DIAGNÓSTICO DE HPN Rol de la Citometría de flujo • Detección y Cuantificación de células con deficiencia de GPI. • Subclasificación de tipo de celulares Dra . Nora Silvia Halperin -Laboratorio de Citometría de Flujo- División hematología Hospital de Clínicas José de San Martín GRCF
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DIAGNÓSTICO DE HPN Rol de la Citometría de flujo · Bioquímica Nora Silvia Halperin –Laboratorio Citometría de Flujo- División Hematología- Hospital de ... Tipo II(deficiencia
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DIAGNÓSTICO DE HPN Rol de la
Citometría de flujo
• Detección y Cuantificación de células con deficiencia de GPI. • Subclasificación de tipo de celulares
Dra . Nora Silvia Halperin
-Laboratorio de Citometría de Flujo-
División hematología
Hospital de Clínicas José de San Martín
GRCF
¿Cuál es el rol de la Citometría de flujo en el
diagnóstico de anemia?
Diferenciar diferentes patologías como
Desorden linfoproliferativo
Mieloma múltiple
Mielodisplasia
HPN
Bioquímica Nora Silvia Halperin –Laboratorio Citometría de Flujo- División Hematología- Hospital de Clínicas-GRCF-
¿Qué es la Hemoglobinuria paroxística nocturna? (Sindrome de Marchiafava-Michelli)
Hemopatía adquirida poco frecuente
Consecuencia de una expansión clonal, no maligna, de células progenitoras hematopoyéticas que han adquirido una mutación somática en el gen PIG-A (brazo corto del cromosoma X)
Este gen codifica una enzima que cataliza el primer paso en la biosíntesis del grupo de anclaje glycosylphosphatidylinositol
Condicionando la carencia total o parcial de la expresión de proteínas ancladas por GPI
Incidencia de 0,05-0,13 casos por 100.000 habitantes/año.
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Indicaciones de búsqueda de clon(es) HPN por citometría de flujo 1. Hemólisis intravascular evidenciada por Hemoglobinuria Hemosiderinuria
2. Hemólisis no explicada + 1 de los siguientes Ferropenia Dolor abdominal o espasmos esofágicos Trombosis Neutropenia o trombocitopenia Daño renal crónico sin causa evidente
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3. Anemia hemolítica adquirida Coombs negativa sin anormalidades morfológicas celulares (ejemplo: esquistocitos) y no infecciosa
4. Trombosis con ≥ 1 de los siguientes: Localizaciones venosas atípicas: esplácnica, cerebral o dérmica Con signos de hemólisis Con citopenias no explicadas
5. Anemia aplásica, mielodisplasia de bajo grado, otras citopenias de causa no aclarada (ensayos de alta sensibilidad para clones muy pequeños).
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El anticoagulante de elección es el EDTA, pero puede
utilizarse heparina o citrato.
Debe conservarse a temperatura ambiente y remitirla al laboratorio dentro de las 24 hs.
En caso de no poder procesarse en ese lapso de
tiempo, se debe agregar el estabilizante TransfixTM que conserva la muestra estable por 7 días.
Indicaciones para la obtención, preservación y transporte de la muestra
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¿Qué tipos de HPN existen?
HPN clásica (clon en G. cercano al 50%) Con evidencia clínica de Hemólisis intravascular o trombosis sin
evidencias de fracaso medular. Clonas de HPN grandes, con MO normal o con hiperplasia roja.
HPN en el contexto de otra patología hematológica (clon en G.<30%)
Datos claros de hemólisis y otra patología medular asociada (anemia aplásica, SMD o mielofibrosis primaria (la presencia del clon indica mejor respuesta al tto.inmunosupresor)
HPN subclínica (clon en G. <1%) Sin datos de hemólisis. Se asocia a aplasia medular.
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¿Cuál es el rol de la Citometría de flujo en el
diagnóstico de HPN?
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Es el método de elección
Sirve para la detección y cuantificación de
células con deficiencia de GPI.
Subclasificación del tipo celular
¿Qué tipos de células HPN existen?
1. HPN I----EXPRESIÓN NORMAL*
2. HPN II---EXPRESIÓN PARCIAL*
3. HPN III---SIN EXPRESIÓN*
* De moléculas ancladas a la membrana por GPI
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¿Cuáles son las proteínas asociadas a GPI?
