DIAGNÓSTICO GENÉTICO PRENATAL 1- GENERALIDADES El diagnóstico prenatal es el conjunto de técnicas y capacidades disponibles para conocer la adecuada formación y desarrollo del feto antes de su nacimiento. En sus inicios, el diagnóstico prenatal consistía fundamentalmente en el cuidado de la madre. Esta situación ha cambiado radicalmente en las últimas décadas debido al uso sistemático y mejoras técnicas de la ecografía, y a los avances en los procedimientos invasivos, no invasivos y diagnóstico molecular. Este proceso también ha generado un incremento en la tasa de diagnóstico prenatal de malformaciones congénitas, y ha llevado a acuñar el concepto del feto como paciente. En la actualidad, el diagnóstico prenatal incluye, además del cuidado de la madre, la evaluación de la salud fetal, la pesquisa y el diagnóstico de defectos congénitos, la búsqueda de la etiología de los mismos, el seguimiento y estrategias de manejo, y eventualmente, intervenciones terapéuticas. Un concepto central es que el diagnóstico prenatal de una malformación fetal requiere de un enfoque multidisciplinario que involucre a especialistas en obstetricia y en imágenes, genetistas, neonatólogos, cardiólogos infantiles y a los especialistas en cirugía infantil. Este concepto de equipo multidisciplinario trasciende el conocimiento y la experiencia de los especialistas en sus respectivas áreas, aumentando las
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DIAGNÓSTICO GENÉTICO PRENATAL
1- GENERALIDADES
El diagnóstico prenatal es el conjunto de técnicas y capacidades disponibles para
conocer la adecuada formación y desarrollo del feto antes de su nacimiento.
En sus inicios, el diagnóstico prenatal consistía fundamentalmente en el cuidado de la
madre. Esta situación ha cambiado radicalmente en las últimas décadas debido al uso
sistemático y mejoras técnicas de la ecografía, y a los avances en los procedimientos
invasivos, no invasivos y diagnóstico molecular. Este proceso también ha generado un
incremento en la tasa de diagnóstico prenatal de malformaciones congénitas, y ha
llevado a acuñar el concepto del feto como paciente.
En la actualidad, el diagnóstico prenatal incluye, además del cuidado de la madre, la
evaluación de la salud fetal, la pesquisa y el diagnóstico de defectos congénitos, la
búsqueda de la etiología de los mismos, el seguimiento y estrategias de manejo, y
eventualmente, intervenciones terapéuticas.
Un concepto central es que el diagnóstico prenatal de una malformación fetal requiere
de un enfoque multidisciplinario que involucre a especialistas en obstetricia y en
imágenes, genetistas, neonatólogos, cardiólogos infantiles y a los especialistas en
cirugía infantil. Este concepto de equipo multidisciplinario trasciende el conocimiento y
la experiencia de los especialistas en sus respectivas áreas, aumentando las
competencias del equipo en el asesoramiento de los padres y en la planificación de un
mejor manejo perinatal.
Específicamente, el diagnóstico prenatal evalúa al feto con riesgo de presentar una
anomalía de cromosomas, de genes o una malformación congénita. O sea, que todos
los especialistas involucrados en el diagnóstico prenatal de defectos congénitos van a
estar involucrados en mayor o menor medida con conceptos y nociones generales de
la genética
1.1 – CLASIFICACIÓN DE LOS DEFECTOS CONGÉNITOS
Un defecto congénito es definido como cualquier anomalía anatómica, bioquímica o
funcional que está presente al momento del nacimiento.
Los defectos congénitos se pueden clasificar desde distintos enfoques. Por el número
de malformaciones se los clasifica en simples o aislados (una sola malformación) o
múltiples (dos o más). De acuerdo a su magnitud se los clasifica en mayores y
menores: los defectos mayores son aquellos defectos que resultan en mortalidad o en
morbilidad o alteración cosmética significativa, o que requieren tratamiento quirúrgico;
los defectos menores no tienen consecuencias médicas ni cosméticas significativas.
Entre el 2 y el 3 % de los recién nacidos presentan una malformación mayor al
momento del nacimiento, y cerca del 10 % una malformación menor.
1.2 – ETIOLOGÍA DE LOS DEFECTOS CONGÉNITOS
La clasificación etiológica de los defectos congénitos es importante para aclarar los
factores de riesgo, determinar qué método de diagnóstico prenatal se utilizará,
establecer un pronóstico perinatal cierto, y realizar un correcto asesoramiento
genético. La etiología se divide en tres grandes grupos: genética, ambiental y
Tabla 5: Técnicas actuales de diagnóstico prenatal
MÉTODOS INVASIVOS
Biopsia de vellosidades coriónicas/ placenta
Amniocentesis
Cordocentesis
Otros procedimientos
toracocentesis
vesicocentesis
paracentesis
MÉTODOS NO INVASIVOS
Imágenes
Ecografía (2D, 3D, 4D)
Doppler
Resonancia Magnética
Tomografía Computada Helicoidal
Marcadores bioquímicos en sangre materna
Ácidos nucleicos fetales en sangre materna
DIAGNÓSTICO GENÉTICO PREIMPLANTATORIO (PGD)
1.3.1 – Indicaciones del diagnóstico prenatal invasivo
Las indicaciones diagnósticas de los procedimientos prenatales invasivos más
comunes se detallan en la tabla 6.
Tabla 6: Indicaciones de procedimientos invasivos de diagnóstico prenatal
Riesgo aumentado para anomalías de cromosomas
Edad materna avanzada
Screening positivo para anomalías de cromosomas
Hallazgos ecográficos: anomalías fetales, restricción de crecimiento intrauterino,
anomalías del volumen del líquido amniótico
Embarazo o hijo previo con una trisomía
Anomalía cromosómica en los padres
Sospecha de enfermedad genética
Por hallazgos ecográficos
Por antecedentes de enfermedad genética familiar con mutaciones conocidas
Parejas heterocigotas (portadoras) para enfermedades autosómicas recesivas
Mujeres portadoras de enferemedades recesivas ligadas al X
Padre o madre afectados con enfermedades autosómicas dominantes
Otras indicaciones de diagnóstico prenatal invasivo
Almacenamiento de ADN
Evaluación de la anemia fetal
Evaluación de la madurez pulmonar feta
Evaluación de infecciones fetales
1.3.1.1 Edad materna avanzada:
El principal factor de riesgo para anomalías cromosómicas numéricas es la edad
materna. La asociación entre edad materna y el riesgo de tener un embarazo con una
trisomía se conoce desde hace años (Tabla 7).
Tabla 7. Riesgo de anomalías de cromosomas de acuerdo a la edad de la madre.
Edad alnacimiento (años)
Riesgo paraTrisomía 21
Riesgo para cualquier anomalía cromosómica
15 1: 1578 1: 454
20 1: 1480 1: 525
25 1: 1340 1: 475
30 1: 940 1: 384
35 1: 353 1: 178
40 1: 85 1: 62
45 1: 35 1: 18
A medida que aumenta la edad materna aumenta el riesgo de un embarazo con
trisomía 21, pero también de otras trisomías como trisomía 13, trisomía 18, trisomía
16; y polisomías como 47,XXX y 47,XXY. La edad materna no altera el riesgo para
monosomía del X (síndrome de Turner) ni para triploidías.
Hasta hace algunos años la “la edad materna avanzada”, definida arbitrariamente
como igual o mayor a 35 años, constituyó la principal indicación de diagnóstico
prenatal invasivo. En la actualidad existe una tendencia a informar a todas las
embarazadas, independientemente de la edad, sobre la posibilidad de realizar un
screening prenatal para anomalías de cromosomas, con el objetivo detectar qué
pacientes podrían beneficiarse con un estudio invasivo.
1.3.1.2 Hijo o embarazo previo con una anomalía de cromosomas:Se ha descripto que ciertas trisomías en recién nacidos, en fetos muertos o en abortos
presentan un riesgo de recurrencia mayor que el esperado simplemente por azar. Esto
es principalmente cierto para trisomía 21. Se ha observado que las parejas con
cariotipo normal que han tenido un hijo con trisomías 13, 18 ó 21 presentan un riesgo
de recurrencia de otro hijo afectado cercano al 1%, o un exceso del 0,7 % por encima
del riesgo de la edad materna.
1.3.1.3 Anomalías cromosómicos en los padresLos individuos portadores de anomalías estructurales son fenotípicamente normales,
dado que no presentan exceso ni déficit de material cromosómico. No obstante,
muestran habitualmente impacto reproductivo con una alta frecuencia de abortos y la
posibilidad de recién nacidos anormales, debido a durante la meiosis se puede
producir un disbalance del rearreglo cromosómico. El riesgo depende del tamaño y
contenido génico de los segmentos que intervienen en el rearreglo. Los rearreglos más
comunes son las translocaciones balanceadas.
