1 ESTUDIO DE PORTACION NASAL DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS EN ESTUDIANTES DE MEDICINA DE LA UNIVERSIDAD DE CARTAGENA EN EL PRIMER SEMESTRE DEL AÑO 2008 PASANTIA REALIZADA EN EL GRUPO DE GENETICA Y BIOLOGIA MOLECULAR DE LA FACULTAD DE MEDICINA, UNIVERSIDAD DE CARTAGENA CARTAGENA - COLOMBIA YORLAIS ALBERTO ARROYO BARRIOS AREA DE PROFUNDIZACIÓN: Microbiología UNIVERSIDAD DE SUCRE FACULTAD DE EDUCACION Y CIENCIAS PROGRAMA DE BIOLOGIA SINCELEJO – COLOMBIA 2009
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DETERMINACION DE LA PREVALENCIA DE PORTACION NASAL DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS EN ... · 2015-04-28 · El género Staphylococcus está formado por cocos Gram positivos, de 0.5 a 1.5
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ESTUDIO DE PORTACION NASAL DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS
EN ESTUDIANTES DE MEDICINA DE LA UNIVERSIDAD DE
CARTAGENA EN EL PRIMER SEMESTRE DEL AÑO 2008
PASANTIA REALIZADA
EN EL GRUPO DE GENETICA Y BIOLOGIA MOLECULAR DE LA
FACULTAD DE MEDICINA, UNIVERSIDAD DE CARTAGENA
CARTAGENA - COLOMBIA
YORLAIS ALBERTO ARROYO BARRIOS
AREA DE PROFUNDIZACIÓN:Microbiología
UNIVERSIDAD DE SUCREFACULTAD DE EDUCACION Y CIENCIAS
PROGRAMA DE BIOLOGIASINCELEJO – COLOMBIA
2009
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ESTUDIO DE PORTACION NASAL DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS
EN ESTUDIANTES DE MEDICINA DE LA UNIVERSIDAD DE
CARTAGENA EN EL PRIMER SEMESTRE DEL AÑO 2008
PASANTIA REALIZADA
EN EL GRUPO DE GENETICA Y BIOLOGIA MOLECULAR DE LA
FACULTAD DE MEDICINA, UNIVERSIDAD DE CARTAGENA
CARTAGENA - COLOMBIA
YORLAIS ALBERTO ARROYO BARRIOS
AREA DE PROFUNDIZACIÓN:Microbiología
DIRECTOR:NIRADIZ REYES RAMOS, Ph.D.
CODIRECTOR:
JUAN MANUEL DIA SOTO, M.Sc.Universidad de Sucre
TUTOR
ALFONSO BETIN MARTINEZ
UNIVERSIDAD DE SUCREFACULTAD DE EDUCACION Y CIENCIAS
PROGRAMA DE BIOLOGIASINCELEJO – COLOMBIA
2009
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“Únicamente los autores son responsables de las ideas expuestas en elpresente trabajo” articulo 12 resolución 02 de 2003.
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Nota de aceptación
Firma del presidente del jurado
Firma del jurado
Firma del jurado
Sincelejo, 2009.
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Lo más bello que podemos experimentar es el lado misterioso de la vida. Es el
sentimiento profundo que se encuentra en la cuna del arte y de la ciencia verdadera.
Albert Einstein
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AGRADECIMIENTOS
Deseo expresar mi más sincero agradecimiento:
A toda mi familia por su apoyo incondicional en especial a mi padre y a mi
madre, cuya lección de amor, fuerza y coraje me marco el camino a seguir.
A la directora de esta pasantia – la doctora Niradiz Reyes Ramos por la
oportunidad brindada en su grupo de investigación, por su confianza y ayuda
constante. Me considero afortunado por haber podido estar bajo su tutoría,
siempre estaré en deuda con ella.
A mi codirector Juan Manuel Díaz soto por transmitir con pasión su
conocimiento, por su compromiso con la ciencia y la biología por trasmitir la
inquietud y por su invaluable ayuda.
Al semillero de investigación de genética y biología molecular de la
Universidad de Cartagena por su acogida, colaboración y la amistad
brindada.
Al joven investigador Alfonso Batín por acogerme e iniciarme en el campo de
la Microbiología por su predisposición permanente en aclarar mis dudas, por
su paciencia y apoyo incondicional.
A mis compañeros de laboratorio, en especial a (guillo, jharol, Karen,) por el
tiempo que hemos compartido entre largas conversaciones, divagaciones
científicas, confesiones, alegrías y algunos momentos de melancolía. Creo
que nos acordaremos siempre de este año.
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A mayito a quien no solo le agradezco su plena colaboración, su simpatía, si
no le doy gracia por brindarme su amistad.
Al personal de apoyo del área de la Microbiología de la Universidad de
Cartagena (Gregorio young, la señora marta Puello, la señora Ketty
Mendoza y la señora Soraya Rodríguez) por su ayuda, por su afectiva y
efectiva acogida.
A mi “Alma Mater” la Universidad de Sucre por brindarme la formación
académica que hoy me permite alcanzar el éxito profesional.
A la Universidad de Cartagena por facilitarnos la infraestructura para realizar
este proyecto.
A mis amigos y compañeros de estudios en especial Wilson manchego,
Jesús Anaya por disfrutar de esos péquenos momentos, por las largas
conversaciones. A jorge por su sentido del humor por sus consejos y por
tantas inquietudes….
A Rosmy por haberle dado un sentido especial a mi vida.
