Diagn stico molecular de doen as infecciosas - stoa.usp.brstoa.usp.br/mariohirata/files/-1/12907/Diagnóstico+molecular+de... · – Bacterioscópico e semeadura ou inoculação e

Diagnóstico molecular de doenças infecciosas

Jorge L M Sampaio

Panorama atual

• As possibilidades e oportunidades são inúmeras• Novas tecnologias com custo elevado• Pressão dos pagadores para redução dos custos em

saúde• Redução da atuação humana com automação da

extração, amplificação e interfaceamento com sistema de apoio à decisão

• Nível de automação depende do número de exames � consolidação de laboratórios de análises clínicas

• O grande desafio é reduzir custos mantendo ou aumentando a qualidade do resultado

Perguntas

• Quais as doenças (excetuando as virais) nas quais os métodos moleculares são essenciais?

• Que tipos de alvos devem ser prioritariamente selecionados e quais as principais estratégias?

• Quais as principais metodologias aplicáveis ao laboratório clínico?

Problema

• O uso de antimicrobianos que alteram a microbiota entérica está relacionado à ocorrência de diarréia causada por Clostridium difficile.

• Em vários casos nos quais há evidências clínicas e epidemiológicas sugerindo essa etiologia, a pesquisa das toxinas A e B nas fezes é negativa.

• Algumas cepas são mais virulentas em função de maior produção e toxinas

Analisando

• Qual o padrão ouro?

– Cultura em meio seletivo seguido de teste de toxigenicidade

– Prazo de 5 a 7 dias

• Como é possível detectar

C. difficile

Fonte: Voth, 2005

Fonte: Sloan, 2008

Performance do testeClostridium difficile

Sloan et al., 2009

Outra estratégia

Fonte: Espy, 2006 Animação

Reanalisando

• Preparo de reagentes de amplificação (área 1)

• Extração manual (área 2)

• Montagem da reação (área 2)

• Amplificação e análise (área 3)

• É possível simplificar?

Realmente simplificando: GeneXpert

Realmente simplificando

• Pesquisa do DNA de C. difficile

– PCR em tempo real GeneXpert

Neisseria gonorrhoeae

• Paciente de 25 anos, sem parceiro sexual fixo, apresenta cervicite e uretrite.

• Foram coletadas amostras endocervical e uretral:

– Bacterioscópico com raros diplococos Gram-negativos intracelulares

– Cultura em meio seletivo para Neisseria: NEGATIVA

• O médico contesta os resultados

• O que pode ter ocorrido e o que pode ser feito?

Viabilidade bacteriana em meio de transporte

Fonte: Rishmawi, 2007

Neisseria gonorrhoeae

• Hjelmevoll, 2008

– 360 amostras (185 homens e 57 mulheres)

– 37 positivas por cultura e Rt-PCR para gene porA

– 15 positivas apenas por RT-PCR, confirmadas por sequenciamento de rRNA 16S

• Alerta: podem ocorrer resultados falsamente positivos em função da similaridade dom espécies não patogênicas.

Chlamydia trachomatis

• Sem parede celular

• Patógeno de multiplicação intracelular obrigatória

• Uretrite

• Cervicite

• Salpingite � infertilidade/esterilidade

Métodos disponíveis

• Isolamento em cultura de células McCoy –padrão ouro

• Imunofluorescência – sensibilidade 88%

• RT-PCR/Amplicor – sensibilidade 97%

SeptiFastDetecção de DNA bacteriano ou fúngico

em sangue total

• Escherichia coli

• Klebsiella sp.

• Enterobacter sp.

• Proteus mirabilis

• Pseudomonas aeruginosa

• Acinetobacter baumannii

• Stenotrophomonas

maltophilia

• Staphylococcus aureus

• SCN

• Streptococcus

pneumoniae

• Streptococcus spp.

• Enterococcus faecalis

• Enterococcus faecium

SeptiFastDetecção de DNA bacteriano ou

fúngico em sangue total

• Candida albicans

• Candida tropicalis

• Candida parapsilosis

• Candida krusei *

• Candida glabrata *

• Aspergillus fumigatus

Tempo de Análise

• Hemocultura

– Transporte/abertura de ficha � 1 hora

– Incubação em equipamento com leitura a cada 10 min

– Detecção em 6 a 72 horas

– Bacterioscópico e semeadura ou inoculação e sistema de automação

– 8 a 24 horas identificação

– Total 15 a 96 horas para possível intervenção

• SeptiFast

• 3 ml de sangue total

• Transporte/abertura de ficha

• Extração do DNA = 2 h

• Amplificação do DNA, análise e identificação da espécie = 3 h

• Total 6 horas para possível intervenção

Bases Moleculares

• Bactérias de crescimento rápido e fungos têm múltiplos operons de rRNA

• Alvo com múltiplas cópias no cromossomo �maior sensibilidade

rRNA E. coli - GenBank

Como Funciona

• Várias reações de PCR

• Análise de curva de “melting”

Estudos Recentes - ICAAC 2008

• Tsalik et al. – Duke University• Adultos febris atendidos no setor de emergências

(TA > 38,3⁰C)• Septifast e 1 par de hemoculturas• 142 pacientes recrutados, 20% com hemocultura

positiva• Definição de casos:

– Confirmado– Provável– Possível

ICAAC 2008

• Schaub et al. , Suíça

Testes positivos

Comparando os MétodosPadrão Ouro a Clínica

Considerações

• Há necessidade de estudos para a avaliação do impacto na mortalidade e tempo de internação

• Sensibilidade semelhante à hemocultura

• Menor tempo de resposta

• Redirecionamento do tratamento na sepse por P. aeruginosa, A. baumannii, S.

maltophilia ou Candida krusei/C. glabrata ?

