1 Determinazione dei batteri lattici nei prodotti lattiero caseari: metodi, terreni, tecniche Angiolella Lombardi Veneto Agricoltura Istituto per la Qualità e le Tecnologie Agroalimentari MontegrottoTerme, 6-7 dicembre 2012 12° Meeting responsabili e tecnici laboratorio settore lattiero caseario Il ruolo positivo dei batteri lattici nella produzione di latti fermentati Acidificazione (fermentazione lattica) Produzione di acetaldeide Produzione di polisaccaridi - Batteri lattici con caratteristiche probiotiche 2 A. Lombardi - Batteri lattici nei prodotti caseari
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Determinazione dei batteri lattici nei prodotti lattiero ... · nella produzione di latti fermentati Acidificazione (fermentazione lattica) Produzione di acetaldeide ... Norma titolo
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Determinazione dei batteri lattici nei prodotti lattiero caseari: metodi, terreni, tecniche
Angiolella LombardiVeneto Agricoltura
Istituto per la Qualità e le Tecnologie Agroalimentari
MontegrottoTerme, 6-7 dicembre 2012
12° Meeting responsabili e tecnici laboratorio settore lattiero caseario
Il ruolo positivo dei batteri lattici nella produzione di latti fermentati
� Acidificazione (fermentazione lattica)
� Produzione di acetaldeide
� Produzione di polisaccaridi
- Batteri lattici con caratteristiche probiotiche
2A. Lombardi - Batteri lattici nei prodotti caseari
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Il ruolo positivo dei batteri lattici nella produzione di formaggi
ISO 20128-IDF192:2006Milk Products – Enumeration of presumptive Lactobacillus
acidophilus on a selective medium-Colony count technique at 37°C
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Conteggio di Lactobacillus acidophilus
Mezzo di coltura MRS + Clindamycin + Ciprofloxacin
Inoculo spatolamento
Atmosfera incubazione anaerobiosi
Incubazione 37°C x 72 +/-3 h
Lettura colonie colonie piatte opache
grigio biancastre
bordi irregolari
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ISO 27205-IDF149:2010-Fermented milk Products – Bacterial starter cultures – standard of identity
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Specifica caratteristiche delle colture starter del settore lattierocaseario (batteri lattici, ma anche bifidobatteri e propionibatteri)
Microrganismo Metodo
L.delbrueckii subsp. bulgaricus
MRS acidificato come ISO 7889-IDF117:2003
L. acidophilus MRS+ Cli e Cipro come ISO 20128-IDF 292: 2006
S. thermophilus M17 pH6,8 come ISO 7889-IDF117: 2003
Lattococchi M17pH7,2, come da ISO 7889 incubato in aerobiosi a 30 °C per 72 ore
Colture miste S. thermophilus -lattococchi
S.thermophilus : M17pH6,8 45 °C aerobiosi 48 hLattococchi M17pH7,2 20 °C aerobiosi 5 g
CCFRA Method 2.7.1:2007Enumeration of presumptive Enterococcus
species:colony count technique
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Il metodo propone diversi mezzi per il conteggio degli enterococchinegli alimenti e nei mangimi: KF streptococcus agar, Kanamicina,-esculina-azide agar (KAA), Slanetz e Bartley agar (SB)
�KAA inoculo per spreading,�37 °C per 24 h ± 4 h
�Necessaria conferma
�Sodio azide e kanamicinaagenti selettivi
�Esculina agente differenziale
Colonie bianche o grigie circondate da un alone nero da confermare
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ISO 29981-IDF220:2010 Milk Products-Enumeration of presumptive bifidobacteria-Colony count technique at 37 °C
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�TOS-MUP propionato agar + agenti selettivi (litio-mupirocina) egalatto-oligosaccaridi (TOS)
� Inoculo per inclusione, incubazione 37 ° C per 72 h in anerobiosi
Litio e mupirocina inibisconocrescita S. thermophilus, L.delbrueckii subsp. bulgaricus, L.acidophilus, L. casei, L.rhamnosus, Lactococcus lactis,
Galatto-oligosaccaridi (TOS)favoriscono sviluppo deibifidobatteri
Colonie bianche piccole da confermare
FIL-IDF 149A. 1997. Levains lactiques de cultures de bactéries lactiques. Norme de composition
Leuconostoc
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�MSE Agar (Mayeux, Sandine, Elliker),
� Inoculo per spreading, incubazione a 22 °C per 4-5 g in aerobiosi
.