Y a todas aquellas personas que habiéndome prestado su colaboración, de
ANALISIS MICROSCOPICO E IDENTIFICACION BIOQUIMICA….27
ANALISIS MICROSCOPICO…………………………………………..27 Tinción de gram……………………………………………………...27 PRUEBAS DE IDENTIFICACION BIOQUIMICA…………………....28 Prueba de la catalasa…………………………………………………28 Prueba de la coagulasa …………………………………………........29 Prueba de aglutinación en látex ……………………………………..30 PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD ANTIBIOTICA…………………...31 CONSERVACIÓN DE LAS CEPAS……………………………………32 ANALISIS ESTADISTICO……………………………………………...32RESULTADOS……………………………………………………………….. ...33
DISCUSION……………………………………………………………………..37
CONCLUSIONES……………………………………………………………….41
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS…………………………………………...42
CAPITULO 2. REVISIÓN……………………………………………………...52
TECNICAS DE TIPIFICACION DE Staphylococcus aureus………………… 52
BIOTIPIFICACION…………………………………………………57 SEROTIPIFICACION………………………………………………59 ANALISIS ELECTROFORETICO DE PROTEINAS……………...60
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METODOS GENOTIPICOS…………………………………………….60ANALISIS DE DNA PLASMIDICO……………………………….62
ANALISIS DE DNA CROMOSOMICO…………………………...64 Electroforesis en geles de agarosa en campo constante………….64
Electroforesis en geles de agarosa en campo pulsante (PFGE)….65Ribotipificación…………………………………………………..68
TECNICAS DE TIPIFICACION BASADAS EN LA PCR………...69Amplificación al azar de ADN polimorfico (RAPD)…………….70PCR – Ribotipia…………………………………………………..72PCR – RLFP……………………………………………………...72
REC – PCR………………………………………………………73 AFLP……………………………………………………………..75 Tipificación de secuencias multilocus (MLST)…………………..75REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS…………………………………………...79ANEXOS…………………………………………………………………………92 ANEXO 1. Consentimiento informado…………………………………….93 ANEXO 2. Formato recolección de datos………………………………….94 ANEXO 3. Prueba de aglutinación en látex……………………………….95
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INTRODUCCION
El género Staphylococcus está formado por cocos Gram positivos, de 0.5 a
1.5 mm de diámetro, que se presentan aislados, en pares, tétradas o
cadenas cortas y en grupos irregulares. Son bacterias catalasa positivas,
inmóviles, oxidasa negativas y la mayoría de las especies que lo forman son
anaerobias facultativas. Staphylococcus aureus es de las 35 especies que
tiene el género la de mayor importancia, que se distingue por ser coagulasa
positiva, fermentador de varios azúcares, entre ellos, el manitol, altamente
resistente al calor y la desecación y puede crecer en condiciones de salinidad
(NaCl 7,5% p/v) (Banerman T, 2002).
S. aureus es considerado parte de la flora normal del hombre, siendo la
colonización de las fosas nasales el reservorio primario y la fuente usual de
infección, por lo que debe ser considerado como un patógeno oportunista
(Casewell M, et al. 1986; Moss B, et al. 1948; Williams R, et al. 1946). Capaz
de causar un amplio espectro de enfermedades asociadas con elevada
morbi-mortalidad, logrando variar desde infecciones cutáneas, tales como,
impétigo, infecciones de heridas, infecciones asociadas a elementos
prostéticos (prótesis), hasta infecciones sistémicas con riesgo de vida
(endocarditis, osteomielitis, neumonía, meningitis, bacteriemia), y
enfermedades producidas por toxinas (intoxicación alimentaria, síndrome de
la piel escaldada o síndrome de shock tóxico) (Morton N, 1990; Jones M,
1999). Su protagonismo ha crecido en las últimos décadas gracias al mayor
aislamiento de una nueva cepa, S. aureus meticilino resistente (SAMR), y la
aparición de cepas con multiresistencia. Hasta hace poco considerado
patógeno principalmente nosocomial, hoy cobra real importancia como
patógeno comunitario (Bearman G, 2004; Naimi T, et al. 2001).
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Estudios epidemiológicos de portación nasal de S. aureus han estimado que
el 20 - 40% de las personas adultas son portadoras, distinguiendo 3 patrones
de portación diferente: persistente, intermitente y no portador (Fekety
F.1964), con porcentajes que pueden ir desde el 30% de la población
persistente, 50% en portadores intermitente y un 20% que nunca ha sido
colonizado (Mandell G, et al.1997; Marjolein F, et al.1999). De igual forma
asociados con diversos factores de riesgo entre los que podemos destacar:
internación (centros asistenciales o casas de salud) reciente, enfermedades
alérgicas, exposición a antibióticos, enfermedad crónica, drogas de adicción
o contacto cercano con personas con los factores de riesgos anteriores
(Oliveira D, et al. 2002; Aires De Sousa, et al. 2001).
Según lo descrito en la literatura, la prevalencia de portación nasal por S.
aureus puede variar de acuerdo a la población en estudio, encontrando que
el personal de salud es mas propenso a su colonización con porcentajes que
pueden llegar al 56 % en contraste con 26% de la población general
(Kluytmans J, et al.1997; Walker T, 2000), habiéndose reportado en
numerosas ocasiones el rol de este personal como transmisor y reservorio de
cepas epidémicas (Yu V, et al. 1986; Zimakoff J, et al.1996; Opal S, et
al.1990). Parte de este personal de salud altamente vulnerable corresponde
a los estudiantes de medicina, que viven en contacto directo no solo con el
personal clínico si no también comunitario en sus diferentes prácticas y si le
sumamos a esto el escaso control de las infecciones a nivel hospitalario
llevan a establecerlo como un grupo en alto riesgo para la colonización de
S. aureus (Baliga S, et al. 2007, Stubbs E, et al.1994, Werner E. et al.2004).
Lo descrito anteriormente genero interés en el grupo de Genética y Biología
Molecular de la Universidad de Cartagena y gracias al convenio
interinstitucional existente entre esta institución y la Universidad de Sucre, se
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brindó la oportunidad de realizar una pasantía en el primer semestre del 2008
que permitió conocer el porcentaje de estudiantes de medicina de la
universidad Cartagena colonizados por Staphylococcus aureus, el patrón de
susceptibilidad de los aislamientos y los factores de riesgo asociados a la
colonización de este grupo. Esperamos que este estudio contribuya a la
generación de programas que favorezcan al control de este agente infeccioso
dentro de esta población.
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OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Determinar la prevalencia de colonización nasal de Staphylococcus aureus,
la susceptibilidad antibiótica y la asociación con posibles factores de riesgo,
en los estudiantes de medicina de la universidad de Cartagena en el primer
semestre del año 2008
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
§ Apropiar conocimientos teóricos y prácticos en los avances de la
Microbiología básica y aplicada.
· Adquirir destrezas en la recolección y transporte de muestras nasales
para su conservación y procesamiento en el laboratorio.
· Obtener habilidades en el manejo de cultivos in Vitro, para el
aislamiento de S. aureus mediante la utilización de medios selectivos.
· Identificar cepas de S. aureus provenientes de muestras nasales
mediante diferentes pruebas bioquímicas.
· Establecer el patrón de susceptibilidad antibiótica de cada uno de los
aislamientos de S. aureus.
· Determinar la asociación existente entre la portación nasal y los
posibles factores de riesgo evaluados en la población.
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CAPITULO 1. INFORME CRÍTICO
Staphylococcus aureus es un microorganismo de gran importancia médica.
