DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE ALFA Y BETA AMILASAS COMERCIALES EN LA PRODUCCIÓN DE ETANOL A PARTIR ALMIDÓN DE CEBADA EMPLEANDO Saccharomyces cerevisiae LADY CAROLINA ESPITIA ROCHA PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL Bogotá, D.C. Enero 11 del 2009
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DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE ALFA … · determinaciÓn de la concentraciÓn de alfa y beta amilasas comerciales en la producciÓn de etanol a partir almidÓn de ... 2.4.2.1
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DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE ALFA Y BETA AMILASAS COMERCIALES EN LA PRODUCCIÓN DE ETANOL A PARTIR ALMIDÓN DE
CEBADA EMPLEANDO Saccharomyces cerevisiae
LADY CAROLINA ESPITIA ROCHA
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL Bogotá, D.C. Enero 11 del 2009
DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE ALFA Y BETA AMILASAS COMERCIALES EN LA PRODUCCIÓN DE ETANOL A PARTIR ALMIDÓN DE
CEBADA EMPLEANDO Saccharomyces cerevisiae
LADY CAROLINA ESPITIA ROCHA
TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial
Para optar al título de
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL Bogotá, D.C.
Enero 11 del 2009
NOTA DE ADVERTENCIA: Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus
alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario
al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales
contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la
justicia”.
DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE ALFA Y BETA AMILASAS COMERCIALES EN LA PRODUCCIÓN DE ETANOL A PARTIR ALMIDÓN DE
CEBADA EMPLEANDO Saccharomyces cerevisiae
LADY CAROLINA ESPITIA ROCHA
APROBADO
_________________________ _________________________ HELBERTH ESPITIA RIVERA IVONNE GUTIERREZ ROJAS Ingeniero Químico Bacterióloga M. Sc Director Asesor
_______________________ _______________________ ADRIANA MATIZ ANDREA AGUIRRE
Bacterióloga M. Sc Bacterióloga M. Sc Jurado Jurado
DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE ALFA Y BETA AMILASAS COMERCIALES EN LA PRODUCCIÓN DE ETANOL A PARTIR ALMIDÓN DE
CEBADA EMPLEANDO Saccharomyces cerevisiae
LADY CAROLINA ESPITIA ROCHA
APROBADO
_______________________ _______________________ INGRID SCHULER JANETH ARIAS Bióloga, Ph.D. Bacterióloga, M. Sc–M. Ed DECANA ACADEMICA DIRECTORA DE CARRERA
Este trabajo lo dedico a Dios por darme la sabiduría y fortaleza en cada paso de
este proceso formativo. A mis padres por su amor, esfuerzo y apoyo. También
quiero agradecer a mis amigos que me acompañaron durante la carrera por toda su
colaboración y amistad que fueron muy importantes para lograr esta meta.
Carolina.
vii
AGRADECIMIENTOS
El presente trabajo es el resultado del interés de la empresa Destilería Premier
LTDA., en especial del Ingeniero Helberth Espitia, director técnico de la misma, por
su continua búsqueda de alternativas de mejoramiento del proceso a nivel de de
rendimientos, calidad y rentabilidad, así como también por proponer, financiar y
dirigir este trabajo.
Agradezco especialmente la colaboración y asesoría permanente e incondicional de
la Doctora Ivonne Gutiérrez de la Pontificia Universidad Javeriana. También al
Ingeniero Axel, director del laboratorio de Bromatología de la Secretaría de Salud
del Tolima de la ciudad de Ibagué, por su asesoría y colaboración en la realización
de los análisis de este proyecto.
Por último agradezco a mi madre por su interés compartido por este trabajo,
acompañándome siempre con una voz de ánimo y disposición de ayuda para poder
2.5.2.5.3 Fósforo .................................................................................................................... 35 2.5.3 FERMENTACIÓN ...................................................................................................... 36 2.6 PRODUCCIÓN DE ALCOHOL EN DESTILERÍA PREMIER LTDA. ........................ 37 3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION .......................................... 39 4. OBJETIVOS ............................................................................................................... 40 4.1 OBJETIVO GENERAL ............................................................................................... 40 4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS...................................................................................... 40 5. MATERIALES Y MÉTODOS ..................................................................................... 41 5.1 DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN ............................................................................ 41 5.1.1 Población de estudio ............................................................................................... 41 5.1.2 Materiales .................................................................................................................. 41 5.1.3 Enzimas y levadura .................................................................................................. 41 Multifect® AA 21L y Multifect® AA 23L son enzimas comerciales de Genencor
Internacional, Inc., las cuales son utilizadas en Destilería Premier LTDA. para el desarrollo de investigaciones de mejoramiento del proceso hidrolítico del almidón de cebada. Multifect® AA 21L es una α-amilasa estable a altas condiciones de calor y a un pH bajo, esta enzima no requiere calcio adicional para operar bajo condiciones de licuefacción industrial. Las condiciones recomendadas de licuefacción primaria son 105-110ºC por 5-7 minutos y secundaria 95ºC por 90-120 minutos (molido húmedo) ó 85-93ºC por 90-120 minutos (molido seco) a un pH entre 5.5-5.8......................................................... 41
5.2 MÉTODOS ................................................................................................................. 42 5.2.1 Proceso hidrolítico del almidón .............................................................................. 42 5.2.1.1 Control de comparación .......................................................................................... 43 5.2.1.2 Control negativo ....................................................................................................... 44 5.2.2 Rendimiento del proceso de hidrólisis .................................................................. 44 5.2.3 Condiciones de fermentación ................................................................................. 44 5.2.3.1 Pruebas preliminares ............................................................................................... 44 5.2.3.2 Preparación de inóculo ............................................................................................ 45 5.2.3.3 Fermentación ............................................................................................................ 45 5.3 DETERMINACIÓN DE BIOMASA ............................................................................. 46 5.4 DETERMINACIÒN DE LA CONCENTRACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES Y
ALMIDÓN. .................................................................................................................. 46 5.4.1 Determinación del título de la solución de Fehling. ............................................. 46 5.4.2 Valoración de la muestra ......................................................................................... 47 5.4.2.1 Cálculo de azúcares reductores ............................................................................. 48
x
5.5 DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE ETANOL .................................. 48 5.5.1 Destilación ................................................................................................................ 48 5.5.1.1 Cálculo de la gravedad específica .......................................................................... 50 5.6 VARIABLES DE ESTUDIO........................................................................................ 50 5.7 RECOLECCIÓN DE LA INFORMACIÓN .................................................................. 51 5.8 ANÁLISIS DE INFORMACIÓN .................................................................................. 51 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .................................................................................. 52 6.1 CARACTERIZACION DE LAS CEBADAS ............................................................... 52 6.2 PROCESO HIDROLÍTICO DEL ALMIDÓN DE CEBADA SIN MALTEAR .............. 53 6.3 ENSAYO PREVIO DE FERMENTACIÓN ................................................................. 58 6.4 FERMENTACIÓN DE Saccharomyces cerevisiae EN HIDROLIZADO DE
CEBADA SIN MALTEAR .......................................................................................... 61 6.4.1 Consumo de sustrato .............................................................................................. 66 6.4.2 Producción de etanol ............................................................................................... 69 6.5 COSTOS DE PRODUCCIÓN .................................................................................... 73 7. CONCLUSIONES ...................................................................................................... 75 8. RECOMENDACIONES .............................................................................................. 77 9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................... 78 10. ANEXOS .................................................................................................................... 88
