DETECCION RAPIDA DE CONTAMINACION EN PRODUCTO TERMINADO DE DETECCION RAPIDA DE CONTAMINACION EN PRODUCTO TERMINADO DE BEBIDA DE MALTA Y REFRESCOS PASTEURIZADOS POR EL METODO DE BEBIDA DE MALTA Y REFRESCOS PASTEURIZADOS POR EL METODO DE BIOLUMINISCENCIA FRENTE AL RECUENTO EN PLACA EN UNA EMPRESA DE BIOLUMINISCENCIA FRENTE AL RECUENTO EN PLACA EN UNA EMPRESA DE BOGOTA D.C BOGOTA D.C CRISTINA BURGOS GRAJALES CRISTINA BURGOS GRAJALES LILIANA MURILLO SÁNCHEZ LILIANA MURILLO SÁNCHEZ TRABAJO TRABAJO DE GRADO DE GRADO Como requisito parcial para optar el titulo de Microbióloga Industrial Como requisito parcial para optar el titulo de Microbióloga Industrial ISABEL CRISTINA GUTIERREZ ISABEL CRISTINA GUTIERREZ Director Director PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL Carrera de Microbiología Industrial Carrera de Microbiología Industrial Bogotá, D.C, 2001. Bogotá, D.C, 2001.
140
Embed
DETECCION RAPIDA DE CONTAMINACION EN PRODUCTO TERMINADO DE ...
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
DETECCION RAPIDA DE CONTAMINACION EN PRODUCTO TERMINADO DE DETECCION RAPIDA DE CONTAMINACION EN PRODUCTO TERMINADO DE
BEBIDA DE MALTA Y REFRESCOS PASTEURIZADOS POR EL METODO DE BEBIDA DE MALTA Y REFRESCOS PASTEURIZADOS POR EL METODO DE
BIOLUMINISCENCIA FRENTE AL RECUENTO EN PLACA EN UNA EMPRESA DE BIOLUMINISCENCIA FRENTE AL RECUENTO EN PLACA EN UNA EMPRESA DE
BOGOTA D.CBOGOTA D.C
CRISTINA BURGOS GRAJALESCRISTINA BURGOS GRAJALES
LILIANA MURILLO SÁNCHEZLILIANA MURILLO SÁNCHEZ
TRABAJOTRABAJO DE GRADO DE GRADO
Como requisito parcial para optar el titulo de Microbióloga IndustrialComo requisito parcial para optar el titulo de Microbióloga Industrial
OLGA LUCIA VARGAS OLGA LUCIA VARGAS ANDREA AGUIRRE ANDREA AGUIRRE Microbióloga BacteriólogaMicrobióloga Bacterióloga Jurado JuradoJurado Jurado
Las autoras expLas autoras exp resan sus agradecimientos a:resan sus agradecimientos a:
& DIOSDIOS por la sabiduría, fortaleza y esperanza brindadas para la culminación de esta
investigación.
& La Empresa Productora de Bebidas, a la División de Producción y al Departamento
de Investigación y Desarrollo por la oportunidad y el patrocinio total brindado para
el desarrollo de este proyecto.
& La Dra. ISABEL CRISTINA GUTIÉRREZ, directora del proyecto, por depositar su
confianza en nosotras y por el constante apoyo científico para el éxito de esta
investigación.
& La Dra. JANETH ARIAS, Co-Directora del Proyecto, por su colaboración en el
desarrollo de la investigación.
& La División de Materiales por su constante preocupación, apoyo y calidez
brindados durante la realización de esta investigación.
& El profesor Miguel Pinzón por su desinteresada colaboración y paciencia en la etapa
final de esta investigación.
& Todas las personas que en una u otra forma contribuyeron al logro de esta
investigación.
TABLA DE CONTENIDOTABLA DE CONTENIDO
PáginaPágina 1. INTRODUCCION1. INTRODUCCION 1 2. MARCO TEORICO2. MARCO TEORICO 4 2.1 RESEÑA HISTORICA DE LA CONSERVACION 4 2.2 RESEÑA HISTORICA DE LA PRODUCCION DE JUGOS 5 2.3 DEFINICIONES 7 2.3.1 Alteración 7 2.3.2 Refrescos de fruta 7 2.3.3 Pulpa natural de fruta 7 2.3.4 Pulpa concentrada 7 2.4 DE LOS REFRESCOS DE FRUTA 8 2.5 PROCESO DE ELABORACION DE REFRESCOS 13 2.5.1 Elaboración de refrescos 13 2.6 MICROBIOLOGIA DE LOS REFRESCOS DE FRUTA 14 2.6.1 Bacterias 15 2.6.2 Levaduras 16 2.6.3 Mohos 17 2.7 CONSERVACION DE REFRESCOS 20 2.7.1 Conservación de alimentos por altas temperaturas 20 2.7.2 Pasteurización 21 2.7.3 Teoría de la pasteurización 22 2.7.4 Pasteurización Instantánea o Flash 23 2.7.4.1 Funcionamiento del sistema 24 2.7.4.2 Transferencia de calor 25 2.7.4.3 Función 26 2.8 BEBIDAS DE MALTA 29 2.9 DEFINICIONES 30 2.9.1 Malta 30 2.9.2 Cebada Malteada 30 2.10 BEBIDAS DE CEBADA MALTEADA 31 2.11 PROCESO DE MALTEADO 33 2.12 MICROBIOLOGIA DE LA MALTA 35 2.12.1 Levaduras 36
2.12.2 Bacterias 37 2.12.3 Mohos 38 2.13 CONSERVACION DE BEBIDAS DE MALTA 40 2.13.1 Pasteurización Túnel 41 2.14 BIOLUMINISCENCIA 43 2.14.1 Breve historia de la bioluminiscencia 43 2.14.2 Adenosin Trifosfato 44 2.14.2.1 Metabolismo Celular 44 2.14.2.2 Importancia del ATP en el Metabolismo Celular 45 2.14.2.3 Modelos Nutricionales de los microorganismos 47 2.14.2.4 Determinación del ATP 48 2.14.3 Sistema de bioluminiscencia 50 2.14.3.1 Zonas de limpieza 52 2.14.3.2 Sensibilidad del equipo 53 2.14.3.3 Diseño básico del equipo 53 2.14.3.4 Ventajas de la bioluminiscencia frente a métodos tradicionales 55 2.15 MÉTODOS PARA EL RECUENTO DE MICROORGANISMOS 56 2.15.1 Recuento en Placa 56 2.16 VALIDACION DE METODOS ANALITICOS PARA EL CONTROL DE ALIMENTOS 59 3. JUSTIFICACION3. JUSTIFICACION 62 4. OBJETIVOS4. OBJETIVOS 63 4.1 Objetivo general 63 4.2 Objetivos específicos 63 5. MATERIALES Y METODOS5. MATERIALES Y METODOS 64 5.1 MUESTREO 64 5.1.1 Prueba piloto 64 5.2 ANALISIS MICROBIOLÓGICO 65 5.2.1 Procesamiento de las muestras 65 5.2.1.1 Prueba piloto 65 5.2.1.2 Prueba final 67 5.3 CRIOCONSERVACIÓN 68
