29.5.2013 1 Metode za odkrivanje/analizo mutacij Celična biologija z genetiko 1. letnik UŠ LBM, št. leto 2012/13 Detekcija polimorfizmov/mutacij • Sprva so razlike v genomu med posamezniki ugotavljali le z opazovanjem in primerjavo metafaznih kromosomov pod mikroskopom (t.i. kariotipizacija) Pod mikroskopom so vidne le spremembe > 3Mbp! Prelomna odkritja v molekularni diagnostiki • sekvenciranje (~1975) za določanje nukleotidnega zaporedja DNA – Frederick Sanger (Cambridge) – Walter Gilbert & Allan Maxam (Harvard) • verižna reakcija s polimerazo (PCR: polymerase chain reaction) (1984) za pomnoževanje določenih odsekov DNA – Kary Mullis (Cetus Corp.) • polimorfizmi dolžin restrikcijskih fragmentov (RFLP: restriction fragment length polymorphism) (1985) Lastnosti molekule DNA • Zelo stabilna molekula • Pri pH <4 in >9 ter visoki temperaturi (nad 90ºC) se reverzibilno denaturira (ddDNA → ssDNA) • Precipitira (obarja se) v alkoholu (etanol, izopropanol) • Absorbira pri A max =260 nm
14
Embed
Detekcija polimorfizmov/mutacij Metode za odkrivanje ......mutacij (RFLP, SSCP, sekvenciranje): prirojene bolezni maligna obolenja infekcijske bolezni transplantacije (ugotavljanje
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
29.5.2013
1
Metode za odkrivanje/analizo mutacij
Celična biologija z genetiko1. letnik UŠ LBM, št. leto 2012/13
Detekcija polimorfizmov/mutacij
• Sprva so razlike v genomu med posamezniki ugotavljali le z opazovanjem in primerjavo metafaznih kromosomov pod mikroskopom (t.i. kariotipizacija)
Pod mikroskopom so vidne le spremembe > 3Mbp!
Prelomna odkritja v molekularni diagnostiki
• sekvenciranje (~1975) za določanje nukleotidnega zaporedja DNA– Frederick Sanger (Cambridge)– Walter Gilbert & Allan Maxam (Harvard)
• verižna reakcija s polimerazo (PCR: polymerase chain reaction) (1984) za pomnoževanje določenih odsekov DNA– Kary Mullis (Cetus Corp.)
Izolacija DNA – različne izvedbe1. Liza celic (razgradnja celične membrane, razpad
celice in sprostitev celične vsebine):– z detergenti, npr. SDS, – mehansko – mletje, homogeniziranje.
2. Odstranitev proteinov, ki so vezani na DNA:– encimska razgradnja, npr. proteinaza K, – ekstrakcija z organskimi topili – proteini so topni v fenolu in
kloroformu,– kromatografija – vezava DNA na različne pozitivno nabite
snovi npr. vezava na kolone.
3. Purifikacija/koncentriranje DNA (precipitacija v alkoholu → centrifugiranje → raztapljanje v majhnem volumnu prečiščene vode ali pufra)
Liza celic (lizatni pufer FABG) in degradacija proteinov (proteinaza K, 70ºC), nato dodamo etanol, da se DNA obori
Oborjena DNA ostane na membrani kolone → s centrifugiranjem odstranimo proteine in ostale celične komponente; spiramo s pufri, ki vsebujejo alkohol
Dodamo vodo ali pufer v katerm je DNA topna in eluiramo
29.5.2013
3
Izolacija RNA
• Običajno iz tkiv v katerih želimo analizirati izražanje genov (prepis v mRNA)
• RNA je zelo nestabilna v primerjavi z DNA ter podvržena razgradnji z endogenimi (v celici/tkivu) in eksogenimi (prisotne povsod!) RNazami
• Preprečiti moramo razgradnjo RNA - predvsem moramo biti pri izolaciji hitri, ves pribor mora biti “RNase-free” – brez prisotnosti RNaz, delamo v posebni komori, večkrat menjamo rokavice…
Verižna reakcija s polimerazoPolymerase Chain Reaction = PCR
• Revolucija na področju molekularne genetike (Kary Mullis, 1984)
• Hitra in vsestranska in vitro metoda za pomnoževanje tarčnih (izbranih) zaporedijDNA
• Omogoča selektivno pomnoževanje izbranega zaporedja v heterogenem vzorcu (npr. genomska DNA posameznika)
• Zahteva: poznati moramo določeno zaporedje tarčnega gena
PCR – princip
• Osnova = reakcija podvajanja DNA molekule (in vitro)
• Uporabimo začetne oligonukleotide (dolžina 15-25 bp), ki so komplementarni sekvenci tarčnega gena, ki jo želimo pomnožiti:
PCR – princip
• Z encimom polimerazo sintetiziramo komplementarni verigi → proces ciklično ponavljamo
• Novonastale verige so matrica za naslednji cikel pomnoževanja
• Eksponentna rast: v idealnih pogojih je število pomnoženih PCR produktov v n-tem ciklu 2n.
29.5.2013
4
PCR – kaj jo omogoča?
• DNA se mora denaturirati (razpreti) – to dosežemo s povišano temperaturo (93-95ºC)
• Običajne polimeraze pri taki temperaturi niso stabilne!
