD [14]. Dabei konnten die im Rahmen der Initiative angeschafften Geräte beider Gruppen hinsichtlich Ihrer spezifischen Leistungsmerkmale sehr gut genutzt werden. In Kooperation mit dem Fachbereich Chemie wurde die Elementarzusammensetzung für Verbindungen ermittelt, bei denen Reinheit und/oder Menge nicht für eine klassische Elementaranalyse ausreichen [15]. In Zusammenarbeit mit dem Institut für Ernährungswissenschaften (Landwirtschaftliche Fakultät) werden derzeit Cholesteroloxidationsprodukte untersucht, die bei der Zubereitung von Nahrungsmittel tierischen Ursprungs entstehen und potentiell gesundheitsschädlich sein können. Hierfür wurde u.a. eine neue LC/MS-Methode entwickelt. Weitere Projekte sind in der Bearbeitung, wobei das Quadrupol-Flugzeit-Hybridmassenspektrometer eine wesentliche Verbesserung unserer analytischen Möglichkeiten darstellt, insbesondere durch die Möglichkeit der akkuraten Massenbestimmung. Vielfach zum Einsatz kommt auch die Mikro- und Kapillar-LC.

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[1] K. Raith und R. Neubert: Liquid Chromatography-Electrospray Mass Spectrometry and Tandem Mass Spectrometry of Ceramides. Anal. Chim. Acta 403 (2000) 295-303. [2] K. Raith, S. Zellmer, J. Lasch und R. Neubert: Profiling of Human Stratum Corneum Ceramides by Liquid Chromatography-Electrospray Mass Spectrometry. Anal. Chim. Acta 418 (2) (2000) 167-173. [3] H. Farwanah, P. Nuhn, R. Neubert und K. Raith: Normal Phase LC Separation of Stratum Corneum Ceramides with Detection by Evaporative Light Scattering and APCI Mass Spectrometry. Anal. Chim. Acta 492 (1-2)(2003) , 233-239. [4] Plätzer, M; Jahn, K; Wohlrab, J; Neubert, R.H.H.: Quantification of mycophenolate mofetil in human skin extracts using high-performance liquid chromatography-electrospray mass spectrometry. J. Chromatogr. B 755, 355-359 (2001). [5] Wohlrab, J; Jahn, K.;Plätzer, M.; Neubert, R.H.H.; Marsch, W.C.: Topical application of mycophenolate mofetil in plaque-type psoriasis. British J. Dermatology 144, 1263-1264 (2001). [6] H. Trommer, M. Plätzer, K. Raith, H.-P. Podhaisky, W. Wohlrab und R. Neubert: Examinations of the Antioxidative Properties of the Topically Administered Drug Bufexamac Reveal New Insights into its Mechanism of Action. J. Pharm. Pharmacol., im Druck. [7] K. Raith, A.V. Kühn, F. Rosche, R. Wolf und R.H.H. Neubert: Characterization of Povidone Products by means of 13C-NMR, MALDI and Electrospray Mass Spectrometry. Pharm. Res. 19 (4/2002), 556-560. [8] M.Plätzer, Einsatz moderner Analysenmethoden in der Biopharmazie-Kapillarelektrophoretische Untersuchungen und Kopplung zwischen Flüssigchromatographie und Massenspektrometrie. Dissertation, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg, Shaker Verlag 2002. [9] A.V. Kühn, H.H. Rüttinger, R.H.H. Neubert und K. Raith: Identification of hyaluronic acid oligosaccharides by direct coupling of capillary electrophoresis / electrospray ion trap mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom., 17 (2003), 1-7. [10] A.V. Kühn, K. Raith, V. Sauerland und R.H.H. Neubert: Quantification of hyaluronic acid fragments in pharmaceutical formulations using LC/ESI-MS. J. Pharm. Biomed. Anal., 30 (2003), 1531-1537. [11] M. Oven, K. Raith, R. Neubert, T.M. Kutchan und M.H. Zenk: Homo-Phytochelatins Are Synthesized in response to cadmium in Azuki Beans. Plant Physiol. 126 (2001), 1275-1280. [12] K. Raith, M. Oven, T. M. Kutchan, R. H.H. Neubert und M. H. Zenk: Detection and Characterization of Homo-Phytochelatins in Azuki Beans using ESI-MS/MS. Proceedings of the 49th Conference of the American Society for Mass Spectrometry, 26.-31.05.2001, Chicago, IL, USA. [13] M. Getie, K. Raith und R. Neubert: LC/ESI-MS analysis of two elastin cross-links, desmosine and isodesmosine, and their radiation-induced degradation products. Biochim. Biophys. Acta, im Druck. [14] K. Raith, R. Neubert, C. Poeaknapo, C. Boettcher, M.H. Zenk und J. Schmidt: Electrospray Tandem Mass Spectrometric Investigation of Morphinans. J. Am. Soc. Mass Spectrom., im Druck. [15] P. Fuchs, C. Tschierske, K. Raith, K. Das und S. Diele: A Thermotropic Mesophase Comprised of Closed Micellar Aggregates of the normal Type. Angew. Chem. Int. Ed. 41 (4/2002), 628-631.

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No 113/11-1

Das QTOF II im Zentrum für Biochemie der Universität zu Köln Stefan Müller, Angelika A. Noegel, Mats Paulsson Zentrum für Biochemie Medizinische Fakultät Universität zu Köln Im Rahmen einer Großgeräte-Initiative der Deutschen Forschungsgemeinschaft wurde dem Zentrum für Biochemie der Universität zu Köln ein QTof II Quadrupol - time of flight Massenspektrometer zur Verfügung gestellt. Das Gerät wurde im Mai 2000 installiert und wird seitdem für die Bearbeitung von proteinchemischen Fragestellungen in einem zentralen Labor des Zentrums eingesetzt. Es ergänzt ein bereits vorhandenes MALDI-Tof Massenpektrometer und hat sich sowohl für die Feincharakterisierung als auch für schwierige Identifizierungen von Proteinen als unverzichtbar erwiesen. Zu Beginn des Projektes wurde ausschließlich mit statischem Nanospray gearbeitet. Mit der Installation einer nano-HPLC Anlage im November 2001 werden die meisten Fragestellungen in LC-MS/MS Experimenten angegangen. Ein Schwerpunkt im Zentrum für Biochemie ist die Identifizierung von Proteinen aus ein- und zweidimensionalen Gelen im Rahmen von Proteomanalysen von Dictyostelium discoideum, einem niederen Eukaryoten, der als Modellorganismus intensiv untersucht wird. Da die Sequenzierung des Genoms erst kürzlich abgeschlossen wurde, war die Identifizierung von Dictyostelium Proteinen mit einem peptide mass fingerprint in der MALDI-Tof Massenspektrometrie oft nicht möglich und gelang erst nach partieller MS/MS-Sequenzierung tryptischer Peptide auf dem QTof. Neben der Identifikation ist die Feincharakterisierung von Proteinen der extrazellulären Matrix ein wichtiges Anwendungsgebiet. Als Beispiele für Analysen posttranslationaler Modifikationen können hier die Lokalisation von Glykosylierungspositionen oder proteolytischen Schnittstellen genannt werden. Darüber hinaus wird das QTof genutzt, um über die Lokalisation von Disulfidbrücken und chemischen Quervernetzern Einblicke in die dreidimensionale Struktur monomerer und oligomerer Matrixproteine zu gewinnen. Eine neu hinzugekommenen Anwendung ist die Identifizierung von Proteinen aus komplexen Mischungen oder großen Komplexen durch zweidimensionale LC-MS/MS Experimente. Ein Beispiel für ein solches Projekt ist die aktuell begonnene Inventarisierung der Strukturproteine des Zellkerns von Dictyostelium discoideum.

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No 120/11-1

Proteomanalyse für Mikrobiologie, Tumorbiologie und Molekulargenetik: Tübinger Perspektive

A. Nordheim Interfakultäres Institut für Zellbiologie Eberhard-Karls-Universität Tübingen Das Proteomlabor der Abt. Molekularbiologie in Tübingen ist bezüglich massenspektrometri-scher Analytik mit einem MALDI-TOF (Reflex III) und einem ES-MS/MS Gerät (Q-STAR) ausgerüstet. Das Q-STAR wurde im Rahmen der DFG Grossgeräte-Initiative Massen-spektrometer finanziert. Die Proteomanalysen der Abteilung bauen auf vielfältigen Kooperationen mit Partnern verschiedener Fakultäten (Biologie, Chemie/Pharmazie, Medizin, Informatik) der Universität Tübingen auf. Alle Projekte nutzen differentielle Proteindarstellung durch 2D-Gelelektro-phorese mit nachfolgender massenspektrometrischer Proteinidentifizierung. Beispiele proteomischer Kooperationsprojekte sind: 1. Mikrobiologie (Partner: Prof. V. Braun): “Darstellung von Membranrezeptoren in Caulabacter crescentus". 2. Pflanzenmolekularbiologie (Partner: Dr. Hochholdinger): “Proteinexpression während der Wurzelbildung bei Mais". 3. Tumorbiologie (Partner: Dr. T. Brümmendorf): “Wirkmechanismen der therapeutischen Substanz Glivec bei Leukämieerkrankungen". 4. Tumorklinik (Partner: Dr. Kurek): “Differenzielle Proteindarstellung von Tumorzellen des Mammkarzinoms". Die erzielten Resultate der genannten Kooperationsprojekte werden in Kürze publiziert werden. Unsere bisherige Proteomforschung am Interfakultären Institut für Zellbiologie war der Kristallisationspunkt für die Bildung eines lokalen Proteomanalyse-Konsortiums, das von dem Baden-Württembergischen Ministerium für Wissenschaft, Forschung und Kunst ausgewählt wurde, ein Kompetenzzentrum für Proteomanalytik („Proteom Centrum Tübingen“) aufzubauen. Die Gründung des Proteom Centrums erfolgte am 01. 06. 2003. Die gewährte Finanzierung durch die Landesstiftung Baden-Württemberg gestattet eine fünf-jährige Analysetätigkeit mit signifikanter personeller und apparativer Ausstattung, sodass weiterführende Kooperationen initiiert und erfolgreich bearbeitet werden können.

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Pe 415/14-1

Biomedizinische Analytik mit 9.4T FT-ICR Massenspektrometrie Jasna Peter-Katalinić Institut für Medizinische Physik und Biophysik Universität Münster

Die moderne Massenspektrometrie (MS) ist eine leistungsfähige analytische Technik zur Identifizierung und Charakterisierung von Biomakromolekülen. Dabei werden die Masse-zu-Ladung Verhältnisse (m/z) von intakten Molekularionen bzw. deren Fragmentionen mit hoher Empfindlichkeit und Genauigkeit bestimmt [1]. Im Rahmen der Großgeräteinitiative der DFG wurde ein Fourier Transform Ion Zyklotron Resonanz Massenspektrometer (FT-ICR MS) sowohl mit einer Elektrospray als auch einer MALDI Ionenquelle beantragt und bewilligt. Durch die Ausstattung des Gerätes mit einem 9.4 T Hochfeldmagneten werden die Leistungen von neun verschiedenen Geräteparametern, darunter Massenauflösungsvermögen, Massenbereich, Nachweisempfindlichkeit und Aquisitionszeit im Vergleich zu normalerweise benutzten Systemen (7T) signifikant (linear bzw. quadratisch) verbessert. Die Eigenschaften des Gerätes sind für die Forschungsschwerpunkte der Arbeitsgruppe “Biomedizinische Analytik” im Bereich Glykomik und Proteomik von entscheidender Bedeutung [2-5]. Nominal isobare Peptide und Oligosaccharide, die eine Massendifferenz von 4,5x10-4 Da aufweisen, also niedriger als die Masse eines Elektrons (5,5 x 10-4 Da), können unterschieden werden. Die hohe Genauigkeit solcher hochaufgelösten Messungen ist von höchster Relevanz z.B. für die Analytik von Glykosaminoglykanen, insbesondere bei der Bestimmung von übersulfatierten Bereichen in Chondroitin/Dermatansulfaten [6]. Eine weitere überragende Eigenschaft von FT-ICR Geräten ist die Möglichkeit, Tandem MS Experimente zur strukturellen Analyse von Analytionen durch gezielte Anregung der Ionen und daraus resultierender spezifischer Fragmentierungsprozesse durchzuführen. Für die Sequenzierung und Identifizierung von Proteinen und deren posttranslationalen Modifikationen ist die Electron Capture Dissociation (ECD) Methode besonders geeignet [4]. Bei der Analyse von O-Glykosylierung konnten mit Hilfe eines einzigen Experimentes vier relevante Fragestellungen, nämlich über die Peptidsequenz, die Positionen der Glykosylierung, den Glykantyp sowie seine Corestruktur beantwortet werden [2, 3]. Die Anregung der Analytionen durch die Anwendung mehrstufiger sustained-off-resonance irradiation collisional induced dissociation (SORI-CID) Experimente wurde erfolgreich in der Analytik von Glykopeptiden und Gangliosiden aus Gemischen biologischen Ursprungs angewendet [5]. [1] J. Peter-Katalinić, FAB and Related Techniques in Glycoconjugate Analysis, Mass Spectrom. Rev. 1994, 13, 77-98. [2] M. Mormann, I. Meisen, K. Hakansson, T. L. Quenzer, M. R. Emmett, A. G. Marshall, J. Peter-Katalinić: Characterization of MUC glycopeptides by nanoElectrospray low-energy CID and Electron Capture Dissociation, Proceedings of the 49th ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, May 27-31, 2001, Chicago, USA. [3] B. Maček, M. Mormann, A. Gonzalez de Peredo, J. Hofsteenge, J. Peter-Katalinić: Electron Capture Dissociation versus Collision Induced Dissociation Mass Spectrometry in Structural Studies of Protein O-Fucosylation, Proceedings of the 50th ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, June 2-6, 2002,Orlando, Florida, USA, [4] M. Mormann, J. Peter-Katalinić: Improvement of electron capture efficiency by resonant excitation, Rapid Commun. Mass Spectrom. 2003, 17, 2208-2214. [5] M. Froesch, A. D. Zamfir, J. Peter-Katalinić: Mapping of O-glycosylated amino acids related to Schindler’s Disease by negative Ion NanoESI-FT ICR MS and SORI-CID at 9.4 T, Proceedings of the 51st ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, June 8-12, 2003, Montreal, Canada. [6] M. Mormann, A. D. Zamfir, D. G. Seidler, H. Kresse, J. Peter-Katalinić: Oversulfation of chondroitin/dermatan sulfate oligosaccharides in bovine aorta, submitted.