xi
INDICE DE TABLAS
Pág
Tabla 1. Composición del grano de cebada………………………………..…20 Tabla 2. Acción que ejerce sobre el almidón la fosforilasa, α-glucosidasa,
α-amilasa, β-amilasa y enzimas desramificadoras…………………………………….………………....25
Tabla 3. Composición típica del mosto……………………………………….30
Tabla 4. Resumen del diseño experimental…………………………............42
Tabla 5. Resultados de la concentración de almidón realizados a la cebada mateada y sin matear…………………………………………...…………….………..…52
Tabla 6. Datos del rendimiento de hidrolisis obtenidos en el proceso
hidrolítico…………………………………………………………..…….56
Tabla 7. Datos de la biomasa máxima alcanzada y el consumo de sustrato
bajos las diferentes concentración de enzimas, (C+) control de comparación y (C-) control negativo……………..………………………………………………........68
xii
INDICE DE GRÁFICAS
Pág
Gráfica 1. Concentración de azúcares reductores en función de la dosis de de enzimas, (C+) control de comparación y (C-) control negativo después de la hidrólisis por 8h…………………………………………………………………….……54
Gráfica 2. Relación azúcares reductores producidos y rendimiento de hidrólisis en función de la concentración de enzimas, (C+) control de comparación y (C-)control negativo……………………………………………………………….…57
Gráfica 3. Curva de Crecimiento de Saccharomyces cerevisiae durante el ensayo previo de experimentación…………………………………..59
Gráfica 4. Población de Saccharomyces cerevisiae presente en el medio de fermentación con las diferentes concentraciones de enzimas…………………………………………………………..……….62
Gráfica 5. Relación entre concentración de células/mL máxima y el tiempo de obtención de la biomasa máxima de S. cerevisiae en función de la concentración de enzimas, (C+) control de comparación y (C-) control negativo………………………………………………………...............65
Gráfica 6. Relación entre la concentración de azúcares reductores inicial y final de la fermentación con S. cerevisiae en función de la concentración de enzimas, (C+) control de comparación y (C-) control negativo…………………………………………………………………...67
xiii
Gráfica 7. Consumo total de sustrato bajos las diferentes concentración de enzimas, (C+) control de comparación y (C-) control negativo…………………………………………………………………..69
Gráfica 8. Producción total de etanol bajos las diferentes concentración de enzimas, (C+) control de comparación y (C-) control negativo…………..……………………………………………………….70
Gráfica 9. Consumo total de sustrato y producción total de etanol bajos las diferentes concentración de enzimas, (C+) control de comparación y (C-) control negativo…………………………………………………….…...............71
Gráfica 10. Relación entre la concentración de etanol producido y productividad producto-sustrato en función en función de la concentración de enzimas, (C+) control de comparación y (C-) control negativo……………………………………………………….…………72
xiv
INDICE DE FIGURAS
Pág
Figura 1. Representación de las dos formas de almidón que se dan en la cebada…………………………………………………………………...22
Figura 2. Degradación del almidón…………………………………..…………..26
Figura 3. Coloración de Gram Saccharomyces cerevisiae..…………..…….31
Figura 4. Reproducción del inóculo…………………………………..…………45
Figura 5. Reacción de Fehling……………………………………..……………..47
Figura 6. Destilación de las muestras………………………………..………….49
Figura 7. Determinación del peso del destilado……………………….…..….50
xv
INDICE DE ANEXOS
ANEXO 1. Soluciones de trabajo…………………………………………..…………..88
ANEXO 2. Determinación del porcentaje de almidón…………………..………….89
ANEXO 3. Método para recuento celular en cámara de Newbauer……..……….90
ANEXO 4. Tablas complementarias del proceso hidrolítico………………..…….92
ANEXO 5. Figuras complementarias del proceso hidrolítico………………….....93
ANEXO 6. Tablas complementarias de fermentación……………………………...95
ANEXO 7. Gráficas complementarias de fermentación…………………………101
ANEXO 8. Figuras complementarias del proceso fermentativo………………105
Todos los ensayos de hidrólisis se llevaron a cabo en un erlenmeyer de 2 litros en
shaker termostatado, bajo las mismas condiciones de experimentación (Cáceres et
al., 2008) (Ver Tabla 4). Para esto se tomaron 250 g, (25 % (p/p)) de cebada sin
maltear y se mezclaron con 500 mL de agua destilada tibia durante 15 minutos,
seguidamente se adicionó un volumen de 500 mL de buffer de acetato de sodio
0.05M (pH 5.5) (Frigard et al., 2002). La hidrólisis del almidón se realizó en dos
etapas. En la primera o licuefacción, se añadió la α-amilasa termoestable durante 2
horas a 95ºC y pH 5.5. Para la sacarificación se adicionó la β- amilasa a 57ºC y pH
5.5 durante 6 horas (Linde et al., 2008). La hidrólisis de la mezcla se detuvo por
adición de HCl 2M hasta pH 1.5-1.6. Finalmente se ajustó el pH a 5-6 (Shariffa et
al., 2008) y las muestras se almacenaron a -20ºC para la determinación de
azúcares reductores al final del proceso (Ebrahimi et al., 2007). Este procedimiento
se realizó por duplicado.
Las concentraciones de enzimas Multifect® AA 21L y Multifect® AA 23L evaluadas
fueron 5, 10, 15, 20 y 25 mL/L, establecidas de acuerdo a ensayos previos
realizados en la destilería bajo las mismas condiciones, en los cuales el manejo de
una concentración inferior a 2 ml/L no representaría un mejoramiento en el proceso
hidrolítico del almidón de cebada no malteada, Sin embargo, este rango de
concentraciones también se establecieron por propuesta por parte del personal de
calidad en base a la experiencia que estos poseen e interés de experimentar bajo
este rango de concentraciones. A su vez se tuvieron en cuenta los resultados
obtenidos por Chen et al. (2007) y Kolusheva y Marinova (2007), los cuales
reportaron rendimientos de hidrólisis satisfactorios.
5.2.1.1 Control de comparación
Se tomaron 250 g, 25 % (p/p) de cebada malteada mezclándolos en un 1 L de
agua destilada a 45ºC durante 55 minutos, seguidamente se realizó la escala de
temperatura establecida por la experiencia de la empresa de la siguiente forma:
52°C por 30 min, 62°C por 1 hora y 72°C por 30 min, con el fin de asegurar que los
almidones de la cebada se transformen en azúcares, posteriormente se separó el
mosto de cebada del resto de los afrechos de la misma, de tal forma que el mosto a
fermentar esté libre de cascarilla, obteniéndose así un mosto o hidrolizado para
44
realizar el proceso de fermentación. Las muestras fueron almacenadas a -20ºC
para la determinación de azúcares reductores (Ebrahimi et al., 2007). Finalmente el
mosto obtenido se fermentó bajo las mismas condiciones de experimentación con
las enzimas comerciales.
5.2.1.2 Control negativo
Este control se desarrolló bajo las mismas condiciones amilolíticas y fermentativas
del control de comparación utilizando cebada sin maltear y sin adición de enzimas
durante el proceso hidrolítico.
5.2.2 Rendimiento del proceso de hidrólisis
El rendimiento de la hidrólisis enzimática fue calculada de acuerdo a la formula
reportada por Chen et al. (2007):
5.2.3 Condiciones de fermentación
5.2.3.1 Pruebas preliminares
Se realizó una fermentación previa bajo las mismas condiciones de
experimentación de los tratamientos de hidrólisis con enzimas, empleando como
sustrato mosto producto de la hidrólisis de cebada malteada, el cual se preparó bajo
las mismas condiciones del control de comparación, con el fin de determinar el
tiempo de duración de la fase aeróbica empleando tapón de algodón para los
erlenmeyes; y durante la fase anaeróbica empleando tapón de caucho con filtro de
salida de gases, para asegurar el crecimiento y fermentación de Saccharomyces
cerevisiae Safwhisky M-1. La determinación de las fases se realizó cuantificando la
concentración de biomasa en células/mL con cámara de Neubauer durante la
fermentación, con el fin de establecer la duración de la fase exponencial o aeróbica
y de esta forma observar el momento en el cual el crecimiento de la levadura se
Polisacárido en el sustrato
Azúcares reductores x 0,9x 100 Rendimiento de Hidrólisis (%) =
45
vuelve estacionario dando lugar a la producción de alcohol en un ambiente
anaerobio.
5.2.3.2 Preparación de inóculo
Se sembró 1 g de Saccharomyces cerevisiae Safwhisky M-1 en 1 litro de mosto
producto de la hidrólisis del almidón de la cebada malteada preparado bajo las
mismas condiciones del control de comparación, no estéril, sin complementos
nutricionales o ajuste de pH, en erlenmeyer, incubando con agitación a 30ºC, 100
rpm por 24 h (Siqueira et al, 2008).
Figura 4. Reproducción del inóculo. Fuente: Autor.
5.2.3.3 Fermentación
Las fermentaciones se llevaron a cabo en erlenmeyers de vidrio de 2L con un
volumen de trabajo de 1L (incluido el inóculo). Se inoculó un 10 % de inóculo a una
concentración de 1, 06 x106 UFC/mL de Saccharomyces cerevisiae Safwhisky M-1
en el producto de las hidrólisis con las diferentes concentraciones de enzimas y
controles (Ebrahimi et al., 2007). Se adicionó sulfato de amonio como fuente de
nitrógeno en una concentración de 1,5 g/L y se incubó en aerobiosis a 35 ± 2ºC con
agitación de 100 rpm, durante el tiempo determinado en el ensayo previo de
fermentación (numeral 5.2.3.1) (Cáceres et al., 2008). Pasado este tiempo se
46
cambió el tapón de algodón por un tapón de caucho con filtro de salida de CO2, para
dar inicio a la fase de fermentación en condiciones anaeróbicas. Se tomaron
muestras cada 12 horas para determinar biomasa (Cáceres et al., 2008). La
concentración de azúcares reductores y etanol se determinaron al final del proceso
de fermentación. Todos los ensayos se realizaron por duplicado.
5.3 DETERMINACIÓN DE BIOMASA
La concentración de biomasa en células/mL se cuantificó con cámara de Neubauer
(Alfenore et al., 2002) (Ver Anexo 3).
