Diagnostic des infections à gonocoque par techniques moléculaires H. Hochard, C. Delamare CHR Metz Thionville Diagnostic des infections Diagnostic des infections à gonocoque et à à gonocoque et à Chlamydia Chlamydia trachomatis trachomatis par techniques par techniques moléculaires moléculaires mardi 11 septembre 2012 H. Hochard, C. Delamare CHR Metz-Thionville
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Diagnostic des infections à gonocoque par techniques
moléculaires
H. Hochard, C. Delamare
CHR Metz Thionville
Diagnostic des infections à Diagnostic des infections à gonocoque et à gonocoque et à Chlamydia Chlamydia trachomatistrachomatis par techniques par techniques
moléculairesmoléculaires
mardi 11 septembre 2012
H. Hochard, C. Delamare
CHR Metz-Thionville
EPIDEMIOLOGIE
Renago, 2008
• Plus de déclaration obligatoire depuis 2000
pas de données de prévalence
• Estimation de l’incidence grâce aux réseaux :
RENAGO de laboratoires, dont les patients consultent majoritairement en médecine de ville
RésIST de cliniciens, dont les patients consultent quasi-exclusivement dans des structures spécialisées (CIDDIST et CDAG)
Neisseria gonorrhoeae (NG)
Réseaux de surveillance
• augmentation des infections gonococciques
• population homosexuelle masculine, mais aussi hétérosexuelle masculine et féminine
• médiane âge femmes infectées 24 ans vs 27 ans pour les hommes
• portage asymptomatique (plus fréquent +++ chez la femme :50-90 % vs < 1 % chez l’homme), favorise la transmission
• augmentation des résistances
Évolution du nombre moyen de gonocoques isolés par laboratoire actif et par an selon le sexe
(réseau Rénago)
Augmentation de la fréquence de l’infection chez l’homme (+26%) comme chez la femme (+33%) entre 2008 et 2009
Évolution du nombre moyen de gonococcies par site participant et par an selon le sexe
(réseau RésIST)
• Absence de recommandations de dépistage en France• Recommandations européennes (IUSTI - OMS, 2001, actualisées 2008)
En présence de symptômes En l’absence de symptômes
symptômes ou signes d’écoulements urétraux chez l’homme
jeune adulte dépisté pour une IST
orchi-épididymite chez l’homme de moins de 40 ans
partenaire sexuel d’une personne ayant une IST ou une atteinte
inflammatoire pelvienne
écoulement vaginal avec facteurs de risque d’IST
nouveaux ou multiples partenaires
cervicite mucopurulente
inflammation pelvienne aiguë
Chlamydia trachomatis (CT)
• 1er agent bactérien responsable d’IST dans les pays industrialisés
• Réseau de surveillance : RENACHLA (laboratoires)
incidence ≈ 4 % infections asymptomatiques chez 75 % des femmes
et 50 % des hommes prévalence varie en fonction :
― des populations étudiées (lieu de recrutement)― de l’âge : maximale chez les femmes de 18 à 24 ans
et chez les hommes de 25 à 30 ans
Réseau Rénachla
HOMMES
Augmentation du nombre de diagnostics de 19 % chez l’hommeentre 2008 et 2009
Chlamydia trachomatis (CT)
Réseau Rénachla
FEMMES
Augmentation du nombre de diagnostics de 25 % chez la femmeentre 2008 et 2009
Estimation de la prévalence en France des infections à CT dans la population générale
• 2 580 personnes testées• 18 - 44 ans• Auto-prélèvement vaginal (femmes) ou urine (hommes) : à domicile
– 18 - 44 ans : • Hommes = 1,4%• Femmes = 1,6%
– 18 - 29 ans : • Hommes = 2,5%• Femmes = 3,2%
Prevalence of Chlamydia trachomatis: results from the first national population-based survey in France.Goulet V, de Barbeyrac B, Raherison S, Prudhomme M, Semaille C, Warszawsk J; CSF group.
Sex Transm Infect. 2010 Aug;86(4):263-70.