Caso clínico

� Paciente de 34 anos, sexo masculino, HIV soropositivo apresenta, há duas semanas, febre, diarréia e dor em membro inferior direito em topografia de cicatriz cirúrgica.

� Há cerca de três meses havia sido submetido a cirurgia ortopédica com colocação de haste de fixação em função de fratura traumática de fêmur.

� A tomografia computadorizada de MI evidenciou abscesso no sítio cirúrgico e sinais de osteomielite.

Caso clínico

� O paciente foi submetido à drenagem cirúrgica da lesão e o material enviado para cultura geral, fungos e micobactérias

� Foram iniciados ceftazidima e vancomicina

� Após duas semanas não houve crescimento bacteriano ou fúngico

� Em função da persistência da febre foi solicitada a coleta de três hemoculturas

Giemsa

Identificação

Identificação

� Realizada extração do DNA do crescimento em Karmali.

� Amplificação e sequenciamento parcial do gene que codifica a subunidade 16S do RNA ribossômico (rRNA 16S).

Resultado do alinhamento da seqüência parcial do rRNA 16S com os depósitos do

GenBank

100% de similaridade com Helicobacter fenneliae

Outras aplicações

• Identificação do Complexo M. tuberculosis e diferenciação de M. bovis e M. bovis BCG.

Isolados Identificados na Rotina - Jan a Dez 2009 - Fleury N %

Complexo M. tuberculosis 55 55,0

Mycobacterium avium/intracellulare 22 22,0

Mycobacterium abscessus 8 8,0

Mycobacterium kansasii 7 7,0

Mycobacterium gordonae 2 2,0

Mycobacterium spp. 6 6,0

Culturas para micobactériasescarro ou lavado bronco-alveolar

Barnes PF, Cave MD. Molecular epidemiology of tuberculosis. N Engl J Med. 2003;349(12):1149-56.

Por que PCR Multiplex?

• 50% dos casos identificados em uma única reação

– redução de custo

– redução da carga de trabalho

– agilidade

• Diferenciação de M. bovis e M. bovis BCG (pirazinamida R)

Sequências alvo no multiplex

• IS6110 � complexo MTB

• hsp65 � todas as micobactérias

• Espaçadores 33 e 34 – região DR �diferenciação de M. bovis e M. bovis BCG

• Yeboah-Manu D, Yates MD, Wilson SM. Application of a simple multiplex PCR to aid in routine work of the mycobacterium reference laboratory. J Clin Microbiol. 2001;39(11):4166-8.

Região DR

DR 30 DR 31 DR 32 DR 37 DR 38 DR 39 DR 40 DR 41 DR 42 M.tuberculosis

DR 30 DR 31 DR 25 DR 32 DR 33 DR 34 DR 35 DR 36 DR 37M.bovis

selvagem

99 bp

DR 30 DR 31 DR 25 DR 32 DR 33 DR 33 DR 34 DR 35 DR 36 M.bovis BCG

172 bp

99 bp

PCR Multiplexo

O que fazer para identificar as demais espécies

• rRNA 16S (rrs)

• hsp65

• ITS 16S-23S

• sodA

• gyrB

• rpoB

Alvos mais Utilizados • rRNA 16S (rrs)

– Aproximadamente 1.500 bp

– Regiões hipervariáveis A (129-267) e B (430-500)

– Na prática 9 � 609

– Não permite diferenciação:• espécies do complexo MTB

• M. abscessus e M. chelonae

• M. zulgai e M. malmoense

• M. kansasii e M. gastri

• M. ulcerans e M. marinum

• M. shimoidei e M. triviale

Alvos mais Utilizados

• hsp65

– 1623 bp

– Na prática 146 � 585 = 441bp

– Permite diferenciação• M. abscessus e M. chelonae

• M. zulgai e M. malmoense

• M. kansasii e M. gastri

– Não permite diferenciação• Espécies do Complexo MTB

Seqüenciamento de DNA

Fundamentos

Estrutura dos Ácidos Nucleicos

Nucleotídeos Estrutura dos Ácidos Nucleicos

DNA

RNA

Ligação Fosfodiéster

Ligação Fosfodiester

Dideoxinucleotídio – Frederick Sanger Prêmio Nobel Química - 1980

Sequenciamento de DNA

• cycseqpc.exe

O laboratório clínico hojeExtração automatizada

Estação para preparo automatizado de reações

Automação – HIV-HCV-HBV

Automação

Automação

Automação