1.3.1.4 Screening positivo para anomalías de cromosomas En la actualidad en muchos países del mundo es una práctica de rutina dentro del
control obstétrico ofrecer un screening para anomalías de cromosomas, y determinar
el subgrupo de embarazos con mayor para una anomalía, y no estimar el riesgo sólo
en base a la edad materna. Existen múltiples esquemas de combinaciones de
marcadores del primer y segundo trimestres, siendo el método más eficiente el
“screening combinado de primer trimestre”. Este screening toma en cuenta en el
cálculo de riesgo la edad materna, marcadores bioquímicos en sangre materna
(PAPP-A y fracción libre de la Beta hCG), y marcadores ecográficos (translucencia
nucal, sumada a uno o más de los siguientes marcadores: hueso nasal, Doppler del
ductus venoso, y Doppler de la válvula tricúspide) entre las 11 y 14 semanas de
embarazo. El uso de este esquema de screening prenatal ha permitido aumentar
notablemente la detección de anomalías de cromosomas, y evitar la realización de
estudios invasivos innecesarios en la mayoría de los embarazos no afectados, y se ha
transformado en la principal indicación de diagnóstico prenatal invasivo (tabla 8)
Tabla 8: Performance de los diferentes esquemas de screening para trisomía 21
EM EM+TN EM+TN+Bq EM+TN+Bq+HN+DV+VT
TD 30% 75% 85% 95%
TFP 5% 5% 5% 2,5%
VPP 1/120 1/40 1/35 1/15
EM: edad materna; TN: translucencia nucal; Bq: marcadores bioquímicos en sangre materna (PAPP-A y
Beta-hCG libre), HN-DV-VT: hueso nasal, ductus venoso y válvula tricúspide
TD: tasa de detección; TF: tasa de falsos positivos
VPP: valor predictivo positivo, expresado en número de procedimientos necesarios para diagnosticar un
caso de trisomía 21.
1.3.1.5 Hallazgos ecográficos anormales: anomalía fetal estructural, restricción del crecimiento intrauterino, anomalía del volumen de líquido amnióticoLa identificación de estos hallazgos por ecografía es una indicación cada vez más
común de estudios invasivos para cariotipo fetal. La mayoría de las malformaciones
congénitas, salvo excepciones, se asocian en mayor o menor medida con mayor
riesgo de aneuploidía. Este riesgo se incrementa aún más con el número de defectos
detectados por ecografía. En líneas generales, las malformaciones aisladas se asocian
con un riesgo de anomalías de cromosomas entre 5 y 10 %, mientras que en el caso
de malformaciones múltiples el riesgo asciende al 20 % o más.
1.3.2 – Procedimientos invasivos
Los procedimientos prenatales invasivos corresponden en su mayoría a punciones
sobre el embarazo con agujas finas bajo control ecográfico, con el objetivo de extraer
muestras para el diagnóstico de distintas condiciones fetales.
Los procedimientos invasivos más empleados en la práctica de la medicina fetal son la
amniocentesis y la aspiración de vellosidades coriónicas o biopsia de placenta, y en
menor medida, la cordocentesis o punción de cordón umbilical (Figura 1).
Estos procedimientos tienen distintos grados de complejidad, pero todos poseen como
factor común el riesgo potencial de la pérdida de embarazo. En consecuencia deben
ser realizados o supervisados por especialistas en medicina materno-fetal con
entrenamiento en procedimientos invasivos, deben ser correctamente indicados, las
pacientes deben ser informadas previamente sobre las características, las
posibilidades y los riesgos del procedimiento, deben prestar su consentimiento
informado, y las pacientes Rh negativas no sensibilizadas deben recibir profilaxis con
gamma-globulina anti-D dentro de las 72hs posteriores al procedimiento.
Figura 1: Procedimientos invasivos en diagnóstico prenatal para obtener una muestra
de tejido para cariotipo
1.3.2.1 Amniocentesis
La amniocentesis consiste en la introducción de una aguja en la cavidad amniótica a
través del abdomen materno para extraer líquido amniótico generalmente con fines
diagnósticos y menos frecuentemente con fines terapéuticos (amniorreducción).
Excepcionalmente se puede usar para introducir líquido (amnioinfusión) o drogas.
Las principales indicaciones diagnósticas incluyen riesgo aumentado para anomalías
de cromosomas, para enfermedades mendelianas, o para defectos de cierre del tubo
neural, y la evaluación del grado de anemia fetal, infecciones fetales y de la madurez
pulmonar fetal. La evaluación del grado de anemia fetal se hace mediante la
espectrometría de líquido amniótico en casos de isoinmunización materna por Rh u
otros antígenos eritrocitarios fetales. La amniocentesis puede servir para confirmar una
corioamnionitis mediante la técnica de Gram. Ante la sospecha de una infección fetal
con posibles efectos teratogénicos la extracción de líquido amniótico permite detectar
la presencia de un agente infeccioso mediante cultivo o con la técnica molecular de
PCR. Ante una posible finalización anticipada del embarazo por compromiso de la
salud materna y fetal, la evaluación de la madurez pulmonar fetal puede hacerse
mediante la medición del cociente lecitina: esfingomielina, el dosaje de fosfatidilglicerol
y el recuento de cuerpos lamelares.
La tasa de complicaciones de la amniocentesis es baja. La principal complicación es la
pérdida del embarazo, probablemente cercana al 0,5%. Otras complicaciones menos
frecuentes incluyen la pérdida transitoria de líquido amniótico y la corioamnionitis. Las
pacientes Rh negativas no sensibilizadas deben aplicarse una dosis de gamma-
globulina dentro de las 72 hs posteriores a la punción para evitar la sensibilización
materna.
1.3.2.2 Aspiración de vellosidades coriónicas o biopsia de placenta
La biopsia o aspiración de vellosidades coriónicas es el procedimiento de elección
para el diagnóstico prenatal de trastornos genéticos durante el primer trimestre.
Inicialmente la toma de la muestra se realizó por vía transvaginal, técnica que ha sido
reemplazada paulatinamente desde la década de los noventa por la punción
transabdominal
La principal indicación de la biopsia de vellosidades coriónicas es el embarazo con
riesgo aumentado para anomalías de cromosomas o para anomalías génicas, similar a
las indicaciones de la amniocentesis. El procedimiento puede realizarse a partir de las
11 semanas de amenorrea y extenderse hasta avanzado el tercer trimestre.
Los riesgos del procedimiento son similares a los de la amniocentesis, con una tasa de
pérdidas de embarazo del 0,5-1 %. Las pacientes Rh negativas no sensibilizadas
deben recibir una dosis de gamma-globulina luego del procedimiento. Debido a una
potencial asociación entre defectos de transversos de miembros, la aspiración de
vellosidades coriónicas no debe realizarse en edades gestacionales menores a 10
semanas.
1.3.2.3 CordocentesisLa extracción de sangre directamente de la vena umbilical tiene como principal
indicación la medición directa de la hemoglobina y el hematocrito fetal en fetos con
sospecha de anemia fetal severa en los embarazos con isoinmunización Rh. En los
trastornos plaquetarios fetales el análisis de la sangre fetal puede ser útil para la
evaluación plaquetaria en cuanto a su cantidad y funcionalidad, como por ejemplo en
la púrpura trombocitopénica autoinmune (PTI) y en la púrpura trombótica alloinmune.
En casos de sospecha de infección fetal por toxoplasmosis, CMV o rubéola, en sangre
fetal puede aislarse directamente el agente infeccioso (toxoplasmosis) o buscar
anticuerpos IgM específicos. La mayoría de estas indicaciones han sido reemplazadas
en la actualidad por estudios moleculares en líquido amniótico.
Además de las indicaciones diagnósticas, la cordocentesis tiene claras indicaciones
terapéuticas, como la transfusión sanguínea intrauterina en los fetos con anemia
severa. También se usa para la administración de drogas como fentanilo y vecuronio
para lograr analgesia y parálisis fetal antes de procedimientos terapéuticos
intrauterinos, como transfusiones, toracocentesis, pericardiocentesis, colocación de
catéteres de derivación pleuroamniótico o vesicoamniótico, etc.
La cordocentesis puede realizarse en forma confiable a partir de las 18 semanas. El
riesgo de pérdidas fetales asociado a la cordocentesis varía ampliamente de acuerdo
a la indicación del estudio. Por ejemplo, el riesgo es mayor si la indicación del estudio
es por anomalías fetales severas o hidrops fetal. Se estima que para operadores
entrenados las pérdidas fetales atribuibles a la punción serían de alrededor de 1 a 2%.
1.3.2.4 Otros procedimientos diagnósticos prenatales
De acuerdo a la situación clínica, puede ser necesario tomar muestras de distintos
tejidos (por ejemplo, músculo, piel e hígado) o de distintas cavidades o
compartimientos (por ejemplo, ascitis, árbol urinario, quiste de ovario, hidrotórax,
derrame pericárdico, lesiones quísticas pulmonares y abdominales, higroma quístico)
tanto con fines diagnósticos o terapéuticos. Los riesgos de estos procedimientos son
en general similares a los referidos para cordocentesis, siendo mayores en casos de
anomalías fetales severas, retardo de crecimiento e hidrops fetal.
2 – RESULTADOS CITOGENÉTICOS EN DIAGNÓSTICO PRENATAL
La citogenética clínica es el estudio de los cromosomas, su estructura, y su modo de
herencia, aplicada a la práctica de la genética médica. Las anomalías cromosómicas
se observan en aproximadamente el 1 % de los recién nacidos (Tabla 9), en más del
50 % de los abortos de primer trimestre y en el 6 % de las muertes intrauterinas.
Además, son la causa de un gran porcentaje de malformaciones congénitas y retraso
madurativo en la infancia.