5.4 DETERMINACIÒN DE LA CONCENTRACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES Y ALMIDÓN.
5.4.1 Determinación del título de la solución de Fehling.
Se valoró la solución de Fehling con la solución de glucosa al 0.5% (p/v) a partir de la
cual se calculó el contenido de azúcares reductores (NTC 5146, 2008).
Se vertieron 5 mL de solución de Fehling A y 5 mL de solución de Fehling B (Ver
Anexo 1) en un erlenmeyer de 250 mL con 150 mL de agua destilada, agregando
perlas de ebullición, para regular la ebullición, llevándose posteriormente a ebullición
sobre la estufa con malla de asbesto durante 1.5-2 minutos. Mientras se va agitando
el vaso se añade la disolución de glucosa al 0.5 % (p/v) desde una bureta hasta que
solo quede una coloración azul suave, añadiendo 5 gotas de azul de metileno al 1 %
y se continua la valoración (Ver Figura 5). El punto final corresponde al cambio de
coloración de azul de metileno a rojo ladrillo. Entre el comienzo de la ebullición y la
terminación de la valoración no deben transcurrir más de 3 minutos, además se
debe mantener la ebullición durante la valoración (NTC 5146, 2008).
La determinación se debe repetir hasta que los resultados no difieran en ± 0.2 mL.
El título se calculó mediante la siguiente ecuación (NTC 5146, 2008):
(Pg) x (Vg)
100 mL de la solución T =
47
T = Título: gramos de glucosa empleados para titular la solución de Fehling.
Pg = Peso de glucosa empleado para preparar la solución patrón, en gramos.
Vg = volumen del patrón para titular la solución de Fehling, en mL.
Figura 5. Reacción de Fehling. Fuente: Autor.
5.4.2 Valoración de la muestra
En un erlenmeyer limpio se agregó 5 mL de solución A, 5 mL de solución B de
Fehling, 150 mL de agua destillada y unas perlas de vidrio. Procediéndose como se
48
indico el numeral 5.4.1, pero empleando como titulante el filtrado recogido de las
muestras con las diferentes concentraciones de enzimas y controles (NTC 5146,
2008).
5.4.2.1 Cálculo de azúcares reductores
El volumen de muestra y los gramos de solución de glucosa gastados para titular la
solución de Fehling, son equivalentes (NTC 5146, 2008).
Azúcares reductores expresados en gramos de glucosa/ L de producto (NTC 5146,
2008):
5.5 DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE ETANOL
Para la determinación de la concentración de etanol se utilizó el método por
destilación y estimación del contenido alcohólico por determinación de la gravedad
específica. En este método el producto se sometió a destilación en condiciones
especificadas, determinándose la densidad del destilado y con este valor y
utilizando tablas correspondientes se calculó el grado alcoholimétrico (NTC 5113,
2008).
5.5.1 Destilación
Utilizando un matraz aforado de 250 mL, se llenó casi hasta la marca con la muestra
y colocándose en un baño a temperatura constante a 20ºC por una hora.
Manteniéndolo en el baño, se completó el volumen con la cantidad necesaria de
muestra, a 20ºC. Teniendo instalado el destilador, se vertió en el matraz con la
ayuda de un embudo la muestra contenida en el balón aforado; lavándose el
recipiente que contiene la muestra y el embudo, con tres porciones de 15 mL de
agua destilada, las cuales se añaden al matraz de destilación, retirando el embudo y
agregando una pequeña cantidad de regulador de ebullición, tapando y dando
comienzo a la destilación, recogiendo el destilado en el mismo matraz en que se
1000 mL x Título
V gastado x V alícuota
Gramos glucosa/L =
49
midió la muestra. El matraz en el que se recoge la muestra debe tener previamente
10 mL a 20 mL de agua, en los que se sumerge la punta de un tubo que prolonga el
refrigerante (NTC 5113, 2008).
Figura 6. Destilación de las muestras.
Fuente: Autor.
El calentamiento se reguló de tal forma que la destilación ocurra sin sobresaltos de
manera lenta pero continua. Se continúo la destilación hasta que el destilado llegue,
aproximadamente, hasta los hombros del matraz. Se suspendió la destilación, se
retiró el tubo colocando en la parte interior del refrigerante y lavando con agua, por
dentro y por fuera, sobre el mismo matraz pero sin llegar al cuello de éste. Se colocó
el matraz en el baño de temperatura contante a 20ºC por una hora y, sin retirarlo del
baño, se completó a volumen con agua a 20ºC. Una vez terminada la destilación y
completado a volumen el destilado, se procedió a determinar su gravedad específica
por el método del picnómetro, para lo cual se pesó un picnómetro vacío, limpio y
seco (NTC 5113, 2008).
50
Se llenó con agua a 20ºC y se pesó para obtener el peso del agua contenida. Se
desocupó el picnómetro, se lavó varias veces con pequeñas cantidades del
destilado, llenandolo con el destilado a 20ºC y volviéndolo a pesar para obtener el
peso del destilado (NTC 5113, 2008).
Figura 7. Determinación del peso del destilado.
Fuente: Autor.
5.5.1.1 Cálculo de la gravedad específica
La gravead específica se calculo por la siguiente fórmula (NTC 5113, 2008):
Con los resultados obtenidos se calcularon los grados alcoholimétricos, por medio
de las tablas correspondientes (NTC 5113, 2008).
5.6 VARIABLES DE ESTUDIO
• Las variables independientes de estudio son la concentración de α y β amilasas.
Gravedad específica = Peso del destilado
Peso del agua
51
• Las variables dependientes son la concentración de azúcares reductores,
formación de biomasa de Saccharomyces cerevisiae, y producción de etanol.
5.7 RECOLECCIÓN DE LA INFORMACIÓN
Se realizó una revisión bibliográfica en el compendio de norma técnicas y guías de
implementación de normas del sector bebidas alcohólicas del ICONTEC, libros,
artículos científicos, revistas especializadas en el tema y normas relacionadas con la
elaboración y calidad microbiológica de las bebidas alcohólicas, específicamente
para aquellas producidas a partir de cebada. Así mismo, la preparación de reactivos,
medios de cultivo y el desarrollo de los métodos se realizaran según Procedimientos
Operativos Estándar.
Todos los resultados obtenidos serán llevados en una bitácora, anotando la fecha
de montaje experimental, evolución, observaciones, fecha de análisis y los
resultados obtenidos.
5.8 ANÁLISIS DE INFORMACIÓN
Para el análisis estadístico de los datos obtenidos, se realizó un análisis de varianza
y se aplicó la prueba de Tukey para determinar si entre los niveles de cada factor
hay diferencias significativas. Las variables de respuesta fueron biomasa,
concentración de azúcares reductores y producción de etanol.
La hipótesis nula será que hay igualdad de medias entre los niveles para cada
factor, así:
Para el factor α amilasa:
Ho: 5 = 10 = 15 = 20 = 25
Ha: Al menos dos son diferentes
Para el factor β amilasa:
Ho: 5 = 10 = 15 = 20 = 25
Ha: Al menos dos son diferentes.
52
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1 CARACTERIZACION DE LAS CEBADAS
Para poder iniciar el estudio, fue necesario determinar la concentración de almidón
presente en cada una de las cebadas empleadas, en donde se encontró que la
cebada malteada posee un 80% de almidón y la cebada sin maltear un 60%, como
se puede observar en la Tabla 5.
Tabla 5. Resultados de la concentración de almidón realizados a la cebada mateada y sin matear.
Tipo % Almidón Representación
Cebada malteada
80
Cebada sin maltear 60
Estos valores concuerdan con los mencionados en el marco teórico (Ver Tabla 1).
Descartándose que cualquier irregularidad en los ensayos sea ocasionada por
limitación de la concentración de almidón. En el trabajo realizado por Chen et al.
53
(2007), se describe que la concentración de sustrato resulta ser un factor crítico en
el momento de la liberación de azúcares reductores, sustentando de manera
confirmativa lo descrito anteriormente, es decir, a mayor concentración de sustrato
la cantidad de azúcares reductores disponibles para la levadura se incrementan.
Considerando de esta forma a estas cebadas como sustratos manejables para la
levadura, y su fermentación (Santander, 2006), debido a que la concentración de
azúcares fermentables producidos en el proceso de hidrólisis de almidón de cebada
determinarán más adelante las condiciones de fermentación para la producción de
etanol.
6.2 PROCESO HIDROLÍTICO DEL ALMIDÓN DE CEBADA SIN MALTEAR
Para establecer la concentración óptima de α y β amilasas comerciales en la
obtención de etanol a partir de cebada sin maltear empleando Saccharomyces
cerevisiae, se tuvieron en cuenta los siguientes factores: concentración de azúcares
reductores, pH, temperatura, formación de biomasa y producción de etanol.
