43 ème Colloque National des Biologistes Hospitaliers Marseille, 57 novembre 2014 Diagnostic et suivi biologique de l’Hémoglobinurie Paroxystique Nocturne (HPN) Caroline Bret Pôle BiologiePathologie Laboratoire de Biologie Médicale du CHRU de Montpellier Département d’Hématologie Biologique
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43ème Colloque National des Biologistes Hospitaliers Marseille, 5-‐7 novembre 2014
Diagnostic et suivi biologique de l’Hémoglobinurie Paroxystique Nocturne
(HPN)
Caroline Bret Pôle Biologie-‐Pathologie Laboratoire de Biologie Médicale du CHRU de Montpellier Département d’Hématologie Biologique
43ème Colloque National des Biologistes Hospitaliers Marseille, 5-‐7 novembre 2014
ACNBH
ODPC N°1495
DECLARATION D’INTERET DANS LE CADRE DE MISSIONS DE FORMATION REALISEES POUR L’ACNBH
Caroline Bret, exerçant au CHRU de Montpellier, déclare sur l’honneur ne pas avoir d'intérêt, direct ou indirect (financier) avec les entreprises pharmaceu@ques, du diagnos@c ou d’édi@on de logiciels suscep@ble de modifier mon jugement ou mes propos, concernant le DMDIV et/ou le sujet présenté.
Définition
Anomalie clonale acquise de la cellule souche hématopoïéGque :
a<einte des différentes lignées sanguines pathologie rare : 15 à 20 nouveaux cas par an en France incidence esHmée : 1 à 5 cas pour 106
gène codant une enzyme de la biosynthèse de l’ancre GPI glycosyl-‐phosphaHdyl-‐inositol
Conséquences : n°1 = anomalie de synthèse de l’ancre GPI
n°2 = défaut parHel ou complet de molécules GPI-‐liées à la surface cellulaire : « clones HPN »
Y. Mortazavi et al. Blood 2000 C. Sugimori et al. Blood Journal Cancer 2012 W. Shen et al. JCI 2014
Similitudes avec physiopathologie des SMD (gènes communs)
Complexité de l’architecture clonale +++
MutaHon PIGA = évènement iniHal ou non
W. Shen et al. JCI 2014
≈ 55% ≈ 10%
≈ 30% ≈ 5%
Tolérance immune/pression de sélecGon Anomalies généGques addiGonnelles
Hypothèse : seraient responsables de l’hétérogénéité clinico-‐biologique au cours de l’HPN
W. Shen et al. JCI 2014
Modèle de l’aplasie médullaire avec désordre auto-‐immun médié par les lymphocytes T Hyp : avantage de survie des CSH HPN+ par rapport aux CSH normales Présence d’un peHt clone HPN : meilleure réponse aux thérapies immunosuppressives
W. Dameshek, Blood 1967 P. Hillmen et al. NEJM 1995 N. Hanaoka et al. Blood 2006 C. Sugimori et al. Blood 2006 JJ. Pu et al. Eur J Heamatol. 2011 L. Gargiulo et al. Blood 2013
Emergence et mainGen du clone de CSH porteur de la mutaGon :
Conséquences du déficit en GPI = déficit en molécules GPI-‐liées
Risitano and Rotoli, Biologics : target and therapy 2008
Conséquences du déficit en GPI = déficit en molécules GPI-‐liées
principale répercussion = défaut de CD55 et CD59, protéines de régulaHon de l’acHon du complément
sensibilité accrue à l’acGon lyGque du complément Cible +++ mais non exclusive = globules rouges
avec possibilité de phénomènes paroxys@ques
en lien avec une majora@on de l’ac@va@on du complément (ex : infec@on,…)
R.A. Brodsky Blood 2014
hémolyse intra-‐vasculaire chronique
Manifestations clinico-‐biologiques
Hémolyse Insuffisance médullaire Thrombose
Hétérogénéité de la présentaGon clinico-‐biologique (diversité et sévérité des signes)
H. Schrezenmeier et al. Haematologica 2014 R.A. Brodsky Blood 2014