Tabla 9: Anomalías cromosómicas en recién nacidos
Anomalía cromosómica Frecuencia en recién nacidosTranslocación balanceada
Translocación no balanceada
Trisomía 21
Trisomía 18
Trisomía 13
47,XXY
47,XYY
47,XXX
45,X
1 en 500
1 en 2000
1 en 700
1 en 3000
1 en 5000
1 en 1000 varones
1 en 1000 varones
1 en 1000 mujeres
1 en 3000 mujeres
2.1 - CARIOTIPO
El estudio “gold standard” de la citogenética prenatal es el cariotipo de bandeo G
(Figura 2).
Figura 2: Cariotipo euploide masculino: 46,XY
Para realizar un cariotipo la célula debe estar en división celular. Por lo tanto, se
puede usar cualquier tejido que tenga células nucleadas que sean capaces de crecer y
dividirse en cultivo.
2.1.1 Cariotipo prenatal en vellosidades coriónicas
Las vellosidades coriónicas están compuestas por una capa externa de células
trofobláticas (citotrofoblasto), que se dividen espontáneamente, y una capa interna de
células mesenquimáticas que forman el core mesodérmico (Figura 3).
Figura 3: Componentes celulares de una vellosidad coriónica
A partir del cultivo de una muestra de vellosidades se pueden obtener tres resultados
distintos::
- DIRECTO de células trofoblásticas
- CULTIVO: Corto plazo: de células trofoblásticas. Como se dividen
espontáneamente, se obtiene un número de
células adecuado para el análisis en menos
tiempo que el largo plazo.
Largo plazo: de células mesenquimáticas.
La constitución cromosómica de las células mesenquimáticas es más representativa
del cariotipo fetal que el de las células trofoblásticas, porque las primeras tienen un
origen embriológico más cercano a las células del macizo celular interno que va a dar
origen al embrión. En la tabla 10 pueden observarse las principales características del
estudio directo y de los cultivos a corto y largo plazo a partir de una muestra de
vellosidades coriónicas.
Tabla 10: Características del estudio en vellosidades coriónicas.
Tiempo del resultado
Tipo de células
ResoluciónContaminación
maternaMosaicismo
Directo 48 hs. citotrofoblasto + + muy baja
Cultivo a corto plazo
7-10 días citotrofoblasto ++ + +++
Cultivo a largo plazo
15-20 días mesénquima +++ +++ +
2.1.2 Cariotipo prenatal en líquido amniótico
La muestra obtenida por amniocentesis también se cultiva, con un tiempo entre la
obtención de la muestra y la entrega del resultado de aproximadamente 3 semanas. El
líquido amniótico obtenido posee una mezcla de células amnióticas y células
descamadas de la piel del feto, y en menor proporción del sistema gastrointestinal y
respiratorio fetal. Estas células reflejan estrechamente la constitución cromosómica del
feto y por lo tanto el cultivo de células de líquido amniótico es de gran utilidad para
aclarar el grado de compromiso fetal ante la presencia de un mosaicismo obtenido en
vellosidades coriónicas.
2.3 – CERTEZA DEL DIAGNÓSTICO CITOGENÉTICO PRENATAL
El cariotipo fetal a partir de una muestra de vellosidades coriónicas o de líquido
amniótico tiene una certeza superior al 99,5 %. El principal problema que puede surgir
en este contexto de un resultado citogenético prenatal es que el resultado del cariotipo
no refleje la constitución cromosómica real del feto. En consecuencia la información
que se le brindará a los padres en cuanto a diagnóstico y pronóstico será incorrecta. El
resultado citogenético prenatal lo podemos agrupar en cariotipo NORMAL, cariotipo
ANORMAL, o cariotipo de SIGNIFICADO INCIERTO. La certeza del estudio va a
depender en primer lugar de la experiencia del citogenetista y del laboratorio, y en
segundo lugar del tipo de muestra evaluada.
2.3.1 Resultado normal Si el resultado citogenético prenatal es normal significa que el cariotipo fetal es
euploide sin anomalías estructurales, con complemento cromosómico sexual normal:
46, XX ó 46,XY. La certeza en vellosidades coriónicas depende del tipo de cultivo. Si
se realizó cultivo de corto y largo plazo, y ambos fueron informados como normales, la
probabilidad descripta de que el feto tenga una anomalía de cromosomas es inferior al
0,08 %. Si sólo se realizó cultivo de corto plazo, la probabilidad de discrepancia es
mayor, de alrededor de 0,4 %.
Las razones por las que se explica un resultado “falso negativo” (cariotipo normal en
vellosidades coriónicas y anormal en el feto) pueden ser variadas: mosaicismo de bajo
grado en la placenta con línea celular única anormal en el feto; fenómeno de no
disyunción mitótica en una célula del macizo celular interno (a partir del cual se forma
el embrión); contaminación de la muestra con células maternas y por lo tanto, análisis
de células maternas y no fetales; fenómeno del “gemelo evanescente”, donde se
obtiene material de un lugar de la placenta que habría correspondido a otro embrión
producto de un embarazo dicigota que se detuvo muy temprano. La recomendación
actual internacional para el manejo de muestras de vellosidades coriónicas es realizar
siempre cultivo de corto y largo plazo.
Si la muestra es de líquido amniótico, la posibilidad de un resultado “falso negativo” a
partir de una muestra de líquido amniótico es muy baja, de alrededor de 0,02 %.
2.3.2 Resultado anormal Si el resultado citogenético prenatal es anormal significa que el cariotipo fetal tiene una
anomalía cromosómica numérica (trisomía, monosomía poliploidía, polisomía), o una
El MLPA es una técnica molecular basada en PCR que amplifica y cuantifica
secuencias específicas de ADN (secuencias “target”). Determina cambios en el
número de copias de hasta 45 secuencias de ADN a la vez en una misma muestra.
Tiene mayor resolución que el cariotipo convencional y el FISH, ya que puede
discriminar secuencias que difieren en un solo nucleótido; obteniendo el resultado en
24-48hs. Esta técnica molecular requiere muy poca cantidad de ADN (20 – 500 ng), es
más sencilla que QF-PCR, permite el manejo automatizado de las muestras, y puede
procesar hasta 96 muestras por ciclo. Puede utilizar ADN parcialmente degradado,
como el que se obtiene de muestras en parafina o formol.
El MLPA en diagnóstico prenatal se utiliza para el diagnóstico rápido de aneuploidías.
También se han desarrollado “kits” con sondas para la evaluación de secuencias
subteloméricas, centroméricas, y regiones involucradas en síndromes de
microdeleción y microduplicación. Los cambios en el número de copias de secuencias
subteloméricas pueden sugerir la presencia de translocaciones desbalanceadas,
cuando se observa pérdida de una región subtelomérica de un cromosoma, y ganancia
en otro. Así mismo, las sondas teloméricas y centroméricas son útiles en la evaluación
de cromosomas marcadores. En casos de enfermedades monogénicas, se puede
utilizar MLPA si se conoce la mutación familiar.
El MLPA como técnica RAD tiene una sensibilidad cercana al 100% y una
especificidad de 99,8% para las aneuploidías no mosaico evaluadas. Dentro de las
desventajas descriptas, no detecta todos los casos de triploidías, no diagnostica
anomalías estructurales balanceadas, y no diferencia contaminación con células
maternas. Con respecto al mosaicismo, todavía no se sabe realmente cuál es la
capacidad diagnóstica del MLPA, pero algunos estudios describen que puede detectar
mosaicismos superiores al 20-30%. Se ha descripto una discordancia entre resultados
del MLPA y cariotipo de bandeo G de alrededor del 0,6% de anomalías detectadas por
el cariotipo, distintas a las aneuploidías numéricas de los cromosomas evaluados.
3.4 ARRAY CITOGENÉTICO
El array citogenético o cromosómico (o microarray) es una técnica molecular que
aplicada al diagnóstico prenatal permite evaluar en una muestra de ADN fetal la
ausencia o duplicación de regiones de ADN. Estas variaciones en la cantidad de ADN
se denominan CNV (copy number variants o variación en el número de copias). Las
CNV son regiones del ADN generalmente superiores a 1 Kb (1000 pb) que están
presentes en un número de copias anormal en comparación con un genoma de
referencia.
Esta técnica supera algunas de las limitaciones del cariotipo, como son el tiempo y la
resolución de la citogenética convencional, y es capaz de evaluar prácticamente todo
el genoma. Detecta anomalías de 150 Kb, pero podría detectar, según el diseño,
variaciones en secuencias de 20 a 50 Kb, o sea, tiene una resolución 100 veces mayor
que el cariotipo, y el resultado está disponible en 48 a 72 hs, ya que no necesita
invariablemente cultivo celular. El ADN se puede extraer de la muestra sin procesar, o
de cultivo.
3.4.1 Tipos de arrayExisten distintos tipos de array. Los que se usan en diagnóstico prenatal son los arrays
genómicos, que a su vez se subdividen en dos clases de acuerdo a la técnica que
usan para evaluar el ADN: array-CGH (array comparative genome hybridization) y
SNP-array (single nucleotide polymorphism array). En la actualidad, también existen
arrays que combinan ambos tipos en una sola plataforma.