5.4 ANALISIS ESTADISTICO 70 6.6. RESULTADOS Y DISCUSION RESULTADOS Y DISCUSION 71 6.1 COMPORTAMIENTO MICROBIOLÓGICO A TRAVES DEL TIEMPO 71 6.2 PRUEBA PARA DETERMINAR SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD DE LA TÉCNICA DE BIOLUMINISCENCIA FRENTE AL RECUENTO ESTÁNDAR EN PLACA PARA REFRESCOS DE FRUTA Y BEBIDA DE MALTA 80 6.3 LIMITES DE CONFIANZA PARA LA MEDIA DE UNA POBLACION REPRESENTADA EN UFC Y URL 91 6.4 Tablas de resultados curvas de crecimiento 93 7. CONCLUSIONES7. CONCLUSIONES 112 8. RECOMENDACIONES8. RECOMENDACIONES 114
ANEXOSANEXOS BIBLIOGRAFIABIBLIOGRAFIA
LISTA DE TABLAS
PáginaPágina
Tabla 1Tabla 1. Porcentaje de fruta en los refrescos de fruta
8
Tabla 2Tabla 2. Características microbiológicas de los refrescos de fruta Higienizados Con duración máxima de 30 días 9 Tabla 3Tabla 3. Características microbiológicas de los refrescos de fruta higienizados Con duración mayor de 30 días 10 Tabla 4Tabla 4. Contenido máximo de metales pesados en los refrescos de Fruta 12 Tabla 5Tabla 5 . Requisitos físico- químicos de la malta 31 Tabla 6Tabla 6. Requisitos microbiológicos de la malta 32 Tabla 7Tabla 7. Clasificación nutricional de los organismos 48 Tabla 8Tabla 8 . Microorganismos para ensayos en refrescos y bebida de Malta 65 Tabla 9Tabla 9 . Análisis microbiológico de refrescos de fruta 66 Tabla 10Tabla 10. Análisis microbiológico de bebida de malta 66 Tabla 11Tabla 11. Análisis microbiológico de refrescos de los refrescos de Fruta 67
Tabla 12Tabla 12. Análisis microbiológicos de bebida de malta 67 Tabla 13Tabla 13. Probabilidad de hallazgo de microorganismos para la Técnica De Bioluminiscencia 88 Tabla 14Tabla 14. Rangos de UFC de productos en estudio 90 Tabla 15Tabla 15. Limites de confianza para la media de la población en estudio 92
LISTA DE FIGURASLISTA DE FIGURAS
PáginaPágina
Figura 1Figura 1. Bacillus licheniformis 15 Figura 2Figura 2. Rhodotorula rubra 17 FiguraFigura 3 3. Penicillium sp. 18 Figura 4Figura 4. Pasteurizador Instantáneo o Flash 24 Figura 5Figura 5. Placas intercambiadoras de calor 25 Figura 6Figura 6. Transferencia de calor 26 Figura 7Figura 7. Componentes del intercambiador de calor 27 FigFigura 8ura 8 Hansenula anomala 36 Figura 9Figura 9. Lactobacillus plantarum 37 Figura 10Figura 10. Penicillium sp 38 Figura 11Figura 11. Pasteurizador Túnel 41 Figura 12Figura 12. Equipo y dispositivo de hisopo 51 Figura 13Figura 13. Diseño del equipo 54
LISTA DE GRAFICAS
PáginaPágina
Gráficas 1 y 2Gráficas 1 y 2 Refresco de naranja + B. l i cheni formis (UFC) y (URL) 72
Gráficas 3 y 4Gráficas 3 y 4 Refresco de naranja + Rhodotoru la sp (UFC) y (URL) 72
Gráficas 5 y 6Gráficas 5 y 6 Refresco de naranja + Penic i l l ium sp (UFC) y (URL) 73
Gráficas 7 y 8Gráficas 7 y 8 Refresco de mora + B. l i cheni formis (UFC) y (URL) 73
GráficaGráficas 9 y 10s 9 y 10 Refresco de mora + Rhodotoru la sp (UFC) y (URL) 74
Gráficas 11 y 12Gráficas 11 y 12 Refresco de mora + Penic i l l ium sp (UFC) y (URL) 74
Gráficas 13 y 14Gráficas 13 y 14 Refresco de mango + B. l i cheni formis (UFC) y (URL) 75
Gráficas 15 y 16Gráficas 15 y 16 Refresco de mango + Rhodotoru la sp (UFC) y (URL) 75
Gráficas 17 y 18Gráficas 17 y 18 Refresco de mango + Penic i l l ium sp (UFC) y (URL) 76
Gráficas 19 y 20Gráficas 19 y 20 Refresco de durazno + B. l i cheni formis (UFC) y (URL) 76
Gráficas 21 y 22Gráficas 21 y 22 Refresco de durazno + Rhodotoru la sp (UFC) y (URL) 77
Gráficas 23 y 24Gráficas 23 y 24 Refresco de durazno + Penic i l l ium sp (UFC) y (URL) 77
Gráficas 25 y 26Gráficas 25 y 26 Bebida de malta + Lactobaci l lus sp (UFC) y (URL) 78
Gráficas 27 y 28Gráficas 27 y 28 Bebida de malta + Hansenu la sp (UFC) y (URL) 78
Gráficas 29 y 30Gráficas 29 y 30 Bebida de malta + Penic i l l ium sp (UFC) y (URL) 79
LISTA DE ANEXOSLISTA DE ANEXOS
Página Página
ANEXO 1ANEXO 1. Medios de cultivo 115
ANEXO 2ANEXO 2. Bioquímicas 117
ANEXO 3ANEXO 3. Utilización del luminómetro 120
ANEXO 4ANEXO 4. Proceso de elaboración de la bebida de malta 124
ANEXO 5ANEXO 5. Proceso de elaboración de refrescos de fruta 125
RESUMEN
En la actualidad las industrias productoras de alimentos se ven en la
necesidad de implementar metodologías que faciliten la obtención de
resultados en un tiempo corto. Es por esto que en esta investigación se
buscó validar la técnica de Bioluminiscencia como una alternativa de
control microbiológico que proporcione resultados rápidos y sensibles
basados en la reacción por ATP con la enzima luciferasa presente en
todos lo organismos vivos.