En orden a lo citado anteriormente, se experimentó con una concentración de
cebada de 250 g/L, estipulada como la dosis equivalente en una base de cálculo de
un litro, a la concentración empleada a escala industrial determinada en base a la
experiencia práctica y teórica de la destilería, asegurando de esta forma el consumo
total de los azúcares por parte de la levadura. Esta concentración se confirma con lo
reportado por Kolusheva y Marinova (2007), quienes obtuvieron la mejor condición
de hidrólisis de almidón con una concentración de sustrato de 250 g/L, ya que
evidenciaron una inhibición generada por los azúcares reductores obtenidos durante
la hidrólisis del sustrato en concentraciones superiores al 250 g/L. Para probar esta
hipótesis, investigaron la influencia de la concentración de la glucosa añadida al
sustrato sobre el tipo de reacción enzimática, concluyendo que la adición de glucosa
en el inicio del proceso de hidrólisis, reduce significativamente la velocidad de
reacción del proceso, y el porcentaje de esta reducción es proporcional a la
cantidad de glucosa añadida.
Como es conocido, la tasa máxima de reacción enzimática es proporcional a la
concentración de enzimas (Kolusheva y Marinova, 2007), por lo tanto, se determinó
54
la concentración de alfa y beta amilasas comerciales necesaria para degradar el
almidón presente en la cebada no malteada, de tal forma que Saccharomyces
cerevisiae utilice los productos de la hidrólisis como fuente de energía. Se examinó
esta influencia en un rango de concentraciones entre 5-25 mL enzimas por litro de
suspensión. En la Gráfica 1 se observa la relación obtenida entre la concentración
de azúcares reductores y las dosis de enzimas adicionadas para el proceso
hidrolítico, evidenciando cómo la concentración de azúcares reductores aumenta a
medida que se incrementa la dosis de enzima, hasta la concentración de de 20
mL/L, como respuesta a la hidrólisis de almidón, demostrándose que el medio y las
condiciones utilizadas para el proceso hidrolítico, llevado a cabo por la acción
catalítica de las enzimas Multifect® AA 21L y Multifect® AA 23L fueron los
adecuados. Sin embargo, Kolusheva y Marinova (2007) reportan, que la mayoría de
las veces la hidrólisis enzimática se lleva a cabo con α-amilasas y con menos
frecuencia son empleadas las β-amilasas, demostrándose con los resultados
obtenidos que estas dos enzimas pueden llegar realizar una labor sinérgica para
hidrolizar el almidón de la cebada sin maltear. Además, de acuerdo con lo reportado
Eglinton (1998), las beta-amilasas son enzimas claves en la degradación del
almidón de la cebada germinada (Hordeum vulgare L.), la cual es sintetizada
durante el desarrollo de la cebada grano, en contraste con otras importantes
enzimas hidrolíticas que son sintetizados durante la germinación.
Gráfica 1. Concentración de azúcares reductores en función de la dosis de de enzimas, (C+) control de comparación y (C-) control negativo después de la hidrólisis por 8h.
55
En la Gráfica 1 se observa, que el valor obtenido de azúcares reductores en el
control negativo, fue inferior en relación a los valores obtenidos en todos los
ensayos con enzimas, demostrando que efectivamente se logró hidrolizar el almidón
de la cebada sin maltear reflejándose en el aumento de la concentración de
azúcares reductores, desaparición del característico color azul con yodo (Ver Figura
Anexo 5.2), y en la turbidez y color del medio (Ver Figura Anexo 5.1) (Norris y
Richmond, 1981).Por lo que se podría considerar el uso estas como una ayuda para
mejorar el rendimiento hidrolítico del almidón de la cebada sin maltear, utilizada en
el proceso de producción de la destilería.
Teniendo en cuenta, que generalmente la acción de α y β amilasas sobre el almidón
natural de los granos no es muy efectiva por que estos presentan una resistencia a
la digestión amilolítica (Sarikaya et al., 2000), los valores obtenidos de las
concentraciones de azúcares reductores, demuestran lo reportado por Lauro (2001),
donde la acción hidrolítica de las amilasas sobre el almidón de granos de cebada se
lleva a cabo porque estas enzimas erosionan la superficie del grano o digieren
canales en puntos seleccionados en la superficie hacia el centro del grano,
permitiendo la difusión de la enzima hacia el sustrato, la adsorción de la enzima
sobre el sustrato y el evento catalizador.
En la Gráfica 1, se evidencia una caída en los valores de la concentración de
azúcares reductores entre la concentración con 20 mL/L y 25 mL/L, la causa de este
hecho según lo reportado por Kolusheva y Marinova (2007), se debe a que entre
mayor sea la concentración de enzimas y menor sea el sustrato disponible, la tasa
de reacción disminuye, porque hay menos lugares de reacción activos disponibles
para hidrolizar el almidón, generando una limitante por exceso de enzimas.
Comparando los resultados anteriores, se determinó que la concentración óptima
de enzimas para producción del mosto ó hidrolizado de fermentación es 20 mL/L, ya
que la utilización de concentraciones mayores no se traduce en un aumento de la
tasa de reacción enzimática (Tabla Anexo 4.1).
Kolusheva y Marinova (2007), reportan en su trabajo que los parámetros básicos
que afectan al proceso de hidrólisis son la temperatura, el tiempo de hidrólisis, el pH
56
del medio, la concentración del sustrato y la concentración de la enzima, los cuales
varían dependiendo de la enzima. Teniendo en cuenta lo anterior, todos los ensayos
se desarrollaron bajo las mismas condiciones de pH (5.5), temperatura (95oC para
α- amilasa y 57oC para β-amilasa), y tiempo de hidrólisis (8 horas). Los resultados
obtenidos del proceso hidrolítico, concuerdan con los obtenidos en el estudio de la
influencia de la temperatura sobre la tasa de hidrólisis por Kolusheva y Marinova
(2007), quienes determinaron que la tasa de la reacción enzimática es casi idéntica
a 90°C y 100°C, eligiendo 90°C como la temperatura óptima. De igual forma, Hill et
al. (1997) reportaron que la mayor tasa de hidrólisis obtenida con una α-amilasa fue
pH 5.5. En cuanto al tiempo de hidrólisis, Kolusheva y Marinova (2007) en sus
resultados sobre la influencia del tiempo de hidrólisis en la concentración de
azúcares reductores, obtuvieron la máxima concentración de azúcares reductores y,
por ende, el nivel máximo de hidrólisis después de 4 horas y 15 minutos. Sin
embargo, reportan que el comportamiento hidrolítico de otra amilasa termoestable,
sintetizada por B. licheniformis MB-80 tuvo una duración superior a 7 horas, lo que
concuerda con el tiempo empleado para la hidrólisis del almidón de cebada, y
confirmándose con los valores de las concentraciones de azúcares reductores de la
Grafica 1.
Tabla 6. Datos del rendimiento de hidrolisis obtenidos en el proceso hidrolítico.
Dosis de Enzimas
(mL/L)
Rendimiento de
hidrólisis (%)
5 66.9964
10 67.3686
15 73.1762
20 89.4376
25 65.3359
Control de
comparación 41.8491
Control Negativo 3.8570
57
Otro parámetro evaluado fue el rendimiento de hidrólisis, estos datos están
presentados en la Tabla 6, exhibiendo que la prueba con el mejor rendimiento de
hidrolisis fue con la dosis con 20 mL/L (89,44%), seguida de la dosis con 15 mL de
enzimas (73.17%), demostrándose que la presencia de enzimas es fundamental
para la obtención de un mejor rendimiento hidrolítico, ya que en todos los
tratamientos con enzimas y en el control de comparación se obtuvo un rendimiento
satisfactorio en relación al control negativo, en el cual la concentración de amilasas
es insuficiente para la degradación completa del almidón presente en la cebada,
razón por la cual el valor del rendimiento de hidrólisis es bajo.
Al igual que en la liberación de azúcares reductores, la tendencia seguida por el
rendimiento de la hidrólisis enzimática es similar, tal como se aprecia en la Gráfica
2, coincidiendo con lo reportado por Chen et al. (2007), quienes reportaron este
parámetro para la determinación del efecto de la concentración de sustrato y de
enzimas en el proceso de hidrólisis enzimática, donde la concentración de azúcares
reductores tenía una tendencia de variación similar al rendimiento de hidrólisis,
aumentando ambas a medida que la concentración de enzimas era mayor.
Gráfica 2. Relación azúcares reductores producidos y rendimiento de hidrólisis en función de la concentración de enzimas, (C+) control de comparación y (C-) control negativo.
58
Los análisis estadísticos fueron realizados por medio del programa computarizado
SPSS vs 10, en donde se cumplió la hipótesis alterna (ver numeral 5.8),
presentando diferencias significativas entre los tratamientos (Ver Tabla Anexo 9.1 y
9.2), confirmando que las dosis de enzimas influyen significativamente en la
concentración de azúcares reductores (p<0,005) y del rendimiento de la hidrólisis
enzimática (p<0,005), obteniendo la mayor concentración de estos en el tratamiento
con 20 mL/L de enzimas.