3.4.1.1 Array-CGH
En el array-CGH se compara la cantidad de ADN normal (control) de secuencias
conocidas contra el ADN de la muestra que se quiere analizar. Un programa de
computación analiza si en la muestra existe exceso de ADN en determinada/s
secuencia/s o si existe déficit (deleción) en relación al ADN control (Figura 10)
Figura 10: Trisomía 21 diagnosticada por Array-CGH. Se observa un exceso de ADN
del paciente en las secuencias correspondientes a regiones del cromosoma 21,
comparadas contra el ADN normal
El array-CGH se puede construir utilizando secuencias originadas en clones
bacterianos: son los BAC- arrays, o secuencias cortas, los oligonucleótidos:
BAC-array (bacterial artificial chromosome): con secuencias entre 150 a 170 kb
Oligoarray : con secuencias de oligonucleótidos tan pequeñas como de 20 a 50 pb
A su vez, la cantidad de secuencias se determina de acuerdo a los segmentos del
genoma que se quiere investigar. Existen dos diseños:
Targeted array : diseñados para detectar partes del genoma asociadas a síndromes
conocidos o genes asociados a patología. Va a incluir sólo la cantidad de
patologías que se quiera evaluar. Por lo tanto, va a detectar la mayoría de las CNV
clínicamente significativas, disminuyendo resultados de significado incierto. El
riesgo es no detectar secuencias asociadas a patologías no evaluadas por el array.
Necesita actualización a medida que se descubren síndromes nuevos.
Whole genome array : evalúa prácticamente todo el genoma. Puede incluir millones
de secuencias. Detecta mayor cantidad de CNV asociadas a patología (mayor
resolución), pero también mayor porcentaje de resultados de significado incierto.
Una de las ventajas es que no se necesita agregarle secuencias para actualizarlo.
Las CNVs se clasifican en tres grupos: benignas, patogénicas, o de significado
incierto. Algunos laboratorios subdividen a las benignas en normales y benignas. La
interpretación del significado de las CNV se basa fundamentalmente en la experiencia
de casos postnatales.
Benignas : Se ha detectado en cantidades iguales en pacientes y controles.
Corresponde al 0,4 % del origen de la variación genética
Patogénicas: Contiene genes asociados a patología
Contiene genes sensibles a la dosis
CNV asociadas a síndromes de microdeleción/ duplicación CNV asociadas a síndromes de anomalías de cromosomas
De significado incierto: Hasta el momento no se ha determinado su valor
o la información es insuficiente para sacar
conclusiones válidas
Algunos laboratorios sugieren no informar las CNVs de significado incierto; otros
laboratorios interrogan a la pareja sobre su deseo de obtener este tipo de información.
El asesoramiento predictivo de la probabilidad de que una CNV sea patogénica y que
resulte en una anomalía en el fenotipo depende de algunas variables:
- Tamaño de la CNV
- Contenido de genes
- Revisión de la literatura
- Revisión de las bases de datos (UCSC, DECIPHER, ISCA, dbGAP,
EUCARUCA, Ensembl)
- Menos importante: ecografía, antecedentes familiares, herencia.
En general, si la CNV son superiores a 1 Mb de largo, involucran regiones con genes,
o si la CNV es “de novo” tiene mayor probabilidad de causar patología. En la mayoría
de los laboratorios, junto con la muestra de ADN fetal se solicita una muestra de
sangre para extracción de ADN de los padres, para descartar contaminación con
células maternas, y para interpretar si un hallazgo es heredado o no. Hoy en día se
sabe que la determinación de la herencia de una CNV no tiende a ser informativa en la
mayoría de los casos individuales debido a la posibilidad de expresividad variable y
penetrancia incompleta de ciertas CNVs. También es una práctica habitual almacenar
material para cultivo o realizar un cultivo paralelo, para confirmar cualquier CNV
detectada utilizando otra técnica como FISH, MLPA o array.
3.4.1.2 SNP-array
El SNP-array utiliza dos tipos de sondas: SNPs y secuencias no polimórficas (CNP:
non polymorphic copy number probes). Mediante esta técnica se puede evaluar si
existe hay pérdida o ganancia de material, por un lado, y detectar además regiones
con pérdida de la heterocigocidad (para diagnóstico de disomía uniparental, mola
completa y consanguinidad)
El método de array presenta una tasa de detección de anomalías citogenéticas
superior al cariotipo convencional. A su vez, como hemos dicho, la resolución es 100
veces mayor. En la mayoría de los estudios publicados el array detectó 3,6% mayor
cantidad de anomalías cromosómicas que el cariotipo convencional; con 1,1% de
CNVs de significado incierto. El cariotipo no detectó anomalías cromosómicas cuando
el array fue normal. Más aún, si la indicación para realizar el array era por
malformaciones ecográficas, la tasa de detección se incrementa aún más, en el orden
de 5,2%, con 1,9% de CNVs de significado incierto.
Hasta el momento, no hay un diseño de array ideal para diagnóstico prenatal. La
mayoría de los laboratorios usan array-CGH con oligonucleótidos, o una combinación
de SNP-array con oligonucleótidos. El número, tamaño y espaciado de las sondas,
tanto en las zonas con genes como en las zonas entre genes, determina el tamaño de
las CNVs que pueden ser detectadas y la tasa de detección de anomalías. El ideal
sería diseñar un array que equilibre la detección de la mayor cantidad de CNVs
patogénicas, minimizando las CNVs de significado incierto. Sería útil contar con más
de un tipo de plataforma, de acuerdo a la indicación del estudio. Por ejemplo, si la se
solicita el array por hallazgos ecográficos, existiría más chance de detectar una CNV y
por lo tanto, sería mejor elegir un array con alta densidad de sondas; en cambio, si la
indicación es edad materna o ansiedad parental, sería más apropiado elegir una
plataforma targeted o con menor densidad de sondas.
3.4.2 Ventajas del Array en diagnóstico prenatal en relación al cariotipo convencional:Los beneficios del array en diagnóstico prenatal son:
1. Diagnostica TODAS las anomalías cromosómicas no mosaico no balanceadas
que diagnostica el CARIOTIPO de bandeo G
2. Mayor resolución: Mayor tasa de detección de anomalías citogenéticas
3. Menor tiempo para obtener un resultado
4. Automatizado
3.4.3 Potenciales Indicaciones del Array:
En la evaluación genética postnatal de neonatos o niños con retraso madurativo,
malformaciones múltiples, o alguna manifestación del espectro del autismo, se usa el
array como primera herramienta diagnóstica.
En diagnóstico prenatal el array está transitando un camino hacia la práctica clínica.
Uno de los problemas en diagnóstico prenatal es que el fenotipo del feto es incompleto
o incierto. La literatura disponible sobre CNV y su impacto está basada en el
reconocimiento postnatal de un fenotipo anormal, quizás sesgado hacia el extremo
más severo de la patología. La recomendación del Colegio Americano de Ginecología
y Obstetricia y del Colegio Americano de Genética Médica es ofrecer el array en los
embarazos con anomalías ecográficas fetales y cariotipo normal, y frente a una muerte
fetal donde no es posible realizar cariotipo.
Las indicaciones del array en diagnóstico prenatal podrían ser:
La evaluación de un embarazo con una o múltiples anomalías ecográficas con
cariotipo normal, ya que el array aumenta la tasa de detección de anomalías.
Interpretación de resultados de significado incierto de un cariotipo convencional,
como por ejemplo frente al diagnóstico de cromosomas marcadores. En estos
casos ayuda a determinar el origen y contenido génico de los cromosomas
supernumerarios.
La evaluación de las translocaciones balanceadas “de novo” detectando o no
CNVs en el sitio de ruptura de los segmentos translocados, no diagnosticadas con
técnicas de menor resolución.
En los casos de muerte intrauterina, existe mayor probabilidad de obtener un
resultado citogenético con array ya que es una técnica que no necesita
invariablemente cultivo celular. Es sabido que en los casos de muerte intrauterina,
y principalmente si el feto tiene cierto grado de maceración, existe mayor riesgo de
fracaso del cultivo.
Análisis de ADN de muestras embebidas en parafina.
3.4.4 Limitaciones del array en diagnóstico prenatal Ningún diseño de array detecta anomalías estructurales balanceadas. Si bien esta
situación no es clínicamente relevante en diagnóstico prenatal ya que no va a
producir una anomalía en el fenotipo, sí es importante para el asesoramiento de
generaciones futuras y otros miembros de la familia. En algunos casos una
translocación balanceada tendrá consecuencias por disrupción de genes en el sitio
de ruptura de los segmentos involucrados, sin ganancia ni pérdida de material
genético.
No diagnostican la localización de los segmentos duplicados y/o delecionados.
Por ejemplo, no distingue entre la duplicación de un segmento por translocación
desbalanceada de la producida por trisomía libre.
Con respecto al array-CGH:
No detecta triploidía
No detecta tetraploidía
Diagnostica mosaicismo sólo si la segunda línea celular está en una proporción de
20 a 30 % o más.
Con respecto al SNP-array:
No detecta tetraploidía
Diagnostica mosaicismo sólo si la segunda línea celular está en una proporción
superior al 15%
3.4.5 Problemas del uso del array en diagnóstico prenatal
Uno de los problemas más frecuentes en la utilización del array en diagnóstico
prenatal es la detección de CNVs de significado incierto. Cuanta más experiencia
acumulen los laboratorios sobre el tema, esta situación va a ocurrir con menor
frecuencia ya que muchas serán recategorizadas en benignas o patogénicas.
