Determinación cuantitativa de proteína en muestra problema por medio de métodos espectrofotométricos Bioquímica Experimental Grupo 5 Equipo 5 Ávila Jaimes Verónica Becerril Román María del Mar J. Toro Jaimes Jorge Oswaldo. Corona Ortega Luis Ángel Román
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Determinación cuantitativa de proteína en muestra problema por medio de métodos espectrofotométricos
Se llevó a cabo la cuantificación de la proteína contenida en una muestra problema por medio de la elaboración de una curva estándar a partir de albúmina sérica bovina (BSA). Se empleó el método de Lowry que consiste en la formación de un color azul dado por iones metálicos en solución reducidos por los grupos fenólicos de los residuos de tirosina presentes en la proteína estudiada. Se midió la absorbancia de las disoluciones en un espectrofotómetro a 750 nm
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Determinación cuantitativa de proteína en muestra problema por
medio de métodos espectrofotométricos
Bioquímica ExperimentalGrupo 5Equipo 5
Ávila Jaimes Verónica
Becerril Román María del Mar J.
Toro Jaimes Jorge Oswaldo.
Corona Ortega Luis Ángel
Román
Resumen
Se llevó a cabo la cuantificación de la proteína contenida en una muestra problema por medio de la elaboración de una curva estándar a partir de albúmina sérica bovina (BSA). Se empleó el método de Lowry que consiste en la formación de un color azul dado por iones metálicos en
solución reducidos por los grupos fenólicos de los residuos de tirosina presentes en la proteína estudiada. Se midió la absorbancia de las disoluciones en un espectrofotómetro a
750 nm
Introducción
La colorimetría es cualquier análisis que permita el cálculo de una concentración a partir de la medición de la absorbancia de un cromóforo coloreado, es decir, que absorba en la región del visible y reúna unas características tales que se pueda aplicar la ley de Lambert-Beer.
Una de las colorimetrías más utilizadas en Bioquímica es aquella conocida como método de Lowry. Se basa en que los grupos fenólicos de las tirosinas presentes en las proteínas
reducen al reactivo de Folin-Ciocalteau (una mezcla de sales de tungstato y molibdato que, en su forma oxidada, es de color amarillo). Además, se añade cobre para que: a) desdoble a
la proteína al formar enlaces de coordinación y b) acelere la reacción entre los grupos fenólicos (que son oxidados a quinonas) y el reactivo de Folin-Ciocalteau (que al reducirse
es de color azul pálido).
Variables
Variables controladas: cantidades de reactivo A y B, longitud de onda empleada (750 nm).
Variable independiente: cantidad de BSA.
Variable dependiente: absorbancia a 750 nm.
Hipótesis
Si el producto derivado de la reacción de la BSA con el reactivo de Folin-Ciocalteau cumple con la ley de Lambet-Beer, entonces el valor de la absorbancia será directamente proporcional a la cantidad de BSA en la
muestra.
Objetivos
Realizar una curva patrón de Albúmina Sérica Bovina (BSA), utilizando el espectrofotómetro.
Determinar la concentración de proteínas en una muestra problema, utilizando los datos de la curva patrón.
Materiales y reactivosMaterial: Celdas de metacrilato grado UV para espectrofotómetro Tubos de microfuga 1 gradilla para tubos de microfuga 1 caja con puntas de 200 µL (amarillas) para micropipeta. 1 caja con puntas de 1000 µL (azules) para micropipeta. 1 Micropipeta 10 µL 1 Micropipeta 20-200 µL 1 Micropipeta 200-1000 µL Vórtex Espectrofotómetro (por grupo)
Materiales y reactivosReactivos:
Albúmina de suero bovino (BSA) a una concentración de 1 mg/mL. Solución problema de proteínas (los profesores la proporcionarán)
Solución de carbonato-tartrato-cobre (CTC; 10% Na2CO3, 0.1 % CuSO4
y 0.2 % de tartrato de Na+ y K+) 10% Dodecilsulfato de sodio (SDS)
0.8 N NaOH
Reactivo A. Se prepara inmediatamente antes de usarse con partes iguales de CTC, 10% SDS,
0.8 N NaOH y H2Odestilada.
Reactivo B. Dilución del reactivo de Folin- Ciocalteu. 1 volumen de reactivo + 5 volúmenes de H2O.
Guardar en frasco ámbar. Preparar preferentemente poco antes de usarse.
Procedimiento
Tabla 1. Reactivos y cantidades para realizar la determinación de proteínas utilizando el método de Lowry.
Tabla 1.1 Reactivos y cantidades añadidos para realizar la curva patrón de BSA y la determinación de la concentración de proteínas de una muestra problema, utilizando el método de Lowry.
Resultados
0 5 10 15 20 25 30 35 400
2
4
6
8
10
12
f(x) = NaN x + NaNR² = 0 Curva Estándar de BSA
Cantidad de Proteína (µg)
Abs
orba
ncia
Gráfica 1.1 Valores de absorbancia de las muestras de BSA en función de la cantidad de proteína para la construcción de una curva estándar.
ResultadosAlgoritmo de cálculo
Discusión
Conclusión
Escribe un breve resumen de los descubrimientos en función de los resultados de los experimentos. Es necesario indicar si los datos
refuerzan la hipótesis y explicar las razones para que lo hagan o no.
Obras citadas
Badui, S. D.: “Química de los alimentos” 3ªed. Alambra Mexicana, México D.F: 2004.188-189
García-Segura, Juan Manuel et al. :“Técnicas instrumentales de análisis en Bioquímica” 3ªreimp. Síntesis, S.A. Madrid, España: 2007.