-‐ au moins 1 épisode thrombo-‐embolique (ETE) chez 29 à 44% des paHents
-‐ chez 19% des paHents : ETE précède le diagnosHc d’HPN
-‐ survenue d’ETE = facteur de mauvais pronosHc : survie à 4 ans après ETE au diagnosHc = 40%
A. Hill et al. Blood 2013
Thrombose et HPN
LocalisaGons anatomiques préférenGelles :
MTEV : localisaGon abdominales a<einte des veines hépaGques = syndrome de Budd Chiari 7,5 à 25% des paHents HNP complicaHon : insuffisance hépatocellulaire, mortalité élevée a<einte des veines mésentériques, duodénales veines cérébrales a<einte du sinus sagi<al supérieur localisaHon neurologique la plus fréquente conduit à 1/3 de décès autres localisaHons : sinus latéral, sinus caverneux, sinus sigmoïde TA : artères cérébrales et coronaires +++
A. Hill et al. Blood 2013
Thrombose et HPN
Physiopathologie des thromboses au cours de l’HPN
AcGvaGon plaquefaire
Hémolyse intra-‐vasculaire
DérégulaGon de l’hémostase
DysfoncGon endothéliale
Etat pro-‐inflammatoire
Hémolyse Insuffisance médullaire Thrombose
Hétérogénéité de la présentaGon clinico-‐biologique (diversité et sévérité des signes)
H. Schrezenmeier et al. Haematologica 2014 R.A. Brodsky Blood 2014
méthode diagnosGque de référence (explora@ons géné@ques non réalisées en rou@ne)
Principe = mise en évidence du déficit en marqueurs GPI-‐liés sur au minimum deux lignées sanguines disGnctes
Présence d’un clone : oui/non
Si oui : déterminaGon de la taille du clone
Recherche de clone HPN = mise en évidence de cellules déficientes en marqueurs GPI-‐liés mais ≠ diagnosKc de l’HPN
Cytometry Part B (Clinical Cytometry) 2010
Cytometry Part B (Clinical Cytometry) 2012
Intérêt pour la détecHon de clones mineurs chez les paHents a<eints : -‐ d’aplasie médullaire
-‐ de SMD
Test de « rouGne »
Sensibilité = 1% AcquisiHon de
5000 cellules cibles
Test de « haute sensibilité »
Sensibilité = 0,01%PNN (0,005%GR) AcquisiHon de
200 000 cellules cibles
versus
Réponse au traitement immunosuppresseur Risque de majoraKon du clone : 10-‐25% des paKents vers forme classique
A. Tichelli et al. Leuk Lymph. 1994 C. Sugimori et al. Blood 2006
Nature de l’échanHllon : sang périphérique, EDTA
Examen à réaliser dans les 24h, le jour même idéalement
1ère étape = recherche de cellules déficientes en marqueurs GPI-‐liés parmi les PNN, avec confirmaGon sur les monocytes
Absence de clone significaHf détectable Présence de cellules déficientes
2ème étape = recherche de cellules déficientes en marqueurs GPI-‐liés parmi les GR
Spanish Society of Hematology, SEHH 2012 MJ. Borowitz et al. Cytometry Part B 2010
Parker et al. Blood 2005
Mosaïcisme du phénotype :
Type I : expression normale Type II : défaut d’expression parHel Type III : absence d’expression
Déficit en marqueurs GPI-‐liés variable au sein des cellules sanguines :
chez un même pa@ent :
MJ. Borowitz et al. Cytometry Part B 2010
Polynucléaires neutrophiles et monocytes : différentes approches possibles
Marqueurs de sélecHon (« gaHng »)
CD45/SSC CD33 CD15 CD64
FLAER/CD24 FLAER/CD14
Marqueurs GPI-‐liés
SélecKon rigoureuse des populaKons Combinaison = sécurité
AnGcorps/réacGfs uGlisés :
FLAER = -‐ dérivé d’une lysine sécrétée par Aeromonas hydrophila pro-‐aérolysine sans ac@vité ly@que -‐ couplé à un fluorochrome (Alexa 488)
liaison spontanée aux ancres GPI