Otra situación difícil es la observación de CNV que pueden producir un amplio
espectro de patología en el fenotipo, desde leve a severa. El origen de esta
variabilidad en la afectación está dada principalmente, por la expresividad variable y/o
penetrancia incompleta de ciertos genes. En estos casos, es imposible predecir con
exactitud el compromiso del feto en cada caso en particular. De la misma complejidad
es el diagnóstico de CNVs asociadas a enfermedades de comienzo tardío, por ejemplo
aquellas asociadas con mayor predisposición a determinados cánceres.
Finalmente, cuando se utilizan SNP-array existe la posibilidad de diagnosticar
consanguinidad y paternidad alterna.
3.5 CONCLUSIÓN
La rapidez con que se desarrollan las técnicas moleculares muchas veces no se
acompaña con la misma velocidad de la evidencia de beneficio clínico para introducir
determinada técnica en la práctica clínica.
Uno de los desafíos más importantes en diagnóstico prenatal, no es aplicar la
tecnología disponible, sino interpretar los resultados en forma confiable y segura. Las
técnicas moleculares descriptas, como todo estudio genético prenatal, deben ir
siempre acompañadas de asesoramiento genético antes del estudio y luego del
resultado. Es importante recalcar que un resultado “NEGATIVO” no indica que la
patología no tiene origen “GENÉTICO”
La interpretación del resultado y el asesoramiento genético en el contexto de un
estudio de array son más complejo que en el ámbito de la citogenética clásica. Si bien
en algunos centros de diagnóstico prenatal de países desarrollados se utiliza el array
como primera herramienta de evaluación citogenética, luego de un procedimiento
invasivo independientemente de la indicación del estudio, todavía no hay una
recomendación formal de que sea un estudio de primera línea o que deba reemplazar
al cariotipo de bandeo G.
4 - DIAGNÓSTICO PRENATAL NO INVASIVO POR ANÁLISIS DE CÉLULAS Y ÁCIDOS NUCLEICOS FETALES EN SANGRE
MATERNA
4.1 GENERALIDADES
Tradicionalmente, el diagnóstico prenatal de anomalías cromosómicas o génicas
fetales se basa en obtener una muestra de material genético fetal utilizando estudios
diagnósticos invasivos (punción de vellosidades coriónicas, amniocentesis,
cordocentesis). Debido a que estos estudios están asociados con un pequeño riesgo
de pérdida de embarazo, desde hace años se buscan fuentes alternativas de material
fetal para evitar la punción y permitir realizar diagnóstico prenatal no invasivo (NIPD).
En la actualidad, el NIPD se refiere a la detección de anomalías genéticas fetales
utilizando material genético fetal obtenido de sangre materna, sin el riesgo asociado a
un procedimiento invasivo.
Inicialmente, la investigación estaba dirigida a aislar y evaluar células fetales, pero a
partir del año 1997, con el descubrimiento de ADN fetal libre en plasma materno, la
misma se concentró en el desarrollo de técnicas que involucraran la detección de
ácidos nucleicos fetales.
En la sangre de toda mujer embarazada se puede demostrar la presencia de genoma
fetal circulando en el interior de células fetales o en forma ácidos nucleicos libres (se
los denomina ácidos nucleicos libres debido a que no se los encuentra dentro de las
células, sino libres en el plasma materno).
4.2 CÉLULAS FETALES EN SANGRE MATERNA
En la sangre de mujeres embarazadas circulan células pertenecientes al embarazo de
distinto tipo (células trofoblásticas, linfocitos, neutrófilos y células nucleadas de la serie
roja) mezcladas con las células sanguíneas maternas. Luego de más de dos décadas
de investigación dedicada al NIPD utilizando células fetales se llegó a la conclusión de
que aislar estas células a partir de la sangre materna es técnicamente complicado: las
células fetales se encuentran en poca cantidad (1 célula fetal cada 107 células
maternas nucleadas); y pueden permanecer durante muchos años en el cuerpo de la
mujer luego de finalizado el embarazo (hasta 25-27 años luego del parto), interfiriendo
con el análisis de embarazos subsiguientes.
En el año 1991, se detectó por primera vez una anomalía cromosómica fetal (trisomía
18) en sangre materna aplicando FISH a células fetales en interfase. Utilizando la
misma técnica se logró, años más tarde, realizar NIPD de trisomía 21. A pesar de que
distintos grupos de investigadores lograron aislar células fetales y llegar al diagnóstico
de aneuploidía fetal, todos coinciden en que el procedimiento es muy complicado y,
hasta el momento, no se han logrado resultados consistentes. En la actualidad, el
enfoque más prometedor en esta área parecería involucrar el aislamiento y evaluación
de células trofoblasticas.
4.3 ÁCIDOS NUCLEICOS LIBRES EN SANGRE MATERNA
Los ácidos nucleicos fetales (ADN y ARN) circulan libremente en el plasma materno,
desde algunas semanas luego de la concepción, y desaparecen pocas horas luego del
parto debido a que tienen una vida media muy corta (aproximadamente 16 minutos). El
ADN libre en plasma materno es una mezcla de ADN materno y fetal, siendo en su
mayoría materno (Figura 11).
Figura 11: el ADN en sangre materna es una mezcla del ADN materno y fetal
El ADN fetal libre proviene de las células trofoblásticas (sinciotrofoblasto), y circula
como fragmentos cortos (largo promedio 143 pares de bases). Comienza a detectarse
en plasma materno desde aproximadamente la 5° semana de gestación, y su
concentración fraccional promedio aumenta con la edad gestacional (9-10% del total
de ADN en plasma materno en primer y segundo trimestre, a 20% en tercer trimestre,
pero es altamente variable entre embarazos). A partir de la 7° semana de gestación el
plasma materno contiene suficiente cantidad de ADN fetal libre como para ser
detectado mediante técnicas de NIPD. El ARN fetal libre es de origen fetal y
placentario, comienza a detectarse en plasma materno a partir de la sexta semana de
embarazo, y su concentración permanece constante a lo largo de la gestación.
Por estas características, parecería ser que el ADN fetal libre en plasma materno sería
la fuente más adecuada de material genético fetal para NIPD: puede detectarse
temprano en el embarazo y es específico de la gestación en curso. Dado que todo el
genoma fetal está representado en estas moléculas de ADN fetal libre circulantes,
teóricamente, cualquiera anomalía genética fetal podría ser detectada a través de
NIPD.
Uno de los factores limitantes para desarrollar tests prenatales basados en ADN fetal
libre es la dificultad en poder diferenciar el ADN fetal del materno (Figura 12). El
segundo obstáculo es que el ADN fetal representa sólo una pequeña cantidad,
alrededor del 10%, del ADN total circulante.
Figura 12: ADN fetal (celeste) mezclado con ADN materno (rojo). ADN fetal en menor
proporción que el materno.
Por este motivo, los primeros intentos de NIPD focalizaron la investigación en
secuencias de ADN fetal que no estuvieran presentes en el genoma materno (tanto
heredadas del padre como secuencias específicas del feto). Ejemplos de aplicación
clínica, son el NIPD de secuencias del cromosoma Y de fetos masculinos, o del gen
RHD fetal en mujeres Rh negativas. Esta perspectiva está cambiando rápidamente
con el desarrollo de tecnologías como la PCR digital o la “secuenciación masivamente
paralela” (MPS, massively parallel sequencing). Estas técnicas permitieron desarrollar
tests de NIPD para enfermedades monogénicas y aneuplodías, a pesar de que estén
presentes alelos o cromosomas maternos idénticos a los fetales.
Por lo tanto, NIPD puede utilizarse en la evaluación de anomalías génicas y
cromosómicas, así como también aplicarse al manejo de complicaciones del embarazo
(isoinmunización por Rh D). La determinación del genotipo RHD fetal de todas las
mujeres Rh D negativas podría convertirse en una práctica clínica de rutina en los
próximos años. Así mismo, otras complicaciones del embarazo, como la preclampsia,
el parto prematuro y la restricción de crecimiento intrauterino, han demostrado estar
asociadas con aumento de la concentración de ADN fetal libre, y quizás, en el futuro,
embarazos en riesgo puedan ser identificados a través de NIPD.
4.3.1 DETECCIÓN DE SECUENCIAS DE ADN ESPECÍFICAS DEL FETO EN PLASMA MATERNO:
La primera aplicación clínica de NIPD se relacionó con la detección de secuencias de
ADN específicas del feto no presentes en el ADN materno, como la determinación de
sexo o del gen Rh D fetal en embarazadas Rh negativas. Estas secuencias pueden
ser detectadas por medio de técnicas moleculares como la PCR convencional o PCR
en tiempo real. La presencia de secuencias del cromosoma Y o del gen Rh D en
sangre materna son interpretadas como provenientes del feto, ya que las mismas no
están presentes normalmente en el genoma materno.
4.3.1.1 Análisis de ADN fetal del cromosoma Y:
El diagnóstico prenatal de sexo fetal puede realizarse por ecografía, pero en el primer
trimestre es confiable sólo a partir de la semana 12-13 y es altamente dependiente de
la experiencia del operador.
La detección en plasma materno de secuencias de ADN exclusivas del cromosoma Y,
como el gen SRY (sex determining region Y), o la secuencia multicopia DYS14 dentro
del gen TSPY1 (testis specific protein, Y-linked 1), se utiliza en la actualidad en NIPD
de sexo fetal. Es un estudio prenatal que puede ser realizado desde la semana 7 de
edad gestacional usando PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR). Si en plasma
materno se detecta ADN del cromosoma Y, el feto es masculino (ya que el genoma
normal de una mujer embarazada no posee cromosoma Y). Por el contrario, si no se
detecta cromosoma Y se asume que el feto es femenino.