6.3 ENSAYO PREVIO DE FERMENTACIÓN
La conversión de glucosa a etanol es llevada a cabo por muchas levaduras, pero
muy pocas bacterias. En los procesos industriales generalmente es utilizada
levadura del género Saccharomyces, ya que posee un rendimiento teórico de 51.1%
(p/p) (Glazer y Nikaido, 1998), además de ser un microorganismo no patógeno
anaerobio facultativo (Navarro y Sossa, 2003). Por esta razón y por ser esta la
levadura empleada en Destilería Premier LTDA. en su proceso productivo, se
seleccionó Saccharomyces cerevisiae cepa Safwhisky M-1 para la fermentación de
los mostos generados en el proceso de hidrólisis (Ver Anexo 12).
Para predecir el desarrollo de la fermentación fue necesario conocer la curva de
crecimiento de la levadura (UFC/mL), determinado los intervalos de tiempo para la
fase aerobia y anaeróbica, debido a que las levaduras en aerobiosis oxidan los
azúcares simples como la glucosa hasta gas carbónico y agua por la vía de Embden
Meyerhoff Parnas y después el ciclo de Krebs, para producir ATP, NADH+H+ y
formar radicales carbonados intermediarios en la biosíntesis celular. Mientras que
en anaerobiosis se produce etanol y CO2 (Madigan et al., 2003). Razón por la cual,,
se realizó una fermentación previa, empleando un hidrolizado de cebada obtenido
bajo las mismas condiciones de experimentación del control comparación tal como
se observa en la Gráfica 3, evidenciando que a partir de la hora 6 empieza una fase
logarítmica hasta la hora 36 de fermentación. Navarro y Sossa (2003), reportan que
la glucosa (azúcar reductor) que es la fuente principal de carbono en el medio
disminuye con el paso del tiempo, reflejándose en el aumento de la biomasa. A la
hora 48 de fermentación se presenta la mayor cantidad de UFC/mL con un recuento
59
de 2,88x 109 UFC/mL, como se aprecia en la Tabla Anexo 6.1. Sin embargo el
recuento entre la hora 36 y 48 no presentó un aumento significativo, como se puede
ver en la Gráfica 3, determinando que la fase aeróbica de fermentación de los
tratamientos con enzimas y controles seria durante las primeras 36 horas de
crecimiento de S. cerevisiae Safwhisky M-1, teniendo en cuenta que muchas
fermentaciones anaeróbicas requieren una fase inicial de crecimiento aeróbico como
es el caso de la producción de dextranos, alcoholes y 2,3 etilenglicol, y sólo
después, en la fase de producción se generan condiciones reductoras (Rhodes y
Fletcher 1969).
Gráfica 3. Curva de Crecimiento de Saccharomyces cerevisiae durante el ensayo previo de experimentación.
En la gráfica 3, se observa una fase estacionaria corta, con una duración de 24
horas, es decir entre la hora 36 y a la 60. A partir de la hora 60 empieza la fase de
muerte de la levadura, donde disminuye la viabilidad celular hasta finalizar con un
recuento de 8,0 x 108 UFC/mL, como se aprecia en la Tabla Anexo 6.1. Estudios
han demostrado el papel que tienen los esteroles en la fermentación de cerveza y
whisky, estando conectados con la necesidad de oxígeno en el proceso de
fermentación. En el estudio realizado por Aries et al. (1977), observaron que el
oxígeno durante la fermentación es necesario para la ciclización del escualeno a
60
lanosterol. En ausencia de oxígeno, el escualeno se acumula y el contenido de
esteroles disminuye, reduciendo el crecimiento de la levadura, mientras que en
presencia de oxígeno conduce a una mayor síntesis de ergosterol, concurrente con
el aumento en el crecimiento de la levadura. En otro estudio, realizado por
Hayashida y Ohta (1980), se demostró el papel del ergosterol sobre la tolerancia del
etanol, complementando las células con ergosterol solo y ergosterol con ácido oleico
durante 48 h, evaluándose la indurabilidad de las células y la acción fermentativa
en presencia de alcohol (20%). Se observó que el oleato de ergosterol ligeramente
promueve el crecimiento, mientras que en alcohol la indurabilidad de las células fue
notablemente mayor. Aunque el ácido oleico y el ergosterol en combinación mejoran
el crecimiento y el alcohol indurabiliza, ninguno de estos puede aumentar la
actividad fermentativa de las células. Por lo tanto, se sugirió que los esteroles son
cruciales para la promoción de la indurabilidad de células en presencia de alcohol
mediante el suministro de rigidez a la membrana. Una disminución en el contenido
de ergosterol de la membrana de la célula también ha sido directamente relacionada
con disminución de la viabilidad celular en presencia de etanol (Larue et al. 1980;
Lees et al., 1980).
Por último, de acuerdo con los resultados obtenidos en el ensayo previo de
fermentación, se determinó que para los tratamientos con enzimas y controles, se
suspendería la entrada de aire a partir de las 36 horas, empleando un tapón de
caucho y filtro de salida de gases hasta terminar la fermentación, considerando que
partir de este punto inicia la fase estacionaria en donde la ausencia de oxigeno
favorece la fermentación de azúcares hasta etanol, terminado la fermentación a las
84 horas. A pesar que esta fermentación se dé durante un tiempo prologado, el
objetivo de dejar hasta la hora 84 fue recuperar el mayor volumen de etanol que las
levaduras pudieran producir, además de poder observa el comportamiento de las
levaduras durante este tiempo, a su vez se estableció este periodo de fermentación
en base a la experiencia de experimentación obtenida por parte del personal en la
destilería.
61
6.4 FERMENTACIÓN DE Saccharomyces cerevisiae EN HIDROLIZADO DE CEBADA SIN MALTEAR
Las levaduras son comúnmente los microorganismos más utilizados para la
fermentación alcohólica. El cultivo anaeróbico de Saccharomyces cerevisiae, genera
además de etanol, dióxido de carbono, glicerol y biomasa como los más importantes
subproductos (Brandberg et al., 2007). Siqueira et al. (2008), reportan en su trabajo
que para la producción de biomasa de Saccharomyces cerevisiae, realizaron la
propagación del inóculo bajo condiciones de agitación de 100 rpm y 30°C durante
24 horas. Condiciones que se adoptaron para la producción del inóculo de
Saccharomyces cerevisiae cepa Safwhisky M-1, con el fin de asegurar una gran
producción de biomasa, obteniendo un recuento de 1,06 x 106 UFC/mL. Para
evaluar el comportamiento de la levadura se evaluaron durante la fermentación
diferentes parámetros tales como la producción de biomasa (UFC/mL), y la
concentración de azúcares reductores y etanol al final de la fermentación.
En orden a lo mencionado anteriormente, de cada repetición de un tratamiento, se
sacó una curva de crecimiento promedio que permitió observar el comportamiento
de S. cerevisiae Safwhisky M-1 a lo largo de la fermentación en el hidrolizado de
cebada, producto de las diferentes concentraciones de amilasas comerciales
estudiadas. En la Gráfica 4, se observan las curvas de crecimiento obtenidas,
evidenciando que las células no necesitaron de una fase de adaptación, desde la
hora cero empezaron un crecimiento exponencial que terminó en la hora 48, a partir
de la cual la población empezó a disminuir, en este caso no se evidenció la fase de
muerte.
Reducir la fase de adaptación a cero horas, implica alcanzar en menos tiempo la
concentración de células necesaria para iniciar el proceso de fermentación, lo cual
es muy bueno para optimizar la reproducción llevada a cabo en planta (Santander,
2006). Además, la razón por la cual, a partir de la hora 48 la formación de biomasa
muestra un comportamiento estacionario, donde los valores de los recuento tienden
a disminuir, como se aprecia en las Tablas Anexo 6, es debido a que la glucosa
presente en el medio entra a un proceso glicolítico, seguido por uno fermentativo,
62
Gráfica 4. Población de Saccharomyces cerevisiae presente en el medio de fermentación con las diferentes concentraciones de enzimas.
donde solo se genera un ATP en la primera etapa (glicolisis), lo que representa un
rendimiento más bajo que el obtenido por vía aerobia (Glazer & Nikaido 1998),
además del agotamiento de este azúcar en el medio.