Para llevar a cabo dicha validación se enfrento la técnica de
bioluminiscencia con la de Recuento Estándar en Placa (utilizando PDA,
SPC, SDA como medios de cultivo) ya que esta ultima es la prueba
estándar utilizada en la planta para el control microbiológico de los
refrescos de fruta y la bebida de malta.
El procedimiento realizado consistió en la inoculación de los productos en
estudio con microorganismos (bacterias, mohos y levaduras) identificados
en estudios anteriores , para garantizar que los resultados obtenidos se
acomodaran a la situación real de los productos en la planta. A partir de
la inoculación se procedió a tomar muestras paralelas para las dos técnicas
con un intervalo de dos horas para cada toma en condiciones controladas
durante un periodo de 12 horas.
De acuerdo a los resultados obtenidos se establecieron rangos de
medición, sensibilidades y especificidades de las técnicas con el fin de
conocer cual es la más precisa y más confiable para la detección de
microorganismos en producto alterado. Finalmente se pudo concluir que
la técnica de Recuento Estándar en Placa es más sensible y especifica
obteniendo resultados cuantitativamente confiables en un periodo mas
largo de tiempo.
1. 1. INTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓN
Los refrescos de frutas son obtenidos en su mayor parte por homogeneización de
pulpa de fruta o bien de frutas enteras, con adición de azúcares y agua y en algunos
casos, también de ácido cítrico y ascórbico.
La proporción de fruta en el producto final es del 8% estando reglamentada esta en las
normas y procedimientos reglamentarios de la Industria de Alimentos por la ANDI
(Resolución 7992/91).
Algunas de las frutas utilizadas para su elaboración son : mango, mora, durazno,
naranja, entre otras. Estas son sometidas al lavado, trituración y calentamiento con el
objetivo de inactivar enzimas. La pasta así obtenida es tratada con mezclas de enzimas
para conseguir por degradación de la protopectina una desintegración del tejido del
fruto manteniendo al mismo tiempo la estructura intacta de las células. Las pectinas
altamente esterificadas y de gran peso molecular así obtenidas a partir de la
protopectina determinan que estos productos posean una alta viscosidad y una
buena estabilidad de la turbidez. Por último son sometidos a mezclas con aditivos
necesarios , homogeneización y pasteurización. (Berlitz, 1989).
La bebida de malta es un producto natural, refrescante, sin alcohol, que resulta de la
maceración y cocción de una mezcla conformada por agua potable, cebada malteada y
lúpulo. Parte del proceso de elaboración incluye azúcar refinada y caramelizada la cual
junto al gas carbónico, convierten a la malta en una bebida agradable y nutritiva. La
malta contiene vitaminas como la Tiamina, la Riboflavina, la- Niacina y la Piridoxina.
Es una excelente fuente de carbohidratos, entre los que se cuentan la maltosa y la
glucosa. Tiene un alto contenido de minerales como el potasio y el magnesio. Gracias a
su proceso tecnológico y método de conservación no requiere preservativos. Al ser su
materia prima de origen vegetal no requiere saborizantes ni otros aditivos. (Berlitz,
1989).
El uso de temperaturas altas para conservar dichas bebidas se basa en los resultados
destructores de los microorganismos. Con respecto a la conservación de cualquier
alimento existen dos tipos de uso habitual: temperatura de pasteurización y
temperaturas de esterilización. (Res, 1994). Tanto el tiempo como la temperatura que
se utiliza en el proceso, dependen del procesamiento empleado y del alimento a tratar.
(Frazier, 1993)
El proceso de pasteurización es un tratamiento térmico, que destruye esencialmente
los microorganismos patógenos y en gran parte a microorganismos banales presentes
que generalmente supone la aplicación de temperaturas inferiores a los 100 ºC en un
corto periodo de tiempo. Su única finalidad es mejorar la estabilidad biológica del
producto final. (EBC, 1995).
Debido a las diferentes técnicas de manufactura y presentación del producto existe
una necesidad creciente de verificar la ausencia de microorganismos viables en un
volumen determinado del producto.
El control microbiológico estándar utilizado es el Recuento en Placa con un tiempo de
cuarentena de 10 a 15 días. La Bioluminiscencia por ATP como una alternativa a los
procedimientos de control de calidad microbiológica tradicionales proporciona
resultados rápidos, exactos y sensibles a través de una operación sencilla. La técnica
de detección está basada en la reacción ATP (Adenosin-trifosfato) presente en todos
los organismos vivos. La cantidad de luz emitida es proporcional a la cantidad de ATP
presente, ya sea en una mesada (lote) o en el producto final. Mediante un Luminómetro
portátil se mide la cantidad de fotones emitidos en Unidades Relativas de Luz (URL) que
es proporcional a la cantidad de microorganismos presentes.
(http://www.jenck.com/celsis.htm)
Este proyecto pretende comparar el método de Bioluminiscencia basado en la reacción
de ATP que permite la detección rápida de microorganismos como una estrategia
dinámica frente a la metodología estática de Recuento en Placa que depende de la
producción de biomasa visible.