Una de las principales indicaciones clínicas para determinar sexo fetal a edades
gestacionales tempranas es en el contexto de enfermedades ligadas al sexo, como por
ejemplo hemofilia o distrofia muscular de Duchenne. En mujeres portadoras de
mutaciones de enfermedades con este tipo de herencia, los fetos masculinos son lo
que presentan riesgo de desarrollar la patología (o las manifestaciones más severas),
mientras que los fetos femeninos son considerados de bajo riesgo.
Otra situación clínica de aplicación de NIPD de sexo fetal donde es útil la identificación
temprana del sexo es para el manejo de patologías asociadas con el desarrollo de
genitales externos ambiguos, como la hiperplasia suprarrenal congénita (HSC). La
HSC es una enfermedad con herencia autosómica recesiva. La deficiencia en la
síntesis de cortisol resulta en sobreproducción de andrógenos. En fetos femeninos
afectados con HSC la exposición prenatal a un exceso de andrógenos puede producir
distintos grados de virilización de los genitales externos. Por lo tanto, existe la
recomendación actual que las embarazadas con riesgo de fetos afectados por HSC
reciban tratamiento con corticoides desde las semanas 6 - 7 de embarazo para reducir
el grado de virilización en fetos femeninos afectados. A partir de la semana 11 se
puede realizar biopsia de vellosidades coriónicas para diagnóstico de sexo fetal y
evaluar la presencia de las mutaciones de la enfermedad. El tratamiento iniciado con
corticoides se puede discontinuar en fetos masculinos o femeninos no afectados.
Como el NIPD de sexo fetal puede realizarse a partir de las 7 semanas de edad
gestacional, sólo las embarazadas con fetos femeninos deberían continuar el
tratamiento con corticoides y realizar un estudio invasivo, acortando el tratamiento
innecesario en fetos masculinos.
La determinación del sexo fetal por medio de ADN en plasma materno también puede
ser aplicada para clarificar ciertos hallazgos ecográficos, por ejemplo, confirmar el
sexo fetal si se identifican genitales ambiguos; o aportar información adicional en
patologías genéticas asociadas a “sex reversal” como la displasia campomélica.
Los resultados publicados sobre NIPD de sexo fetal con ADN fetal libre en plasma
materno describen una tasa de detección de 95% y una especificidad de 98, %, entre
7 y 12 semanas de edad gestacional, incrementándose a 99% y 99,6%,
respectivamente luego de las 20 semanas. Antes de las 7 semanas la sensibilidad es
baja (75%).
Este estudio presenta dos principales limitaciones: un 5% de fracaso del test, por lo
que se requiere repetir el estudio; y la posibilidad de falsos negativos, ya que los fetos
femeninos son identificados a través de un resultado negativo, que también puede
implicar insuficiente cantidad de ADN en la muestra. Una forma de solucionar este
último problema es utilizar marcadores fetales específicos, fuera del cromosoma Y,
para estar seguros de que hay suficiente cantidad de ADN fetal en la muestra.
El NIPD de sexo fetal se utiliza actualmente en la práctica clínica en algunos países El
estudio se debe realizar luego de la semana 7 de edad gestacional, y previamente
determinar que no sea un embarazo múltiple. Como la tasa de detección no es del 100
%, se recomienda realizar una ecografía luego de la semana 12 para confirmar el
resultado del NIPD.
4.3.1.2 Determinación del Rh D fetal:
El antígeno Rhesus D (Rh D) es un antígeno de superficie de células sanguíneas de la
serie roja. Aproximadamente el 15% de la población caucásica es Rh D negativa, o
sea no poseen el gen RHD que codifica al antígeno (dd). En una mujer embarazada
Rh D negativa la presencia de secuencias del gen RHD en plasma sugiere que el feto
es Rh D positivo.
Los fetos Rh D positivos de embarazadas Rh D negativas con inmunización previa
pueden desarrollar anemia por hemólisis prenatal y neonatal. En estos casos, es útil
determinar el estado Rh del feto mediante la determinación del genotipo RHD en ADN
fetal, ya que los fetos Rh D negativos no presentan riesgo de hemólisis y por lo tanto
realizar seguimiento estricto y estudios complementarios son innecesarios. Esta
muestra de ADN fetal puede obtenerse mediante biopsia de vellosidades coriónicas o
amniocentesis, con el riesgo asociado de pérdida de embarazo y la posibilidad de
incrementar la producción de anticuerpos maternos, y por lo tanto la hemólisis. En este
contexto es ideal, desde un punto de vista clínico, obtener la muestra mediante un
procedimiento prenatal no invasivo.
En el año 1998 se describió por primera vez la posibilidad de NIPD del genotipo RHD
fetal en mujeres Rh D negativas por medio del análisis de ADN fetal libre en plasma
materno. A partir de ese momento, numerosos estudios han evaluado la capacidad
diagnóstica de esta técnica. El NIPD de genotipo RHD fetal tiene una exactitud
diagnóstica de 94,8%. Así mismo, tres estudios de screening RHD fetal en mujeres Rh
D negativas realizados en Holanda, Inglaterra, y Alemania, describieron una tasa de
detección entre 99,799,8%, y una especificidad de 94-99 %. Los casos de falsos
positivos se debieron principalmente a falta de ADN fetal en la muestra de sangre
materna, y se pensó que podrían disminuirse utilizando marcadores fetales como
controles para demostrar que el plasma contiene ADN fetal.
Otra potencial aplicación de NIPD de genotipo RHD fetal en plasma materno es para
detectar las mujeres embarazadas Rh D negativas que se beneficiarían con profilaxis
con inmunoglobulina anti-Rh D: sólo las mujeres Rh D negativas con fetos Rh D
positivos son las que presentan riesgo de isonmunización, y por lo tanto necesitan
profilaxis. Esta estrategia reduciría costos ya que evitaría administrar
innecesariamente inmunoglobulina a 38% de mujeres Rh D negativas con fetos Rh D
negativos.
En la actualidad, NIPD de genotipo RHD fetal es una técnica que se encuentra
disponible en la práctica clínica en varios centros del mundo.
4.3.2 DIAGNÓSTICO PRENATAL NO INVASIVO DE ENFERMEDADES MONOGÉNICAS
Los primeros intentos de lograr NIPD de enfermedades monogénicas fueron en
familias con patologías con herencia autosómica dominante donde el padre era el
afectado. En estos casos, el padre es portador de una mutación que le produce, en
mayor o menor medida, manifestaciones de la enfermedad; mientras que la madre
posee sus dos alelos normales, y por lo tanto es sana. La detección (o no) de la
mutación paterna en plasma materno permite confirmar (o excluir) que el feto haya
heredado la mutación (y por lo tanto la enfermedad), ya que es imposible que ese ADN
mutado provenga de la madre. El NIPD de enfermedades dominantes con herencia
paterna, o si la mutación fetal era “de novo”, ha sido aplicado con éxito utilizando
técnicas como PCR en distrofia miotónica, QF-PCR en enfermedad de Huntington,
PCR seguida de RFLP (restriction fragment length polymorphism) en acondroplasia,
entre otras.
Mucho más complejo es evaluar si el feto ha heredado una mutación materna, como
en enfermedades de herencia autosómica recesiva, o dominantes donde la madre es
portadora de la mutación, debido a la dificultad para distinguir si una secuencia de
ADN circulante proviene de la madre o del feto. Uno de los principales obstáculos es
la gran cantidad de ADN materno libre en plasma, comparado con la poca cantidad de
ADN fetal.
En relación a las enfermedades recesivas, los primeros intentos se basaron en
descartar que el feto haya heredado la mutación paterna, en situaciones donde las
mutaciones parentales eran distintas. El razonamiento se basa en que si el feto ha
heredado el alelo paterno mutado, la probabilidad de heredar el alelo materno mutado,
y por lo tanto, la patología, es del 50%. En estos casos, se puede ofrecer un estudio
de diagnóstico prenatal invasivo para evaluar los alelos fetales. Por el contario, si en
plasma materno no se detecta el alelo paterno mutado, el feto sería no afectado.
Lo y colaboradores desarrollaron dos estrategias para aplicar
Existen dos estrategias en el estudio prenatal de enfermedades autosómicas recesivas
y para determinar si el feto ha heredado la mutación paterna. En familias donde los
progenitores son portadores de mutaciones distintas (el feto sería heterocigota), se
propuso determinar marcadores polimórficos o SNPs (polimorfismos de nucleótido
único, secuencias de ADN que difieren en un nucleótido) asociados a las mutaciones
parentales para diferenciar los alelos. La identificación en plasma materno de SNPs
asociados a un determinado alelo permite inferir si el feto ha heredado ese alelo y por
lo tanto, deducir si manifestará o no la enfermedad. El problema de esta estrategia es
la cantidad de SNPs que hay que evaluar para que el estudio sea informativo, y la
necesidad de evaluar más miembros de la familia para asociar SNPs con alelos. Esto
ha sido aplicado a enfermedades como la beta-talasemia y la hiperplasia suprarrenal
congénita.