Enzimas
Acetilcolinesterasa: hematíes
CD73: subpoblaciones de linfocitos B y T
CD157: monocitos y neutrófilos
Fosfatasa alcalina del neutrófilo: neutrófilos
ADP-ribosiltransferasa: subpoblaciones de linfocitos T y neutrófilos
Moléculas de adherencia celular
CD48: linfocitos
CD58: todas las células hematopoyéticas
CD66b y CD66c: neutrófilos
Proteínas de superficie reguladoras de la actividad del complemento
CD55: todas las células hematopoyéticas
CD59: todas las células hematopoyéticas
Receptores
CD16: neutrófilos y células dendríticas relacionadas con monocito; en
forma transmembranaria se expresa en linfocitos citolíticos
CD14: monocitos y macrófagos
CD87: monocitos y granulocitos
CD90: célula madre y subpoblaciones de linfocitos T
Sistemas de antígenos sanguíneos eritrocitarios
Cromer: hematíes
Cartwright/Yt: hematíes
John Milton Hagen: hematíes
Dombrock: hematíes
Holley-Gregory: hematíes
Antígenos del neutrófilo
Otras
CD24: linfocitos B, neutrófilos
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¿ Cuales son las células diana más informativas y en qué muestra debo
investigar?
SI-----------------------------GRANULOCITOS Y MONOCITOS NO----------------------------LINFOCITOS (vida 1/2 larga, Variable expresión de las proteínas unidas por GPI) NO----------------------------GR (transfusiones, hemólisis Intravascular previo al test). NO---------------------------MO (formas mieloides inmaduras)* SI----------------------------SP (cuidado en MDS)
*Si con marcadores de madurez como IREM para monocitos
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Anticuerpos utilizados en glóbulos blancos
Marcador Granulocitos Monocitos
CD14 NA ++
CD16 ++ NA
CD24 ++ NA
CD66b + NA
FLAER* ++ ++
* DERIVADO FLUORESCENTE DE LA TOXINA BACTERIANA AEROLISINA MODIFICADA, CAPAZ DE UNIRSE AL GPI EN LEUCOCITOS , NO EN HEMATÍES (sensib.: 0.5%)
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FLAER
No se lo utiliza el GR porque se une a uniones inespecíficas
Antígenos utilizados (recomendados) en G.R.
Recomendación Guidelines for the Diagnosis and Monitoring of Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria
and Related Disorders by Flow Cytometry- Borowitz et al. Cytometry Part B (Clinical Cytometry) 78B:211–230 (2010)
Proteínas reguladoras del complemento
CD59 puede estar conjugado con FITC (altamente expresado) , clon MEM-43
Permite distinguir diferentes tipos de células HPN
(MIRL : inhibidor de la lisis reactiva de la membrana)
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Protocolo de marcación 3 fluorescencias (1 láser) FacsCan
Glóbulos rojos 1. Glicoforina A PE/ CD59 FITC (MEM-43) Lavar 2 veces para sacar uniones no específicas!!!!
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Búsqueda de células HPN en glóbulos blancos
Lavo 2 veces la SP
Marco
liso
Adquisición de la muestra
Incubar 20’ en oscuridad
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Búsqueda de células HPN en glóbulos rojos
60 ul de G.R. al 0.75% (3 ul de SP en 400ul en PBS)
Acs. Monoclonales
Lavar 2 veces!! con PBS
Resuspendemos con PBS
Incubar 20’ en oscuridad
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Adquisición de la muestra 10000 eventos para 1% de cél HPN
¿Cuántas células debo adquirir?
Para una sensibilidad de 0,1%:
Adquiero 250.000 cél de interés (por ejemplo: granulocitos), requiriendo 25 eventos para identificar una población
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Detección de CD14 en monocitos, estrategia de gating
Tubo CD45/CD14/CD64
HPN I
HPN II
HPN III
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FACScan – Cell-quest- Paint-a gate SELECCIÓN DE GRANULOCITOS Y BÚSQUEDA DE EXPRESIÓN DE CD66b, CD16 Y CD24
TUBOS: CD45/CD24/CD66b y CD15/CD16/CD45
HPN I
HPN II
HPN III
EOSINÓFILOS
FACScan – Cell-quest- Paint-a gate EXPRESIÓN DE CD59 EN GLÓBULOS ROJOS (ADQUISICIÓN EN ESCALA LOGARÍTMICA)
HPN III HPN II
HPN I
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HPN III HPN II
HPN I
Caso 2 : paciente con anemia aplásica, con altos requerimientos transfusionales, metrorragias por mioma uterino
monocitos
granulocitos
0,42%
22,23%
Caso 2: glóbulos rojos
Control negativo Control positivo ????
