UNIVERSIDAD POPULAR DEL CESAR
FACULTAD DE INGENIERAS Y TECNOLOGAS
INGENIERIA AGROINDUSTRIAL
DETERMINACIN DE Salmonella sp
ALBERNIA DELGADO JOHAN
BOLIVAR ZULETA ELKIN
GUERRERO MORENO NELSON
HERRERA ROCHA FABIO ESTEBAN
MARTINEZ MARTINEZ DAVINSON
PEALOZA MERCADO SANDY
VALLEDUPAR CESAR 12/ 11 / 2014
PROCEDIMIENTO1. ENRIQUECIMIENTO NO SELECTIVO
Mezclar muy bien la muestra (si es liquida) para asegurar su
homogenizacin.Desinfectar con alcohol al 75% el sitio por donde se
vaya a extraer la muestra.Abrir aspticamente ( con el mechero en
medio) y adecuadamente la muestra.Si es slida tomar porciones de
diferentes sitios de la muestra.Pesar 25 gramos de la muestra en
balanza analtica si es slida, sobre un papel graff estril o medir
25 mililitros si es liquida en recipiente estril.Macerar, picar o
triturar.Aadir al recipiente de dilucin que contiene 225 ml de agua
peptonada Cuando se analiza leche en polvo, utilizar agua destilada
adicionada de 5 ml de solucin verde brillante al 0.1%Incubar a 35 +
/ - 2C por 18 24 horasRealizar controles positivos y negativos con
cepas conocidas 2. ENRIQUECIMIENTO SELECTIVOTransferir 0.1 ml de
cultivo obtenido del enriquecido no selectivo en 10 ml de caldo
Rappaport Vassiliadis Transferir 1ml para el Caldo Muller -
Kauffmann Incubar el caldo Rappaport Vassiliadis a 44.5C por 18-24
horas y el caldo Muller Kauffmann a 37C durante 18-24horas.3.
SIEMBRA EN PLACAS CON MEDIOS SELECTIVOS Y DIFERENCIALESSe debe
utilizar como minimo dos medio s selectivos por cada caldo de
enriquecimiento no selectivo y selectivo para el aislamiento del
microorganismo, se recomienda el agar bismuto sulfito, al agar
verde verde brillante lactosa sacarosa con novobiocina y el agar
XLD.
A partir de cada uno de los cultivos obtenidos del
enriquecimiento no selectivo y selectivo, sembrar en superficie con
asa por agotamiento placas con agar verde brillante lactosa
sacarosa, agar bismuto sulfito o agar XLD. Incubar las placas a 35C
+ / - 2C durante 24 48 horasEscoger 3 colonias tpicas sospechosas
de SalmonellaAislarlas en Agar selectivo para garantizar su
pureza.Proceder a su identificacin teniendo en cuenta que las
colonias presuntivas de salmonella deben estar bajo este esquema:
Salmonella tipica: TSI: K/A, H2S + ; LIA: K/ k, K/A, H2S +
Salmonella atipica: TSI K/A, H2S - ; LIA: : K/ k, K/A, H2S
Salmonella grupo III: TSI: A/A , H2S + ; LIA: k/k, H2S + 4.
IDENTIFICACIN DE SalmonellaLa identificacin de cultivos sospechosos
de pertenecer al gnero Salmonella sp incluye dos Etapas seguidas:
Comprobacin de las colonias sospechosas mediante pruebas bioqumicas
confirmativas Identificacin serolgica de las cepas sospechosas
mediante el uso de antisueros.4.1. Realizar las siguientes pruebas
bioqumicascoloracin de Gram, prueba de oxidasa, fermentacin de
carbohidratos(glucosa, lactosa y sacarosa),prueba de la lisina
descarboxilasa, movilidad, reduccin de nitrato rojo de metilo voges
proskauer (MR-VP), produccin de indol, reaccin en agar citrato de
Simmons, reaccin en agar urea, desaminacin de la
fenilalanina(APP)
INTERPRETACION DE RESULTADOS La presente tcnica para la deteccin
de Salmonella en alimentos, describio un esquema general que
consiste de 5 pasos bsicos: 1. Preenriquecimiento, es el paso en
donde la muestra fue enriquecida en un medio nutritivo no
selectivo, que permitio restaurar las clulas de Salmonella daadas,
logrando de esta manera una condicin fisiolgica estable. 2.