Desde hace muchos años se le ha reconocido como uno de los principales
agentes patógenos para el humano. Es un coco gram-positivo, no móvil, que
no forma esporas, es anaerobio facultativo, pero crece mejor en condiciones
aerobias. Forma parte de la familia Microccocaceae, y el género
Staphylococcus el cual contiene más de 35 especies diferentes y muchas de
éstas son habitantes naturales de la piel y las membranas mucosas del
hombre. Microscópicamente las colonias son de 1-3 mm, convexas, lisas,
brillantes y de color blanco o dorado en medios sólidos debido a la
producción de un pigmento carotenoide, la mayoría de sus cepas son beta-
hemolíticas en agar sangre y suele ser identificado mediante una serie de
pruebas bioquímicas entre las cuales tenemos: 1) test de catalasa positivo,
que lo distingue de los estreptococos, 2) test de coagulasa positivo que lo
distingue de las otras especies de estafilococos denominados por ellos
coagulasa negativo (S. epidermidis y S. saprophyticus, entre otros), 3)
fermentación de manitol a diferencia de S. epidermidis y 4) sensibilidad a la
novobiocina a diferencia de S. saprophyticus que fermenta ocasional mente
el manitol. (Waldvogel F. 2000)
S. aureus posee un alto grado de patogenicidad que se produce al
combinarse los factores de virulencia de la bacteria con una disminución de
las defensas del huésped. En su accionar intervienen los componentes de la
pared celular y la producción de enzimas y toxinas favorecedoras de la
invasión tisular, además de su capacidad para diseminarse y multiplicarse en
los tejidos del huésped (Miller M, Y B. Bassler. 2001).
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COMPONENTES DE LA PARED:
Peptidoglicano: Es el componente básico de la pared de S. aureus le
confiere resistencia y tolerancia osmótica tiene importantes propiedades
biológicas: presenta actividad endotoxica, desencadena la producción de
interleucina -1 por los monocitos, estimula la quimiotaxis y agregación de los
leucocitos, activa el complemento e induce la producción de anticuerpos
opsonizantes (Mandell G, et al. 2000).
Acido teicoico o polisacárido A: son polímeros de fosfato específicos de
esta especie, pueden estar unidos covalentemente al péptidoglicano de la
pared o ligados a los lípidos de la membrana celular. Su función es mediar
en la unión de los estafilococos a la superficie mucosas mediante uniones
específicas a la fibronectina. Tiene la capacidad de inducir la producción de
anticuerpos (Mandell G, et al. 2000).
Capsula externa o gluococalix: Es de naturaleza polisacarida, facilita la
adherencia de las bacterias y tiene capacidad antifagocitaria. Se han descrito
11 serotipos capsulares, de los cuales los serotipos 5 y 8 son los que se
asocian con la mayor parte de las infecciones (Miller M, Y B. Bassler. 2001).
ENZIMAS:
Son sustancias que producen su acción en zonas próximas al foco
infeccioso. (Bannerman ,2003) Las más importantes son: Catalasa: degrada
el peróxido de hidrogeno protegiendo al microorganismo durante la
fagocitosis. Coagulasa: se encuentra en dos formas; el factor de agregación
o coagulasa ligada, al que nos hemos referido al tratar los componentes de la
pared celular y la coagulasa libre o extracelular. Ambas, intervienen en la
formación de coágulos, convierten el fibrinogeno en fibrina, facilitando
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procesos sépticos y permitiendo la formación de abscesos. Existe una fuerte
correlación entre la producción de coagulasa y la virulencia de la cepa. La
detección de la coagulasa libre es la prueba que diferencia S. aureus de los
estafilococos coagulasa negativos. Hialuronidasa: degrada el acido
hialuranico de la matriz del tejido conjuntivo y facilita la propagación de la
infección. Penicilinasa: Esta enzima en la actualidad es producida por casi
todas las cepas de S. aureus y puede inactivar la penicilina mediante la
hidrólisis de su anillo betalactamico (Madigan M, et al. 2003)
TOXINAS:
Algunas cepas de S. aureus son capaces de sintetizar proteínas
extracelulares adicionales que producen su acción en zonas distantes del
foco infeccioso. Su expresión esta regulada por un gen accesorio regulador
de proteínas (agr) y pueden ser modificadas por el ADN cromosómico o
plasmídico. Las mas importantes son (Dinges M, et al. 2000).
Hemolisinas: se han identificada cuatro, denominadas, alfa, beta, gamma y
delta. Son sintetizadas por la mayoría de las cepas de S. aureus. Poseen
capacidad hemolítica y citolitica actuando sobre determinadas células
eucarióticas del huésped como leucocitos, macrofagos, plaquetas y
fibroblastos. La toxina alfa es la mejor estudiada. Parece intervenir en el
desarrollo de edema y daño tisular como consecuencia de los cambios de
permeabilidad inducidos en las células endoteliales y los consiguientes
cambios en el balance iónico.
Leucocidina de Panton – Valentine: es sintetizada por el 2-3% de las cepas.
Esta compuesta por dos subunidades proteicas la F y S sintetizadas
independiente mente que actúan en forma sinérgica sobre las membranas de
las células fagocíticas. Se une a lo fosfolípidos de la membrana de los
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leucocitos y macrofagos induciendo la formación de poros que destruyen la
célula al alterar la permeabilidad celular (Omoe K, et al. 2003).
Toxinas exfoliativas o epidermoliticas: la prevalencia de cepas
productoras de estas toxinas varía geográficamente, pero generalmente es
inferior al 5-10%. Se han identificado dos serotipos, A y B (ETA y ETB),
ambas pueden producir el síndrome de la piel escaldada. La toxina esfoliativa
A es termoestable y de codificación cromosomita, mientras que la B es
termolábil y de codificación plasmidica. Actúa destruyendo los desmosomas
del estrato granuloso de la epidermis, sin citolisis, ni inflamación, por lo que
en la capa de la epidermis afectada no se encuentran ni leucocitos ni
estafilococos. Poseen actividad proteasa serinica, lo que desencadenaría la
exfoliación (Dinges M, et al. 2000).
Enterotoxinas: son producidas por el 30- 50% de las cepas de S. aureus Se
han descrito 8 serotipos de enterotoxinas estafilococicas (A, B, C, D, E, G, H,
I). Siendo el serotipo A, el más común de todos ellos, son termoestables y
resistentes a las enzimas digestivas. Siendo responsables de intoxicaciones
alimentarías con emesis y cuadros de enterocolitis. Posees las
características inmunomoduladoras propias de los súper antígenos.
Toxina 1 del síndrome del Shock toxico: anteriormente denominada
exotoxina pirogénica C o enterotoxina F, es una proteína termoestable
sintetizada por genes cromosómicos. Actúa como un superantigeno,
induciendo la liberación de citotoxinas por macrófagos y linfocitos T. A bajas
concentraciones produce la extravasación de las células endoteliales, y a
altas concentraciones tiene efecto citotóxico (Mandell G, et al. 2000).