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Pr 175/4-1/5-1

Hochauflösende FT-ICR-Massenspektrometrie in der Biopolymer-Strukturanalytik: Analytische Entwicklung, neue biochemische und medizinische Anwendungen

Prof. Dr. Michael Przybylski, Fachbereich Chemie, Laboratorium für Analytische Chemie Universität Konstanz Die Fouriertransform-Ionencyclotronresonanz (FTICR)-Massenspektrometrie, unter Verwendung von "soft-ionisation"-Methoden (Elektrospray/ESI-MS, Matrix-unterstützte Laserdesorption/MALDI-MS) hat mit dem im Mai-September 2000 installierten Bruker-ApexII-FTICR-Massenspektrometer in der ersten Förderungsphase des Vorhabens einen Durchbruch der massenspektrometrischen "High-performance"-Strukturanalytik von Biopolymeren ermöglicht. HöchstAuflösung und –Nachweisempfindlichkeit, sowie eine Reihe von bisher nicht zugänglichen Verfahren der Strukturanalytik konnten entwickelt werden, sie eröffnen zahlreichen neue bioanalytische Anwendungsbereiche. Im bisherigen Förderungszeitraum (2000 – 2003) wurden insbesondere die folgenden Zielsetzungen der analytischen Entwicklung der FTICR-Methode verfolgt:

1. Analytische Entwicklung und Etablierung der FTICR-Massenspektrometrie mit den Schwerpunkten

(i) sequenzspezifische Fragmentierung (MS/MS) zur Identifizierung von Protein Strukturmodifikationen;

(ii) Strukturanalyse von nicht-kovalenten supramolekularen Komplexen; (iii) Hochleistungs- Proteomanalytik und Analytik kombinatorischer Gemische,

insbesondere mit Hilfe neuer Mikroverfahren (Chip-FTICR-MS); (iv) Identifizierung von molekularen Erkennungsstrukturen (Epitopanalytik). (v)

2. Die wichtigsten Zielsetzungen von biochemischen und biomedizinischen Anwendungen der FT-ICR-MS waren:

(i) Proteomanalytik zur Aufklärung von Targetproteinen für neurodegenerative und Autoimmun- Erkrankungen;

(ii) Identifizierung von oxidativ veränderten zellulären Proteinen (u.a. Apoptose-spezifische Proteine);

(iii) Identifizierung von Strukturmodifikationen in Zellregulations-Proteinen. Das im vorliegenden Projekt bewilligte Bruker Apex II 7T FTICR-Massenspektrometer konnte, nach Installation ab Mai 2000 und nach Fertigstellung von Test- und Erprobungsmessungen ab Herbst 2000 im vollen Umfang zu analytischen und bioanalytischen Untersuchungen des Arbeitsprogramms in Betrieb genommen werden; es hat seitdem im wesentlichen störungsfreien Betrieb und Hochleistungsanalytik bewiesen. Im Verlauf der analytischen Entwicklung wurden eine Reihe von Neueinrichtungen und Methoden etabliert; hierzu zählen (i) die Entwicklung der Mikro/Nano-ESI-MS, (ii) ein Mikrochip-FTICR-System sowie (iii) die Installation und Optimierung einer neu entwickelten MALDI- Ionenquelle (s. Veröffentlichungen Nr. 3,4,9,10 der Veröffentlichungen des Arbeitsberichts; sowie Patentanmeldungen). Die im bisherigen Förderungszeitraum (bis Spätherbst 2003) des Projektes entstandenen Veröffentlichungen sind in der folgenden Aufstellung wiedergegeben. Im Rahmen des Vorhabens wurden bisher 4 Dissertationen mit wesentlichen Teilen der FT-ICR-MS abgeschlossen, sowie drei Patentanmeldungen durchgeführt. Neben den bioanalytischen Anwendungen der FTICR-MS in zahlreichen interdisziplinären Kooperationen wurde seit dem Frühjahr 2000 ein Spezialkurs „Hochlösende Biopolymer-Massenspektrometrie“ (High resolution biopolymer mass spectrometry) aufgebaut, der Grundlagen und experimentelle Bioanalytik der FTICR-Methode behandelt. Der Kurs wurde bisher in drei Jahren als GDCH-Kurs (5-tägig) mit ca. 20 Teilnehmern aus Hochschuleinrichtungen und der Industrie durchgeführt; er hat sich inzwischen mit zunehmender Nachfrage auch international etabliert.

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Die wichtigsten Ergebnisse zur analytischen Entwicklung der FTICR-MS, sowie von bioanalytischen Anwendungen in verschiedenen Forschungsprojekten sind in den folgenden Abschnitten zusammengefasst. Von diesen lassen sich in jüngsten Untersuchungen die folgenden Bereiche hervorheben: Entwicklung eines Mikrochip-ESI-FTICR- Systems. Das neuartige Mikrochipsystem (Mikrokanalstruktur auf Keramikbasis) konnte insbesondere zur Hochleistungs-Proteomanalytik und hochauflösenden massenspektrometrischen Analytik von kombinatorischen Gemischen mit Erfolg entwickelt werde (s. Ref. [4] des Arbeitsberichts). Es eröffnet ferner neue Möglichkeiten der Mikroimmobilisierung von Biopolymeren und Anwendungen zur Affinitäts-Massenspektromketrie. Charakterisierung von molekularen Erkennungsstrukturen und Epitopanalytik. Die Entwicklung und kürzliche Anwendungen der massenspektrometrischen Epitopanalyse durch proteolytische Epitopexcision mit der FT-ICR-MS hat zur Aufklärung eines Amyloid-Plaque-spezifischen Vaccinepitops eines Antikörpers aus einem transgenen Alzheimer-Mausmodells geführt (s.u.a. [24, 25]). Dieses Epitop liefert eine direkte Führungsstruktur für die Entwicklung eines neuen, molekularen Alzheimer-Vaccins, sowie neue Ansätze für die Entwicklung eines hochspezifischen Alzheimer-Diagnostikums. Identifizierung von Peroxynitrit-induzierter Tyrosin-Nitrierung im Prostaglandin- Stoffwechsel. Von einer Reihe von Anwendungen der FT-ICR-MS zur direkten Analyse von posttranslationalen Strukturmodifikationen in Proteinen ist die Aufklärung der oxidativen Nitrierung eines spezifischen Tyrosinrests im katalytischen Zentrum der Prostacyclinsynthase hervorzuheben, die vor kurzem erstmals den eindeutigen Nachweis dieser toxikologisch wichtigen Strukturmodifikation ermöglichte (s. [17]). Dieser Nachweis, der nach zahlreichen früheren Versuchen aufgrund der Hoch-Auflösung und -Empfindlichkeit der FTICR-MS möglich war, eröffnet neue analytische Möglichkeit zur molekularen Charakterisierung von oxidativen intrazellulären Prozessen; diese sollen im Fortsetzungsantrag des Vorhabens verfolgt werden. Veröffentlichungen zum Arbeitsbericht

1) Bruns, K (2002) Entwicklung und Anwendung neuer Methoden der Biopolymer-Massenspektrometrie zur Strukturanalyse von Proteinen und Protein-Komplexen. Dissertation, Universität Konstanz.

2) M. Przybylski, W. Weinmann, T. Fligge (2003) in "Mass Spectrometry"; Handbook of Spectroscopy; ed. H. Gauglitz; Wiley-VCH.

3) Marquardt, A., E. Windberg, X. Tian, M. Kohlmann, F. Hudecz, and M. Przybylski (2002) Perspectives and applications of Fourier transform-ICR mass spectrometry for vaccine development and analysis of combinatorial libraries. in 7th International Symposium on Solid Phase Synthesis and Combinatorial Chemical Libraries. Southampton: Mayflower Worldwide.

4) Rossier, J.S., N. Youhnovski, N. Lion, E. Damoc, F. Reymond, H.H. Girault, M. Przybylski (2003) Thin-Chip Microspray System for High Performance Fourier-Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry of Biopolymers. Angew. Chemie Int. Ed. Engl. 42: 55-60.

5) Fligge, T.A., C. Reinhard, C. Harter, F.T. Wieland, and M. Przybylski (2000) Oligomerization of peptides analogous to the cytoplasmic domains of coatomer receptors revealed by mass spectrometry. Biochemistry, 39(29): 8491-8496.

6) Seidl, A., G. Maccarone, N. Youhnovski, K.P. Schaefer, and M. Przybylski (2002) Identification and secondary structure characterisation of a non-covalent dimer complex of lung surfactant protein SP-C by high resolution electrospray mass spectrometry. Anal. Bioanal. Chem., in press.

7) Borchers, C., R. Boer, K. Klemm, V. Figala, T. Denzinger, W.R. Ulrich, S. Haas, W. Ise, V. Gekeler, M. Przybylski (2002) Characterization of the dexniguldipine binding site in the multidrug resistance-related transport protein P-glycoprotein by photoaffinity labeling and mass spectrometry. Mol Pharmacol, 61(6): 1366-1376.

8) Windberg, E., F. Hudecz, A. Marquardt, F. Sebestyen, A. Kiss, S. Bosze, H. Medzihradszky-Schweiger, M. Przybylski (2002) Characterisation of combinatorial libraries of mucin-2 antigen peptides by high-resolution mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom, 16(9): p. 834-839

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9) Bauer, S.H.J., M.F. Wiechers, K. Bruns, M. Przybylski, C.A.O. Stuermer (2001) Isolation and identification of the plasma membrane-associated intracellular protein Reggie-2 from goldfish brain by chromatography and fourier-transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Anal. Biochem. 298: 25-31.

10) Damoc, E., N. Youhnovski, D. Crettaz, J.D. Tissot, M. Przybylski (2003) High resolution proteome analysis of cryoglobulins using Fouriertransform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Proteomics 3: 1425-1433.

11) Albach, C., E. Damoc, T. Denzinger, M. Schachner, M. Przybylski, B. Schmitz (2003) Identification of glycosylation sites using consensus sequences of the murine neural cell adhesion protein NCAM by MALDI-TOF and MALDI-FTICR mass spectrometry. Anal. Bioanal. Chem., im Druck.

12) Michels, J., A. Geyer, V. Mocanu, W. Welte, A.L. Burlingame, M. Przybylski (2002) Structure and functional characterization of the periplasmic N-terminal polypeptide domain of the sugar-specific ion channel protein (ScrY porin). Protein Sci, 11(6): 1565-1574.

13) Macht, M., A. Marquardt, S.-O. Deininger, E. Damoc, M. Kohlmann, M. Przybylski (2003) "Affinity proteomics": direct identification of proteins from complex biological matrices by mass spectrometric epitope mapping. Anal. Bioanal. Chem., im Druck.

14) Marquardt, A., S. Muyldermans, M. Przybylski (2003) Mass spectrometric determination of the molecular recognition structure of a synthetic camel microantibody against hen eggwhite lysozyme. Chemistry, im Druck.

15) Kohlmann, M. (2001). Massenspektrometrische Methoden zur Analyse von molekularen Erkennungsstrukturen: Analytische Entwicklung und Anwendung zur Aufklärung von Autoantigenepitopen der Autoimmunerkrankungen Spontane Gallenzirrhose und Rheumatoide Arthritis. Dissertation, Universität Konstanz.

16) Przybylski, M., F. Hudecz (2003) Mass spectrometric approaches for epitope identification - molecular tools for vaccine targeting. J. Mol. Recognition, im Druck.

17) Schmidt, P., N. Youhnovski, A. Daiber, B.-A. Balan, M. Arsic, M. Przybylski, V. Ullrich (2003) Specific nitration at tyrosine-430 revealed by high resolution mass spectrometry as basis for redox regulation of bovine prostacyclin synthase. J. Biol. Chem. 278: 12813-12819.

18) Damoc, C.-E., M. Baack, S. Kreitz, D. Schaarschmidt, R. Knippers, M. Przybylski (2003) Multi-phosphorylation structure and cell cycle specificity of mcm3 protein by metal ion affinity isolation and high resolution mass spectrometry. Biochemistry, eingereicht.

19) Kulartz, M., S. Kreitz, E. Hiller, E.C. Damoc, M. Przybylski, R. Knippers (2003) Expression and phosphorylation of the replication regulator protein geminin. Biochem. Biophys. Res. Commun. 305: 412-420.

20) Becker, J.S., S.F. Boulyga, J.S. Becker, C. Pickhardt, E. Damoc, M. Przybylski (2003) Structural identification and quantitation of protein phosphorylations after gel electrophoretic separation using laser ablation ICP-MS and Fouriertransform-ICR mass spectrometry Int. J. Mass Spectrom. 228: 985-997.