RéacKf : -‐ performant +++ pour la mise en évidence des déficits d’expression de marqueurs GPI-‐liés, -‐ désormais incontournable pour l’évaluaHon des GB
FCS/SSC CD235a
CD59
mieux que CD55 car sépare mieux les types II
Globules rouges :
Marqueurs de sélecHon (« gaHng »)
Marqueur GPI-‐lié
Modalités de préparaHon de l’échanHllon 2 lavages, pas de « vortex »
Choix des réacHfs, quanHté d’anHcorps uHlisée An@-‐CD235a : clone KC16 An@-‐CD59 : clone MEM43 ou OV9A2
R. Sutherland et al. Cytometry Part B (Clinical Cytometry) 2010, 2012
Risque d’agrégaGon des globules rouges
ValidaGon de la méthode en « haute sensibilité »
Nécessité de déterminer la sensibilité de la méthode méthode de dilu@on
Nécessité d’évaluer une série de sujets sains « bruit de fond » m= 4 GR de type III/106 chez sujets sains
Modalités de préparaHon de l’échanHllon en vue de l’acquisiHon de plus de 200 000 cellules cibles
aFen@on notamment aux sujets leucopéniques
R. Sutherland et al. Cytometry Part B 2012
Lymphocytes = contrôle interne
FSC-‐A
FSC-‐H
SSC-‐A
CD45
PNN
Monocytes
1ère étape = sélecKon des populaKons à évaluer
SSC-‐A
CD15
CD15
CD33
CD33
CD64
1ère étape (suite) = sélecKon des populaKons à évaluer
SélecKon « affinée »
FLAER FLAER
CD24 CD14
PNN : 0,00% de type III, monocytes : idem
2ème étape = évaluaKon de l’expression des marqueurs GPI-‐liés/FLAER
FSC-‐H
FSC-‐A
SSC-‐A
FSC-‐A
SSC-‐A
CD235a
CD235a
CD59
FSC-‐A
FSC-‐H SSC-‐A
CD45
SSC-‐A
CD15
CD15
CD33
CD33
CD64
1ère étape = sélecKon des populaKons à évaluer
PNN : 4,7% de type III Monocytes : 58,9% de type III
2ème étape = évaluaKon de l’expression des marqueurs GPI-‐liés/FLAER
FSC-‐H
FSC-‐A
SSC-‐A
FSC-‐A
SSC-‐A
CD235a
CD235a
CD59
3,1
ObjecGfs de l’examen : -‐ rechercher la présence d’un clone HPN -‐ le quanHfier au sein des leucocytes et des globules rouges
= taille du clone
Compte-‐rendu :
Nature de l’échanHllon,… Renseignements cliniques éventuels Marqueurs de sélecHon uHlisés (marqueurs de « gaHng ») Marqueurs GPI-‐liés évalués Sensibilité de la méthode (PNN et globules rouges), à compléter par la sensibilité de l’examen si inférieure
1/4
AfenGon à la formulaGon : objecGf = éviter les erreurs d’interprétaGon !
1er cas de figure : absence de clone HPN
Conclusion avec formulaGon claire
éviter les « posiHfs »/ »négaHfs »
+ Donner la limite de sensibilité
sur les PNN
2/4
A. Illingworth and R. Sutherland, ESCCA congress Dublin 2011
ex à proscrire : « le test HPN est néga@f » « toutes les cellules sont posi@ves »…
Taille de clone HPN dans chaque catégorie de cellules : -‐ type II -‐ type III -‐ type II + III = taille totale du clone
3/4
2ème cas de figure : Présence d’un clone HPN
Conclusion dictée par la taille du clone au sein des PNN :
ConfirmaGon par le clone au sein des monocytes et des globules rouges :
« confirmé sur les monocytes (x%) et sur les globules rouges (x%) »
si HPN II+III < 0,1% si HPN II+III ≥ 0,1% et ≤ 1% si HPN II+III > 1% « Présence de rares
cellules présentant un déficit en protéines GPI-‐
liées »
« Présence d’un clone HPN minoritaire
esGmé à x % sur les PNN »
« Présence d’un clone
HPN esGmé à x% sur les PNN»
4/4
Groupe HPN-‐AFC -‐ A. Illingworth and R. Sutherland, ESCCA congress Dublin 2011
Forme « classique »
Forme « infra-‐clinique »
Forme associée à une anomalie médullaire
R. Hu et al. Blood 2005 C. Parker et al. Blood 2005