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ASPECTOS EPIDEMIOLOGICOS
En cuanto a su epidemiología S. aureus es considerado un patógeno
oportunista que forma parte de la microflora humana, alcanzando a estar
colonizada con esta bacteria entre el 30 y 50% de la población, siendo la
localización más frecuente la colonización nasal (Wenzel R, et al.1998). El
principal reservorio de S. aureus lo constituye el hombre enfermo o portador.
La frecuencia de colonización es mayor en el medio hospitalario,
especialmente en pacientes sometidos a hemodiálisis, diabéticos tipo I,
pacientes con lesiones cutáneas, sujetos infectados por el VIH y en adictos a
drogas por vía parental.
El portador nasofaríngeo asintomático es también el origen mas frecuente de
S. aureus resistente a meticilina (SARM). Actualmente este microorganismo
es reconocido como uno de los patogenos mas importantes causantes de
infecciones nosocomiales en todo el mundo. Cuando una persona entra en
contacto con una cepa de SARM puede resultar colonizada, desarrollar
infección y/o convertirse en portador (Wenzel R, et al.1998): Así pues, se
habla de colonización por SARM cuando este microorganismo es aislado de
una muestra clínica en ausencia de signos de infección. Las zonas mas
frecuentes de colonización son; las lesiones cutáneas, el tracto respiratorio y
el tracto urinario (Coello R, et al. 1994). Además la colonización por SARM
puede persistir durante meses o años (Sanford M, et al. 1994). Las
infecciones causadas por SARM son las mismas que las producidas por
cepas sensibles a meticilina. Las mas frecuentes son las de herida quirúrgica
(10 -28%), bacteremia (10 -21%) generalmente a partir de catéter y la
neumonía (15- 40%), sobre todo en enfermos ventilados (Pujol M, et al.
1994). En menor frecuencia se encuentran las infecciones de partes blandas,
urinarias, intraabdominales, cardiovasculares y osteomielitis (Coello R, et al.
1994).
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Finalmente se considera que una persona es portadora de SARM cuando
este microorganismo se aísla en una localización, en la que no suele causar
infección lo que facilita su persistencia en el microorganismo. La localización
mas frecuente es la nariz, donde actúa como reservorio seguido de la
orofaringe y las regiones perianal, inguinal, axilar y rectal (Coello R, et al.
1994).
Diferentes estudios describen que los portadores nasales de SARM tienen un
mayor riesgo de infección nosocomial por este microorganismo y que los
pacientes infectados por SARM presentan una mayor morbi mortalidad
comparada con los pacientes infectados por cepas sensibles de S. aureus
(Romero – Vivas J, et al. 1995; Pujol M, et al; Cosgrove S, et al. 2003).por lo
tanto este hecho es importante a la hora de intentar mantener una
prevalencia de SARM baja.
CARACTERISTICAS GENETICAS
S. aureus se caracteriza genéticamente por poseer un genoma de un tamaño
aproximado de 2800 kb, que esta formado por un único cromosoma circular
en el que se encuentran elementos génicos móviles como son plasmidos,
bacteriófagos, transposones y secuencias de inserción (Pattee L, et al. 1990).
El estudio de estos elementos ha permitido explicar los mecanismos de
transferencia génica entre las cepas mediante procesos de conjugación,
transformación, transducción y movilización mediante plasmidos conjugativos
(Archer G y Scout J. 1991; Skurray R.1997).
Los plásmidos son moléculas extracromosomicas de DNA circular de
pequeño tamaño (2.5 kb) que contienen genes que codifican para la
producción de toxinas y/o para la resistencia a antibióticos y metales
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pesados; Pueden transferirse de una célula a otra mediante el proceso de
conjugación.
Los transposones son fragmentos móviles de DNA generalmente
flanqueados por secuencias repetidas, su longitud varia de unos cientos a
unos miles de nucleótidos. La transposición tiene lugar a través de dos
mecanismos: uno consiste en la escisión del elemento móvil para luego
insertarse en el DNA diana, el otro consiste en un mecanismo de
retrotransposicion, mediante el cual el transposon genera una copia de si
mismo que se insertara en el DNA diana. Las enzimas que catalizan los
cortes y las uniones de estos elementos son específicas y están codificadas
en el propio transposon. Los transposones pueden transportar uno o varios
marcadores de resistencia antibiótica. Se han descrito distintos transposones
como el Tn551 portador del gen ermB de resistencia a eritromicina (Kham S
y Novick R. 1980), Tn4001 portador de genes que codifican la resistencia a
kanamicina, tobramicina y gentamicina (Lyón B, et al. 1984), Tn4003 codifica
la resistencia a trimetoprin (Rouch D. 1989), Tn552 contiene el gen operon
bla que le confiere resistencia a penicilina (Rowland S.1989) por la
producción de penicilinasa y Tn554 que contiene los genes ermA para la
resistencia a eritromicina y el gen spc que codifica la resistencia a
espectinomicina (Murphy E, et al.1985). Los dos elementos utilizados en la
transferencia génica son TN551 y Tn554. Tn554 se encuentra con gran
frecuencia en el cromosoma de Staphylococcus aureus resistente a meticilina
(SARM) y se ha utilizado para el seguimiento epidemiológico de clones
epidémicos SARM (De lencastre H, et al. 1994; Domínguez M,1994).
RESISTENCIA ANTIBIÓTICA
En cuanto a la resistencia antimicrobiana S. aureus fue el primer
microorganismo en poner de manifiesto la resistencia a los antimicrobianos y
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ser capaz de desarrollar múltiples mecanismos, intrínsecos o adquiridos, que
le han ido confiriendo resistencia a la mayoría de los antimicrobianos
adecuados para el tratamiento de la infección estafilocócica. De tal manera a
que en los primeros años de la década de 1940 se introduce de forma
terapéutica la penicilina en el tratamiento de las infecciones estafilococicas.
Poco tiempo después, se empiezan a descubrir aislamientos de S. aureus
con resistencia a penicilina debido a la producción de betalactamasas
(barber, 1947).
Durante la década de los años 1950, a medida que se iban adquiriendo
resistencia a los antibióticos conocidos, se fueron introduciendo en la práctica
clínica nuevos antibióticos. Así, en 1957, muchas cepas de S. aureus
presentaban resistencia múltiple a penicilina, estreptomicina, tetraciclina,
cloranfenicol y eritromicina (Sanson, 1981).