Enriquecimiento selectivo, se logro a partir de un medio de cultivo
que conjuntaras dos condiciones, por un lado debe incrementar las
poblaciones de Salmonella y por otro inhibir otros microorganismos
presentes en la muestra. En nuetro caso fue Caldo
Vassiliadis-Rappaport y Caldo Mller Kauffmann 3. Seleccin en medios
slidos, este punto se derivo directamente del anterior y se
utilizaron medios selectivos, que restringieron el crecimiento de
otros gneros diferentes a Salmonella y que permitio el
reconocimiento visual caracterstico de colonias sospechosas. Los
medios usados fueron Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD); Agar SS
y Agar Bismuto Sulfito.
Medio selectivoCaractersticascoloniales deSalmonella
sppComposicion y fundamentoResultados
Agar XLDRosas o rojas pueden ser transparentes, con o sin centro
negro. En algunos casos completamente negras o del mismo color del
medio con centro negro. las colonias de Salmonella H2S negativo
(ej. S. Paratyphi en el XLD son rosadas con un centro rosa oscuro y
las de Salmonella lactosa positivas son de color amarillo con o sin
centro negro.
Utiliza el desoxicolato de sodio como agente selectivo y, por
consiguiente, inhibe los microorganismos gram positivos.Xilosa ,
Lactosa sacarosa (genera la produccin de cido haciendo virar el
indicador (rojo fenol) de rojo a amarillo.) L-Lisina, se incuye
para aumentar la diferenciacion de Salmonella ya que sin la lisisna
estos microoganismos fermentan rapidamente la xilosa porduciendo
acidificaciond del medio y no pudiendolas diferenciar. Cloruro
sdico Extracto de levadura Rojo fenol Desoxicolato de sodio Citrato
frrico de amonio , Tiosulfato sdico (indicador de produccion de
H2S, colonias de centro negro)AgarSe observ colonias rosadas
algunas con centro negro.
Agar SSTranslcidas en ocasiones opacas. Algunas con centro
negro. Las colonias fermentadoras de lactosa son rojasExtracto de
carne bovina Digerido pancretico de casena Digerido pptico de
tejido animal Lactosa Sales biliares Citrato sdico Tiosulfato sdico
(formacion de SH2)Citrato frrico Rojo neutro (indicador)Agar Verde
brillante
pH: 7,2
Los microrganismos fermentadores de lactosa acidifican el medio
haciendo virar al rojo el indicado de pH obtenindose como resultado
colonias rosadas o rojas sobre un fondo rojizo. Mientras que
Salmonella que es un microorganismo no fermentador de la lactosa
creci adecuadamente en el medio de cultivo y produjo colonias
transparente.La produccin de cido sulfhdrico se evidenciara como
colonias con centro negro debido a la formacin de sulfuro de
hierro. Ninguna de las colonias presento centro negro.
Agar Bismuto SulfitoCaf, grises o negras; con o sin brillo
metlico. Algunas veces presencia de halo caf o negro.Extracto de
carne, digerido pancreatico (inhibe crecimiento Gram (+), digerido
peptico de tejido animal dextrosa, fosfto de sodio, sulfato
ferroso, indicado de sulfito de bisuto, agar, verde brillante, agua
destilada. Antes de inocular era opaco, verde palidoSe observaron
colonias translucidas con centro negras con poco brillo metlico.
(sin halo negro)
4. Identificacin bioqumica, este paso permitio la identificacin
genrica de los cultivos de Salmonella y la eliminacin de cultivos
sospechosos falsos.
Las reacciones biquimicas de Salmonella que fueron aplicadas en
agar LIA y TSI. Se tomaron colonias presuntivas y se procedio a
realizar pruebas biquimicas.