21) Tian, X., R.-E. Cecal, E.R. Amstalden, M. Kohlmann, K. Bruns, S. Bühler, and M. Przybylski (2002) Synthesis, structural characterisation and epitope elucidation of the cytoplasmic domain of Alzheimer's amyloid precursor protein by FTICR mass spectrometry. J Peptide Science, 8(8): p. S182.

22) Bühler, S. (2002) Synthese und Strukturanalyse von funktionellen Domänen und pathophysiologischen Abbauprodukten des Alzheimer-Amyloid-Vorläuferproteins. Dissertation, Universität Konstanz.

23) Bühler, S., R. Cecal, R. Tikkanen, V. Herzog, M. Przybylski (2003) Isolation, structural characterisation and assignment of intramolecular disulfide bridges of recombinant N-terminal Alzheimer-amyloid-precursor proteins (sAPP). Anal. Bioanal. Chem., eingereicht.

24) McLaurin, J., R. Cecal, M.E. Kierstead, X. Tian, A.L. Phinney, M. Manea, J.E. French, M.H.L. Lambermon, A.A. Darabie, M.E. Brown, C. Janus, M.A. Chishti, P. Horne, D. Westaway, P.E. Fraser, H.T.J. Mount, M. Przybylski, P.S. George-Hyslop (2002) Therapeutically effective antibodies against amyloid-ß-peptide target amyloid-ß residues 4-10 and inhibit cytotoxicity and fibrillogenesis. Nature Med.8: 1263-1269.

25) Przybylski, M., R. Cecal, X. Tian, M. Manea, J. McLaurin, D. Westaway, P.E. Fraser, H.T.J. Mount, P. St-George-Hyslop (2002, 2003) Lead structures for active immunisation therapy of Alzheimer's disease (AD) and diagnostic procedure for AD based on a specific epitope of -�-peptide amyloid A�42. Patent applications, University of Konstanz & University of Toronto.

26) Przybylski, M., J. McLaurin, R.-E. Cecal, M.E. Kierstead, X. Tian, C. Janus, P. Horne, D. Westaway, P.E. Fraser, P. St George Hyslop (2002) Lead structure for active immunisation against Alzheimer's disease (AD) upon elucidation of a plaque-specific epitope recognised by therapeutically active antisera from transgenic AD mice. J. Peptide Sci. 8(8): 73-74.

27) Tian, X., R. Cecal, G. Mezo, M. Manea, R. Stefanescu, J. McLaurin, P. St.-George-Hyslop, F. Hudecz, M. Przybylski (2003) New amyloid-derived vaccine lead structures against Alzheimer’s disease discovered by affinity proteomics and high resolution mass spectrometry. In: Advances in Peptide, Protein and Nucleic Acid Antibody and Vaccine Strategies/Proc. 8th Int. Sympos. Solid Phase Synthesis and Cominatorial Libraries (R. Epton, ed.), Mayflower Int., im Druck.

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Re 837/7-1

Moos Proteomik Eric Sarnighausen, Dimitri Heintz, Stefan A. Rensing, Ralf Reski Pflanzenbiotechnologie Universität Freiburg

Das Laubmoos Physcomitrella patens kann im Gegensatz zu allen bisher unter-suchten Pflanzen DNA hocheffizient über Homologe Rekombination in die nukleäre DNA integrieren. Damit sind gezielte Genveränderungen, wie das gerichtete Aus-schalten spezifischer Gene, genauso effizient möglich wie z. B. bei Hefe. Da die vorherrschende Phase zudem haploid ist, können solche Mutanten direkt ohne Rück-kreuzungen analysiert werden. Damit ist dieses Moos ein neuer Modellorganismus in Bereich der funktionellen Genomanalyse geworden. Wir haben eine erschöpfende EST-Datenbank des Mooses erstellt, die ca. 25.000 protein-kodierende Gene umfasst und damit über 95% des Transkriptoms abdeckt. Diese Datenbank bildet die Basis für die Identifizierung von Proteinen über ihren peptide mass fingerprint bzw. über ihre Primärsequenz. Eine hochauflösende, reproduzierbare Methode zur Proteintrennung über 2D-Elek-trophorese wurde etabliert und bisher über 300 Proteine massenspektrometrisch identifiziert. 32 von diesen werden von Genen kodiert, die bisher keine Funktions-annotation in den internationalen Datenbanken haben. Diese „neuen Gene“ sind für uns von besonderem wissenschaftlichen Interesse. Gleichzeitig wurde eine hochreproduzierbare Methode etabliert, über Affinitätsreini-gung (IMAC) und Kapillarzonen-Elektrophorese spezifisch tryptische Phosphopeptide aus dem Moos zu isolieren. Bisher konnten auf diese Weise 256 Phosphoproteine aus Physcomitrella identifiziert werden. Diese Methode eignet sich besonders gut zur Untersuchung der Signaltransduktion (z. B. nach Hormongabe), da diese über rever-sible Phosphorylierung/Dephosphorylierung erfolgt. Die von uns entwickelte Methode ist so sensitiv, dass Proteinkinasen, z. B. eine MAP Kinase Kinase, als auch Trans-kriptionsfaktoren identifiziert wurden. Zahlreiche zelluläre Funktionen werden über dynamische Proteinkomplexe vermittelt. Wir interessieren uns insbesondere für die Regulation von Zell- und Plastidenteilung durch FtsZ-Proteine. Die FtsZ-basierenden Komplexe werden über blue-native-Gel-elektrophorese isoliert und dann über SDS-Gelelektrophorese aufgetrennt. Die ein-zelnen Mitglieder dieser Komplexe werden massenspektrometrisch analysiert. Nach der erfolgreichen molekulargenetischen Analyse des Mooses wurden somit alle relevanten Methode zur Proteomanalyse, z. T. erstmals bei Pflanzen, für Physcomi-trella entwickelt, optimiert und angewendet.

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Ri 192/22-1

Untersuchung von Protein-Komplexen in Neuronen durch Affinitätsreinigung und massenspektrometrische Identifizierung

Friedrich Buck, Hans-Jürgen Kreienkamp, Stefan Schumacher und Dietmar Richter Institut für Zellbiochemie und Klinische Neurobiologie Universitäts-Klinikum Hamburg-Eppendorf Neuronale Strukturen wie etwa Synapsen stellen ein komplexes Netzwerk von miteinander mehr oder weniger fest verknüpften Proteinen dar. Ionenkanäle und G-Protein-gekoppelte Rezeptoren bilden Multiprotein-Komplexe, die durch weitere Protein-Protein-Wechsel-wirkungen mit Verankerungspunkten an den synaptischen Membranen oder dem Zytoskelett verbunden sind. Die Aufklärung der Struktur dieser Komplexe und ihrer Plastizität ist die Voraussetzung für das Verständnis der neuronalen Signaltransduktionswege. Eine der zuverlässigsten Methoden in der Strukturaufklärung dieser Komplexe besteht in der affinitätschromatographischen Aufreinigung und direkten proteinanalytischen Identifikation der Komponenten. Wir haben auf diese Weise Proteinkomplexe untersucht, die G-Protein-gekoppelte Rezeptoren mit der postsynaptischen Dichte verknüpfen, Komplexe, die am dendritischen Transport von RNSs beteiligt sind und Komplexe, die an der Bildung und Regeneration von Dendriten beteiligt sind. Neben klassischen chromatographischen Verfahren wurden verschiedene Verfahren zur Affinitätsreinigung (Immunpräzipitation, Affinitätschromatographie) eingesetzt. So konnte etwa durch Affinitätschromatographie mit der an GST fusionierten cytosolischen Domäne eines neuronalen Differenzierungsfaktors die Proteinphosphatase 2A als Bindungspartner dieser Domäne durch ESI-Tandem-Massenspektrometrie mit einem QTOF II identifiziert werden. Als besonders erfolgreich erwies sich die Chromatographie an immobilisierten synthetischen Peptiden. Dafür wurden Dekapeptide eingesetzt, die den C-Termini der untersuchten Proteine entsprechen und Kandidaten für die Bindung an definierte Erkennungsbereiche (PDZ-Domänen) anderer Proteine sind. Die Bindung an diese Peptide ermöglicht die hochselektive Aufreinigung der dieses Motif erkennenden Proteine. Die Peptide wurden kovalent an eine Matrix gebunden, mit detergenz-solubilisierten Extrakten aus Gehirn-Membranen inkubiert, extensiv gewaschen, über SDS-Gele getrennt und massenspektrometrisch identifiziert. Die Methode wurde benutzt, um die Bindung der C-terminalen Sequenzen synaptischer Proteine an PDZ-Bindungsproteine (z. B. der C-terminalen Sequenz des murine Somatostatin-Rezeptors Subtyp 4 (SSTR4) an PSD95/SAP90-Protein) nachzuweisen. In anschließenden Experimenten konnte die Wechselwirkung der betreffenden Proteine durch Nachweis der Coimmunpräzipitation (durch Western Blot) und der Colokalisation (durch Immunhisto-und cytochemie) demonstriert werden.

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Sa 257/20-1

Proteingebundene Lipide beim Aufbau der Wasserbarriere der Haut

Barbara Pierstorff, Ingo Damm, Heike Hupfer und Konrad Sandhoff, Kekulé-Institut für Organische Chemie und Biochemie Universität Bonn Die Haut ist ein multifunktionelles Organ, welches den Organismus nach außen hin begrenzt. Zu den wichtigsten Aufgaben der intakten Haut gehört die Aufrechterhaltung der epidermalen Permeabilitätsbarriere. Sie ist in der äußersten Schicht der Epidermis, im stratum corneum, angesiedelt. Im reifen stratum corneum findet man eine charakteristische, stapelförmige Anordnung der Korneozyten (= terminal differenzierte Keratinozyten), welche in eine multilamellare, sehr hydrophobe Lipidmatrix eingebettet sind. Die molekulare Architektur des Übergangs zwischen Protein- und Lipidteil ist einzigartig. Durch eine bislang ungeklärte enzymatische Anbindung von sehr langkettigen �-hydroxylierten Glucosylceramiden bzw. Ceramiden und deren nachfolgende Prozessierung entstehen völlig neuartige Lipoproteine, die dem Korneozyten eine hydrophobe Oberfläche verleihen. Man nimmt an, dass der Korneozyt von einer kovalent gebundenen Monoschicht dieser Lipide umgeben ist, welche ihn in der Lipidmatrix verankert und strukturgebend für die Ausrichtung der frei extrahierbaren multilamellaren Lipidschichten ist. Störungen in diesem sogenannten Lipid Bound Envelope führen zu einer verminderten Barriereleistung. Die sehr langkettigen �-hydroxylierten Ceramide des Lipid Bound Envelope sind über Esterbindungen an saure Aminosäureseitenketten von Strukturproteinen des cornified envelope gebunden. Der cornified envelope wird entlang der Innenseite der Keratinozyten-Plasmamembran gebildet und bekommt durch Disulfidbrücken und durch Transglutaminase-vermittelte Quervernetzung (Isodipeptidbindungen) eine hochmolekulare Architektur. Unser Ziel ist es, die Bindungsstellen der kovalent gebundenen �-hydroxylierten Lipide zu identifizieren. Ein Problem dabei ist die extreme Stabilität des stratum corneum gegenüber Proteasen, die in der starken dreidimensionalen Verknüpfung des cornified envelope durch Isodipeptid- und Disulfid-Brücken begründet ist. Durch eine Bromcyan-Spaltung und einen anschließenden 48-stündigen tryptischen Verdau des stratum corneum können wir allerdings ausreichende Mengen an Peptiden und Lipopeptiden generieren. Ein zusätzliches Problem stellt die Heterogenität der gebundenen Lipide dar. Sie variieren sowohl in ihren Hydroxylierungsmustern als auch in ihrem Sättigungsgrad und in den Kettenlängen der beteiligten Fettsäuren. Diese Heterogentität macht eine massenspektrometrische Analyse von Lipopeptiden nahezu unmöglich. Aus diesem Grunde führen wir an den durch Bromcyanspaltung und tryptischen Verdau erhaltenen Lipopeptiden eine Umesterung mit Natrium-Methanolat-Lösung durch, bei der wir die Lipidester in Methylester überführen. Diese Methylester besitzen eine eindeutige Masse und zerfallen bei der Peptidfragmentierung im Massenspektrometer nicht. Durch die massenspektrometrische Analyse von Peptiden, die mit Natrium-Methanolat umgeestert wurden, konnten wir durch sequenzanalyse verschiedene Peptide identifizieren, die einen Glutaminsäuremethylester enthalten. Alle diese Peptide trugen an der Stelle, an der wir den Glutaminsäuremethylester detektiert haben, ursprünglich einen Glutamat- oder einen Glutamin-Rest. Dies deutet darauf hin, dass an dieser Stelle vor der Umesterung ein anderer Alkohol, z.B. ein �-hydroxyliertes Ceramid, esterartig gebunden war. Die auf diese Weise bisher gefundenen Lipidbindungsstellen befinden sich alle in den Keratinen 1 und 10, den Keratinen des stratum corneums. Eine Signalsequenz für die Hydroxylierung lässt sich nicht erkennen. Als zusätzliches Resultat ergab sich während dieser Arbeiten eine mögliche Affinitätsspaltung N-terminal von veresterten Glutamaten. Behandelt man ein verestertes Peptid 1 h lang mit Natrium-Methanolat, so erhält man den entsprechenden Methylester, verlängert man die Reaktionszeit auf 24 h, so bricht der Peptidstrang N-terminal neben dem