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Tipo Celular DEFICIENCIA RESULTADOS
ERITROCITOS
Tipo II (deficiencia parcial de CD59 ) 0,04%
Tipo III (deficiencia total de CD59 ) 0,36%
Tamaño total del clon (Tipo II y Tipo III) 0,40%
MONOCITOS
Tipo II (deficiencia parcial de CD14) 1,21%
Tipo III (deficiencia total de CD14) 25,00%
Tamaño total del clon (Tipo II y Tipo III) 26,21%
NEUTROFILOS
Tipo II(deficiencia parcial de CD16/CD24/CD66b) 0,42%
Tipo III (deficiencia total de CD16/CD24/CD66b ) 22,23%
Tamaño total del clon (Tipo II y Tipo III) 22,65%
. Conclusiones: Se observa un clon de HPN entre los eritrocitos (0,40%), monocitos (26,21%) y granulocitos neutrófilos (22,65%). Estos hallazgos son compatibles con un diagnóstico de hemoglobinuria paroxística nocturna. La variación del tamaño del clon entre las diferentes poblaciones puede deberse a la baja viabilidad de la muestra y/o hemólisis y/o reciente transfusión. Se sugiere correlacionar estos resultados con el resto de los datos clínicos y de laboratorio para arribar a un diagnóstico definitivo. Se recomienda tener en cuenta la vida media de los glóbulos rojos si el paciente hubiera recibido una transfusión.
Los glóbulos blancos fueron marcados con anticuerpos monoclonales dirigidos contra las moléculas CD14, CD16, CD66b y CD24 (estos antígenos están anclados a la superficie celular por medio de las moléculas GPI) para evaluar el tamaño del clon y lisada con una solución de FACS Lysing
con el fin de eliminar sus glóbulos rojos. Otra parte de la muestra fue marcada con la molécula CD59 para evaluar su expresión en glóbulos rojos y calificar los diferentes tipos de
células HPN. Se comparó el patrón de marcación con el de una sangre periférica normal.
INFORME: ¿Qué debe constar en el informe?
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Caso 3: paciente con leucopenia, anemia, con tratamiento inmunosupresor
monocitos
granulocitos
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Caso 3: glóbulos rojos
Control negativo Control positivo ??????
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• Los glóbulos blancos fueron marcados con anticuerpos monoclonales dirigidos contra las moléculas CD14, CD16, CD66b y CD24 (estos antígenos están anclados a la superficie celular por medio de las moléculas GPI) para evaluar el tamaño del clon y lisada con una solución de FACS Lysing con el fin de eliminar sus glóbulos rojos..
• Otra parte de la muestra fue marcada con la molécula CD59 para evaluar su expresión en glóbulos rojos y calificar los diferentes tipos de células HPN.
• Se comparó el patrón de marcación con el de una sangre periférica normal.
Tipo Celular DEFICIENCIA RESULTADOS
ERITROCITOS
Tipo II (deficiencia parcial de CD59 ) 4%
Tipo III (deficiencia total de CD59 ) 57%
Tamaño total del clon (Tipo II y Tipo III) 61%
MONOCITOS
Tipo II (deficiencia parcial de CD14) 4%
Tipo III (deficiencia total de CD14) 94%
Tamaño total del clon (Tipo II y Tipo III) 98%
NEUTROFILOS
Tipo II(deficiencia parcial de CD16/CD24/CD66b) 3%
Tipo III (deficiencia total de CD16/CD24/CD66b ) 78%
Tamaño total del clon (Tipo II y Tipo III) 81%
. Conclusiones:
Se observa un clon de HPN entre los eritrocitos (61%), monocitos (98%) y granulocitos neutrófilos (81%).
Estos hallazgos son compatibles con un diagnóstico de hemoglobinuria paroxística nocturna.
La variación del tamaño del clon entre las diferentes poblaciones puede deberse a la baja viabilidad de la muestra y/o hemólisis
y/o reciente transfusión.
Se sugiere correlacionar estos resultados con el resto de los datos clínicos y de laboratorio para arribar a un diagnóstico definitivo.
Se recomienda tener en cuenta la vida media de los glóbulos rojos si el paciente hubiera recibido una transfusión.
INFORME: ¿Qué debe constar en el informe?
SIN LAVAR
1 LAVADO
2 LAVADOS
EXPRESIÓN DE CD55 Y CD59 EN GLÓBULOS ROJOS DEL PACIENTE CON HPN
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CD55 CD59
Criterios diagnósticos
El diagnostico de HPN por citometría de flujo requiere
demostrar el déficit de expresión de 2 o más proteínas
asociadas a GPI en 2 o más líneas celulares
hemopoyéticas distintas (pueden ser 2 proteínas asociadas
a GPI o una proteína asociada a GPI + FLAER).
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Comparación entre CD55 y CD59, sensibilidad
No permite diferenciar HPN II de HPN III
Sin sensibilidad por debajo de 1-2%
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Se recomienda monitorear el tamaño del clon mediante citometría de flujo en: Pacientes con HPN tratados con Eculizumab: al inicio del tratamiento, a los 6 meses y posteriormente de forma anual.
Pacientes con HPN clásica sin tratamiento y HPN asociada (Anemia aplásica, MDS o subclínica) de forma anual.
Todos los casos en que se observen cambios en la clínica del paciente.
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Seguimiento de los clones HPN
MUCHAS GRACIAS !!!
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