La Gráfica 4, muestra el comportamiento obtenido de la población durante el
proceso de fermentación de 84 horas en los mostos resultantes de la hidrólisis con
las amilasas. Al comparar los datos obtenidos, no se observa que una diferencia
significativa entre los recuentos de los diferentes ensayos, sin embargo las curvas
con mejor desempeño fueron aquellas donde el medio fue tratado con las
concentraciones más altas de enzimas (Ver Tablas Anexo 6 y Gráficas Anexo 7). La
población de todos los ensayos tienden a aumentar con el transcurso del tiempo
durante las primeras horas de fermentación aproximadamente hasta la hora 48, con
excepción del ensayo con 5mL/L (Hora 54); momento en el cual se obtiene la
biomasa máxima para todos los tratamientos, a partir de este punto se evidencia un
descenso de la población, debido al agotamiento del sustrato, en este caso glucosa,
ya que los valores obtenidos de la concentración de azúcares reductores al final de
la fermentación son inferiores a los obtenidos al inicio de la fermentación (Ver Tabla
Anexo 6.9). Además, S. cerevisiae tiene la capacidad de alcanzar tasas de glicolisis
63
y de producción de etanol en condiciones óptimas en poco tiempo, pero esta tasa se
mantiene sólo por un breve período durante la fermentación y disminuye
progresivamente a medida que el etanol se acumula en el medio (Casey y
Ingledew, 1977; Ingram y Buttke, 1984; Moulin et al., 1984). Estudios anteriores han
identificado una necesidad esencial de lípidos (Beavan et al., 1982; Casey et al.,
1984; Thomas et al., 1978) u oxígeno molecular para la biosíntesis de los lípidos
(Andreason y Stier, 1954; Buttke et al., 1980; Buttke y Pyle, 1982) en muchos
medios de fermentación para el mantenimiento de una actividad fermentativa alta. El
suministro de estas necesidades nutricionales reduce, pero no elimina la
disminución de la actividad fermentativa durante la fermentación. Se conoce que el
etanol altera la permeabilidad de membrana y la función de la membrana en una
variedad de sistemas biológicos (Casey y Ingledew, 1986; Ingram y Buttke, 1984).
En levaduras, el etanol provoca un aumento en el flujo de iones de hidrógeno a
través de la membrana plasmática de las células suspendidas en agua (Cartwright,
et al., 1986). Este aumento de flujo de iones de hidrógeno se ha propuesto como el
responsable de la inducción del etanol, disminuyendo las tasas de transporte
observadas en condiciones similares (Beavan, 1982; Leao y Van Uden, 1982; Leao
y Van Uden,1984; Leao y Van Uden,1984). Demostrándose que la acumulación de
etanol no puede ser el único factor responsable para la disminución de la actividad
fermentativa, ya que la sustitución del medio de fermentación que contiene etanol
por uno nuevo que carece de este, no restablece inmediatamente la actividad
fermentativa (Dombek y Ingram, 1986.). Millar et al. (1982) demostró que las
concentraciones de etanol por debajo del 12% (v/v) no desnaturaliza las enzimas o
causa una inhibición de la actividad apreciable in vitro. Dado a que el etanol no se
acumula dentro de levadura, pero si se difunde rápido en toda la membrana celular
(Dombek y Ingram, 1985; Guijarro y Lagunas, 1984), inhibiendo directamente las
enzimas glicolíticas intracelulares, sin embargo, reportan que es poco probable que
durante la fermentación se produzca una concentración del 12% (v/v) de etanol o
menos.
En la gráfica 4 también se observa, que las curvas de crecimiento de todos ensayos
con enzimas están muy cercanas a la curva de control de comparación, en especial
los tratamientos con concentraciones de enzimas mayores, lo que demuestra que
64
los hidrolizados de cebada fueron medios con concentraciones de azúcares
adecuadas para el desarrollo de Saccharomyces, logrando tener un comportamiento
muy cercano al establecido tradicionalmente por la destilería (control de
comparación). Sin embargo, teniendo en cuenta el valor obtenido de azúcares
reductores en el control de comparación (Ver Gráfica 1), se puede decir que en este
medio los azúcares liberados al medio son fácilmente asimilados por las levaduras,
favoreciendo una mayor formación de biomasa en relación a las curvas de
crecimiento obtenidas en los tratamientos con enzimas en los cuales todos
presentaron valores de azúcares reductores superiores a este control, no obstante,
este valor no indica que toda esta concentración sea aprovechable para las
levaduras, ya que de acuerdo con lo reportado por Hornesey (2003), estas enzimas
pueden producir altos niveles de monosacáridos pero relativamente poco azúcar
fermentecible.
En la Gráfica 5 se evidencia, que las barras que representan el valor de la biomasa
máxima alcanzada en los diferentes ensayos, tienden a alcanzar la misma altura, lo
anterior no expresa que todos los ensayos tengan el mismo valor de biomasa
máxima, por ejemplo el tratamiento con una concentración de enzimas de 25 mL/L
presento la población máximas más alta a la hora 48 (2,35 x 109 UFC/mL), seguido
por el control positivo (2,33x 109 UFC/mL), y las concentraciones de 20 mL/L,10
mL/L y 15 mL/L(2,15x109 UFC/mL, 1,98x109 UFC/mL, 1,83x109 UFC/mL,
respectivamente), mientras que los valores más bajos fueron obtenidos en la
concentración de 5 mL/L (8,0x108 UFC/mL) a la hora 54 y en el control negativo
(7,75x108 UFC/mL). Aunque el ensayo llevado a cabo con 25 mL/L de α y β-
amilasas alcanzó el valor de biomasa máxima mayor y sabiendo que este es un
factor importante, no se escogió a esta dosis por la baja concentración de azúcares
reductores liberados en la hidrólisis del almidón de cebada, al descartarla le sigue
la concentración con 20 mL/L, en la cual se obtuvo la mayor concentración de
azúcares reductores, y el valor de biomasa máxima para esta no está tan alejado al
de la concentración con 25 mL/L, alcanzando la biomasa máxima, también a las 48
horas de fermentación.
65
Gráfica 5. Relación entre concentración de células/mL máxima y el tiempo de obtención de la biomasa máxima de S. cerevisiae en función de la concentración de
enzimas, (C+) control de comparación y (C-) control negativo. En la Gráfica 5 se observa, que al incrementar la dosis de enzimas se favorece la
producción de biomasa a pesar que la diferencia entre ensayos no es
representativa. También se evidencia que el tiempo en el que alcanza S. cerevisiae
su biomasa máxima, se ve influenciado por la concentración de enzimas, como por
ejemplo, en el medio con 5 mL/L de enzimas S. cerevisiae alcanzó su biomasa
máxima a la hora 54 de fermentación, en comparación al tiempo en el cual S.
cerevisiae alcanzó su biomasa máxima en todos los demás tratamientos, el cual fue
a las horas 48 horas de fermentación.
Al analizar estadísticamente los resultados obtenidos de biomasa, se comprueba
que existe diferencias significativas entre los tratamientos (Ver Tabla Anexo 9.3 y
9.4), confirmando que las dosis de enzimas influyen significativamente en la
formación de biomasa (p<0,005). Además se demostró, que la concentración de
enzimas no influye en el tiempo en el cual la levadura alcanza su biomasa máxima ,
ya que no se presentaron diferencias significativas, razón por la cual, S. cerevisiae
66
presentó una tasa de crecimiento diferente en cada tratamiento con una
determinada concentración de enzimas, debido a que en cada ensayo se obtuvo
una concentración diferente de azúcares disponibles para la levadura,
consumiéndolos como fuente de carbono y energía, independiente del tiempo de
fermentación.
6.4.1 Consumo de sustrato
La glucosa (azúcar reductor) es la fuente principal de carbono en los hidrolizados de
cebada, disminuyendo con el tiempo de fermentación, como se observa en la
Gráfica 6, evidenciando que las concentraciones de azúcares reductores obtenidas
en el proceso de hidrólisis caen drásticamente hasta una concentración determinada
para cada ensayo, especialmente en los tratamientos con las concentraciones de
enzimas más altas. Este descenso o consumo de sustrato, es causado por que los
azúcares disponibles en el medio son utilizados por la levadura como fuente de
carbono. Se observa también, que el consumo de sustrato es proporcional a la
concentración de azúcares reductores iníciales de la fermentación, entre mayor sea
la fuente de carbono disponible, mayor será el consumo de sustrato por parte de la
levadura. Demostrando que la variación observada a nivel de población de S.
cerevisiae en los diferentes tratamientos con enzimas, se debe a la concentración
de azúcares disponibles, valor que está directamente determinado por la
concentración de enzimas presente en el medio.
El consumo de sustrato observado, demuestra que los azúcares reductores
presentes en el hidrolizado son fácilmente metabolizados por la levadura, ya que,
Saccharomyces cerevisiae posee una baja batería enzimática, donde solo puede
fermentar hexosas como: D-glucosa, D-fructosa y D-manosa, aunque no todas las
utiliza a la misma velocidad (Tuite y Oliver, 1991), indicando también que el azúcar
que posiblemente pueden estar presente en el hidrolizado es principalmente la
glucosa, a demás de ser el monómero constituyente del almidón.
67
Gráfica 6. Relación entre la concentración de azúcares reductores inicial y final de la fermentación con S. cerevisiae en función de la concentración de enzimas, (C+)
control de comparación y (C-) control negativo.