2.2. MARCO TEORICOMARCO TEORICO
2.1 RESEÑA HISTORICA DE LA CONSERVACION2.1 RESEÑA HISTORICA DE LA CONSERVACION
La palabra conservar deriva de la latina conservare , que significa mantener intacto o
inalterado, por ello se aplica al procedimiento que permite que los alimentos sean
resistentes al deterioro. La conservación de los alimentos por calor la realizó por
primera vez Nicolás Appert (1750-1841) en 1809, francés a quien Napoleón otorgó un
premio de 12000 francos por haber logrado un método de conservación de alimentos
envasados en vidrio bajo la acción del calor. (Muller, 1981)
Appert mantuvo la creencia de que la causa de alteración de los alimentos era el
contacto con el aire y de que el éxito de su técnica era debido a la eliminación del aire
del producto. Esta creencia persistió con, a veces, fatales consecuencias durante otros
50 años hasta que las investigaciones de Pasteur establecieron la relación entre la
actividad microbiana y la putrefacción. (Adams, 1995)
El término pasteurización apareció en el siglo antepasado (1865-1867) en las vinerías
como un método para tratar el vino con el propósito de prolongar la vida de
almacenamiento. Sin embargo, el calentamiento de productos con el fin de incrementar
la vida de almacenamiento ya había sido ensayado en 1782 por el científico sueco Carl
Wilhelm Scheele. El resultado de estos experimentos fueron olvidados por largo tiempo
pero posteriormente fueron investigados y desarrollados por Pasteur de quien proviene
su nombre. (EBC, 1995)
2.2 RESEÑA HISTORICA DE LA PRODUCCION DE JUGOS2.2 RESEÑA HISTORICA DE LA PRODUCCION DE JUGOS
Es posible que los jugos de fruta, en una u otra forma, se hayan consumido durante
muchos años. Sin embargo, hasta el siglo XIX el único medio de conservación conocido
era la fermentación y la consiguiente transformación a vino o sidra. La industria
comercial de jugos se inicia el 1869 con el embotellado de jugo de uvas sin fermentar
por la compañía Welch de Vineland, New Jersey. Esta industria introdujo el principio de
conservación mediante la pasteurización. La industria se desarrolló lentamente, aunque
en Estados Unidos comenzó una tendencia a la expansión en la década de los años 20
que se aceleró en los 30. El valor nutritivo de las frutas, especialmente por su
contenido de vitamina C, se reconoció durante los años de hambruna de la gran
depresión y la demanda se estimuló posteriormente por los desarrollos tecnológicos,
tales como la pasteurización relámpago, la cual mejoró en gran medida la calidad del
producto. En este momento, el consumo en gran escala era principalmente un
fenómeno norteamericano y en el caso del jugo de naranja, más del 75% de la
producción mundial se encontraba en Estados Unidos.
El jugo de fruta se siguió extendiendo en Estados Unidos siendo estimulada su
producción por la demanda del ejercito, que reconoció el valor nutritivo del jugo. El
avance tecnológico que permitió la producción de jugos concentrados congelados
supuso un empuje adicional.
Durante la década de los años 50, el jugo de fruta se convirtió en un componente más
de la dieta norteamericana. La industria se desarrolló mucho más despacio en Europa y
así en Gran Bretaña, el consumo de Jugo de fruta se limitó a pequeñas botellas o latas
de jugo frecuentemente edulcoradas. Los jugos de frutas tendieron a ser considerados
como bebidas para “ocasiones especiales” y el incremento en su consumo se asoció
con frecuencia a las tendencias sociales, como el mayor auge de los restaurantes y los
cambios en los hábitos de bebida. Sin embargo, en la segunda mitad de los años 70
tuvo lugar un enorme incremento de su consumo. Esto fue como consecuencia de una
demanda de bebidas que fueran compatibles con la idea de adoptar un estilo de vida
saludable, pero este empuje se vio favorecido por la aplicación de tratamientos de
esterilización UHT y envasado aséptico de los jugos de fruta. Esa tecnología permitió la
elaboración, a menudo a partir de concentrados, de un producto de alta calidad y larga
vida útil, previamente de acuerdo con las consideraciones de un producto “sano”.
(Varnam, 1997)
2.3 DEFINICIONES2.3 DEFINICIONES
2.3.1 ALTERACION2.3.1 ALTERACION
Las palabras alteración y deterioro se refieren a todo cambio que ocurre en un
alimento, en virtud del cual se convierte en no apto para el consumo humano. Esta
definición incluye tanto los defectos de seguridad como los de calidad. (Doyle, 2001)
2.3.2 REFRESCOS DE FRUTA2.3.2 REFRESCOS DE FRUTA
Se consideran refrescos a los productos obtenidos a partir de jugos concentrados,
clarificados, congelados o deshidratados a los cuales, se les ha agregado agua, azúcar
y demás productos naturales. (ICONTEC, 1995)
2.3.3 PULPA NATURAL DE FRUTA2.3.3 PULPA NATURAL DE FRUTA
Es la obtenida a partir de la fruta fresca o congelada. Esta fruta puede ser conservada
por congelación o pasteurizada (mayor a 87- 90 ºC) dependiendo de la fruta de la cual
sea la pulpa y envasada asépticamente o congelada. (ICONTEC, 1995)
2.3.4 PULPA CONCENTRADA2.3.4 PULPA CONCENTRADA
Es elaborada a partir de la pulpa natural y concentrada por evaporación al vacío. Esta
pulpa es conservada por congelación o puede ser envasada en calor en cuyo caso no
necesita refrigeración. (ICONTEC, 1995)
2.4 DE LOS REFRESCOS DE FRUTA2.4 DE LOS REFRESCOS DE FRUTA
Artículo 25Artículo 25. Condiciones para su elaboración: Los refrescos de fruta deben elaborarse
en condiciones sanitarias apropiadas, con frutas frescas, sanas y limpias.
Artículo 26.Artículo 26. De las características de los refrescos de frutas: Los refrescos de frutas
deben presentar las siguientes características:
a.a. Organolépticas:Organolépticas:
- Los refrescos de fruta deben ser líquidos y deben estar libres de materias y sabores
extraños.
- Deben poseer color y olor semejante al de la fruta.
A estos refrescos no se les puede agregar conservantes en su elaboración, pero si han
sido fabricados con jugos, pulpas o concentrados previamente conservados, se acepta
la presencia de sorbato de potasio y benzoato de sodio en cantidad no mayor a 250
mg/kg y anhídrido sulfuroso 60 mg/kg.
Artículo 27.Artículo 27. De los ingredientes: El porcentaje mínimo de fruta agregado para la
preparación de los refrescos, referido al Brix natural de la fruta, se ha indicado en la
siguiente tabla.