LIA FUNDAMENTO Y COMPOSICIONla peptona y el extracto de levadura
(nutrientes); La glucosa(hidrato de carbono fermentable) ; lisina
es el sustrato utilizado para detectar la presencia de las enzimas
decarboxilasa y deaminasa. El citrato de hierro y amonio, y el
tiosulfato de sodio, son los indicadores de la produccin de cido
sulfhdrico; El purpura de bromocresol, es el indicador de pH, el
cual es de color amarillo a pH igual o menor a 5.2, y de color
violeta a pH igual o mayor a 6.8.Por decarboxilacin de la lisina,
se produce la amina cadaverina, que alcaliniza el medio y esto
produce el viraje del indicador al color violeta. La decarboxilacin
de la lisina, tiene lugar en medio cido, por lo que es necesario
que la glucosa sea previamente fermentadaLos microorganismos que no
producen lisina decarboxilasa, pero que son fermentadores de la
glucosa, producen un viraje de la totalidad del medio de cultivo al
amarillo, pero a las 24 hs de incubacin se observa el pico de color
violeta debido al consumo de las peptonas, y el fondo amarillo.La
produccin de sulfuro de hidrgeno, se visualiza por el
ennegrecimiento del medio debido a la formacin de sulfuro de
hierrRESULTADOS 1. Decarboxilacin de la lisina:Prueba Positiva:
Pico violeta/fondo violeta.Prueba Negativa: Pico violeta/fondo
amarillo.2. Desaminacin de la lisina:Pico rojizo/fondo amarillo..3.
Produccin de cido sulfhdrico:Prueba positiva: Ennegrecimiento del
medio (especialmente en el lmite del pico y fondo)Para Salmonella
typhimurium y Salmonella enteritidis, el control de calidad
es:Microoganismo Color en el pico de flautaColor en la base del
tubo Ennegrecimieto del medio
Salmonella typhimurium PurpuraPurpuraPositivo
Salmonella enteritidisPurpuraPurpurapositivo
Informe de resultado para LIA
No se presento ennegrecimiento del medio, el fondo del tubo se
manifesto color amarillo, el pico de flauta se manifesto color
purpura. No se evidencio presencia de Salmonella typhimurium o de
Salmonella enteritidi.
TSI FUNDAMENTO Y COMPOSICION extracto de carne, pluripeptona
(nutrientes)cloruro de sodio lactosa, sacarosa y glucosa (hidratos
de carbonos fermentables)sulfato de hierro y amonio (produccion de
acido sulfhidrico)tiosulfato de sodio (se reduce a sulfuro de
hidrogeno que reaccina luego con una sal de hierro proporcionando
el color tipico sulfuro de hierro de color negro)rojo de
fenol(indicador acido)agar INTERPRETACION DE RESULTADOS 1.
Superficie alcalina/profundidad cida (pico rojo/fondo amarillo): el
microorganismo solamente fermenta la glucosa2. superficie
acida/profundida acida (pico amarillo/fondo amarillo): el
microoganismo fermenta glucosa, lactosa y/o sacarosa.3. superficie
alcalina/profundidad alcalina(pico rojo/fondo rojo):el
microoganismo es no fermentador de azucares4. la presencia de
burbujas o ruptura del medio de cultivo indica que el microoganismo
produce gas.5. el ennegrecimiento del medio indica que el
microoganismo produce acido sulhidrico.
Para Salmonella typhimurium el control de calidad debe ser:
MicrooganismoSuperficie/profundidadProduccion de gasProduccion
de SH2
Salmonella typhimuriumK/ANegativoPositivo
Donde A es reaccion acida (color amarilla) y K es reccion
alcalina (color rojo)Informe de Resultados para TSI
Se evidenca presencia de gas por la separacion del medio, K/A
(pico rojo, fondo amarillo), no se evidencio enengrecimiento del
medio, es decir, no hay produccion de acido sulfhidrico. Negativo
para Salmonella typhimurium
Nuestro anlisis fue comparado con la investigacin Presencia del
gen de invasividad inv A en cepas de Salmonella spp. aisladas de
alimentos del Caribe Colombiano(Espinal-Prieto, et al; 2006) cuyo
objetivo fue establecer la presencia del gen de invasividad invA en
aislamientos de Salmonella spp. obtenidos de alimentos en la regin
Caribe Colombiana. Los resultados obtenidos en la investigacion
fueron los siguiente: se recuperaron 74 aislamientos de Salmonella