• HAS 2003
• personne symptomatique• CIDDIST, CDAG : dépistage systématique chez les femmes de
15 à 25 ans et les hommes < 30 ans • quels que soient l’âge et le sexe si >1 partenaire dans l’année • un ou une partenaire infecté(e) à C.trachomatis
DIAGNOSTIC
• Diagnostic direct– détection de Neisseria gonorrhoeae dans les
différents milieux accessibles à un prélèvement (urètre, endocol, urines…)
• par cultureculture• détection du génome bactérien par biologie biologie
moléculairemoléculaire
• Diagnostic indirect : sérologique, qui met en évidence les anticorps – inapproprié dans le cadre d’un dépistage et d’un
diagnostic
Neisseria gonorrhoeae
Chlamydia trachomatis
• Détection du génome bactérien par biologie moléculaire avec amplification génique – Sensibilité > 95%– Spécificité > 99%
• Adaptée dans toute situation clinique et pour tout type de prélèvement
• Les techniques de détection directe de CT par identification des inclusions intracellulaires sur culture ne sont plus recommandées.
• Il est préconisé de ne plus utiliser la technique de détection directe par méthode immunologique.
• Aucun intérêt de la sérologie dans les infections bassesDIAGNOSTIC BIOLOGIQUE DE L’INFECTION Á CHLAMYDIA TRACHOMATIS HAS Juillet 2010
Les prélèvements
• Culture (NG)
endocol urètre écoulement
urétral anal pharyngé
• Tests moléculaires endocol vagin (auto-
prélèvement) urètre sperme urine anal pharyngé
• Tests moléculaires (1 seul écouvillon pour NG et CT )
matériel de prélèvement avec milieux de transport spécifiques aux différents tests de diagnostic moléculaire
non interchangeables important d’adresser au laboratoire le
milieu en adéquation avec la technique de diagnostic
à titre d’exemple :– milieu Abbott contient du thiocyanate de
guanidium qui inhibe la PCR Cobas Roche,car la libération des acides nucléiques associée a cette technique est une lyse et non une extraction n’élimine pas le thiocyanate
• Culture (NG)
milieu de transport gélosé
! inhibition PCR
Les milieux de transport
• réalisée en systématique pour toute demande de culture
• visualisation directe du gonocoque sous la forme de diplocoques à Gram négatif intracellulaires « en grain de café »
• sensibilité :– élevée en cas d’urétrite aiguë chez l’homme (sensibilité > 95 %)– mauvaise chez les hommes asymptomatiques (50 à 75 %) et chez la
femme à partir des prélèvements endocervicaux et urétraux (respectivement 45 à 65 % et 20 %)
• non adaptée aux localisations anorectales et pharyngées– présence de cocci à Gram négatif appartenant à d’autres espèces
bactériennes– sensibilité ≤ 40 %
NG : La microscopie(coloration de Gram)
• Patients symptomatiques : méthode de référence {IUSTI/WHO 2008}
• Milieu de culture (gélose chocolat) sélectif contenant des antibiotiques (VCN) // Milieu non sélectif
• Avantages : – faible coût– sensibilité : 90% (80 à 96 % selon les études) pour les prélèvements
d’urètre, ≈ 80-90 % pour les prélèvements cervicaux– permet la réalisation d’un antibiogramme et d’un typage pour les études
épidémiologiques
• Inconvénients : – nécessité d’effectuer des prélèvements invasifs– transport rapide vers le laboratoire – délai d’obtention des résultats de 2 à 3 jours– sensibilité faible pour pharynx et anus (respectivement < 50 % et < 60 %)
NG : La culture
• Détection des acides nucléiques du génome bactérien (ADN ou ARN)
• Différentes techniques :
– ( hybridation moléculaire )
– techniques d’amplification génique
• PCR• TMA • SDA
Les tests de biologie moléculaire
PCR( Polymerase chain reaction )
• Amplification cyclique d’un segment d’ADN cible
• 3 températures :
– 95°C : dénaturationdénaturation de l’ADN– entre 50 et 65°C : hybridationhybridation
des amorces oligonucléotidiques complémentaires à leurs régions cibles
– 70°C : élongationélongation dans le sens 5’→ 3’ des amorces par Taq polymérase
40 cycles : 106 fois la cible
SDA ( Strand Displacement Amplification ou amplification par déplacement de brin )
• Amplification isothermique d’ADN
• 2 enzymes thermorésistantes :– une enzyme de restriction– une ADN polymérase
• 2 couples d'amorces
• ADN cible possédant ce site de restriction est généré à l'aide de la polymérase
TMA(Transcription Mediated Amplification)
• Amplification isothermique d’ARN(via un intermédiaire ADN)
La culture peut être associée à la biologie moléculaire si les conditions de transport risquent d’affecter la survie de NG (délai d’acheminement, température).