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veresterten Glutamat und es bildet sich ein Pyroglutamat. Da dieser Bruch weder neben unverestertem Glutamat noch neben Glutamin passiert, kann davon ausgegangen werden, dass die Reaktion spezifisch für veresterte Glutamate ist. Weitere Arbeiten, die mit dem Q-ToF 2 – Massenspektrometer durchgeführt wurden: 1. Expression of recombinant human GM2-activator protein in insect cells: purification and characterization

by mass spectrometry Wendeler, M., Lemm, T., Weisgerber, J., Hoernschemeyer, J., Bartelsen, O., Schepers, U., and Sandhoff, K., 2003, Prot. Expr. Purif. 27, 259 – 266

2. Expression of the GM2-activator protein in the methylotrophic yeast Pichia pastoris, purification, isotopic labeling and biophysical characterization

Wendeler, M., Hoernschemeyer, J., John, M., Werth, N., Schoeninger, M., Lemm, T., Hartmann, R., Kessler, H., and Sandhoff, K., in Vorbereitung 3. Localization of the lipid binding site of the human GM2-activator protein

Wendeler, M., Hoernschemeyer, J., Hoffmann, D., Kolter, T., Schwarzmann, G. and Sandhoff, K., in Vorbereitung

4. Physiological Substrates for Human Lysosomal �-Hexosaminidase S Hepbildikler, S.T., Sandhoff, R., Kölzer, M., Proia,R.L., and Sandhoff, K., 2002, J. Biol. Chem. 277, 2562 - 2572

5. Distinguishing the Topology of Macrocyclic Compounds and Catenanes (Kooperation mit Priv.-Doz. Dr. C. Schalley, Kekulé-Institut, Universität Bonn) Schalley, C.A., Hoernschemeyer, J., Li, X., Silva, G., and Weis, P., 2003, Int. J. Mass Spectrom. 228, 373 - 388

6. Proteomic and biochemical analyses of human B cell-derived exosomes: Potential implications for their function and multivesicular body formation (Kooperation mit Prof. Dr. W. Storvogel, Universtiy Medical Center Utrecht) Wubbolts, R., Leckie, R.S., Veenhuizen, P.T., Schwarzmann, G., Möbius, W., Hoernschemeyer, J., Slot, J.W., Geuze, H.J., and Storvogel, W., 2003, J. Biol. Chem. 278, 10963 - 10972

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Sche 235/11-1

MALDI-TOF-MS-gestützte Analyse von an der Ausprägung pflanzlicher Stressantworten und Sekundärstoffwechselprozesse

beteiligten Peptiden und Proteinen Dierk Scheel, Stephan Clemens, et al. Institut für Pflanzenbiochemie Halle/Saale Der von der DFG für das IPB Halle angeschaffte QStar mit einer KapillarLC wird vor allem für ein Projekt eingesetzt, dessen Ziel es ist, die im Rahmen der „Functional Genomics“ verfolgte Analyse des Transkriptoms von Arabidopsis thaliana durch das umfassende „Profiling“ von Proteinen, Peptiden und Metaboliten zu ergänzen. Die gewonnenen Profile werden für die Detektion früher, stressinduzierter Veränderungen genutzt, um die Identifizierung bislang unbekannter Signalmoleküle und Stressantworten zu ermöglichen. Weiterhin sind Werkzeuge für die im Zuge der “Reverse Genetics” immer wichtiger werdende biochemische Charakterisierung von Mutanten entwickelt worden. Das „Profiling“ von Arabidopsis thaliana (Sekundär)Metaboliten stützt sich vor allem auf Kapillar-LC und ESI-QqTOF-Massenspektrometrie (von Röpenack-Lahaye et al., eingereicht bei Plant Physiology). Hierbei werden methanolische Extrakte aus Blättern und Wurzeln von hydroponisch und sehr kontrolliert angezogenen Arabidopsis-Pflanzen (Abb. 1) analysiert. Das Totalionen-Chromatogramm löst dabei keine Peaks auf, sondern erfordert Dekonvolution (Abb. 2). Dies ist manuell möglich und inzwischen auch automatisch unter Verwendung der MetaboliteID-Software. Eine umfassende Evaluierung der gesamten Profiling-Methode wurde durchgeführt anhand von zufällig ausgewählten m/z-Werten. Verdünnungsreihen haben gezeigt, dass für die meisten Massensignale der dynamische Bereich mind. zwei Grössenordnungen umfasst. Damit wird eine quantitative Auswertung möglich. Die Massengenauigkeit liegt auch in den sehr komplexen methanolischen Extrakten bei < 10 ppm. Retentionszeiten in der KapillarLC sind sehr stabil und zeigen eine durchschnittliche Abweichung von < 0.25 min. Die Analytik zeigt eine gute Robustheit und Reproduzierbarkeit mit einer Varianz zwischen 10 und 25 %, abhängig vom Metaboliten. Die automatische Datenextraktion und –auswertung ist nur unwesentlich variabler als die zeitaufwendige manuelle Dekonvolution und Integration von Massensignalen. Für diese noch junge und sehr vielversprechende Technik existieren nur sehr begrenzt Werkzeuge für die Datenauswertung bei der Anwendung für Profiling-Experimente. Deshalb sind von uns Verfahren für die automatische Analyse und Evaluierung von Daten entwickelt worden, um den Probendurchsatz erhöhen zu können. Dadurch sind wir jetzt in der Lage, in Wurzelextrakten etwa 800 Massensignale und in Blattextrakten etwa 1400 Massensignale zu detektieren und zu analysieren. Weitgehende Automatisierung erlaubt die Analyse von 10-15 Proben pro Tag. Erhaltene Massendaten können gegen eine eigens angelegte Arabidopsis thaliana-Datenbank verglichen werden. Die Genauigkeit der Massenbestimmung in der „time-of-flight“-Analyse, kombiniert mit bei der Ionisierung entstehenden Fragmenten, erlauben bereits die Ableitung struktureller Informationen über Metabolite. Dies ist unter anderem deswegen sehr wichtig, weil die meisten der in einer gegebenen Pflanze vorkommenden Verbindungen noch unbekannt sind. Metabolite, die interessante qualitative oder quantititative Veränderungen zeigen, können außerdem über Tandem-MS strukturell aufgeklärt bzw. einer Stoffklasse zugeordnet werden. Dies ist an einer Reihe von Beispielen erprobt worden. Damit stellt die Methode ein Werkzeug mit hohem Potential für die Analyse der metabolischen Plastizität von Pflanzen – und damit der pflanzlichen Biologie - dar. Eine Übertragbarkeit auf Proben gänzlich anderen Ursprungs, z.B. in der medizinischen Diagnostik, ist ebenfalls denkbar. Zur Qualität des erworbenen Gerätes sei noch angemerkt, dass die Hardware verlässlich funktioniert und Daten hoher Qualität liefert. Problem ist hier die Anfälligkeit der Turbopumpen. Deren Lebensdauer sollte ca. 5 Jahre betragen. Eine Pumpe musste jedoch schon nach zwei Jahren ersetzt werden. Als völlig unzureichend und nicht funktionstüchtig hat sich die erste Version der Software Analyst erwiesen. Eine Reihe grundsätzlicher Fehler

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hat zu häufigen Systemabstürzen und Inkompatibilitäten geführt. Erst mit der zweiten Version war eine gewisse Betriebssicherheit gewährleistet.

Abb. 1: Hydroponische Arabidopsis thaliana-Anzucht für die reproduzierbare Bereitstellung von Blatt- und Wurzelmaterial.

Abb. 2: Dekonvolution der MS-Daten. Gezeigt ist ein Ausschnitt des Totalionen-Chromatogramms im Massenbereich 200-225 Da und die Extraktion von Spektren.

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Schi 416/1-1

Der Einsatz eines Q-TOF II Massenspektrometers am Fachbereich Biochemie der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg

Dr. Angelika Schierhorn FB Biochemie/Biotechnologie Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg Das Q-TOF II Massenspektrometer ist mit einer Elektrospray-Quelle, Nano-Spray und einer CapLC ausgestattet. Es wird an unserem Institut hauptsächlich für die Peptid- und Proteinanalytik eingesetzt. Neben Molekulargewichtsbestimmungen rekombinanter Proteine steht die Identifizierung von Proteinen aus 1D- oder 2D-Gelen im Vordergrund. Das Massenspektrometer wird nicht nur vom FB Biochemie genutzt, sondern es werden auch Analysen für die FB Biologie und Pharmazie und die Max-Planck-Arbeitsgruppe für Enzymologie der Proteinfaltung durchgeführt. Bei der Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Arbeitsgruppe geht es um die Identifizierung von Modifikationen von Peptidyl-Prolyl-cis/trans-Isomerasen (SCHI 416/1-1). Diese Isomerasen katalysieren die cis/trans-Isomerisierung von Peptidbindungen vor Prolin. Die Isomerase Cyclophilin A erscheint im 2D-Gel des HeLa-Zell-Lysates als sogenannte Perlenschnur. Wir konnten für jeden der 7 Spots sowohl den freien als auch acetylierten N-Terminus sowie den N-Terminus mit und ohne Start-Methionin nachweisen. Andere Modifikationen wurden nicht gefunden. Da auch das rekombinante Protein ein ähnliches Muster bei der 2D-Gel-Analyse aufweist, könnte dieses Verhalten auf die sehr niedrige Pufferkapazität des Enzyms um den isoelektrischen Punkt zurückzuführen sein. Für das humane Parvulin 14, eine im Kern lokalisierte Peptidyl-Prolyl-cis/trans-Isomerase konnte eine Phosphorylierung am Ser19 nachgewiesen werden (1). Der Phosphorylierungsgrad wurde zunächst mittels MALDI im Gesamtprotein bestimmt und anschließend das phosphorylierte Peptid nach zweimaliger RP-HPLC isoliert. Eine Fragmentierung mit nano-Spray-MS/MS diente zur Lokalisierung der phosphorylierten Aminosäure. In einer Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Technische Enzymologie wurde native Phospholipase D (PLD) (92kDa) aus Weißkohl als Phospholipase D2 durch Sequenzvergleich mit rekombinanter PLD1 und PLD2 identifiziert. Durch nano-Spray-MS/MS konnte eine N-terminale Acetylierung bewiesen werden (2). In Kooperation mit dem Institut für Pflanzenphysiologie des FB Biologie arbeiten wir an einem Proteomics-Projekt zur Charakterisierung der plastidären Proteinimportrezeptoren aus Arabidopsis thaliana. Ziel ist es die Funktion der 6 putativen Proteinimportrezeptoren (atToc33, atToc34, atToc159, atToc132, atToc120 und atToc90) in Arabidopsis aufzuklären. Dabei wurde zunächst eine T-DNA-Mutante des atToc33 Rezeptors, die als blässlich, gelb-grüner Phänotyp einen reduzierten Chlorophyll- und Carotenoid-Gehalt aufweist, untersucht. Das Fehlen des Rezeptors sollte zu einem reduzierten Import seiner Substrate führen. Das Proteinmuster der Gesamtblattextrakte junger Pflanzen, der Thylakoid Membran und des Stroma wurde nach Auftrennung über 2D-Gele mit dem Wildtyp verglichen und 23 variierende Proteine bestimmt. Die Trennung der Membran-Proteine erfolgte vor der SDS-PAGE über eine Blue Native Elektrophorese. In ähnlicher Weise sollen auch die anderen Proteinimportrezeptoren untersucht werden. Für Projekte weiterer Arbeitsgruppen, die mit Microorganismen oder Pflanzen arbeiten, über deren Genom wenig bekannt ist, waren zur Proteinidentifizierung de novo Sequenzierungen notwendig. Dafür erwies sich das Sequenzierprogramm der Software BioLynx als sehr hilfreich.