FRUTAFRUTA % MINIMO DE FRUTA% MINIMO DE FRUTA Masa/MasaMasa/Masa
% MINIMO DE SOLIDOS SOLUBLES % MINIMO DE SOLIDOS SOLUBLES APORTADOS POR LA FRUTA A LA APORTADOS POR LA FRUTA A LA
FORMULACION DEL REFRESCOFORMULACION DEL REFRESCO
DURAZNO 8 0.92
MANGO 8 1.0
MORA 8 0.52
NARANJA 8 0.72
TabTab la 1. Porcentaje de fruta en los refrescos de fruta.la 1. Porcentaje de fruta en los refrescos de fruta. Fuente: ANDI, 1991.Fuente: ANDI, 1991.
b. Fisicoquímicas:b. Fisicoquímicas:
- Sólidos solubles por lectura refractométrica a 20ºC (Brix) % m/m mínimo 10
- pH a 20ºC máximo 4.0
- Acidez titulable expresada como Acido cítrico en % mínimo 0.1
b.b. MMicrobiológicas: icrobiológicas: Las características microbiológicas de los refrescos de fruta
higienizadas , con duración máxima de 30 días, son las siguientes:
nn mm MM cc
Recuento de microorganismos
mesofílicos/cm3
3 1000 3000 1
NMP Coliformes Totales/cm3 3 9 29 1
NMP Coliformes fecales/cm3 3 <3 - 0
Recuento esporas Clostridium Sulfito
reductor/cm3
3 <10 - 0
Recuento de hongos y levaduras/cm3 3 100 200 1
Tabla 2. Características microbiológicas de los refrescos de fruta Tabla 2. Características microbiológicas de los refrescos de fruta higienizados con duración máxima de 30 díashigienizados con duración máxima de 30 días FueFuente: ANDI, 1991.nte: ANDI, 1991.
Donde:
n = número de muestras a examinar
m = índice máximo permisibles para identificar nivel de buena calidad
M = índice máximo permisible para indicar nivel aceptable de calidad
c = número máximo de muestras permisibles con resultado entre m y M
Las características microbiológicas de los refrescos de frutas higienizadas, con
duración mayor de 30 días, son las siguientes:
nn MM MM cc
Recuento de microorganismos
mesofílicos/cm3
3 100 300 1
NMP Coliformes Totales/cm3 3 <3 - 0
NMP Coliformes fecales/cm3 3 <3 - 0
Recuento esporas Clostridium Sulfito
reductor/cm3
3 <10 - 1
Recuento de hongos y levaduras/cm3 3 10 100 1
Tabla 3. Características microbiológicas de los refrescos de fruTabla 3. Características microbiológicas de los refrescos de fru ta ta higienizados con duración mayor de 30 díashigienizados con duración mayor de 30 días Fuente: ANDI, 1991.Fuente: ANDI, 1991.
Art. 28. Art. 28. De los aditivos: Se permiten los siguientes:
a.a. Conservantes:Conservantes:
- Acido benzóico y sus sales de calcio, potasio y sodio en cantidad máxima de 1000
mg/kg expresada como ácido benzóico.
- Acido sórbico y sus sales de calcio, potasio y sodio en cantidad máxima de 1000
mg/kg expresada como ácido sórbico.
Cuando se empleen mezclas de ellos su suma no deberá exceder de 1250 mg/kg.
b.b. Antioxidantes:Antioxidantes:
- Acido ascórbico limitado por Buenas Prácticas de Manufactura (BPM).
Cuando se declare como vitamina C en el producto, se debe adicionar mínimo el 60%
de la recomendación fijada en la resolución Nº 11488/84.
c.c. Estabilizantes:Estabilizantes:
- Alginatos de amonio, calcio, potasio y propilenglicol.
- Carboximetil celulosa de sodio.
- Carragenina.
- Goma Xantán.
- Pectina.
Solos o en mezclas en cantidad máxima de 2 g/L
d.d. Saborizantes:Saborizantes:
Saborizantes naturales y artificiales.
e.e. Colorantes:Colorantes:
Se permite la adición de los colorantes artificiales establecidos en la resolución Nº
10593/85 en una cantidad n mayor de 30 mg/L.
f.f. AcidulantesAcidulantes
- Acido cítrico.
- Acido tartárico.
- Acido málico.
- Acido fumárico.
Limitados por las BPM.
Artículo 29. Artículo 29. Aditivos no permitidos: En los refrescos de frutas no se permite la
adición de sustancias diferentes indicadas en el artículo anterior.
Artículo 30.Artículo 30. Límite máximo de defectos: En los refrescos de frutas se admite se
admite un máximo de 10 defectos visuales no mayores de 2 mm en 20 cm3 de muestra
analizada. En 100 cm3 del producto no se admite la presencia de insectos sus
fragmentos.
Art. 31. Art. 31. Contenido máximo de metales pesados:
METALMETAL Mg/kgMg/kg
COBRE como Cu 5
PLOMO como Pb 0.3
ARSENICO como As 0.1
ESTAÑO como Sn 150
Tabla 4. Contenido máximo de metales pesados en los refrescos de frutasTabla 4. Contenido máximo de metales pesados en los refrescos de frutas Fuente: ANDI, 1991.Fuente: ANDI, 1991.
Art. Art. 32. 32. Denominación: Los refrescos de frutas se designaran con la palabra “refresco
de...” seguida del nombre de la fruta utilizada. En el producto elaborado con dos o más
frutas se debe indicar en el rótulo el nombre de las frutas utilizadas.
Parágrafo:Parágrafo: En el rótulo y la publicidad de los refrescos de frutas no pueden incluirse
los términos “natural o 100% natural”. (ANDI, 1991. Capítulo 4)
2.5 PROCESO DE ELABORACION DE REFRESCOS2.5 PROCESO DE ELABORACION DE REFRESCOS
Anexo 5Anexo 5
2.5.1 ELABORACION DE REFRESCOS 2.5.1 ELABORACION DE REFRESCOS
En la producción a escala industrial de refrescos se inicia el proceso con la adición de
la pulpa, el azúcar, el agua y otros aditivos al tanque de crudos. El zumo fluye hacia
tanques de almacenamiento dotados con un agitador para mantener la pulpa en
suspensión. Las principales operaciones tecnológicas antes del envasado son la
extracción del aceite residual y la pasteurización, la cual junto con el pH bajo del
producto garantizan su estabilidad. (Varnam, 1997). Posteriormente el refresco pasa al
envasado y sellado aséptico para después ser distribuido.