L. mesenteroides dextranicum forma colonie mucose, gelatinose, altri Leuconostoc formano colonie piccole incolori
Sodio azide del terrenoinibisce batteri Gram - elattococchi
Saccarosio favorisceformazione destrani.
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ISO17792-IDF180:2006Milk, milk products and mesophilic starter cultures –Enumeration of citrate fermenting bacteria.Colony
count technique at 25 °C
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Terreno di Nickels eLeesment, contenente citratoe calcio lattato, incubato a 25°C in aerobiosi per 72 h. Dopoincubazione viene aggiunto X-gal, ulteriore incubazione per24 ore
Citrato fermentanti presentano alone attorno alla colonia
Lactococcus colonie bianche
Leuconostoc colonie blu
Altri batteri lattici
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L. casei/paracasei, L. rhamnosus, L.plantarumNSLAB formaggi Latti fermentati, probiotici
MRS agar + vancomicina ( 10 µg/ml)
Incubazione 30 °C , anaerobiosi, 72 h.
In questo terreno possono sviluppare
anche pediococchi e Leuconostoc
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Batteri lattici eterofermentanti
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�Terreno HHD consente differenziare batteri lattici omo edeterofermentanti in base alla differente acidificazione delfruttosio presente in bassa concentrazione in questo mezzo.
�Dopo incubazione 30 °C per 72 h i batteri omofermentanticrescono con colonie blu-verdi, mentre quelli eterofermentanti concolonie incolori (non acidificano e quindi non determinano il viraggiodel verde bromocresolo)
�In alternativa per il conteggio degli eterofermentanti:
MRS; verifica produzione gas in un numero rappresentativo dicolonie
Leuconostoc: MSE 22°C per 4-5 g
Metodi di controllo sieroinnesti-Criticità
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-2-8 x 108 ufc/ml-dominanza L. helveticus (80-85%), presenza di diversibiotipi-L. delbrueckii subsp. bulgaricus e subsp. lactis-L. fermentum (eterofermentante)-Talora presenza di S. thermophilus
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Microrganismo Metodo Campo applicazione
Terreno
S. thermophilus ISO 7889-IDF 117: 2003
Yogurt M17 agar, aerobiosi a 37 °C per 48 ore
Colture miste S. thermophilus -lattococchi
ISO 27205 - IDF 149:2003
Colture starter termofile
S.thermophilus : M17
pH6,8 45 °C aerobiosi 48 h
Risultati molto variabili in funzione di:
�Brand commerciale terreno�Modalità di aggiunta del lattosio �Temperatura di incubazione�Aggiunta di ulteriori “ingredienti” (latte peptonizzato)
E i probiotici?
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Es latte fermentato contenente S. thermophilus, L.bulgaricus, L. acidophilus, Bifidobacterium lactisS. thermophilus ISO 7889-IDF 117: 2003
B. lactis ISO 29981- IDF 220: 2010
L. acidophilus ISO 20128-IDF 292: 2006
L. delbrueckii subsp. bulgaricus ?�ISO 7889-IDF 117: 2003 non consente conta differenziale
L. bulgaricus-L. acidophilus�Semina per spreading e differenziazione morfologia colonie?
�Conferma colonie mediante ISO 9232: 2003-IDF 146?
�Conferma mediante PCR?
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Conclusioni
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� Sono disponibili diversi metodi per il conteggio dibatteri lattici.
� Tuttavia, data la complessità di questo gruppomicrobico e la presenza in uno stesso alimento di piùgeneri/specie permangono delle criticità
� Adattamento del metodo in funzione del prodotto
� Necessità di confronti interlaboratori su matrici reali
� Sviluppo di metodi che consentano di individuaregruppi di batteri lattici con attività potenzialmentenegative (es. proteolitici,, eterofermentantiobbligati)?