1. T. Reimer, M. Weiward, A. Schierhorn, P.-K. Rücknagel, J.-U. Rahfeld, P. Bayer, G. Fischer, J. Mol. Biol. (2003) 330, 955-966 Phosphorylation of the N-terminal domain regulates subcellular localization and DNA binding properties of the peptidyl-prolyl cis/trans isomerase hPar14 2. R. Schöps, A. Schierhorn, I. Schäffner, J. Mansfeld, R. Ulbrich-Hofmann J. Protein Chem. (2002) 21, 407-411 Identification of phospholipase D from cabbage as N-terminally acetylated PLD2

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Schn 254/11-1

FT/ICR-MS als Werkzeug zur Untersuchung der Bildungsmechanismen und der Bindungsverhältnisse von metalloiden Clustern

Katharina Weiß, Ralf Burgert und Hansgeorg Schnöckel Institut für Anorganische Chemie Universität Karlsruhe (TH) Die Bildung von Metallen aus Lösungen und das Auflösen von Metallen z. B. in Säuren gehört zu den ältesten chemischen Prozessen der Menschheit. Trotzdem ist über den Mechanismus d. h. über Intermediate bei diesen Prozessen fast nichts bekannt. Die Lücke wird durch einen bestimmten Typ von Metallatomclustern geschlossen, für den wir den Begriff des metalloiden Clusters eingeführt haben.1 Metalloide Cluster besitzen einen Kern, der ausschließlich aus Metallatomen besteht, die direkt miteinander verbunden sind. Dieser Kern wird durch eine Hülle organischer Liganden geschützt, so dass die Zahl der Metall-Metall-Bindungen größer ist als die Zahl der Metall-Nichtmetall- d. h. der Metall-Ligand-Bindungen. Die größten Cluster dieser Art im Bezug auf die „nackten“, keine Liganden tragenden Metallatome sind ein Ga84-Cluster2 und ein Al77-Cluster.3 Weitere Beispiele für derartige Clusterverbindungen sind mit Hilfe einer apparativ aufwendigen Synthesetechnik in den letzten Jahren hergestellt und mittels Röntgenstrukturanalyse exakt bestimmt worden. Diese Verbindungen sind in einem kürzlich publizierten Übersichtsartikel vorgestellt worden.4 Für die hier zu diskutierenden massenspektrometrischen Untersuchungen interessieren aus dieser Verbindungsklasse besonders die Cluster Ga19[C(SiMe3)3]6- 15 und SiAl14Cp*

6 26 (Cp*=C5(CH3)5) sowie die aus jüngsten Untersuchungen resultierende Al8Cp*

4 -Verbindung 3.7 Um zu einem besseren Verständnis für die Bindungsverhältnisse in diesen Clustern zu gelangen, stellt die Fourier-Transform-Ionencyclotronresonanz-Massenspektrometrie mit ihren vielfältigen Möglichkeiten für MSn-Experimente ein hervorragendes Werkzeug dar. Sind die extrem luft- und wasserempfindlichen metalloiden Cluster in z. B. THF löslich wie 1, so können sie unter geeignetem Aufwand mittels Elektrospray unzersetzt ionisiert und in die Gasphase transferiert werden. Ist dies nicht der Fall wie bei den metalloiden Clustern 2 und 3, so bietet sich die Laserdesorption als Ionisierungsmethode an. Mit Hilfe von SORI-CAD (sustained-off-resonance-collision-acitvated-dissociation) Experimenten können diese Cluster dann sukzessive abgebaut und so – unter Berücksichtigung quantenchemischer Rechnungen – ihre Bindungsverhältnisse geklärt werden. Dabei stellt sich heraus, dass der eigentliche Metallatomkern des metalloiden Clusters 1 aus den 13 inneren, „nackten“ Gallium-Atomen besteht, die keinerlei Bindungen zu irgendeinem der Ligandatome aufweisen. Dieser Metallatomkern ist von 6 GaR – Einheiten (R = C(SiMe3)3) umgeben. 8 9 Analog dazu wird der SiAl8 – Metallatomkern des metalloiden Clusters 2 von 6 AlCp*-Einheiten 10 umgeben. In gleicher Weise ist in 3 ein Al4-Kern durch 4 AlCp*-Gruppen geschützt. Sämtliche bisherigen Ergebnisse zeigen, dass die metalloiden Cluster 1, 2 und 3 als Ga13(GaR)6

�, SiAl8(AlCp*)6 und Al4(AlCp*)4 beschrieben werden müssen. Somit stellen diese

1 A. Purath, R. Köppe, H. Schnöckel, Angew. Chem. Int. Ed. 38, 2926 - 2928 (1999) 2 A. Schnepf, H. Schnöckel, Angew. Chemie Int. Ed. 40, 712 – 715 (2001) 3 A. Ecker, E. Weckert, H. Schnöckel, Nature 387, 379 - 381 (1997) 4 A. Schnepf, H. Schnöckel, Angew. Chem. Int. Ed. 41, 3533 – 3554 (2002) 5 A. Schnepf, G. Stößer, H. Schnöckel, J. Am. Chem. Soc. 122, 9178 – 9181 (2000) 6 A. Purath, C. Dohmeier, A. Ecker, R. Köppe, H. Krautscheid, H. Schnöckel, R. Ahlrichs, C. Stoermer, J. Friedrich, P. Jutzi, J. Am. Chem. Soc 122, 6955 - 6959 (2000) 7 J. Vollet, K. Weiß, H. Schnöckel (in Vorbereitung) 8 K. Weiß, H. Schnöckel, Int. Journal of Mass Spectrometry 214, 383 – 395 (2002) 9 K. Weiß, H. Schnöckel, Z. Anorg. Allg. Chem. 629, 1175 – 1183 (2003) 10 K. Weiß, H. Schnöckel, Analytical and Bioanalytical Chemistry (zur Publikation angenommen)

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Verbindungen als Intermediate zwischen den festen Metallen und den klassischen Metallverbindungen (z. B. Salzen, Oxiden oder Organometallspezies wie AlCl3, Al2O3 oder Al2(CH3)6) einen neuartigen Verbindungstyp dar, dessen Bindungsverhältnisse bisher nur rudimentär erfassbar sind, der jedoch, wie jüngste Ergebnisse zeigen, unerwartete, neuartige physikalische Eigenschaften aufweist.11 Den bisher durchgeführten und hier präsentierten massenspektrometrischen Ergebnissen und den geplanten Untersuchungen in diesem Bereich kommt daher eine zentrale Rolle für die Aufklärung sowohl der Bindungsverhältnisse als auch des Bildungsmechanismus metalloider Cluster zu.

11 a) J. Hagel, M. T. Kelemen, G. Fischer, B. Pilawa, J. Wosnitza, E. Dormann, H. v. Löhneysen, A. Schnepf, H. Schnöckel, U. Neisel, J. Beck, J. Low Temp. Phys. Vol. 129, 314, 133 – 142 (2002); b) Oleg N. Bakharev, Niels Zelders, Hans B. Brom, Andreas Schnepf, Hansgeorg Schnöckel, L. Jos de Jongh, Eur. Phys. J. 24, 101 – 104 (2003)

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Schn 317/6-9

The Smaller the Better – 25µ-Columns for Protein and Peptide Analysis

Andreas Schlosser, Jens Schneider-Mergener Institut für Medizinische Immunologie Charité, Universitätsmedizin Berlin Die Sensitivität eines LC-MS-Systems wird in erster Linie durch den Innendurchmesser (i.d.) der verwendeten LC-Säule bestimmt. Je kleiner der Säulendurchmesser umso besser ist die erreichbare Sensitivität. In den letzten Jahren kam es deshalb zu einer kontinuierlichen Verkleinerung der LC-Säulen, über Kapillarsäulen mit einem i.d. von 150-500 µm und einer Flußrate von 1-10 µL/min, bis hin zu nanoLC-Säulen mit einem i.d. unter 150 µm und einer Flußrate im Nanoliterbereich. Für die Peptid- und Proteinanalytik hat sich inzwischen ein Säuleninnendurchmesser von 75 µm und eine Flußrate von 200 nL/min etabliert. Um Volumina im Mikroliterbereich (1-20 µL) injizieren zu können werden in der Regel sog. Column-Switching-Systeme, bestehend aus einer Vorsäule (trapping column, i.d.R. 300 µm i..d.) und einer analytischen Säule (i.d.R. 75 µm i.d.), verwendet. Seit kurzer Zeit sind nun auch nanoLC-Säulen mit einem i.d. von 25 µm, die sich mit einer Flußrate von 25 nL/min betreiben lassen, kommerziell erhältlich (NanoSeparations). Wir haben ein Column-Switching-System, bestehend aus einer 50µ-Vorsäule und einer 25µ-analytischen Säule in unserem Labor etabliert und die erreichbare Sensitivität mit einem 300µ/75µ-System verglichen. Mit der 25µ-Säule liegt die Nachweisgrenze für die beiden Peptide EAISAAPFAK und EAITAAPFAK bei 500 amol, die entsprechende Nachweisgrenze der 75µ-Säule liegt bei 5 fmol. Die Sensitivität des LC-MS-Systems konnte somit, wie theoretisch zu erwarten war, um etwa eine Größenordnung gesteigert werden. LC-MS/MS-Spektren mit fast vollständiger y-Ionen-Serie konnten von den beiden Phosphopeptiden EAIpSAAPFAK und EAIpTAAPFAK noch mit jeweils 10 fmol erhalten werden.

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Schr 305/2-1

Antimikrobielle Peptide und Proteine der menschlichen Haut Prof. Dr. rer. nat. Jens-Michael Schröder Klinik für Dermatologie, Venerologie und Allergologie Universitätsklinikum Schleswig-Holstein, Campus Kiel, und SFB 617 Die menschliche Haut ist normalerweise mit Mikroorganismen bedeckt aber nicht infiziert. Wir sind der Hypothese nachgegangen, dass dieser Schutz sowohl durch die Bereitstellung konstitutiv produzierter als auch durch Kontakt mit Bakterien induzierter körpereigener Antibiotika erreicht wird. Dazu wurden Hautschuppen-Extrakte (gewonnen von Gesunden sowie Patienten mit Schuppenflechte (Psoriasis)), die wir durch HPLC aufgetrennt hatten, zunächst hinsichtlich der Anwesenheit antimikrobiell aktiver Peptide und Proteine analysiert. Wir fanden eine Vielzahl von Fraktionen mit antibiotischer Aktivität. Die Aktivitäts-Profile unterschieden sich sowohl qualitatitiv als auch quantitativ. Diese Fraktionen wurden parallel zu den biologischen Testreihen an einem QTOF II einer ESI-MS-Analyse mit MaxEnt1-Auswertung unterzogen. Dabei waren wir in der Lage einige bekannte Peptidantibiotika des Menschen wie das humane ß-Defensin-2 (HBD-2) in entsprechenden Fraktionen mit seiner exakten Masse zu detektieren. Es gelang uns, weitere antimikrobiell wirksame Peptide und Proteine des Menschen aus Hautschuppen-Extrakten zu isolieren. Ein neues antimikrobielles Peptid mit S. aureus-abtötenden Eigenschaften („humanes ß-Defensin-3, HBD-3“) konnten wir aus Psoriasis-Schuppen reinigen. Massenspektrometrische Analysen dieses neuen Peptides ergaben eine exakte Masse von 5347 Da. Bei nachfolgenden Untersuchungen an unserem Gerät konnten wir jetzt zeigen, dass natürliches HBD-3 in wässrigen Systemen als Gemisch von Dimeren und Monomeren vorliegt und deshalb ein komplexes RP-HPLC-Chromatogramm aufweist. Dieses Phänomen ist auch von befreundeten amerikanischen Gruppen beobachtet worden und konnte nunmehr erklärt werden. Bei Versuchen zur rekombinanten Synthese von HBD-3 (in E. coli über enzymatische Spaltungen von HisTag-Fusionsproteinen) entstanden überraschenderweise komplexe Gemische der Produkte, die gelelektrophoretisch nicht zu analysieren waren. ESI-MS-Analysen zeigten, dass hier nicht wie vermutetet N- und C-terminale Fragmente sondern Homo- und Heterodimere unterschiedlicher HBD-3-Spezies (die 6 Cysteine enthalten) nachweisbar waren, die z. T. 2 bzw. 4 Dalton kleinere Molekularmassen als berechnet aufwiesen und damit von partiell reduzierten Formen des HBD-3 herrühren. Diese Erkenntnis wird jetzt genutzt, um korrekt gefaltetes rekombinantes HBD-3 herzustellen. Es gelang uns, weitere neue antimikrobielle Peptide und Proteine (APs) der menschlichen Haut zu identifizieren. Bei einem der identifizierten APs, die ein breites Spektrum von Mikroorganismen abtöten und auch von gesunder Haut in relativ großen Mengen produziert werden, handelt es sich um eine neue RNase (RNase 7). Dieses Protein haben wir massenspektrometrisch sequenzieren können und aufgrund der Teilsequenzen klonieren können. Die exakt bestimmte Molekularmasse von 14546.06 zeigte, dass die acht Cysteine der RNase 7 vier Disulfid-Brücken ausbilden. Von hoher Relevanz könnte der Befund einer ungewöhnlichen Empfindlichkeit Vancomycin-resistenter Enterococcus faecalis gegenüber natürlicher RNase 7 sein, die eine LD90 im Bereich von 1 nMol/l aufweisen und daher diese Bakterien über bislang unbekannte, nicht über Porenbildung ablaufende Mechanismen (die mikromolare Konzentrationen erfordern) abzutöten scheinen. Bei anderen Untersuchungen, die zum Ziele hatten der Frage nachzugehen, warum der Darmkeim E. coli keine Hautinfektionen hervorruft, gelang es uns ein quantitativ dominierendes antimikrobielles Protein von ca. 11 kDa (nach SDS-PAGE-Analyse im Tricin-System) zu reinigen, das einer Edman-Sequenzierung nicht zugänglich war. Eine Sequenzierung von LysC-Verdau-Fragmenten sowohl mit einem Proteinsequenzer als auch