2.6 MICROBIOLOGIA DE REFRESCOS DE FRUTA2.6 MICROBIOLOGIA DE REFRESCOS DE FRUTA
No todos los tipos de microbios inicialmente presentes en la fruta se desarrollan por
igual en el refresco, debido a su composición química y sobre todo a su pH bajo, los
refrescos de fruta son un buen medio de cultivo para el desarrollo de levaduras y
mohos, mientras que las bacterias y estreptomicetos apenas pueden crecer, aunque a
veces sobrevivan a los tratamientos de elaboración.
El crecimiento microbiano abundante durante la obtención de zumo origina
transformaciones perjudiciales, tales como descomposición de azúcares y producción
de alcohol y dióxido de carbono. Puesto que la conservación de zumo de frutas
depende de su contenido microbiano durante la elaboración de aquel habrá que
procurar reducir la carga microbiana, ello se consigue mediante un tratamiento rápido
y una limpieza adecuada. Sin embargo, tan poco deben olvidarse las alteraciones
bioquímicas de origen microbiano.
De acuerdo con las investigaciones realizadas, en la primera fase de obtención de
zumos aumenta mucho la carga microbiana original, por el contrario, durante la
clarificación disminuyen los microorganismos presentes, así sucede tanto en zumos
filtrados, como los centrifugados. La intensa actividad metabólica microbiana origina
siempre modificaciones químicas perjudiciales. (Muller, 1981)
Con la excepción de pequeñas cantidades de zumo que contienen benzoato o que
están carbonatadas el principal factor (y en muchas ocasiones el único) que controla el
crecimiento microbiano es el pH. El pH de los zumos varía, pero en todos los casos es
suficientemente bajo para ser selectivo para las levaduras, mohos, bacterias ácido
lácticas y bacterias ácido acéticas. Muchos de estos microorganismos son capaces de
crecer rápidamente en el zumo, por lo que se precisa la aplicación de la refrigeración
como un factor extrínseco de control en los zumos no tratados térmicamente. En
algunos casos el zumo es deficiente en nutrientes para las levaduras, mohos y
bacterias ácido lácticas, aunque en la práctica esto tiene una importancia muy limitada.
(Varnam, 1997)
2.6.1 BACTERIAS 2.6.1 BACTERIAS
Las bacterias productoras de endosporas constituyen un problema especial,
seguramente las formas vegetativas de estas bacterias mueren en las condiciones
ordinarias de esterilización comercial, pero las esporas de Baci l lus y Clostr id ium
pueden sobrevivir a dicho tratamiento al ser muy termorresistentes. (Muller, 1981)
- B a c i l l u s l i c h e n i f o r m i sB a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s
Figura 1. Figura 1. B a c i l l u s l i c h e n i f o r m i sB a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s Fuente:Fuente:http://www.microbiologyatlas.kvl.dk/biologi/english/showmorf.asp?articleid=6
Bacilo Gram positivo, esporulado, no es patógeno común, se encuentra en el suelo,
agua, polvo, leche, exterior de las plantas y materia en descomposición.
Frecuentemente se encuentra como contaminante ordinario de laboratorios. Es
productor de sustancias antibióticas como la Bacitracina. (Frazier, 1993) Estudios
realizados demuestran que algunas cepas de este microorganismo pueden estar
relacionadas con intoxicaciones alimenticias. (M. S. Salkinoja-Salonen, 1999)
2.6.2 LEVADURAS2.6.2 LEVADURAS
Las levaduras son el agente causal más frecuente de las alteraciones de los refrescos.
Los patrones de alteración se caracterizan por la formación de películas, fermentación
con producción de gas, turbidez y sedimentos y de aromas “afrutados”. De los
refrescos y de sus ingredientes se han aislado numerosos géneros de levaduras. Entre
las más importantes que causan alteraciones están: Cándida, Bret tanomyces,
Saccharomyces y Zygosaccharomyces la cual presenta una especial
resistencia a los conservantes y puede llegar a ser difícil de erradicar de la planta
productora mientras que Bre t t anomyces puede causar problemas en refrescos
altamente carbonatados. También suelen aislarse con frecuencia los géneros
Rhodotoru la y Cryptococcus, aunque parecen tener una baja capacidad
alteradora. (Varnam, 1997)
- R h o d o t o r u l a s pR h o d o t o r u l a s p
Figura 2.Figura 2. R h o d o t o r u l a s p . R h o d o t o r u l a s p . Fuente:Fuente: http:// www.asmusa.org/branch/brscal/photos.rhodotorula.html
La mayoría de las levaduras son hongos unicelulares microscópicos que no forman
micelio y por lo tanto se presentan como células sencillas. Las levaduras tienen forma
redonda, ovalada o elongada siendo relativamente constante para la misma especie. La
mayoría de las levaduras se reproduce asexualmente por gemación y unas pocas lo
hacen por fisión simple como las bacterias. El tiempo de regeneración de la mayoría de
las células es de 20-30 minutos en condiciones ideales.
Las levaduras falsas que no producen ascosporas pertenecen a los hongos
imperfectos, grupo al que pertenece la Rhodotoru la sp . (Hayes, 1993)
Estas levaduras son faces amórficas de Basidiomicetos. En el género
Rhodospor id ium se encuentran las productoras de teliosporas. Se reproducen por
gemación multilateral y no son fermentadoras. Las dos especies que mas abundan en
los alimentos son: Rhodotoru la g lut in is y Rhodotoru la muc i lag inosa .