Para extender la evaluación a enfermedades recesivas donde ambos progenitores son
portadores de la misma mutación, y por lo tanto es imposible diferenciar en plasma
materno si la secuencia es de la madre, o del feto heredada del padre, o ambas, se
desarrolló una estrategia cuantitativa denominada “dosis relativa de la mutación”
(relative mutation dosage, RMD). Para que sea posible aplicarla, la madre debe ser
heterocigota para la mutación del locus en evaluación (las secuencias de los alelos
deben ser distintas: un alelo mutado y otro normal). En este contexto, para un gen en
particular, tanto el padre como la madre tienen cada uno un alelo mutado idéntico y un
alelo normal. La estrategia de RMD compara las cantidades relativas del alelo normal
y del mutado en plasma materno, sin determinar si el origen es materno o fetal, sólo
determina cantidad de secuencias. Para RMD se utiliza PCR digital, que es una
técnica molecular cualitativa y cuantitativa. La máquina de PCR digital realiza cientos a
miles de ciclos de PCR al mismo tiempo, donde en cada ciclo se analiza una molécula
única de ADN. De esta forma, se determina, no sólo la presencia de una secuencia
determinada, sino la cantidad de secuencias contando la cantidad de reacciones de
PCR positivas. Si se fabrica un “kit” de PCR con primers para un conjunto de
mutaciones y secuencias normales de un gen a estudiar, se puede cuantificar tanto
secuencias mutadas como normales, y luego pueden comparar las cantidades
relativas de cada secuencia. Por ejemplo, si tanto una mujer embarazada como el feto
son heterocigotas para la mutación (un alelo mutado y uno normal), debe haber
cantidades iguales de secuencias de ADN con la mutación y secuencias normales.
Pero si el feto es homocigota porque heredó el otro alelo mutado del padre
(recordemos que las mutaciones de los progenitores son idénticas), habrá
proporcionalmente (no cantidades absolutas) en plasma materno más copias del alelo
mutado que de el normal. Por el contario, si el feto no heredó ninguna mutación (sus
dos alelos son normales) habrá más secuencias normales que con la mutación. Su
utilidad ha sido demostrada en el estudio de la beta-talasemia aplicando PCR digital
para una cantidad determinada de mutaciones y secuencias normales del locus de la
beta-globina (HBB). De la misma forma, se podría aplicar RMD al estudio de
enfermedades dominantes heredadas de la madre.
Por lo descripto, se podría aplicar NIPD para, prácticamente, cualquier enfermedad
monogénica de herencia autosómica recesiva o dominante, mediante la evaluación de
ADN en plasma materno. En la actualidad, esto se realiza en forma clínica pero en
laboratorios seleccionados comprometidos con la investigación en esta área.
4.3.3 DIAGNÓSTICO PRENATAL NO INVASIVO DE ANOMALÍAS CROMOSÓMICAS:
La evaluación de anomalías cromosómicas es la indicación más frecuente para
realizar un procedimiento de diagnóstico prenatal invasivo. Debido a que estos
procedimientos están asociados con un riesgo de pérdida de embarazo, sería ideal
lograr el NIPD de aneuploidías utilizando ADN fetal libre en plasma materno. Sin
embargo, existen dos aspectos que dificultan esta tarea: la gran cantidad de ADN
materno circulante interfiere con el análisis de ADN fetal; y la complejidad de
determinar la cantidad de cromosomas del feto, ya que el ADN fetal circulante está
mezclado con el materno. Se han desarrollado varias estrategias para superar estas
dificultades. Las dos principales incluyen la identificación en plasma materno de
secuencias específicas del feto, y la utilización de técnicas de cuantificación de
moléculas.
4.3.3.1 Análisis de secuencias de ácidos nucleicos específicas del feto:
El análisis de secuencias de ácidos nucleicos de un cromosoma específicas del feto
en plasma materno, o sea que no están presentes en genoma materno, permite
identificar ese cromosoma. De esta forma el ADN materno circulante no interferiría con
la evaluación del ADN fetal. Se han utilizado secuencias de ARNm expresado sólo por
la placenta, o secuencias con cambios epigenéticos específicas de la placenta, ambas
originadas en el cromosoma de interés.
Un ejemplo de cambio epigenético es la metilación del ADN, que está asociada con la
regulación de la expresión génica. La metilación del ADN se refiere a la presencia de
un grupo metilo en el carbono 5´de un nucleótido de citosina que precede a un
nucleótido de guanina. Como cada tejido tiene un perfil propio de expresión génica,
determinado en gran parte por este mecanismo, la metilación de ciertos genes también
difiere en los tejidos. Por lo tanto, una forma de identificar el ADN fetal es buscar
secuencias de ADN de genes que difieren en su estado de metilación entre el tejido
placentario (de donde proviene el ADN fetal libre circulante) y las células sanguíneas
maternas (de donde proviene el ADN materno libre circulante): por ejemplo,
secuencias de ADN idénticas en la madre y en el feto, pero metiladas sólo en el feto.
Ejemplos de secuencias de ácidos nucleicos fetales específicas del feto son: ARNm de
“PLAC4” (placenta-specific 4)y ARNm de “c21orf105” (chromosome 21 open reading
frame 105), ambos del cromosoma 21; ARNm de “SERPINB2” (serpin peptidase
inhibitor,clade B (ovalbumin), membrane 2), “SERPINB5” hipometilado, ambos del
cromosoma 18; y “HLCS” hipemetilada (holocarboxilasa sintetasa) del cromosoma 21.
Una vez identificadas las secuencias del feto hay que evaluar la cantidad de las
mismas para inferir el número de copias del cromosoma de origen (euploide, trisomía
o monosomía).
Cuantificación por “Proporción de alelos”
Una forma de cuantificación de cromosomas es utilizar la “proporción de alelos”
(“allelic ratio”). Esta estrategia consiste en determinar las cantidades relativas de cada
alelo (para cada secuencia, los alelos deben ser distintos, o sea el feto debe ser
heterocigota para el locus en estudio). Un ejemplo de la estrategia “ARN-SNP”
comprende la determinación en plasma materno de la proporción entre los alelos del
ARNm del PLAC4 localizado en el cromosoma 21. Recordemos que este ARNm no se
expresa en la madre, por lo tanto todas las secuencias de PLAC4 en plasma materno
son sólo de origen placentario (fetal). La mayoría de los fetos son heterocigotas para
PLAC4, por lo tanto sus dos cromosomas 21 tienen cada uno un alelo diferente. Si un
feto es euploide para el cromosoma 21 (2 copias), las cantidades relativas de ambos
alelos de PLAC4 deben ser aproximadamente iguales. Por el contrario, si el feto es
portador de una trisomía 21 (3 copias: 2 alelos iguales y uno distinto) uno de los alelos
va a observarse en mayor cantidad relativa que el otro. Se demostró que esta
estrategia tenía una sensibilidad de 90% y una especificidad de 96,5%. De la misma
forma se aplicó NIPD de trisomía 18 a través del análisis de la proporción de alelos
del ARNm de SERPINB2.
La principal desventaja de esta estrategia de “proporción de alelos” es que sólo puede
aplicarse a la evaluación de fetos heterocigotas para la secuencia evaluada. Por lo
tanto, es necesario evaluar más de una secuencia por cromosoma de modo de que el
feto sea heterocigota para uno o más marcadores evaluados, y por lo tanto poder
aplicar la técnica a toda la población.
Cuantificación por “Proporción epigenética-genética”
Otra estrategia para la determinación de cantidad de cromosomas se denomina
“proporción epigenética-genética” (EGG). Se elige un marcador epigenético fetal
específico derivado de un cromosoma potencialmente aneuploide, por ejemplo HLCS
del cromosoma 21, y un marcador genético fetal específico de otro cromosoma, para
normalizar la dosis cromosómica. El marcador genético fetal podría pertenecer al
cromosoma Y para fetos masculinos, o podría ser un alelo polimórfico de herencia
paterna. La ventaja de EGG es que no necesita secuencias polimórficas en el
cromosoma aneuploide. Sin embargo, se necesitan aun estudios de mayor escala para
confirmar su eficacia diagnóstica.
4.3.3.2 Cuantificación molecular de secuencias de ADN del cromosoma 21 en plasma
materno
El reciente desarrollo de técnicas moleculares de cuantificación de moléculas
individuales de ADN permite detectar anomalías cromosómicas fetales en plasma
materno sin tener que limitar el estudio a secuencias de ácidos nucleicos específicas
del feto. Ejemplos de estas técnicas son la PCR digital y secuenciación masivamente
paralela o MPS, que permiten la cuantificación de secuencias de ácidos nucleicos
contando cada molécula individual, y con un nivel de precisión superior a la PCR
convencional. Por este método se determina la proporción de ADN en plasma que
corresponde a un cromosoma en particular, y a esta proporción se la identifica como
la dosis cromosómica fetal. Se supone que la proporción relativa de moléculas de ADN
que se originan en un determinado cromosoma, por ejemplo, cromosoma 21, es
constante en embarazos euploides. El valor debería reflejar la representación
genómica del cromosoma 21 en embarazos normales. Por otro lado, si una mujer está
embarazada de un feto con trisomía 21, la cantidad proporcional de moléculas de ADN
en plasma que se originan en el cromosoma 21, se incrementa. El incremento relativo
del contenido de ADN del cromosoma 21 en plasma materno debería ser del 50% del
contenido fraccional de ADN fetal de ese cromosoma (Figura 13). El inconveniente, es
que la modificación en la cantidad de ADN es generalmente pequeña y depende de la
concentración fraccional de ADN fetal circulante.