En 1959 se introduce la meticilina, una penicilina semisintetica que resiste la
acción de la betalactamasa que degrada la penicilina. Esta nueva droga
permite volver a tener un control sobre las infecciones de S. aureus; sin
embargo, esta nueva situación va a demorar poco, ya que en 1961 aparecen
las primeras cepas resistentes a meticilina aisladas en Inglaterra por jevons y
Knox (Jevons y Knox ,1961). Dos años después aparece el primer brote
epidémico de infección nosocomial por S. aureus resistente a meticilina
(SARM) en el reino unido (Stewart, 1963). Estos aislamientos de S. aureus
resistentes a meticilina presentan resistencia intrínseca a todos los
betalactamicos, incluidas las cefalosporinas y carbapenemes.
La resistencia de S. aureus a aminoglucosidos parece estar relacionada en
su inicio con el uso tópico. Los primeros aislamientos resistentes a este
grupo de antibióticos se detectaron en 1959 en EEUU y es en los años 70
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cuando aparecen los primeros casos en Europa (Crossley, 1979). A finales
de los años 80 se muestran cepas de S. aureus que combinan la resistencia
a meticilina con la resistencia a otros muchos grupos antibióticos incluyendo
cloranfenicol, tetraciclina, macrólidos , lincosamidas, amino glucósidos y
fluoroquinolonas (Schaefler,1989). En la ultima década se han documentado
casos de S. aureus con sensibilidad disminuida a glucopeptidos (Hiramatsu,
1997), y recientemente se han descrito casos en Estados Unidos de cepas
de S. aureus con resistencia de alto nivel a vancomicina (CDC, 2002; Chang
,2003; CDC, 2004; Tenover 2004
MECANISMO RESISTENCIA A ANTIBIOTICOS BETALACTAMICOS
Los antibióticos betalactamicos actúan inhibiendo la síntesis de la pared
bacteriana al unirse de forma irreversible a las enzimas peptidoglicanos-
transpeptidasas, también denominadas PBPS (Penicillin- Binding- Proteins).
S. aureus ha desarrollado tres mecanismos de resistencia a los
betalactamicos. En primer lugar, la producción de betalactamasas que actúan
sobre las penicilinas naturales y semisinteticas; en segundo lugar, la síntesis
de PBPS modificadas con baja afinidad a los betalactamicos, que origina la
denominada resistencia intrínseca a meticilina y al resto de los
betalactamicos; y por ultimo, la tolerancia al efecto bactericida de los
betalactamicos. Cada cepa de S. aureus puede tener varios de estos
mecanismos de resistencia (Imsade J .1978).
Producción de betalactamasas.
Las betalactamasas son enzimas extracelulares que inactivan la penicilina
mediante la hidrólisis de un enlace betalactamico. El determinante génico
que determina su síntesis (gen blaZ) se localiza habitualmente en plásmidos,
que también suelen conferir resistencia a otros antibióticos. Las
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betalactamasas de S. aureus son inducibles, a diferencia de las producidas
por las bacterias gramnegativas; esto significa que la producción a niveles
elevados de esta enzima depende de la presencia de antibióticos
betalactamicos. El mecanismo de inducción es el siguiente: la penicilina y sus
análogos favorecen la producción de una proteina antirrepresora que, al
inhibir el gen represor de la betalactamasa (gen blal) aumenta la síntesis de
penicilinasa (Imsade J. 1973).
La susceptibilidad de los distintos betalactamicos a las betalactamasas de S.
aureus depende de su sensibilidad a la hidrólisis enzimatica y del nivel de
producción de betalactamasa que inducen (Cercenado E et al. 1997). Dicha
sensibilidad se determina mediante la concentración inhibitoria minima (CIM)
de cada antibiotico betalactamico frente a S. aureus. Así, las penicilinas
naturales y semisinteticas como la bencilpenicilina, que son muy sensibles a
las penicilinasas, tienen CIMs que oscilan entre 0.2 y 32 ug/ml. En cambio las
llamadas penicilinas resistentes alas penicilinasas –PRP-(oxacilina y
meticilina) y las cefalosporinas son resistentes a los niveles habituales de
producción de betalactamasas.
Resistencia intrínseca.
La resistencia intrínseca de S. aureus a la penicilina, también denominada
resistencia a la meticilina, es un fenómeno genéticamente complejo, que
tiene una expresión fenotípica variable y multifactorial. Las cepas de S.
aureus sensible a meticilina (SASM) tienen 5 tipos de PBPs (1, 2, 3, 3´, 4),
mientras que las resistentes (SARM)producen una PBPs supernumeraria,
denominada PBP2a o PBP2´, que tiene menor afinidad ala meticilina y al
resto de los antibióticos betalactamicos. En las cepas resistentes la PBP2´
asume la síntesis de la pared bacteriana cuando las otras PBPs están
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saturadas por el antibiotico, evitando así la muerte del microorganismo
(Hartman B et al. 1986).
La resistencia de S. aureus a meticilina esta codificada en la región
denominada“ mec” cromosomica, que esta presente únicamente en las cepas
resistentes. Dicha región esta formada por el gen “mec A”, responsable de la
síntesis de PBP2a y marcador genético de la resistencia y por el gen “mec R”
o represor. Sin embargo, no todas las cepas con el gen “mec A” no expresan
la resistencia y su grado varia una cepa a otra e incluso entre los distintos
clones de una cepa. Por ello se distinguen dos tipos de resistencia intrínseca:
la homogénea y la heterogenia. La base genética de estos dos tipos de
resistencia es la siguiente. En las cepas con resistencia homogénea la
síntesis de PBP2a es constitutiva, es decir, que no esta influenciada por otros
factores.en cambio, en las cepas heterogéneas la expresión del gen “mec A”
estaría regulada por otra región cromosomica desconocida a través de la
producción del llamado factor X. diversos factores favorecen la síntesis de
PBP2a en las cepas heterogéneas: las condiciones de incubación, un inoculo
elevado, la presencia de antibióticos betalactamicos. Además, los genes que
codifican la producción de betalactamasas (blal y bla R) también producen la
síntesis de PBP2a (Hiramatsu K et al. 1990).
TOLERANCIA A LOS BETALACTAMICOS
El último paso en la actuación de los antibióticos betalactamicos es la lisis de
la bacteria por enzimas autoliticas intracelulares (autolisinas). La tolerancia al
efecto bactericida de los antibióticos betalactamicos es un fenómeno
detectado en S. aureus y otros microorganismos grampositivas. Las cepas
tolerantes requieren para su lisis una concentración de antibiotico,
denominada concentración minima bactericida (CMB), mucho mayor que la
necesaria para inhibir su crecimiento (CIM).este fenómeno es debido a una
25
disminución de la actividad autolitica de la bacteria por la presencia de un
exceso de inhibidores de las autolisinas (Sabath L and Mokhbat K. 1983).