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mit dem QTOF II zeigte klar, dass es sich hier um ein S100-Protein handelt. Wir fanden interessanterweise, dass dieses S100 Protein in der Haut des Menschen heterogen ist und in multiplen Formen vorkommt. Für eine genaue Analyse der Isoformen, deren biologische Rolle noch völlig unklar ist, waren zunächst umfangreiche HPLC-Aufreinigungsverfahren, die mehrere „Reversed-Phase“-Trennverfahren mit unterschiedlicher Beladung der Säulen erforderlich. Wir sind z. Zt. in der Lage mehrere Isoformen chromatographisch voneinander zu trennen. SDS-PAGE-Analysen zeigten keinerlei Unterschiede der Bandenlage bei ca. 11 kDa. Detaillierte massenspektrometrische Analysen der einzelnen HPLC-Fraktionen ergaben eine Vielzahl von Massen im Bereich zwischen ca. 10 und 12 kDa. Die Hauptkomponente konnte chromatographisch gereinigt werden und ergab eine exakte Masse von 11366 Da. Ein Trypsin-Verdau nach Reduktion und Alkylierung und ein anschließendes Massen-Mapping und Tandem-MS wies auf N-terminal acetyliertes S100-Protein hin. Ähnliche Untersuchungen haben wir auch mit anderen Varianten dieses Proteins, deren antimikrobielle Aktivität zu variieren scheint, durchgeführt. Das Massen-Mapping und massenspektrometrische Sequenzierungen zeigten hier, dass neben Polymorphismen durch Austausch einzelner Aminosäuren auch eine Form isoliert wurde, die der N-acetylierten Form einer zweiten in der Datenbank vorhandenen S100-Protein-Gen-Variante entspricht. Darüber hinaus wurde eine Variante identifiziert, bei der Aminosäuren des N-Terminus fehlen und der mutierte N-Terminus acetyliert ist. Die biologische Bedeutung dieser unterschiedlichen Varianten ist derzeit unklar und soll in zukünftigen Untersuchungen beleuchtet werden. Weitere Untersuchungen an Extrakten von Hautschuppen und massenspektrometrischer de novo Sequenzierung, Edman-Abbau und Klonierung führten zu noch nicht (!) in den Datenbanken vorhandenen Peptidsequenzen. Eines dieser kleinen Proteine zeigt bei der Analyse eines Pools von Hautschuppen verschiedener Probanden eine außerordentlich hohe Heterogenität, die durch posttranslationale Modifikation allein nicht erklärt werden kann und offensichtlich von Polymorphismen dieses Proteins herrührt. Auswahl an Publikationen und Übersichten zum Thema: Schröder JM, Häsler R, Grabowsky J, Kahlke B, Mallet AI. Identification of diacylated ureas as a novel family of fungus-specific leukocyte-activating pathogen- associated molecules. J Biol Chem. 277, 27887-27895, 2002. Harder J, Schröder JM. RNase 7, a novel innate immune defense antimicrobial protein of healthy human skin. J Biol Chem. 277, 46779-46784, 2002. Schröder JM. Antimicrobial peptides: effector molecules of the skin as immune organ Hautarzt. 53, 424-34, 2002. Harder J, Bartels J, Christophers E, Schröder JM. Isolation and characterization of human beta -defensin-3, a novel human inducible peptide antibiotic. J Biol Chem. 276, 5707-5713, 2001. Schröder JM. Epithelial antimicrobial peptides: innate local host response elements. Cell Mol Life Sci. 56, 32-46, 1999.

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Berlin SIFT-GIB-Apparatur

Schw 221/15-1

Entwicklung eines SIFT/GIB-Massenspektrometers für die Grundlagenforschung Detlef Schröder and Helmut Schwarz Institut für Chemie Technische Universität Berlin Im Rahmen einer großzügigen Sachbeihilfe seitens der DFG wird im Arbeitskreis Schwarz an der TU Berlin ein SIFT/GIB-Massenspektrometer augebaut. Dabei handelt es sich um ein weltweites Unikat bei dem eine selected-ion flow tube (SIFT) Apparatur mit einen guided ion beam (GIB) Instrument gekoppelt ist. Die Apparatur soll es ermöglichen, die Thermochemie und Kinetik von Ion/Molekül-Reaktionen in der Gasphase zu untersuchen, wobei der besondere Aspekt des SIFT/GIB-Geräts in der Möglichkeit besteht, die Energieabhängigkeiten von Ion/Molekül-Reaktionen dezidiert zu untersuchen.Der schematische Aufbau des Geräts ist nebenstehend gezeigt. Im Quellenbereich stehen drei verschiedene Ionenquellen zur Verfügung, die die Erzeugung einer breiten Palette von Primärionen gestatten. Daran schliesst sich ein Quadrupolmassenfilter Q1 an. Zentralbauteil ist das nachfolgende Flussrohr, in dem die massenselektierten Ionen potentialfrei bei einem Druck von ca. 0.5 mbar thermalisiert werden. Die Detektion erfolgt über ein Tandem-Massenspektro-meter im hinteren Teil des Geräts (GIB-Teil). Die Quadrupol/Oktopol/Quadrupol-Konfiguration des GIB-Teils gestattet es, die in der Ionenquelle erzeugten, dann massenselektierten und im Flussrohr thermalisierten Ionen bei wohldefinierten Stossenergien mit neutralen Reagenzien umzusetzen und so die Energieabhängigkeiten von Ion/Molekül-Reaktionen zu untersuchen. Zudem können der SIFT- und der GIB-Teil auch im Einzelbetrieb benutzt werden, was insbesondere für die Messung von Geschwindigkeitskonstanten von Vorteil ist. Das Gerät soll zur Untersuchung elementarer Fragestellungen aus der organischen und metallorganischen Chemie genutzt werden. Beispiele sind die Struktur von protoniertem Benzol, die Rolle von Metalloxiden bei der Partialoxidation von Alkanen, die Identifizierung isomerer Spurenkomponenten in der Erdatmosphäre und die Entwicklung von Enzymmimetika.

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Se 263/17-1

Massenspektrometrische Analytik der Eicosanoide und ihrer Pharmakomodulatoren in der Pädiatrie

Bernhard Watzer, Hannsjörg W. Seyberth, Horst Schweer, Rolf Nüsing, Andreas Leonhardt, Günter Klaus Medizinisches Zentrum für Kinder- und Jugendmedizin Philipps-Universität Marburg Geräteevaluation des API 3000-LCMS-Systems Die MS-Einheit des API3000 erwies sich als sehr robust und wartungsfreundlich. Zeitintensive Probleme ergaben sich mit der Peripherie. Die quarternäre Pumpe (PE-Series 200) erwies sich durch ihr zu großes Totvolumen als ungeeignet und mußte getauscht werden. Das Relais des Jun-Air-Kompressors 4000-40M ist nicht für die hohen Schaltraten ausgelegt. Die Auslieferung des API3000 erfolgte mit der Steuerungs- und Auswertesoftware Analyst 1.1. Systemabstürze waren eine häufige Folge. Inkompatibilitäten mit CTC-PAL Autosampler und PE-Micropumpen konnten mit einem Upgrade auf Analyst 1.2 behoben werden. Die Überwindung der Schwierigkeiten nahm mehr als ein Jahr in Anspruch. Einführung in die Problemstellung Arzneimittelanwendungen in der Pädiatrie werden durchschnittlich zu 80% nicht lizenziert oder außerhalb der Zulassung eingesetzt. Die von der Internationalen Konferenz für Harmonisierung aufgestellten Leitlinien zur klinischen Evaluation von Medizinprodukten in der Pädiatrie fordern, daß pharmakokinetische Untersuchungen nur mit empfindlichsten Assays unter Anwendung der Tandem-Massenspektrometrie durchgeführt werden sollen. Weitere Forderungen für sichere und effektive Pharmakotherapien sind u.a.: Minimierung der Probenzahlen, sparsamer Probeneinsatz, Evaluation in klinischen Studien und der Einsatz von Populationskinetik-Studien. Arbeitsrichtung: Eicosanoide und deren Pharmakomodulation Forschungsschwerpunkt unserer Klinik ist die pathopysiologische Bedeutung des Eicosanoidsystems bei pädiatrischen Erkrankungen u.a. der Niere (Salzverlust-Tubulopathien) und der Lunge (Bronchopulmonale Dysplasie). Hiermit verbunden ist der therapeutische Einsatz von Pharmakomodulatoren des Eicosanoidsystems wie Cyclooxygenase- und Lipoxygenaseinhibitoren und dessen Rezeptorliganden. Projektauswahl aus der Neonatologie, Nephrologie und Pumologie Bei Frühgeborenen mit persistierendem Ductus arteriosus und bei Salzverlust-Tubulopathien steht die Therapie mit nicht-steroidalen Antiphlogistika (NSAID) im Vordergrund. Zur Durchführung notwendiger Dosis-Wirkungsstudien wird eine sensitive Analytik benötigt. Mit dem API3000 konnten Methoden zur Bestimmung von Indomethacin (LOQ: 5pg/Inj.) und Ibuprofen aus Serum (Minimalvolumen: 10 µl) aufgebaut werden. Des Weiteren wurde eine APCI Methode zur Bestimmung der neuen Cyclooxygenase-II Inhibitoren etabliert. Die Studienergebnisse wurden publiziert. [Kidney International, Vol. 62 (2002), pp. 253-260] Leukotriene (LT) und Plättchen-Aktivierende Faktoren (PAF) wirken broncho- und vasokonstriktiv und sind bedeutende Mediatoren in der Pathophysiologie der akuten und chronischen Lungenerkrankungen. Auf Grund der unzureichenden Hitzestabilität, auch nach Derivatisierung, sind diese Substanzen gaschomatographisch nicht zugänglich. Mittels LCMS-Technik konnten wir Methoden zur Bestimmung von LTB4, LTC4, LTD4, LTE4, C16-PAF, C16-lyso-PAF und C18-PAF aufbauen. Zur Klärung eines möglichen Eicosanoidshifts unter NSAID-Gabe wurde die Bestimmung von LTE4 aus Urin validiert. Diese Studien sind zur Zeit noch nicht abgeschlossen.

Zusammenfassung und Ausblick Mit dem API3000 werden hoch sensitive Studien in der Pädiatrie ermöglicht. Mit nicht oder gering invasiven Probennahmen können Pharmakomodulatoren und adäquate Biomarker zur

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klinischen Evaluation von Medikamenten quantifiziert werden. Zukünftig ist die LCMS-Analytik als empfindliche Methode zur gleichzeitigen Bestimmung von in Kombinationstherapien eingesetzten Immunsuppressiva bei Kindern (PK/PD-Studien) geplant.

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Se 435/7-1

ESI FT-ICR Massenspektrometrie für die Analyse von molekularen Erkennungs-mechanismen in regulatorischen Membranproteinen

Ernst Conzelmann, Walter Sebald, et al. Physiologische Chemie II Würzburg 1. Das Apex II FT-ICR-MS hat sich für zahlreiche Problemstellungen als sehr wertvolles Hilfsmittel erwiesen. Mittlerweile haben wir eine ganze Reihe von Anwendungen etabliert: 1.1. Messung niedermolekularer Substanzen. 1.1.1. Quantitative Bestimmung von Gallensäuren bei knock-out-Mäusen mit einem Defekt der α-Methylacyl-CoA-Racemase (im Zusammenhang mit dem Forschungsvorhaben Co 116/3-1). Dabei können aufgrund der hohen Auflösung des Geräts in einer einzigen Messung ca. 70 verschiedene Gallensäuren identifiziert und durch Vergleich mit geeigneten deuterierten Standards auch quantifiziert werden. [In diesem Rahmen wird zur Zeit auch die Bestimmung freier Fettsäuren und von Acyl-Carnitinen etabliert.] 1.1.2. Kontrolle synthetischer Peptide. Prof. Palm und PD Dr. Schinzel führen für zahlreiche Arbeitsgruppen Synthesen von Peptiden durch, teilweise mit Modifikationen wie Biotinylierung, Fluoreszenzmarkierung u.a.. Die Kontrolle der Syntheseprodukte mittels Massenspektrometrie hat sich als sehr wertvoll erwiesen, um die korrekte Sequenz und Derivatisierung der Peptide zu überprüfen. 1.1.3. Proteomik. Die Identifizierung von Proteinen anhand von tryptischen Peptiden aus einer Spaltung im Gel ist mittlerweile eine Routinemethode und ist inzwischen auch hier etabliert. 1.2. Analyse von intakten Proteinen. Die Wachstums- und Differenzierungsfaktoren sowie die extrazellulären Anteile der Rezeptoren, deren Wechselwirkung untersucht werden soll, werden rekombinant in verschiedenen Organismen exprimiert. Sowohl für die Bindungsstudien als auch für Kristallisation und Röntgenstrukturanalyse einzelner Proteine sowie der Komplexe ist es nötig, die genaue Struktur der Proteine zu kennen. Vor Allem müssen posttranslationale Modifikationen möglichst präzise charakterisiert werden. Dafür hat sich die FT-ICR-Massenspektrometrie als nahezu unersetzlich erwiesen. Inzwischen wurden mehr als 50 verschiedene Proteine untersucht. Dabei geht es im Wesentlichen um folgende Fragestellungen: 1.2.1. Kontrolle der Identität und korrekten Sequenz der exprimierten Proteine. In mehreren Fällen hat sich gezeigt, dass das exprimierte Protein nicht das gewünschte war. Zum Teil war es bei der Amplifikation der cDNA-Konstrukte zu Mutationen gekommen, z.T. waren auch versehentlich falsche Konstrukte verwendet worden. 1.2.2. Analyse posttranslationaler Modifikationen: Bei den rekombinant exprimierten und anschließend gereinigten Proteinen können eine ganze Reihe physiologischer und unphysiologischer Veränderungen auftreten, die kontrolliert werden müssen: - Abspaltung N-terminaler Aminosäuren (Met, Met-Ala, usw.) - Glykosylierung (N-, O-), bei Expression in Eukaryonten-Zellen (bspw. Insekten-Zellen) - Kontrolle der korrekten Abspaltung der His-Tags oder ähnlicher Hilfs-Sequenzen - Kontrolle der Bildung von Met-Sulfoxiden - Addukte an SH-Gruppen (bspw. DTT) 2. Das Gerät steht selbstverständlich nach Kapazität auch anderen Gruppen in Würzburg zur Verfügung. Die jeweiligen Fragestellungen werden in der Regel von Dr. Schmitz, der das Gerät betreut, in Zusammenarbeit mit den jeweiligen Gruppen bearbeitet. Es ist aber auch möglich, dass ein Mitarbeiter der Gruppe, nach entsprechender Einweisung, am Gerät selbständig arbeitet. Solche Zusammenarbeiten bestehen zur Zeit mit