PCR digital La estrategia se denomina “dosis cromosómica relativa”, donde se compara la
cantidad de moléculas de ADN provenientes de un cromosoma aneuploide, (por
ejemplo el cromosoma 21) en plasma materno, con la cantidad de moléculas de ADN
de otro cromosoma de referencia. La proporción de secuencias del cromosoma 21
debe ser mayor que la de secuencias del cromosoma de referencia, y el grado de
incremento está relacionado con la concentración de ADN.
Figura 13: Proporción de oléculas de ADN fetal en sangre materna en un feto normal y
uno con trisomía 21
Secuenciación cuantitativa
Se demostró que se puede realizar NIPD de trisomía 21 fetal con el uso de MPS (una
forma de “next-generation sequencing”). “Next generation sequencing” se denomina a
una forma de secuenciación que apareció después de la secuenciación clásica. Se la
denomina de tercera o cuarta generación, de acuerdo a técnicas subsiguientes, y en
conjunto se las denomina “de próxima o nueva generación”. Estos secuenciadores
pueden analizar la secuencia de millones a billones de moléculas de ADN en cada
ciclo de secuenciación. Secuencian masivamente y en paralelo, de ahí el nombre de la
técnica MPS. Las secuencias de ADN se ordenan en relación al genoma humano para
identificar el origen cromosómico de cada secuencia. Además de la identidad de las
moléculas, se puede obtener la frecuencia de distribución de las moléculas de ADN en
la muestra, y gracias a ello cuantificar moléculas con impresionante exactitud. La
hipótesis desarrollada es que el ADN en plasma materno, que se encuentra
naturalmente fragmentado, puede ser secuenciado para identificar el origen
cromosómico de cada secuencia de ADN, y determinar la proporción relativa de
moléculas derivadas de un cromosoma potencialmente aneuploide, por ejemplo,
cromosoma 21, para después comparar las proporciones con una muestra normal. Si
se analiza una muestra de plasma materno con un feto con trisomía 21, y se
identifican el número total de secuencias pertenecientes al cromosoma 21, se pueden
determinar pequeños incrementos de estas secuencias comparadas con el número
obtenido de una muestra normal. La cantidad de moléculas secuenciadas y el análisis
estadístico posterior determinan el límite inferior en la proporción de secuencias para
la detección de aneuploidías.
Los estudios a gran escala de validación clínica de NIPD de trisomía 21 con MPS,
demostraron una sensibilidad de 79-100%, y especificidad de 98-99 %, para trisomía
21, utilizando distintos protocolos (mejores resultados evaluando menor número de
muestras por ciclo de secuenciación) con la misma plataforma de secuenciación. Los
estudios más recientes muestran una sensibilidad de 99-100 % y una especificidad de
99,7 a 99,8 %.. Los intentos de aplicar la técnica a la evaluación de trisomía 18 y 13
han observado una mayor dificultad para la detección de estas trisomías, sobre todo
para trisomía 13, debido a su alto o bajo contenido en secuencias de guanina-citosina
(GC) que comprometen la secuenciación. Esto pudo ser mejorado con modificaciones
en el análisis bioinformático tomando en cuenta esta desviación en el contenido de
GC.
Con la tecnología actual, el NIPD tendría para las anomalías cromosómicas más
frecuentes (trisomías 21; 18 y 13; y monosomía del X) una sensibilidad y especificidad
cercanas al 100%. Si bien estos estudios fueron realizados en población de alto riesgo
para anomalías cromosómicas, los datos sugieren que NIPD de trisomía 21 en plasma
materno usando MPS tiene suficiente sensibilidad y especificidad para comenzar la
validación para su aplicación clínica en embarazadas de población general.
Estudios recientes evaluaron la MPS para NIPD de trisomía 21 y 18, usando una
estrategia “target”, donde se realiza la MPS de secuencias determinadas del ADN
fetal, en lugar de evaluar todas las secuencias de ADN contenidas en la muestra de
plasma materno. Este tipo de NIPD “target” logra tasas de detección para trisomía 21
de 100 % y 98 % para trisomía 18, a la vez que permite analizar mayor cantidad de
muestras por vez, y por lo tanto disminuir los costos.
Como hemos dicho, en plasma materno circulan moléculas de ADN fetal libres que
corresponden a todo el genoma fetal. Por lo tanto, existe la posibilidad de determinar
la concentración fraccional de todos los cromosomas y, en un futuro próximo, realizar
un cariotipo fetal en forma no invasiva. Las secuencias de ADN podrían ser analizadas
para determinar la herencia fetal de enfermedades monogénicas. Por lo tanto, NIPD
tiene el potencial de ser aplicado a la evaluación de todas las enfermedades genéticas
fetales.
4.4 ESTADO ACTUAL DE NIPD
El NIPD en sangre materna está transitando hacia la práctica clínica. En los próximos
años, junto con otros avances en biología molecular, va a modificar sustancialmente la
práctica del diagnóstico prenatal. Luego de años de investigación basada en células
fetales, pareciera ser que utilizar ácidos nucleicos en plasma materno sumado a las
nuevas técnicas de secuenciación es la base del NIPD de forma más efectiva. Si bien
no hay duda sobre su beneficio en medicina fetal, el principal problema reside en la
forma de introducirlo en la práctica clínica.
En la actualidad, NIPD en plasma materno se implementa de rutina en varios países
del mundo en dos situaciones clínicas: para la determinación prenatal de sexo fetal, y
para identificar el genotipo Rh D fetal en embarazadas Rh D negativas.
Con respecto a NIPD de aneuploidías, varios laboratorios comerciales, que han
formado parte de los estudios de validación clínica, han comenzado a ofrecer estos
tests en forma pública. Es claro que aplicar un estudio no invasivo para el diagnóstico
de anomalías cromosómicas tiene la ventaja de evitar el riesgo de pérdida de
embarazo asociado a los estudios invasivos. Otros potenciales beneficios serían la
posibilidad de ofrecer estos estudios a una edad gestacional temprana, con una alta
tasa de detección y una baja tasa de falsos positivos. Lo ideal sería que NIPD en
plasma materno se convierta en un estudio diagnóstico que no necesite un segundo
paso confirmatorio (biopsia de vellosidades coriónicas, amniocentesis) antes de dar
una respuesta definitiva.
Sin embargo aún no hay consenso sobre cómo estos tests deben ser ofrecidos a la
población de embarazadas: como tests de screening a toda la población, como
alternativa a un estudio invasivo en embarazadas consideradas de alto riesgo luego de
un estudio de screening, o un intermedio entre los estudios de screening y los de
diagnóstico para disminuir la cantidad de estudios invasivos.
Algunos autores los consideran, por el momento, “tests de screening avanzado”. Se
basan en que los estudios de validación han sido aplicados a mujeres de alto riesgo
para anomalías de cromosomas, y por ello, podrían ofrecerse luego de un estudio de
screening convencional y de esta forma disminuir casi 99 % los estudios invasivos. Por
otro lado debido a que presentan una pequeña tasa de falsos positivos, todavía parece
prudente confirmar un estudio anormal con un estudio invasivo.
La Sociedad Internacional de Diagnóstico Prenatal (ISPD) definió en 2011su posición
en relación a NIPD usando MPS. Considera este estudio como screening, con probada
eficacia en población de alto riesgo, pero sugiere que falta evidencia en población de
bajo riesgo, y en subpoblaciones partriculares como embarazos múltiples o resultado
de técnicas de fertilización asistida de alta complejidad. Esta sociedad acepta el uso
de MPS, con asesoramiento genético previo, en pacientes con un estudio de screening
positivo, mientras que no apoya su uso, por ahora, en embarazadas de bajo riesgo
para aneuploidías fuera de un protocolo de validación clínica. Por último, recomienda
un estudio invasivo para mujeres con alto riesgo en la descendencia de enfermedades
monogénicas, y/o microdeleciones.
Por el contrario, otros autores proponen que NIPD, en un futuro cercano, deberá ser
considerado un estudio diagnóstico. El resultado de NIPD utilizando MPS en plasma
materno depende fundamentalmente de la concentración fraccional de ADN en el
mismo. Está demostrado que esta concentración fraccional no presenta variación
significativa entre embarazadas con fetos con trisomía 21 o euploides, ambas
consideradas previamente de alto riesgo para anomalías cromosómicas. La misma
tampoco depende de la edad materna o de la indicación para realizar el estudio. Por
esto, sugieren que la capacidad diagnóstica del test no va a ser sustancialmente
diferente en población de bajo riesgo.
De cualquier forma todavía quedan interrogantes por resolver antes de su
implementación en la práctica clínica. Se deben considerar el costo del estudio, la
edad gestacional límite para aplicarlo, las indicaciones específicas, y cómo se van a
articular o combinar con la ecografía y los protocolos de screening para aneuploidías
existentes. Es importante que la evaluación de NIPD no se focalice sólo en el
desarrollo de la tecnología, sino que incluya consideraciones éticas, psicosociales y
económicas. Por último hay que tener en cuenta que NIPD no es el único avance
tecnológico introducido en el campo del diagnóstico prenatal. Las opciones en técnicas
de diagnóstico se han incrementado exponencialmente en cantidad y complejidad (Ej.
Array, MLPA). Por lo tanto, cualquier estrategia que se considere para la
implementación de NIPD también debe tener en cuenta todas las opciones
disponibles.
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