La trascendencia clínica de este fenómeno puede ser mayor en
determinadas infecciones como endocarditis, meningitis y osteomielitis, y en
el huésped inmuno deprimido, en el que es imprescindible un efecto
bactericida del antibiotico (Sabath L and Mokhbat K. 1983).
26
METODOLOGÍA
POBLACION DE ESTUDIO Y DISEÑO EXPERIMENTAL
Este estudio se llevo a cabo en el periodo comprendido entre marzo y julio
del 2008, en la Facultad de Medicina de la Universidad de Cartagena,
participando en el todos los estudiantes de medicina que por voluntad propia
firmaron un consentimiento informado como participante de la investigación
(anexo 1). Luego a cada uno de ellos se les suministro un formulario en el
que se recogía información como la edad, genero, sexo, historial medico
incluyendo modificaciones anatómicas de la nariz, alergias crónicas, el uso
de antibiótico y el contacto con pacientes entre otras (anexo 2). El estudio fue
revisado y aprobado por el Comité de Ética de la Universidad de Cartagena,
manejando como diseño experimental un estudio observaciónal de corte
transversal.
RECOLECCIÓN Y TRANSPORTE DE MUESTRAS
A cada voluntario le fue tomada una muestra nasal utilizando para ello un
hisopo de algodón estéril por cada participante, mediante la técnica de 3
movimientos circulares en sentido de las manecillas del reloj y luego al
sentido contrario, en cada uno de los orificios nasales (Karabay O, et al,
2006), inmediatamente tomada la muestra se introdujo el hisopo en un tubo
de tapa rosca previamente rotulado, que contenían medio de transporte
Stuart (OXOID),y refrigerados a una temperatura de 4°C, con el propósito de
mantener la viabilidad de los microorganismos sin permitir la proliferación y
muerte de los mismos hasta su posterior utilización (Salazar, et al., 2006).
27
AISLAMIENTO DE CEPAS PRESUNTIVAS
Para el aislamiento primario de S. aureus, cada una de las muestras fue
cultivada en medio agar manitol sal (OXOID). Por ser un medio altamente
selectivo para el crecimiento de S. aureus, Luego se incubaron en
aerobiosis a 37°C durante un periodo de 24 a 48 horas (Incubator Automatic,
Presición Scientific Inc, model (1020)). Transcurrido el periodo de incubación
se procedió a la selección de las colonias presuntivas, teniendo en cuenta
características como la pigmentación que puede variar desde amarillo hasta
amarillo naranja, que es indicativa de fermentación del manitol (virando el
color del medio de rojo a amarillo), presencia de bordes lisos, apariencia,
ligeramente convexas y con diámetro entre 1 - 2 mm (Joklik W, et al. 1986.
p 518 - 523).
Una vez seleccionadas fenotípicamente las colonias presuntivas de S
aureus. Se procedió a la obtención de colonias puras. Para esto fueron
subcultivadas en agar nutritivo (DIFCO) mediante el método de siembra por
agotamiento, e incubadas a 37ºC durante 24 horas, para su posterior
identificación bioquímica.
ANALISIS MICROSCOPICO E IDENTIFICACION BIOQUIMICA
ANALISIS MICROSCOPICO
El examen microscópico fue utilizado como criterio de exclusión, para
separar las bacterias de nuestro interés (cocos gram positivos) de las que no
eran de interés (gram negativas), para lo cual fue utilizada la coloración de
gram descrita por Koneman (Koneman, et al, 1999. p. 84 - 86).
Tinción de gram.
Para llevar a cabo esta técnica primero se escogía la colonia bacteriana de
interés proveniente de un cultivo en agar nutritivo de 24 horas y se realizaba
28
un extendido bacteriano delgado sobre un portaobjeto, se fijaba al calor y
luego se cubría la superficie con el colorante cristal violeta por un minuto;
trascurrido este periodo se lavaba con abundante agua y se le agregaba
lugol por el mismo tiempo del paso anterior. Después de un enjuague con
agua y una decoloración con alcohol acetona por mas o menos 30 segundos,
se lavaba el preparado con agua y se le agregaba safranina, se esperaba un
minuto y se volvía a lavar, se secaba al ambiente y se examina el extendido
bajo un microscopio óptico (Microscopio Olympus, Olympus Corporatión,
MODEL CX3IBSFA) en el objetivo de 100X.
Se escogieron aquellas colonias que al monitorearse las placas se
observaban como cocos gram positivos en racimos como lo reporta la
literatura para la identificación microscópica de S. aureus.
PRUEBAS DE IDENTIFICACION BIOQUIMICA
Para la identificación bioquímica de las cepas presuntivas de S. aureus se
realizaron las siguientes pruebas: test de catalasa, seguido de la Prueba de
coagulasa y finalmente un test de aglutinación en látex. Se utilizó en cada
uno de estos ensayos la cepa control ATCC 25923 la cual es MSSA
ß-lactamasa-negativa.
Prueba de la catalasa.
El peróxido de hidrógeno se forma como uno de los productos finales de
oxidación del metabolismo aerobio de los hidratos de carbono. Si se permite
que se acumule, resultaría letal para las células bacterianas. Como un
mecanismo de evasión se produce la enzima catalasa que convierte el
peróxido de hidrógeno (H2O2) en agua y oxígeno según la siguiente reacción:
29
2H2O2 → 2 H2O + O2 (burbujas de gas)
De esta manera las bacterias se protegen del efecto tóxico del H2O2. Esta
prueba se usa con mucha frecuencia para diferenciar miembros de la familia
Micrococcaceae de miembros de la familia Streptococcaceae (Lutz B, 1992).
Para la determinación de esta enzima en primera instancia se transfiere una
porción de colonia proveniente de un cultivo de 24 horas sobre la superficie
de un portaobjetos, luego se realiza un frotis y posteriormente se le agrega
una gota de peróxido de hidrógeno (H2O2) al 3% y se observa la reacción. La
aparición de burbujas o efervescencia constituye una reacción positiva,
aclarando que la observación de unas pocas burbujas pequeñas después de
20 o 30 segundos no se considera un resultado positivo.
Prueba de la coagulasa.
El criterio más ampliamente utilizado y de aceptación general para la
identificación de S. aureus se basa en la confirmación de la enzima
coagulasa por ser este la única especie dentro del género que produce esta
enzima (Kloos, W. et al. 1999).