• Rešitev: termostabilne polimerazemikroorganizmov, ki živijo v termalnih vrelcih –najbolj razširjena je Taq DNA polimeraza (Thermus aquaticus)
Ideja vrednaNobelove nagrade
PCR - potek
1. denaturacija: segrevanje na 94-95 °C
2. prileganje oligonukleotidnih začetnikov (primerjev) pri 40-60 °C
3. izgrajevanje komplementarne verige s termostabilno DNA polimerazo (72 °C)
• stopnje 1-3 sestavljajo en cikel, ki ga 20-40-krat ponovimo
• vzorec DNA z odsekom, ki ga želimo pomnožiti (matrica)
• dva oligonukleotidna začetnika (omejimo odsek za pomnoževanje)
• dATP, dCTP, dTTP, dGTP (dNTP)
• termostabilna DNA polimerazo (običajno Taq)
• Mg++
• reakcijski pufer
PCR - aparature
• reakcija poteka v cikličnem termostatu• uspešnost reakcije preverimo z
elektroforezo na agaroznem gelu
29.5.2013
5
Elektroforeza (EF) (I)• EF je separacijska metoda, ki temelji na
potovanju nabitih delcev v električnem polju.
• Nabiti delci potujejo proti elektrodi z nasprotnim nabojem:– (+) nabiti delci proti (-) nabiti elektrodi (KATODI)– (-) nabiti delci pa proti (+) nabiti elektrodi (ANODI)
• DNA je negativno nabita → potuje proti anodi
Vplivi na hitrost potovanja nabitega delca v električnem polju
1. NABOJ DELCA2. VELIKOST IN OBLIKA DELCA3. JAKOST EL. POLJA4. LASTNOSTI PUFRA 5. TEMPERATURA6. LASTNOSTI NOSILCACilj elektrofereze: dobra ločba v čim krajšem času → kompromis med naštetimi dejavniki (+ cena)
1. Naboj delca
• ↑ naboj → ↑ hitrost potovanja
• Naboj je odvisen od pK skupin in pH pufra
• izoelektrična točka (pI) je pH, pri katerem je neto naboj delca enak 0
2. Velikost in oblika delca
• ↑ masa ali velikost molekule →↓hitrost potovanja
• nosilci z majhnimi porami delujejo kot molekularna sita
29.5.2013
6
3. Jakost elek. polja
• ↑ jakost el. polja → ↑ hitrost potovanja in ↓čas EF
• Vendar: večja jakost el. Polja zahteva izvajanje EF pri višji napetosti. To povzročinaraščanje temperature (T), kar vodi v:- izhlapevanje pufra
4. Lastnosti pufra
Vloga pufra:• zagotavlja konstanten pH in s tem vpliva na
naboj delcev• služi kot prevodnik el. tokaZahteve za EF pufer:• ne sme reagirati z vzorcem• imeti mora ustrezno ionsko ionsko jakost
Pufri, ki se uporabljajo za EF nukleinskih kislin:tris-acetat EDTA (TAE), tris-borat EDTA (TBE) in tris-fosfatni pufri
5. Temperatura
• ↑ T EF → ↓ upor in hitrejša ločba, vendar:– nevarnost
• Iskanje novih mutacij (SSCP, sekvenciranje)�ko pride do neujemanja med genotipom in fenotipom
Genotipizacija na osnovi mikrosatelitnih označevalcev
• S PCR reakcijo pomnožimo odsek DNA, ki vsebuje mikrosatelitno zaporedje
• Različni aleli imajo različno dolžino glede na število ponovitev mikrosatelitnega zaporedja
• Izvedemo elektroforezo s katero ločimo PCR produkte po velikosti (poliakrilamidni gel ali kapilarna elektroforeza)
• Odčitamo rezultat (dolžino alelov primerjamo s standardom)
Genotipizacija na osnovi mikrosatelitnih označevalcev - primer
• V promotorskem delu gena CYP11A1 se nahaja mikrosatelitno zaporedje (TTTTA)n
• Najbolj pogosti aleli v populaciji imajo 4, 6, 8 in 9 ponovitev zaporedja TTTTA
RFLP
• Najstarejša metoda = polimorfizmi dolžin restrikcijskih fragmentov ali RFLP (restriction fragment length polymorphism)
• Temelji na uporabi encimov restrikcijskih endonukleaz:� bakterijski encimi, ki cepijo dsDNA na točno določenem mestu� prepoznajo 4-8 bp dolga, običajno palindromna zaporedja v
dvoverižni DNAperica reže raci rep; 5’ AGCT 3’
3’ TCGA 5’� v okviru SNP-ja oz. v njegovi bližini je cepitveno mesto� SNP uniči ali ustvari prepoznavno mesto za določeno rest� http://highered.mcgraw-
hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120078/bio20.swf::Restriction Fragment Length Polymorphismsrikcijsko endonukleazo.
• poleg dNTP v reakcijski zmesi še dideoksi-nukleotidi (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP)
29.5.2013
12
Dideoksinukleotidi (ddNTP)
• ddNTP-ji se lahko vgradijo v verigo namesto dNTP. Vgradnja dideoksi-nukleotida, ki nima 3′-OH skupine na deoksiribozi povzroči prekinitev sinteze DNA verige od ddNTP naprej.