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- dem Institut für Anatomie (Dr. Baumgartner) - dem Institut für med. Strahlenkunde und Zellbiologie (Prof. Rapp) - dem Institut für Organische Chemie (Prof. Würthner) 3. Die im Antrag vorgesehenen Untersuchungen zur Wechselwirkung zwischen Proteinen sind derzeit noch nicht so weit fortgeschritten, dass Ergebnisse berichtet werden können. Dafür sind im Wesentlichen folgende Ursachen zu nennen: 3.1. Technische Probleme der Installation. Wie bereits in unserem Schreiben vom 26.3.2002 geschildert, traten bei der Installation und Inbetriebnahme sowie auch beim weiteren Betrieb des Geräts eine Reihe unvorhergesehener Probleme auf, die den Beginn der Arbeiten erheblich verzögerten. Auch seither führten technische Probleme immer wieder zu Stillstands-Zeiten. Insbesondere der Wechsel der Ionenquellen von ESI zu MALDI (die bis heute noch nicht funktioniert) führte mehrfach zu Ausfällen. 3.2. Personelle Probleme. Die ursprünglich für die Durchführung des Forschungsprojekts (sowie auch den Betrieb und die Betreuung des Massenspektrometers) vorgesehenen Mitarbeiter verließen die Universität Würzburg aus beruflichen Gründen bereits vor Aufstel-lung des Geräts. Es erwies sich auch als praktisch unmöglich, einen in FT-ICR-Massenspektrometrie erfahrenen Mitarbeiter anzuwerben. Erfreulicherweise hatte sich Herr Dr. Schmitz bereit erklärt, zusammen mit Prof. Conzelmann diese Aufgabe zu übernehmen, er musste sich jedoch von Grund auf in die Materie einarbeiten und zunächst Erfahrungen sammeln. 3.3. Grundsätzliche methodische Probleme. Die Fragestellung erwies sich als technisch doch anspruchsvoller als ursprünglich erwartet. Dabei stehen 2 grundsätzliche Probleme im Vordergrund: 3.3.1. Größe der zu messenden Komplexe. Das Apex II FT-ICR-Massenspektrometer, speziell die Dimensionierung und elektronische Steuerung der Ionen-Transferstrecke von der Ionenquelle zum Analysator, ist prinzipiell für die hochauflösende Massenspektrometrie kleiner bis mittelgroßer Ionen (< 10 kDa) ausgelegt. Durch Elektrospray-Ionisation unter stark sauren Bedingungen ist es, wegen der hohen Ladung der Protein-Ionen und dem daraus resultierenden niedrigen m/z-Verhältnis, möglich, routinemäßig Proteine bis ca. 25 - 30 kDa zu vermessen, in einigen Fällen auch darüber hinaus. Die Komplexe, deren Untersuchung angestrebt wird, dürften bei 40 kDa aufwärts liegen, also in einem Bereich, in dem auch Einzelproteine nur unter günstigen Bedingungen zu messen sind. Damit verbunden ist das noch schwierigere Problem der 3.3.2. Einhaltung physiologischer Bedingungen. Um sinnvolle Aussagen machen zu können, ist es nötig, die Wechselwirkung der Proteine unter annähernd physiologischen Bedingungen zu studieren, d.h. bei etwa neutralem pH-Wert und einer Ionenstärke um 150 mM. Die hohe Salzkonzentration würde aber eine Elektrospray-Ionisation unmöglich machen, der neutrale pH-Wert hätte eine nur geringe Netto-Ladung der Proteine zur Folge, d.h. einen sehr hohen m/z-Wert. Die ggf. nötige Anwesenheit zweiwertiger Kationen (Ca2+) würde zu weiteren Problemen führen. Es wird daher für jeden einzelnen zu untersuchenden Fall nötig sein, Kompromiss-Bedingungen auszuarbeiten. Dazu kommt, dass angesichts der notorisch geringen Ionen-Ausbeute der ESI hohe Proteinkonzentrationen nötig sind, um messbare Signale zu erzeugen (in Abwesenheit organischer Lösungsmittel zwischen 1 und 10 mg Protein/ml). 4. Fazit: Zwar konnten die ursprünglich beantragten Arbeiten noch nicht durchgeführt werden, das FT-ICR-MS hat sich aber bereits jetzt als sehr wertvoll sowohl für die Arbeitsgruppe Prof. Sebald als auch für andere Gruppen an der Universität Würzburg erwiesen.

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Sp 314/3-1

FT-ICR-Massenspektrometrie in der bioanalytischen Methodenentwicklung

Bernhard Spengler, Dieter Kirsch, Werner Bouschen Institut für Anorganische und Analytische Chemie Justus-Liebig-Universität Gießen Die Projektziele lagen im Bereich der Entwicklung von abbildender Massenspektrometrie ("SMALDI-MS") und deren Kopplung an die FT-ICR-Technik, der Untersuchung von biologischem Gewebe und von Einzelzellen, der Nutzung der hohen Massenrichtigkeit der FT-ICR-MS für die Strukturaufklärung, der Grundlagenuntersuchungen zur Ionen-Fragmentierung, sowie der de novo Sequenzierung von MHC-Peptiden. Aufgrund von Lieferschwierigkeiten konnte die ursprünglich geplante Beschaffung nicht realisiert werden. Es wurde stattdessen schließlich ein Gerät des Typs "LTQ-FT" beschafft, das im Juni 2003 geliefert wurde. Das Gerät weist hervorragende Eigenschaften auf und zeigte sich von Beginn an als ideal geeignet, um die Projektziele zu erreichen. In den drei Monaten seit Installation wurden erste Tests der Geräteeigenschaften durchgeführt und begonnen, die Projektaufgaben zu bearbeiten. Die Geräteeigenschaften erwiesen sich in allen Punkten als deutlich besser als spezifiziert. Erste Ergebnisse zur verbesserten und vereinfachten de novo-Sequenzierung von MHC-Peptiden liegen vor. Im Bereich der Aufklärung von Peptid-Fragmentierungsmechanismen konnten Fragestellungen sehr einfach und schnell beantwortet werden, die bislang mit anderen Massenspektrometern nicht zufriedenstellend bearbeitbar waren. So ist beispielsweise die Primärstruktur kleinerer Fragmentionen in aller Regel unmittelbar aus der exakten Masse ablesbar, während mit herkömmlichen Massenspektrometern meist erhebliche Ambivalenzen bestehen. Im Projektzeitraum vor endgültiger Auslieferung des FT-ICR-Massenspekrometers wurde zielgemäß die neue Methode der Scanning Microprobe Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (SMALDI-MS) weiterentwickelt und für eine Implementierung in die FT-ICR-Methode vorbereitet. Mit der SMALDI-MS ist es möglich, ortsaufgelöste, bildgebende Massenspektrometrie im lateralen Auflösungsbereich von etwa 1 Mikrometer zu betreiben. Bioanalytische Informationen können direkt von biologischen oder bioaktiven Oberflächen abgelesen werden und zu Verteilungsbildern verarbeitet werden. Die FT-ICR- Methode soll zusätzlich die Möglichkeit bieten, über die hohe Massenrichtigkeit unmittelbare Informationen über die Natur der detektierten Substanzen zu gewinnen, sowie über die hohe Massenauflösung auch hochkomplexe, natürliche Systeme sinnvoll bearbeiten zu können. Nach Installation des neuen Gerätes wurde eine Atmosphärendruck-MALDI-Quelle an das FT-ICR-Gerät adaptiert, um so die Kompatibilitäten im Hinblick auf eine zukünftige SMALDI-FT-ICR-MS zu testen. Wichtige Voraussetzung dafür ist die Möglichkeit, Massenspektren auch aus einzelnen Laserpulsen zu erhalten, da in der SMALDI-MS eine Aufsummierung einer großen Zahl von Einzelspektren wegen der höheren Abtragrate im Allgemeinen nicht möglich ist. Diese Voraussetzung konnte mit der AP-MALDI-Quelle erfüllt werden. Es ergaben sich sehr gut auswertbare MS- und MS-MS-Spektren aus einzelnen Laserpulsen. In der Folgezeit gilt es nun, eine SMALDI-Quelle für das LTQ-FT zu entwickeln und deren Eigenschaften zu optimieren. Die Nutzung der hohen Massenrichtigkeit für die Untersuchung komplexer Systeme, sowie für Proteomics und SMALDI imaging erfordert die Entwicklung intelligenter Software tools.

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We 888/15-1

Vom Proteinkomplex zur Aminosäure: LC-MS/MS in den Pflanzenwissenschaften Elmar W. Weiler, Markus Piotrowski Fakultät für Biologie Ruhr-Universität Bochum 1. Zielsetzung Die Zielsetzung des Programms bestand darin, während des Berichtszeitraums die mas-senspektrometrische Analytik mittels Quadrupol-Time-of-flight Hybridmassenspektrometern im Arbeitskreis fest zu etablieren, wobei der Schwerpunkt auf der Bearbeitung von Proteinen und Peptiden liegen sollte, und sodann die erarbeitete Analytik dem eigenen, aber auch inte-ressierten Arbeitskreisen, zur Verfügung zu stellen. Die Bedienung des Gerätes wurde Herrn Dr. Markus Piotrowski (AR z.A.) anvertraut. 2. Allgemeine Einschätzung Das durch die DFG beschaffte Gerät erwies sich von Anfang an als stabil und sehr leistungs-fähig. Die Spezifikationen werden mühelos eingehalten. Probleme traten mit der Inbetrieb-nahme keine auf, auch im laufenden Betrieb ist die Zuverlässigkeit hoch. Das System ist als ausgereift und betriebssicher zu bezeichnen, die Entscheidung für dieses Gerät war richtig. Die Einarbeitung in die Bedienung des Gerätes, aber auch in die Technik der Proteinmas-senspektrometrie und insbesondere in die Proteinsequenzierung durch Herrn Dr. Piotrowski verlief sehr erfolgreich. Damit wurde das Ziel, ein leistungsfähiges Labor für Hybridmassenspektrometrie einzurichten, sowohl personell als auch von der Geräteseite her erreicht. Das Gerät ist ständig im Einsatz und wird neben der Proteinmassenspektrometrie auch - gemäß der ursprünglichen Zielsetzung - für den Nachweis bestimmter niedermolekularer Metabolite erfolgreich eingesetzt. Im folgenden werden einige der durchgeführten Projekte kurz geschildert, um beispielhaft den Einsatz des Gerätes und erreichte Ergebnisse darzustellen. 3. Ergebnisse Die Anwendung des QTOF-2 liegt größtenteils im Bereich der Proteinanalytik, insbesondere in der de-novo Sequenzierung. Beispiele dafür: - Identifizierung eines Photosystem I-assoziierten Proteins (Boekema et al. 2001) - Identifizierung einer Proteinkinase in einem Proteinkomplex (Ogrzelwall et al. 2002) - Identifizierung der autophosphorylierungsstelle einer pflanzlichen Proteinkinase

(Rutschmann et al 2003) Daneben wird das Q-TOF2 regelmäßig zur Identifizierung und Quantifizierung verschiedener niedermolekularer Reaktionsprodukte eingesetzt, z.B.: - Identifizierung und Quantifizierung von Aminosäuren (Piotrowski et al. 2001) - Identifizierung von Polyaminvorstufen (Piotrowski et al. 2003, Janowitz et al. 2003)

4. Schlussbemerkungen Das von der DFG bewilligte Hybridmassenspektrometer hat sich bisher als robust, in der An-wendung sehr sicher und ausgereift gezeigt. Durch die Verfügbarkeit konnte im Arbeitskreis und bei den Kooperationspartnern ein neuer Maßstab an Sicherheit in der Datengewinnung bei allen proteinbiochemischen Arbeiten eingeführt werden. Hervorgehoben werden soll weiterhin die sehr gute Zuverlässigkeit der Sequenzierungsalgorithmen, die insbesondere für Arabidpopsis thaliana im Abgleich mit den Sequenzdatenbanken die eindeutige Zuordnung und Identifizierung isolierter Proteine mit einem hohen Grad an Zuverlässigkeit selbst im au-tomatischen Betrieb ermöglichen.