La coagulasa es una enzima que tiene actividad similar a la protrombina,
capas de convertir el fibrinogeno en fibrina dando como resultando la
coagulación del plasma. S. aureus produce dos tipos de coagulasa: fija y
libre. La fija (prueba en portaobjetos) permanece unida a la pared celular y
actúa directamente sobre el fibrinógeno provocando la formación de coágulos
o grumos cuando se mezcla una suspensión bacteriana con plasma
citratado. Y la coagulasa libre (prueba en tubo) que actúa sobre la
protrombina en el plasma para producir un producto semejante a la trombina
30
el cual reacciona con el fibrinógeno produciéndose un coágulo de fibrina
(Pezzlo, M, 1994).
La determinación de la coagulasa libre o prueba en tubo fue realizada
utilizando el kit BD BBL coagulase plasma, Rabbit with EDTA de acuerdo
con las especificaciones técnicas de la casa comercial descrita a
continuación: Con una asa bacteriológica estéril tomar de 2 – 4 colonias del
día anterior y emulsionarlas en un tubo de prueba con 0,5 ml de plasma de
conejo. Luego se incuba a 35 - 37 º C durante un máximo de 4 horas,
examinando los tubos periódicamente inclinándolos con suavidad evitando
sacudirlos para prevenir la desintegración del coagulo. Cualquier nivel de
coagulación transcurrido en el periodo de 4 horas es considerado como un
resultado positivo. Si en ese momento no se observa cambio aparente se
reincuba a temperatura ambiente y se procede a su lectura a las 24 horas,
por existir cepas productoras de enzimas débiles que producirán coagulación
del plasma en este tiempo.
Prueba de aglutinación en látex
Las colonias que resultaron ser cocos gram positivos, catalasas positivas y
productoras de la enzima coagulasa, se les complemento su identificación
bioquímica con el kit de aglutinación en látex (Staphaurex). Este consiste de
partículas de látex de poliestireno recubiertas de fibrinogeno e
inmunoglobulina G (IgG), Que al mezclarse con una suspensión de
organismos de S. aureus reacciona la proteína A de la bacteria con las IgG
causando una rápida e intensa aglutinación de las partículas de látex.
(Langone, J. 1982; Essers, L. et al. 1980). Para su determinación se procedió
de acuerdo a las siguientes indicaciones.
31
Inicialmente se debe agregar una gota de látex en uno de los círculos de la
tarjeta de reacción, con previa agitación del reactivo, luego recoger con el
bastoncillo una cantidad más o menos de 6 colonias de tamaño medio
proveniente de un cultivo de 24 horas y emulsionarla en la gota de látex con
la parte plana del bastoncillo por unos segundos, luego se desecha el
bastoncillo y se agita manualmente con movimientos circulares por 20
segundos. Las reacciones positivas se corroboran por el desarrollo de una
aglutinación de las particulas de látex con el fondo claro casi inmediatamente
iniciada la agitación indicando la presencia de la proteína A (anexo 3).
PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD ANTIBIOTICA
Cada aislamiento identificado bioquímicamente como S. aureus le fue
realizado un análisis de susceptibilidad por el método de difusión en disco,
utilizando los siguientes antibióticos: oxacilina (1 µg), cefoxitina (30 µg),
PFGE: Electroforesis en gel de campo pulsante, PCR: Reacción en cadena de la polimerasaAFLP: Amplificación de fragmentos de longitudes polimorficas, MLST: Tipificación desecuencias multilocus.
En todas estas aplicaciones el objetivo es el de definir la relación existente,
clonal o no, entre los aislamientos estudiados. El término clon o grupo
clonal en epidemiología hace referencia al grupo de aislamientos
relacionados por el hecho de descender de un ancestro común, esto es, por
formar parte de una cadena de replicación y transmisión. Las cepas
relacionadas provienen, pues, de la expansión clonal de un precursor único y
poseen un nivel de similitud entre sus genotipos y fenotipos
significativamente superior al que se encontraría entre aislamientos no
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relacionados de la misma especie seleccionados arbitrariamente (Soll D et al
.2003, Coll P y Prats G.2006).
A continuación se exponen los métodos moleculares que más se han
utilizado para estudios epidemiológicos en bacteriología, en cada uno de
ellos se comentan sus fundamentos básicos incluyendo criterios para la
interpretación de los resultados.
2.1. ANALISIS DE DNA PLASMIDICO:
Los plásmidos son descritos como elementos de DNA circular extra
cromosomales hereditarios móviles, los cuales pueden replicarse
autónomamente y contener al menos un origen de replicación. Aunque ellos
no son esenciales para la vida de las bacterias, cuando la célula bacteriana
se divide, copias de los plásmidos residentes se distribuyen entre las células
hijas, por lo que es de esperar que miembros de la misma línea clonal
contengan los mismos plásmidos (Sloos J et al .2000).
Fue el primer método molecular que se utilizo como herramienta
epidemiológica de tipificación bacteriana basándose en el reconocimiento y
comparación en el número y tamaño de bandas entre los aislamientos,
permitiéndolos agrupar de acuerdo a la coincidencia de sus bandas (Farrar,
1983).
La determinación de los perfiles plasmidicos puede realizarse por
procedimientos relativamente simples de extracción y separación de DNA
plasmídico del cromosómico, seguido de la separación de los plásmidos por
electroforesis en un gel de agarosa gracias a su migración diferencial según
el peso molecular. Habitualmente se comparan dos cepas examinando el
número y tamaño de sus plasmidos. Sin embargo, si estas poseen un único
plasmido con peso molecular similar como en algunas cepas de S. aureus,
63
es necesario confirmar la identidad entre sus plasmidos mediante el análisis
por restricción con endonucleasas del DNA plasmídico (Figura 4). Estas
enzimas reconocen secuencias de bases especificas y las cortan en una
posición determinada, de forma que dos plasmidos iguales presentaran el
mismo perfil de restricción de DNA plasmídico (Tenover ,1985).
Figura. 4. Análisis del ADN extracromosómico de dos cepas de Staphylococcus aureustras el empleo de endonucleasas de restricción. Recorridos 1 y 2: digestión con Eco RI;recorrido*: cepa control; recorridos 3 y 4: digestión con Hin dIII; recorrido L: marcador depeso molecular. (adaptado de Trilla A.1993)
El análisis de DNA plasmídico es una técnica rápida que se correlaciona muy
bien con otros métodos fenotipicos, como el perfil bioquimico y el patrón de
resistencia a antibióticos. Sin embargo, su poder de discriminación es
limitado por varios motivos (Shales et al.1986). En primer lugar, solo el 90%
de las cepas presentan plasmidos. En segundo lugar, se puede producir
variaciones en los perfiles plasmidicos por deleccion y recombinación de
secuencias del DNA en el mismo plasmido o entre plasmidos, o bien por
adquisición de DNA nuevo. Además los plásmidos pueden presentarse en
64
diferentes conformaciones que varían con el grado de superenrollamiento,
produciendo a partir de una misma variedad de plásmido diferentes patrones
de movilidad electroforética. Una cepa también puede adquirir o perder
plasmido a lo largo del brote epidemiológico, o durante el subcultivo Por ello,
se recomienda que el análisis debería realizarse en bacterias con el menor
número de subcultivos posibles (Zuccarelli et al, 1990). Por ultimo, algunos
factores técnicos como la variación de los métodos de extracción o de las
condiciones de electroforesis también pueden influir en el perfil plasmídico
obtenido. Debido a estas limitaciones se ha definido la tipificación por
perfiles plasmidicos como una herramienta de gran ayuda en estudios
epidemiológicos limitados temporal y geográficamente, y que puede tener
más valor si es complementada con otras técnicas genotípicas que
involucren estudios cromosómicos.