spp. , en carne de res 30 (40,5 %), embutidos 13 (17,6 %), pollo 12
(16,2 %), queso 9 (12,2 %), cerdo 6 (8,1 %) y otros 4 (5,5 %). Los
serotipos ms frecuentes fueron: S. anatum 14 (18,9 %), S. uganda 13
(17,6 %), S. newport 9 (12,2 %) y S. typhimurium 7 (9,5 %). el gen
invA se detect en 72 (97,3 %) aislamientos de Salmonella.El
procedimiento que se realizo en el estudio fue similar al realizado
en el laboratorio (con excepcin de la realizacion de las pruebas
serologicasque no fueron realizadas): se pesaron 25 g de cada
muestra de alimento que fueron inoculados en 225 mL de medios de
preenriquecimiento, agua peptonada y caldo infusin cerebro corazn y
se incubaron a 37 C durante 18-24 h. Se inocul 1 mL de cada muestra
anterior en 9 mL de medio Rappaport y se incubaron a 43 C entre
18-24 h. Se inocul 1 mL de cada muestra en 9 mL de Tetrationato
lquido y se incubaron a 37 C durante 18-24 h. Cada muestra fue
subcultivada tomando una asada de los tubos de enriquecimiento y su
siembra por agotamiento en agar base XLT4 (Difco Detroit, Mi USA),
XLD, SMID (Biomeriux, etoiac, France), SS, Hekctoen y Sulfito
Bismuto; estas placas se incubaron a 37 C por 18-24 h. A las
colonias sospechosas de Salmonella se les realizaron pruebas
bioqumicas convencionales (Urea, LIA y TSI) incubndolas a 37 C
durante 18-24 h para ser identificadas. Se confirmaron con
antisueros polivalentes para Salmonella (Difco, Detroit, Mi,
EE.UU.). Cada cepa se conserv por triplicado en tubos de Skin Milk
a -70 C.Mediante las pruebas serologicas se detect la presencia del
gen invA en los serotipos de Salmonella circulantes en alimentos en
la regin Caribe Colombiana.los alimento que fueron analizados
fueron:agua, arepa de huevo, carne de res, cerdo, embutido, pollo
quesos viceras en ciudades como Barranquilla, Cartagena, Monteria,
Sincelejo:
INFORME DE RESULTADOS DE LABORATORIO Ausencia de de Salmonella
sp/ 25 gramos de muestra de salchicha Ranchera marca Zenu.
CONCLUCIONDebido a que no se evidencio Salmonella sp. en una
salchicha Ranchera marca Zenu, se puede deducir que es apta para el
consumo humano y que cumple la Norma Tecnica Colombiana NTC 1325 el
cual reza que entre los requisitos microbiologicos para productos
carnicos procesados cocidos la deteccion de Salmonella,/25 g debe
ser ausencia; sin embargo, no se descarta la evidencia de otros
microoganismo en la muestra, por lo que no podemos concluir si es
apta o no. Posiblemente se evidencio el crecimiento de otros
microganismos debio a que la mala manipulacion y almacenamiento del
producto, pues el producto se adquirio de un establecimiento donde
para su comercializacion las salchichas son sacadas de su empaque
original para ser comercializadas al detal, y expuestas a
contaminacion cruzadas por otros productos almacenados en la cadena
de frio, tales como verduras, frutas, carnes crudasde pollo y res ,
leches empacadas en bolsa, sanguazas, etc.
BIBLIOGRAFIA Instituto COLOMBIANO DE NORMAS TECNICAS Y
CERTIFICACION. Industrias Alimentarias. Productos Crnicos no
Procesados.5 actualizacin, Bogot. ICONTEC (NTC 1325).ESPINAL MARIN,
Paula; PRIETO SUAREZ, Edgar; OTERO JIMENEZ, Vanessa y MATTAR
VELILLA, Salim. Presencia del gen de invasividad inv A en cepas de
Salmonella spp: aisladas de alimentos del Caribe Colombiano. Rev
Cubana Salud Pblica [online]. 2006, vol.32, n.2 [citado
2014-11-04], pp. 0-0 . Disponible en: . ISSN 0864-3466.Referencia
en internetHoja tcnica para
LIAURL:http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/lisinahierroagar.htmHoja
tcnica para TSI
URL:http://www.britanialab.com/productos/332_hoja_tecnica_es.pdfHoja
tcnica para Agar XLD
URL:http://www.britanialab.com/productos/337_hoja_tecnica_es.pdfHoja
tcnica para Agar SSURL:
http://www.britanialab.com/productos/337_hoja_tecnica_es.pdfHoja
tcnica para Agar Bismuto de Sulfito (laboratorio
Pronadisa)URL:http://www.condalab.com/uploads/media/1011__AGAR_BISMUTO_SULFITO_REv_0_Abril_2010_01.pdf