En la Tabla 7, se observa que la variación entre los valores de la biomasa máxima
obtenidos, no es tan grande como la del consumo de sustrato, en relación a la
concentración de enzimas, por lo que se puede decir que la presencia de las
enzimas influye en el aprovechamiento del sustrato para producir biomasa
(Santander, 2006). Sin embargo, al comparar el tratamiento con 15 mL/L de
enzimas, y el de 25 mL/L, el consumo de sustrato obtenido para estos es muy
parecido (42,312 g/L, 41,084 g/L, respectivamente), pero la biomasa producida con
ese mismo consumo es más alta cuando la concentración de enzimas es mayor.
Según estos resultados, adicionar una dosis de enzimas mayor al medio, hace más
eficiente el consumo de sustrato, la célula aprovecha los azúcares para producir
más biomasa que para otras funciones fisiológicas (Santander, 2006),
demostrándose con los resultados obtenidos de formación de biomasa (Ver Gráfica
4), donde Saccharomyces cerevisiae incrementa su tasa de crecimiento a medida
que aumenta la concentración de enzimas, ya que en los tratamientos con dosis de
enzimas mayores, se obtuvieron las concentraciones de azúcares reductores y
consumos de sustrato más altos, confirmando que la levadura toma los azúcares
68
reductores presentes en el medio como fuente de carbono y energía (Navarro y
Sossa, 2003).
Tabla 7. Datos de la biomasa máxima alcanzada y el consumo de sustrato bajos las diferentes concentración de enzimas, (C+) control de comparación y (C-) control negativo.
Concentración de enzimas
mL/L
Log Biomasa
máx (UFC/mL)
Sustrato Consumido
(g/L)
5 8,902 36,159
10 9,295 38,274
15 9,261 42,312
20 9,332 53,400
25 9,371 41,084
C + 9,366 34,208
C - 8,889 0,159
Por otro lado, en el control negativo, se evidencia que Saccharomyces cerevisiae
alcanza un valor de biomasa máxima de 8,889 Log UFC/mL, mostrando una mínima
diferencia de 0,013 Log UFC/mL con el tratamiento de 5 mL/L de enzimas, teniendo
en cuenta que en este control no hay un elemento enzimático que realizara la
hidrólisis del almidón, se considera que este comportamiento se da, por la presencia
de fuentes de carbono diferentes a los azúcares liberados del almidón y de fácil
asimilación para la levadura, porque los valores obtenidos de azúcares reductores y
del consumo de estos para este control fueron muy bajos, razón por la cual, la
concentración de azúcares obtenida no tiene una correlación con el valor de
biomasa obtenido .
Como se observa en la Gráfica 7, el aumento de la dosis de enzimas influye en el
consumo de sustrato, mostrando un comportamiento de variación similar. Se
evidencia que la concentración de enzimas con mayor consumo de sustrato es la
recomendada en este estudio, 20 mL/L (53,4 g/L), sin embargo, en los tratamientos
69
Dosis de Enzimas (ml/L)
5 10 15 20 25 C + C -
Sus
trato
Con
sum
ido
(g/L
)
0
10
20
30
40
50
60
70
Gráfica 7. Consumo total de sustrato bajo las diferentes concentraciones de enzimas, (C+) control de comparación y (C-) control negativo.
con las diferentes concentraciones de enzimas se observan consumos no tan
lejanos a los obtenidos en esta concentración, pero si superiores al control de
comparación (Ver tabla ANEXO 6.9), demostrándose, que el empleo de este tipo
enzimas favorece a la liberación de azúcares reductores en la hidrólisis del almidón
de la cebada sin maltear, los cuales serán asimilados por la levadura para su
mantenimiento celular. Al analizar estadísticamente los resultados obtenidos de
consumo de sustrato, se comprueba que existe diferencias significativas entre los
tratamientos (Ver Tabla Anexo 9.5), confirmando que las dosis de enzimas influyen
significativamente en la formación de biomasa, obteniendo el mayor consumo en el
tratamiento con 20 mL/L de enzimas (p<0,005).
6.4.2 Producción de etanol En la Gráfica 8 se observa, la concentración de etanol obtenido en la fermentación
con S. cerevisiae Safwhisky M-1 en función de la concentración de enzimas
utilizadas en el proceso hidrolítico. Se evidencia, que la tendencia que tiene la
concentración etanol es aumentar, a medida que se incrementa la dosis de enzima
70
(Ver tabla Anexo 6.11). El tratamiento con mayor producción de etanol fue con 20
mL/L de enzimas, comprobando que el aumento de la dosis de enzimas, favorece la
obtención de etanol. Sin embargo, los valores de etanol obtenidos en la
concentración de 15 mL/L, en relación a los de la concentración de 20 mL/l
presentan una variación de solo 0,58% de etanol, por lo que el rendimiento de esta
concentración es muy cercano al mejor (20mL/L).
Gráfica 8. Producción total de etanol bajos las diferentes concentración de enzimas,
(C+) control de comparación y (C-) control negativo.
En la gráfica 9, se observa que la producción de etanol en la concentración de
25/mL fue la menor en relación a los demás ensayos y al control de comparación,
indicando que en este caso, la levadura utilizó gran parte del sustrato para formar
biomasa y el remanente lo utiliza para la formación de producto, porque la biomasa
producida en este ensayo no tuvo mayor diferencia a la de los demás resultados
obtenidos, pero la influencia de esta concentración si se refleja en el sustrato
consumido y porcentaje de alcohol producido. De la misma forma, se observa que
para los demás tratamientos y control de comparación, la producción de etanol
requiere un consumo mayor de sustrato, observando una proporción directa entre
estos dos parámetros.
71
Gráfica 9. Consumo total de sustrato y producción total de etanol bajos las diferentes concentración de enzimas, (C+) control de comparación y (C-) control
negativo.
Por otro lado, en el control negativo, se evidencia que Saccharomyces cerevisiae
alcanza un valor de etanol de 0,46 %, considerando que este valor, a pesar de ser
muy bajo, es obtenido posiblemente por la fermentación de azúcares liberados por
hidrólisis enzimática por acción de alfa y beta amilasas de la cebada, las cuales se
encuentran en concentraciones tan bajas que para un proceso productivo no son
representativas en relación a la concentración presente en la cebada malteada, sin
embargo, como se observa en la grafica 8, la concentración de enzimas presentes
en esta cebada tuvo la capacidad de liberar azúcares del almidón para producir este
valor de etanol, pero la naturaleza de estos azúcares son diferentes a la glucosa, ya
que el valor de azúcares reductores obtenido y el consumo de sustrato, reflejan un
comportamiento muy bajo, por lo que la levadura pudo realizar la fermentación a
partir de una fuente de carbono diferente a los azúcares cuantificados por el método
de Fehling.
Con el análisis estadístico se comprobó que existe diferencias significativas entre
los cinco tratamientos (p<0,005), (Ver Tabla Anexo 9.6), demostrando que los
tratamientos con una concentración de enzimas entre 15 y 20 mL/L, producen
72
mayor concentración de etanol, que en los tratamientos donde se utilizan dosis
menores o mayores a estas.
Gráfica 10. Relación entre la concentración de etanol producido y productividad producto-sustrato en función en función de la concentración de enzimas, (C+)
control de comparación y (C-) control negativo.
En la Gráfica 10 (Ver Tabla Anexo 9.7) se observa la productividad del proceso, en
la cual, la relación de gramo de etanol producido por gramo de azúcar consumido no
presenta una diferencia considerable entre ensayos, sin embargo la influencia de las
dosis de enzimas si afecta este valor, ya que la producción de etanol depende de la
cantidad de azúcar consumido y por ende la concentración de azúcares producidos
en la hidrólisis por acción de una determinada concentración de enzimas. Estos
resultados concuerdan con lo referenciado por Siqueira et al. (2008) obteniendo
resultados donde el porcentaje de etanol generado, por gramo de sustrato
consumido en cada ensayo no presenta diferencias considerables. Por lo tanto se
concluye que la productividad con mejor comportamiento es para las dosis con 15 y
20 mL/L de enzimas, confirmando los demás resultados presentados donde el
desempeño de estas enzimas fue el óptimo para este estudio. Por otro lado, al
observar la Gráfica 9 y 10, se evidencia que la mayor concentración de etanol
obtenida fue con una concentración de enzimas de 20 mL/L, confirmando a esta
Dosis de enzima (ml/litro)
5 10 15 20 25 C + C -
Etan
ol (%
)
0
1
2
3
4
5
Y p/
s (g
de
etan
ol/g
azú
care
s re
duct
ores
)
0
1
2
3
4
73
como la mejor concentración de alfa y beta amilasas, para la obtención de una alta
concentración de azúcares reductores fácilmente asimilables por Saccharomyces
cerevisiae.