Producen pigmentos de color variable desde rosa a rojo y la mayoría son de color
naranja a rosa salmón. El género incluye algunas especies/cepas psicrotrofas que se
encuentran en las canales frescos de aves, en los camarones, en la carne de vacuno y
en el pescado. Algunas crecen en la superficie de la mantequilla. ( Jay, 1994)
2.6.3 MOHOS2.6.3 MOHOS
Por su condición de aerobios viven en la superficie de los refrescos, por ejemplo en los
tanques de almacenamiento forman un micelio blanco algodonoso. En ocasiones la
película formada se hunde y va al fondo, mientras en otros permanece en la superficie,
como si se tratase de una cubierta micelial que flota en el liquido. Los pigmentos
originados por los mohos se difunden en parte por el refresco y dan lugar a cambios de
coloración que también se originan por destrucción microbiana de los pigmentos
naturales de los refrescos de frutas. Muchos Deuteromycetos, como el Penic i l l ium y
el Asperg i l lus, dan el típico sabor a moho. De otro lado destruyen los ácidos de la
fruta como el cítrico y el ascórbico o sintetizan otros como el glucónico y el oxálico
por lo que se modifica el pH y el sabor del jugo. (Muller, 1981)
- P e n i c i l l i u m s pP e n i c i l l i u m s p
Figura 3. Figura 3. P e n i c i l l i u m s p .P e n i c i l l i u m s p . Fuente:Fuente: http:// www.botany.utoronto.ca/researchlab/malloch/moulds/penicillium
Es un género grande, en la taxonomía más reciente y completa se reconocen 200
especies. Estudios posteriores, indican que este número es demasiado bajo. 50
especies, al menos, son muy corrientes. Todas las especies corrientes crecen y
esporulan bien en medios sintéticos o semi sintéticos y son generalmente fácilmente
identificables hasta nivel de género. La clasificación de los penicilos se basa
principalmente en su morfología microscópica. El género Pen ic i l l ium se divide en
dos subgéneros atendiendo al número y disposición de las fiálidas (estructuras
productoras de conidios), métulas y ramas (estructuras que soportan las fiálidas) que
parten de las células del estipe principal o pie. La clasificación de Pitt incluye 4
subgéneros: Asperg i l lo ides, cuyas fiálidas parten directamente de los estipes sin la
intervención de elementos de soporte; Furcatum y Bivert ic i l l ium con fiálidas
soportadas por métulas y Penic i l l ium que corrientemente poseen métulas y ramas.
La mayoría de las especies toxigénicas y productoras de alteración alimenticia forman
parte del subgénero Penic i l l ium . (Doyle, 2001)
2.7 CONSERVACION DE REFRESCOS2.7 CONSERVACION DE REFRESCOS
La conservación de los refrescos tiene por objeto poner a los alimentos en condiciones
en las que las causas internas o externas de alteración se eliminen o el proceso de
descomposición resulte retardado. La conservación se utiliza a veces como sinónimo
de prolongación del plazo de utilización. Muchas veces se trata de la combinación de
varios procesos simultáneos o de realización sucesiva.
Para valorar correctamente los resultados de las operaciones implicadas hay que
distinguir entre:
÷ Operaciones que eliminan completamente (esterilización) o una parte considerable
(pasteurización) los microorganismos presentes en el alimento.
÷ Los que inhiben la multiplicación de los microorganismos transitoriamente o de
forma permanente.
2.7.1 CONSERVACION DE ALIMENTOS POR ALTAS TEMPERATURAS2.7.1 CONSERVACION DE ALIMENTOS POR ALTAS TEMPERATURAS
El empleo de altas temperaturas en la conservación de alimentos se basa en sus
efectos destructivos sobre los microorganismos. Por alta temperatura se entiende
aquella que es superior a la ambiental. Con respecto a la conservación de alimentos, se
emplean constantemente dos clases de temperatura: pasteurización y esterilización.
(Roger, 1998)
Es necesario conocer los microorganismos o enzimas existentes para fijar el
correspondiente factor de reducción. La intensidad del tratamiento será función del
factor de reducción elegido para el parámetro. En el caso de los microorganismos es
muy importante partir de una materia prima que tenga un nivel de contaminación
mínimo. En la selección de la especia de microorganismos más adecuada para el
establecimiento de los estándares de pasteurización, hay que tener en cuenta, que este
presente y que pueda desarrollarse en el alimento, que el organismo sea tóxico, que
sea el más termorresistente y que, a su vez, sea activo a temperatura ambiente.
(Rodríguez, 1990)
2.7.22.7.2 PASTEURIZACION PASTEURIZACION
La pasteurización pretende destruir los microorganismos patógenos no esporulados y
reducir significativamente la microbiota banal para ofrecer al consumidor un producto
seguro con una vida útil aceptable para que sea consumido en un corto plazo. A veces,
puede conseguirse la estabilidad microbiológica, como es el caso del vinagre en que se
pretende destruir la microbiota más termorresistente (mohos y levaduras) que puede
desarrollarse al pH tan bajo del producto.
Existen dos modalidades de pasteurización:
a. LTH ( low temperature holding) o pasteurización baja: es un sistema discontinuo
adecuado cuando de pretende pasteurizar volúmenes pequeños (por ejemplo 100 a
500 litros). Se utilizan tiempos largos (aproximadamente 30 minutos) y
temperaturas bajas ( 62 a 68 ºC) y se lleva acabo en tanques de doble pared
provistos de una agitador y un termómetro. Por la doble pared circula el fluido
calefactor y el refrigerante.
b. HTST (high temperature, short time) o pasteurización alta: este método se realiza
en sistema de flujo continuo con cambiadores de calor (tubulares o de placas). Se
utilizan temperaturas elevadas (72-85 ºC) y tiempos cortos (15-20 segundos).
Como siempre sobrevivirán al tratamiento un número determinado de
microorganismos, no es necesario un envasado aséptico, que encarecería
innecesariamente el producto final, basta con que sea higiénico. Los envases
utilizados pueden ser botellas de vidrio o plástico, bolsas de plástico, cartones,
etc. (Ordoñes, 1998).
2.7.3 TEORIA DE LA PAS2.7.3 TEORIA DE LA PASTEURIZACIONTEURIZACION
La pasteurización es un proceso físico mediante el cual se protegen los productos,
generalmente de tipo alimenticio, de los microorganismos que pueden estar presente
en ellos, los cuales pueden descomponer todo el producto. El proceso es un
calentamiento a temperaturas que sean capaces de matar dichos microorganismos, o
por lo menos inactivarlos, pero no lo suficientemente elevadas para que pudieran casar
efectos secundarios adversos que puedan afectar las características organolépticas de
los productos tratados.
Pasteur de acuerdo a sus investigaciones, demostró que los líquidos de carácter ácido
se esterilizan a temperaturas más bajas que aquellos de carácter alcalino o neutro.