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5. Literatur Boekema, E.J., Hifney, A., Yakushevska, A.E., Piotrowski, M., Keegstra, W., Berry, S., Michel, K.-P., Pistorius,

E.K. und Kruip, J. (2001) A giant chlorophyll-protein complex induced by iron deficiency in cyanobacteria. Nature, 412:745-748

Janowitz, T., Kneifel, H. und Piotrowski, M. (2003) Identification and characterization of plant agmatine iminohydrolase, the last missing link in polyamine biosynthesis of plants. FEBS Lett., 544:258-261 Ogrzelwalla, K., Piotrowski, M., Reinbothe, S. und Link, G. (2002) The plastid transcription kinase from mustard (Sinapis alba L.). A nuclear-encoded CK2-type chloroplast enzyme with redox-sensitive function. Eur. J. Biochem., 269:3329-3337 Piotrowski, M., Schönfelder, S. und Weiler, E.W. (2001) The Arabidopsis thaliana isogene NIT4 and its orthologs

from tobacco encode �-cyanoalanine hydratase/nitrilase. J. Biol. Chem., 276:2616-2621 Piotrowski M., Janowitz T. und Kneifel H. (2003) Plant C-N hydrolases and the identification of a plant N-

carbamoylputrescine amidohydrolase involved in polyamine biosynthesis. J. Biol. Chem., 278:1708-1712 Rutschmann, F., Stalder, U., Piotrowski, M., Oecking, C. und Schaller, A. (2002) LeCPK1, a calcium-dependent

protein kinase from tomato. Plasma membrane targeting and biochemical characterization. Plant Physiol., 129:156-168

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Bericht der eingeladenen Gutachter zur Großgeräteinitiative der DFG

„Hochleistungs-Massenspektrometer in den Biowissenschaften“

Durch die Großgeräteinitiative zum Einsatz von Hochleistungs-Massenspektrome-tern in den Biowissenschaften sind die apparativen Voraussetzungen zur Realisierung der Forschungsvorhaben in den Forschungseinrichtungen deutlich verbessert worden. Die Förderinitiative hat bei den 34 geförderten Arbeitsgruppen überwiegend einen deutlichen Produktivitätsschub bewirkt. Vor allem in der molekularen Protein- und Kohlenhydratanalytik wurden die Expertise gestärkt und viele neue wissenschaftliche Ergebnisse und aktuelle Arbeitsschwerpunkte ermöglicht. Die Großgeräteinitiative wurde letztlich durch die Entde-ckung der neuen Ionisationstechniken Matrix Assisted Laser Desorption (MALDI) und Elektrospray Ionisation (ESI) ermöglicht, die der Massenspektrometrie zu einem Durchbruch hinsichtlich der Anwendbarkeit auf biologische und biochemische Fragestellungen verhalfen und zur Entwicklung entsprechend angepasster Gerätesysteme führten. Die erzielten Ergebnisse stehen durch die zugrunde liegende molekulare Analytik inzwischen auf einer wissenschaftlich soliden Basis. Dieser Effekt wird auch einige Jahre weiter in die Zukunft wirken. Die Vorträge der beteiligten Arbeitsgruppen vermittelten den Eindruck, dass die Förderinitiative insgesamt ein Erfolg war und der wissenschaftlichen Wettbe-werbsfähigkeit der Bioanalytik in Deutschland einen wichtigen Entwicklungsschub gegeben hat. Auch im internationalen Vergleich wurden die Standorte hervorragend ausgestattet.

Die Palette der Forschungsthemen war breit gestreut, vom biochemischen Grundla-gen- bis zum medizinisch-diagnostischen Anwendungsbereich; sie umfasste die MS-Analytik von Peptiden und Proteinen einschließlich Proteinkomplexen, Glykoproteinen, Lipiden, Eicosanoiden, Nukleotiden und Kohlenhydraten, wobei neben der Identifizierung und Sequenzierung auch schwierigere Probleme wie die Auffindung von Phosphorylierungs-, Glykosylierungs- oder Disulfid-Positionen erfolgreich bearbeitet wurden. Hinzu kamen Arbeiten in so verschiedenen Bereichen wie Grundlagenforschung in der Metallkomplexche-mie, Studien über neue pharmazeutische Wirkstoffe, klassische proteomische Experimente an verschiedenen Pflanzen und die Erforschung antimikrobieller Wirkstoffe auf der menschlichen Haut. Anzumerken ist dabei, dass der Erfolg des Einsatzes von Massen-spektrometern in der Forschung auch von den Gruppen eindrucksvoll demonstriert werden konnte, die zuvor mit der Massenspektrometrie wenig vertraut waren. Die Anwendungsberei-che reichen inzwischen von der Identifizierung/Sequenzierung von Proteinen/Peptiden, was teilweise auch als Serviceleistung in größeren Forschungsverbünden durchgeführt wird, der Analyse von Proteinmodifikationen bis zur Identifizierung von niedermolekularen Substanzen und zu einer großflächigen Metabolitenanalyse in Verbindung mit chromatographischen Methoden. In der Kohlenhydratanalytik wurden Applikationen gezeigt, bei denen Hochauflö-sungs-Daten unbedingt erforderlich waren. In Applikationen aus dem Proteinbereich wurde auf diesen Punkt kaum eingegangen. Es ist aber davon auszugehen, dass die hohe Genauigkeit und Richtigkeit dieser Daten die Signifikanz der Ergebnisse verbessert (im Vergleich zu Niederauflösungs-Daten). Dies wird wahrscheinlich erst dann mehr ausgelotet werden, wenn in größerem Umfang Daten mit Fehlern um 1 ppm erzeugt werden können. Generell wurde der stark erhöhte Informationsgehalt von Hochauflösungs-MS-Daten im Vergleich zu Niederauflösungs-MS-Daten aber kaum thematisiert. Hierzu wäre Hilfe von der Bioinformatik her zu empfehlen, die beim Rundgespräch nicht vertreten war.

Entsprechend dem wissenschaftlichen Anwendungsspektrum waren die unterschied-lichsten Massenspektrometer angeschafft worden, von einfachen Quadrupol-Instrumenten

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über MALDI Time-of-Flight und Q-TOF Geräten bis zu den neuesten Ion-Trap Fourier-Transform Massenspektrometern. Die Rolle der angewandten MS-Verfahren und ihres jeweiligen Potenzials wurde dabei in sehr unterschiedlicher Weise zur Geltung gebracht; teils erschien die MS lediglich als geradezu routinemäßig eingesetztes analytisches Endglied einer Kette aufwändiger Trennmethoden, teils wurde überzeugend demonstriert, wie erst die Anwendung ausgefeiltester MS/MS- oder Hochauflösungstechniken zu gezielten Aussagen führt. In diesem Zusammenhang erschienen auch die Arbeiten, die sich mit der Entwicklung neuer MS-Techniken befassten, für die Geräteinitiative als besonders wichtig und wegweisend. Nach mehr als zehn Jahren seit der Entdeckung der beiden sanften Ionisationstechniken MALDI und ESI haben nun sowohl die massenspektrometrischen Techniken als auch ihre Handhabbarkeit ein Niveau erreicht, das ihren breiten Einsatz in den biologischen Wissenschaften fruchtvoll werden lässt. Dies ist im Rahmen dieses Rundgesprächs deutlich geworden.

Bedeutsam für etwaige künftige Investitionen waren insbesondere die Beiträge, die sich neben der Darlegung der wissenschaftlichen Projekte auch mit der – teilweise vergleichenden – Geräteevaluation auseinander setzten. Generell positiv bei der Darstellung ihrer Forschungsergebnisse können die Gruppen bewertet werden, die mit Q-TOF-MS gearbeitet haben. Das trifft sowohl auf die Vortragenden zu, bei denen Fragen der Grund-lagenforschung im Vordergrund standen, als auch auf die Einrichtungen zu, wo durch vielfältige Kooperationen diese Geräte dienstleistend genutzt wurden. Diese User-Netzwerke erweisen sich als dienlich, nicht nur um die Geräte optimal auszulasten, sondern auch um die jeweiligen Vorteile verschiedener Systemkombinationen für die Lösung spezifischer Fragestellungen von mehreren Arbeitsgruppen gemeinsam sinnvoll zu nutzen. Bei den Analysekompetenz-Zentren ist aber darauf zu achten, dass die Leiter und Wissenschaftler derartiger Zentren nicht ausschließlich zu Experten einer subtilen Technik werden, ohne dabei die biologischen Fragestellungen im Auge zu behalten. Auch bei Großgeräteförderinitiativen der DFG müssen immer die Forschungsprojekte selbst im Mittelpunkt der Begutachtung und Bewilligung stehen - ein Aspekt, der gar zu leicht verloren gehen kann, wenn eine Technologie im Mittelpunkt einer solchen Initiative steht.

Während die Q-TOF-Geräte sowohl im ESI- als auch im MALDI-Betrieb durchweg gut

abschnitten, war dies bei den teureren FT-ICR-Maschinen nur bedingt der Fall. Die FT-ICR Geräte zeigten gegenüber den Q-TOF Geräten eine verminderte Empfindlichkeit (laut Diskussion gut eine Größenordnung sowohl für den ESI- als auch für den MALDI-Betrieb), wenn auch bei letzteren die außerordentlich hohe Massengenauigkeit übereinstimmend hervorgehoben wurde; allerdings gewann man den Eindruck, dass deren Potenzial nicht von allen einschlägigen Arbeitsgruppen bislang auch voll ausgenutzt werden konnte. Nach einer schwierigen Anlaufphase konnten einige Gruppen mit diesen Geräten zwar hervorragende Ergebnisse erzielen, andere waren auf Grund der ständigen Ausfälle von Hard- und Software aber oft nicht über die Vermessung von Testsubstanzen hinaus gekommen. In einer solchen Situation kann eine Zeitspanne von 2-3 Jahren Projektförderung manchmal nicht ausreichen, um kompetitive Ergebnisse zu erzielen. Dem muss ein kontinuierlich geführter Dialog mit der DFG und anderen Anwendern über den Einsatz der Geräte entgegensteuern. Die DFG sollte hier anstreben, generell Erfahrungsberichte wenige Jahre nach Beschaffung und Inbetriebnahme derartiger Großgeräte (nach ein bis zwei Jahren) einzuholen.

Für einige Arbeitsgruppen stellte die Massenspektrometrie erwartungsgemäß ein

Novum dar. Das damit verbundene Risiko, dass ungeübtes Personal nicht mit der zur Ver-fügung gestellten Technik würde umgehen können, ist weitestgehend aber nicht zum Tragen gekommen, weil von den neuen MS-Nutzern meist geeignete Geräte ausgesucht wurden, deren Technik weit genug entwickelt war und weil die jeweiligen Gruppen sich den technischen Anforderungen erfolgreich gestellt haben.

Erwähnenswert sind drei Geräte-Förderprojekte, die außerhalb der Biowissenschaf-ten angesiedelt sind, die jedoch nichtsdestotrotz ebenfalls anlässlich des Rundgesprächs

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vorgestellt und evaluiert wurden. Dies ist zum einen ein FT-ICR-MS, mit dem erfolgreich sehr empfindliche metalloide Cluster untersucht wurden (teils unter Anwendung von ESI aus THF-Lösung, teils von MALDI), des Weiteren ein Multicollector-ICP-MS, mit dem eine neue Qualität von hochpräzisen Isotopenverhältnismessungen für geochemische und klimatologische Fragestellungen etabliert werden konnte, schließlich die Entwicklung eines SIFT/GIB-MS (Selected Ion Flow Tube/ Guided Ion Beam) für die massenspektrometrische Grundlagenforschung, ein Gerät, das als weltweites Unikat anzusehen ist. Diese Beiträge konnten in beeindruckender Weise ein Licht auf die vielfältigen Einsatzgebiete der Massenspektrometrie werfen. Der Dialog verschiedener Wissenschaftsdisziplinen wurde dadurch noch einmal erweitert.

Insgesamt wurden die Geräte, von wenigen Ausnahmen abgesehen, die im Wesentli-

chen aber die technische Verfügbarkeit und Leistungsmerkmale eines Instrumententyps betrafen, ausgesprochen erfolgreich und zielgerichtet eingesetzt. Anfängliche Schwierigkei-ten, die Geräte auch zu beherrschen, wurden in den allermeisten Fällen bewältigt. Dennoch ist anzumerken, dass die bewilligten Geräte für einzelne Projekte überqualifiziert, d.h. unnötig teuer erschienen. Die Bewilligung der FT-ICR-Geräte hätte teilweise kritischer hinterfragt werden müssen, zumal die damaligen Neuentwicklungen offenbar noch nicht für den Forschungsbetrieb einsatzbereit waren. Offenbar war, wohl wegen der Vielzahl der gleichzeitig zu begutachtenden Anträge und der zur Verfügung gestellten Mittel, der Maßstab der Gutachter nicht immer kritisch genug. Insbesondere die zurückliegende Leistung zu den geplanten Projekten hätten durchaus sorgfältiger berücksichtigt werden sollen.

Abschließend kann gesagt werden, dass die Initiative, Massenspektrometer im größeren Stil in die biologische Wissenschaft einzubringen, ein Erfolg war. Ihre breite Streuung entspricht der dezentralen Natur biologischer Wissenschaft. Die Geräteinitiative war ein sehr gelungener Schritt zur Etablierung moderner Infrastrukturen in der Bioanalytik, aber auch in besonderen Bereichen der Chemie, Physik und Geowissenschaften. Folgerich-tig diente das evaluierende Rundgespräch auch dem äußerst wichtigen Erfahrungsaus-tausch zwischen den Nutznießern - auch den Berichterstattern und Gutachtern – dieser Initiative. Es hat dazu beigetragen, dass erstmalig in diesem größeren Rahmen auch fachübergreifend ein nützlicher und fruchtbarer Austausch zwischen den Anwendern stattfand, speziell auch über die Einsatzmöglichkeiten und Qualität der angeschafften Geräte. Die Synchronisierung der Beschaffungen, d.h. die über einen engen Zeitraum verteilte Aufstellung so zahlreicher Großgeräte einer Technologie bedeutet aber natürlich auch eine Synchronisierung des Ersatzbedarfs. Beim derzeitigen rapiden Fortschritt der Massenspektrometrie ist daher abzusehen, dass schon in wenigen Jahren „flächendeckend“ veraltete Geräte stehen werden.

Redaktion: Dr. Achim R. Tieftrunk <mailto:[email protected]>

Deutsche Forschungsgemeinschaft Wissenschaftliche Geräte und Informationstechnik Dieser Bericht ist auch im Internet unter www.dfg.de erhältlich

DFG€¦ · Die DFG stellte den Antragstellern am Zentrum für Molekulare Biologie, Universität Heidelberg (ZMBH) ein Elektrospray-Quadrupol-Time of Flight Hybrid Massenspektrometer

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