Finalmente, se sometieron a una prueba sensorial los diferentes destilados
obtenidos en los diferentes tratamientos con las concentraciones de enzimas, con el
fin de determinar una posible alteración en la calidad organoléptica del alcohol
obtenido en estos ensayos, determinado que en ninguno de los ensayos se
presentó una alteración de sabor y olor, resultado que favorece y respalda la
propuesta de este ensayo, como lo es la utilización de enzimas comerciales como
alternativa en el proceso de producción en Destilería Premier, teniendo en cuenta
también experiencias similares en la destilería que presentaron un producto picante
y con deficiente aceptación por el panel de evaluación sensorial.
6.5 COSTOS DE PRODUCCIÓN Chen et al. (2007), reportaron como el costo de las enzimas contribuye
significativamente al costo total del proceso de conversión de biomasa, donde la
dosis de enzimas debe ser minimizado tanto como sea posible. Teniendo en cuenta
esto, las concentraciones empleadas en este estudio se establecieron basándose
en las recomendaciones del proveedor, y en un ensayo previo con una dosis de 1
mL/L, dando este último un resultado desfavorable a nivel de hidrólisis y generando
un medio muy viscoso para la fermentación. La reducción de los costos de
producción son la esencia de la adopción de medidas contundentes en la mejora del
proceso manufacturero de la industria de destilería (Kłosowski, 2006), por lo tanto,
se calculó el costo de un litro de etanol producido en la destilería para un lote de
10.000 litros, el cual es de 4.428 pesos/litro como resultado de la destilación de un
volumen de 1.000 litros de etanol (Ver Anexo 10). Además, se determinó el costo
del mismo litro de alcohol, pero empleando una contracción de 20 mL/L de enzimas
para un lote de producción de 10.000 litros, dando como resultado que el litro de
alcohol tendría una equivalencia de 15.936 pesos/litro de etanol, en base a los
resultados obtenidos del presente estudio. Además, la propuesta de este estudio de
emplear únicamente cebada nacional como materia prima para el proceso hidrolítico
74
y fermentativo, presenta ventajas como ser 2.500 pesos/kilo más económica que la
cebada malteada, asimismo su disposición no requiere un proceso de importación.
Teniendo en cuenta lo mencionado anteriormente, se considera que el empleo de
las enzimas en una concentración de 20 mL/L como única herramienta hidrolítica
sustituyente de la cebada importada, no se favorece a nivel de rentabilidad en el
proceso productivo de las destilería. Sin embargo, la utilización de estas enzimas
como ayudante en el proceso de hidrólisis, especialmente para la degradación del
almidón de cebada sin maltear, favorecería el rendimiento de este proceso y tiempo
de producción, además de ser una posible solución a los problemas que en
ocasiones se presenta en el proceso productivo en la destilería, a nivel de tiempos
muy largos en la hidrólisis del almidón, incremento de la viscosidad, generando
apelmazamiento del medio y retraso en la producción, teniendo en cuenta que estas
enzimas contribuyeron en la disminución de la viscosidad del medio, de acuerdo con
los resultados obtenidos en el proceso hidrolítico (Ver Anexo 5)
Por otro lado, en este estudio se demostró que las enzimas empleadas para el
proceso amilolítico, realmente degradaron el almidón de la cebada sin maltear, por
lo que se podría considerar para futuros estudios el empleo de concentraciones de
sustrato mayores, empleando las mismas concentraciones de enzimas de este
estudio durante periodos de tiempo más largos y a su vez, concentraciones de
enzimas menores tales como las reportadas por Kolusheva y Marinova (2007), las
cuales fueron 6, 8, 10, 12 y 14 unidades de enzimas por mL, obteniendo un 30,2 %
de rendimiento de hidrólisis, teniendo en cuenta que entre mayor sea el uso de la
cebada nacional o sin maltear en el proceso productivo, mayor será el ahorro para la
destilería.
75
7. CONCLUSIONES
Con la concentración de enzimas propuesta (20 mL de enzimas/L suspensión) se
logró mejorar el rendimiento de hidrólisis en un 89,44 % en relación al que se
obtiene normalmente en la planta 41.85 %, considerando a esta como la dosis
óptima para la etapa hidrolítica del proceso de producción de alcohol cuando se
emplea como sustrato cebada sin maltear.
Las condiciones de experimentación en el proceso hidrolítico favorecieron la
degradación del almidón de cebada, logrando un medio con una temperatura y pH
favorable para la actividad de las enzimas, reflejándose en los valores de azúcares
reductores obtenidos en todos los tratamientos.
Todos los resultados obtenidos en el estudio, muestran que se puede producir
etanol a partir de almidón de cebada sin maltear empleando las enzimas Multifect®
AA 21L y Multifect® AA 23L, considerando el uso de α y β-amilasas comerciales
como una alternativa viable para la degradación del almidón de cebada sin maltear,
especialmente cuando se presentan problemas de hidrolisis del almidón de cebada
(apelmazamiento) en el proceso de producción, pero la producción del hidrolizado
requiriere más estudios de optimización para la obtención de una mayor gran
cantidad de azúcares reductores que sean asimilados rápidamente por la levadura y
así obtener mayores niveles de producción de etanol.
En etapa fermentativa, aumentar la concentración de enzimas de 15 a 20 mL/L
ayuda a incrementar la obtención de producto, sin embargo con la dosis de 25 mL/L
se presenta el hecho de tener más concentración de células en el medio,
generándose más necesidades nutricionales para el mantenimiento de la levadura y
menos disponibilidad de sustrato para la producción de alcohol.
El empleo concentraciones de enzimas comerciales en el medio de cultivo de
reproducción mejora la eficiencia de consumo de sustrato, elimina la fase de
adaptación del microorganismo y asegura la rápida obtención de la biomasa
76
máxima a las 48 horas de fermentación dependiendo de la cantidad de enzimas
presentes en el medio.
El porcentaje de etanol obtenido al final de la fermentación fue de 4,98 % v/v por
destilación utilizando a Saccharomyces cerevisiae en hidrolizado de cebada sin
maltear con una concentración de enzimas de 20 mL/L, mostrando una
productividad de producto en sustrato de 0,0951 g de etanol/ g de azúcares
reductores.
Las pruebas realizadas mostraron que la ausencia de enzimas en la cebada no
malteada, puede ser reemplazada por amilasas comerciales donde el aumento en la
concentración de estas se ve reflejado en la obtención de concentraciones mayores
de producto, siempre y cuando esta concentración libere los azúcares reductores
necesarios para que la levadura pueda generar un buen nivel de etanol
La realización de este tipo de trabajos permite entender el proceso de producción de
alcohol y por lo tanto saber cómo influyen factores tales como la temperatura y el
tiempo de hidrólisis, concentración de azúcares reductores, tiempo de fermentación,
concentración de inóculo y por su puesto la concentración de enzimas,
obteniéndose así herramientas para solucionar los problemas que se puedan
presentar y bases para la optimización del proceso.
77
8. RECOMENDACIONES
Es necesario realizar al menos un ensayo de la concentración de enzimas
propuestas a nivel piloto en la planta, con el fin de confirmar la correspondencia de
los resultados obtenidos en el laboratorio, debido a que los resultados que se
obtienen en el proceso industrial son el punto definitivo para considerar a estas
enzimas como una alternativa rentable para la empresa, ya que en el laboratorio se
trato de simular al máximo el proceso de la destilería, las condiciones ambientales,
separación de afrecho, control de temperatura no se llevaron a cabo de forma igual,
por lo que los resultados pueden generar variaciones.
Realizar el proceso de hidrolítico bajo tiempos de hidrólisis más prolongados, con el
fin de poder obtener rendimientos interesantes empleando concentraciones de
enzimas inferiores a la sugerida en este estudio.
Debido a que en este estudio no se determinó la concentración de azúcares
reductores al durante el proceso de hidrólisis, al iniciar la fermentación y en la
fermentación, así como también la realización de un seguimiento de la producción
de etanol durante toda la fermentación, sería muy valioso continuar con la
investigación teniendo en cuenta estos aspectos, puesto que estos factores en la
industria de producción de alcohol son puntos de suma importancia que podrían
reportar resultados más significativos.
Es necesario realizar una cromatografía para conocer el tipo y cantidad de
componentes del hidrolizado, para identificar la naturaleza de las fuente
nutricionales que puede utilizar Saccharomyces cerevisiae en la fermentación del
hidrolizados de cebada.
Establecer un procedimiento para la determinación de la actividad enzimática de las
enzimas, con el fin de determinar la tasa de reacción de estas a diferentes
concentraciones y en presencia del almidón de cebada no malteada.
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9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Alfenore, S., Molina-Jouve, C., Guillouet, S. E., Uribelarrea, J. L., Goma, G.,
Benbadis, L. 2002. Improving ethanol production and viability of Saccharomyces
cerevisiae by a vitamin feeding strategy during fed-batch process. Appl. Microbiol.
Biotechnol 60 (1–2), 67–72.
Andreason, A. A., y Stier, T. J. 1954. Anaerobic nutrition of Saccharomyces
cerevisiae. II. Unsaturated fatty acid requirement for growth in defined medium. J.