2.2. ANALISIS DE DNA CROMOSOMICO:
El análisis de DNA cromosómico consiste en la ruptura del mismo en
fragmentos mediante una o varias enzimas de restricción y su separación
posterior por electroforesis en gel de agarosa, obteniendo un patrón de
bandas característicos de cada cepa. A diferencia del análisis del DNA
plasmídico puede utilizarse en aquellas bacterias que carecen de plasmidos,
y tiene una mayor estabilidad. Por ello, se considera el método más sensible
para el estudio epidemiológico de SARM (Jordens y Hall, 1985; Venezia et al
,1992).Se distinguen varios tipos de análisis de DNA cromosómico:
2.2.1. Electroforesis en geles de agarosa en campo constante:
Se obtienen un perfil numeroso de fragmentos de DNA de 25 a 0.5 Kb difícil
de interpretar, por lo que tiene menor poder de discriminación que otras
técnicas electroforeticas como el inmunoblotting (Burnie et al ,1989). Su
capacidad de discriminación puede mejorar utilizando southern blot para
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identificar fragmentos de DNA concretos mediante su hibridación con sondas
especificas (Mulvey et al, 1986).
2.2.2. Electrofores en geles de agarosa en campo pulsante (PFGE):
La electroforesis en gel de campos pulsantes (PFGE por sus siglas en inglés)
fue descrita en 1984 como una herramienta para examinar el ADN
cromosómico de organismos eucariotas. Ha sido uno de los progresos más
útiles de la epidemiología molecular en las décadas pasadas; emerge en los
90´s como una técnica de la huella dactilar considerada el estándar de oro
para la tipificación molecular de microorganismos, por tener un poder de
discriminación entre distintas cepas y una estabilidad superiores al del DNA
plasmídico y a la fagotipificación. (Maslow et al, 1993; Goering, 1993;
Tenover et al., 1994; Struelens y MESGEM, 1996; Tenover et al., 1997;
Warner y Onderdonk, 2003).
En esta técnica, el genoma bacteriano es digerido con una enzima de
restricción que es relativamente de pocos sitios de reconocimiento y que
genera aproximadamente de 10 a 30 fragmentos de restricción que van de
10 a 800 kb. Todos estos fragmentos pueden ser separados como un patrón
de distintas bandas por PFGE, usando una cámara diseñada especialmente
que cambia de posiciones en el gel de agarosa entre tres juegos de
electrodos que forman un hexágono alrededor del gel (Figura. 5) (Tenover et
al., 1997; Warner y Onderdonk, 2003).
Figura. 5. Distribución de los electrodos en la electroforesis en gel de campo pulsante.
Cartagena de indiasCONSENTIMIENTO INFORMADO PARA PARTICIPAR EN INVESTIGACIONYo, __________________________________ por el presente, estoy de acuerdo en participar en unestudio que tiene como objetivo determinar la frecuencia de colonización del patógeno oportunistaStaphylococcus aureus en los estudiantes de medicina de la Universidad de Cartagena durante el año2008.Los investigadores me han explicado que los estudiantes de medicina representamos unapoblación en riesgo de adquirir cepas de Staphylococcus aureus debido a que durante el desarrollo denuestro programa de estudios, interactuamos directamente con pacientes y con personal médico dediversas instituciones de prestación de la salud en diferentes áreas de la ciudad. Por lo tanto, existe unriesgo real de que en algún momento los estudiantes adquiramos inadvertidamente una cepa resistenteen una institución y la transfiramos a pacientes susceptibles de la misma institución o de unainstitución diferente.Me han informado que la duración estimada del estudio es de 12 meses; entiendoque los investigadores pueden detener el estudio ó mi participación en cualquier momento sin miconsentimiento. Así mismo tengo derecho a retirarme del estudio en cualquier momento. Me hanexplicado que de acuerdo a la reglamentación del Ministerio de Salud de Colombia, Resoluciónnúmero 8430 de 1993, este estudio está clasificado como de riesgo mínimo para los sujetosparticipantes y en él se requiere la toma de muestras nasales mediante el uso de hisopos, lo cual norepresenta riesgos significativos para mi salud. La toma de muestras se hará por una única vez en elestudio. En los casos que resulten positivos para la portación de la bacteria S. aureus, se harán estudiosde seguimiento que implican la toma periódica de muestras nasales con periodicidad mensual por unlapso de un año.Mi participación en el estudio también requiere que complete una encuesta en la quecontestaré preguntas relacionadas con mi historial clínico. Los investigadores me han explicado que norecibiré ningún beneficio económico por mi participación en este estudio. Que mi participación puedeser de utilidad para la comunidad médica en general, ya que los resultados contribuirán al diseño deprogramas dirigidos a lograr el control efectivo de la diseminación de cepas resistentes, tanto alinterior del ambiente hospitalario como a la comunidad en general. Por el presente autorizo a losinvestigadores a utilizar las muestras nasales y sus derivados para este estudio y los que se deriven delmismo, y los autorizo a enviarlas a otros laboratorios, tanto nacionales como internacionales para larealización de análisis relacionados. Además, autorizo a los investigadores responsables a publicar lainformación obtenida como resultado de mi participación en este estudio, en revistas u otros medioslegales, y de permitirles revisar mi historia clínica, guardando la debida CONFIDENCIALIDAD de minombre y apellidos. Entiendo que todos los documentos que revelen mi identidad serán confidenciales,salvo que sean proporcionados tal como se menciona líneas arriba ó requeridos por Ley.
Firma del Participante: _______________Iniciales del participante: ________Fecha: ___
Niradiz Reyes Ramos Firma: Tel: 313 5512833
Yorlais Arroyo barrios Firma: yorlais arroyo b Tel: 3107415599
Alfonso Bettin Martínez Firma: Alfonso Bettin M Tel: 312-6799095
Este estudio ha sido aprobado por el Comité de Ética de la Universidad de Cartagena