Para evaluar cualquier ciclo de pasteurización, se requieren dos componentes: una
curva de letalidad (también referida como curva de muerte térmica) de organismos que
pueden sobrevivir en un producto y una curva de tiempo - temperatura del proceso de
pasteurización. (Master Brewers, 1982)
2.7.4 PASTEURIZACIÓN INSTAN2.7.4 PASTEURIZACIÓN INSTANTANEA O FLASHTANEA O FLASH
El calentamiento por corto tiempo es, con un margen muy amplio sobre los demás, el
proceso que más respecta la integridad de la bebida. Hay que ser consientes, sin
embargo, que aquí únicamente se incluyen los microorganismos de infecciones
primarias, que en la industria de las bebidas, en el caso de las infecciones, solo
constituyen una proporción cercana al 50%. La otra mitad de los problemas biológicos
se desencadena mediante las infecciones secundarias en el área de embotellado.
3. Conexiones: Orificios que coinciden con la entrada de la tubería a través de la placa
de bastidor, permitiendo así que los medios a tratar entren en el intercambiador.
4. Pernos de apriete: El paquete de placas que cuelga entre la placa de bastidor y la
placa de presión se comprime mediante un cierto número de pernos de apriete
hasta que las placas hacen contacto metálico y presionan juntas lo suficiente para
sellar los estrechos canales que se forman entre las placas.
5. Placas de canal: En una ranura que bordea la placa y rodea los orificios se
encuentra una junta, generalmente de material elastómero. El calor se transfiere a
través de la superficie que abarca la junta, excepto en pequeñas zonas próximas a
las esquinas. El número de placas del paquete de su intercambiador está
determinado por la magnitud de la superficie de transmisión de calor requerida.
6. Placa de presión: Placa de acero que es móvil como las placas de transmisión de
calor. En algunos casos las tuberías pueden conectarse a la placa de presión.
7. Barra guía: Las placas cuelgan de una barra soporte y se mantienen alineadas
gracias a una barra guía situada en la parte inferior.
8. Columna soporte: Las dos barras están suspendidas entre la placa de bastidor y
una columna soporte.
9. Junta.
2.8 BEBIDAS DE MALTA2.8 BEBIDAS DE MALTA
Las bebidas no alcohólicas han tenido gran aceptación en los últimos años, ejemplo de
esto son las bebidas de malta ya que por su gran porcentaje en carbohidratos posee un
alto contenido energético para las personas en todas las etapas de la vida. En este tipo
de bebidas las vitaminas como: riboflavina, tiamina y niacina son importantes
cofactores enzimáticos que catalizan oxidaciones y deshidrataciones de aminoácidos,
aldehidos y piridinucleótidos esenciales para las funciones vitales del organismo;
también son usados como suplementos alimenticios, lo que la convierte en una bebida
refrescante, vigorizante y nutritiva. (Fenneman, 1993)
Estas bebidas se elaboran a partir de la cebada malteada es decir que ha pasado por
diversos procesos de control como: selección, remojo, germinación (este es tal vez uno
de los proceso más importantes ya que aquí se activan las proteínas, el almidón y la
grasa del grano) y por último el secado y el tostado, para de esta forma obtener el color
deseado para el producto final. Después de estos procesos la malta es colocada en un
periodo de calentamiento ya que va de aproximadamente los 35 ºC a los 76 ºC, en este
momento las enzimas de la malta digieren los almidones y liberan los azúcares,
proteínas y aminoácidos. (Brock, 1997)
2.9 DEFINICIONES2.9 DEFINICIONES
2.9.1 MALTA2.9.1 MALTA
Es la cebada carbonatada la cual es elaborada a partir de cebada malteada, adicionada o
no de otros compuestos acidulantes, aromatizantes, saborizantes, edulcorantes, color
caramelo y suplemento vitamínico. (Norma Técnica Colombiana 4474)
2.9.2 CEBADA MALTEADA2.9.2 CEBADA MALTEADA
Cebada de variedad que ha sido sometida a un proceso de germinación controlada y
posterior tostado en condiciones adecuadas para su empleo en la elaboración de malta.
(Norma Técnica Colombiana 4474)
2.10 BEBIDAS DE CEBADA MALTEADA (Norma Técnica Colombiana 4474)2.10 BEBIDAS DE CEBADA MALTEADA (Norma Técnica Colombiana 4474)
MALTA MALTA
OBJETOOBJETO
Esta norma establece los requisitos de debe cumplir y los ensayos a los cuales se debe
someter la bebida de cebada malteada la cual es denominada malta.
REQUISITOS GENERALESREQUISITOS GENERALES
- El color, olor y el sabor de la malta deben ser característicos del producto.
- La malta debe presentar aspecto limpio, libre de cuerpos extraños, sin sedimentos
ni materiales en suspensión que no correspondan a las características de diseño
del producto.
REQUISITOS ESPECIFICOSREQUISITOS ESPECIFICOS
- La malta debe cumplir los siguientes requisitos fisico-químicos:
REQUISITOREQUISITO ESPECIFICACIONESPECIFICACION
Extracto total expresado como Plato o % m/m.
mínimo.
7.5
CO2, mínimo, expresado como: volumen de
CO2/g CO2/dm3
2.0
4.0
Proteína, expresada como: % m/v mínimo 0.2
Plomo , expresado como Pb (mg/dm3), máximo 0.1
Cobre, expresado como Cu (mg/dm3), máximo 1.0
Zn, expresado como Zn (mg/dm3). máximo 1.0
Arsénico, expresado como As (mg/dm3),
máximo
0.1
Tabla 5. Requisitos físicoTabla 5. Requisitos físico -- químicos de la malta químicos de la malta Fuente: Norma Técnica Colombiana 4474.Fuente: Norma Técnica Colombiana 4474. - La malta debe cumplir los siguientes requisitos microbiológicos:
MICROORGANISMOSMICROORGANISMOS NMPNMP F ILTRACION POR F ILTRACION POR
MEMBRANA (UFC)MEMBRANA (UFC)
S IEMBRA EN S IEMBRA EN
PLACA PLACA
PROFUNDA (UFC)PROFUNDA (UFC)
Coliformes - <1/100/cm3 0/cm3
Recuento de Mesófilos - <10/100/cm3 <=100/cm3
Recuento de Levaduras - <1/100/cm3 <=10/cm3
TabTab la 6. Requisitos microbiológicos de la maltala 6. Requisitos microbiológicos de la malta Fuente: Norma Técnica Colombiana 4474.Fuente: Norma Técnica Colombiana 4474.
2.11 PROCESO DE MALTEADO2.11 PROCESO DE MALTEADO
La cebada para maltear ha sido objeto de largos programas de selección con lo que han
sido obtenidas variedades como la Triumph que presenta una aceptable calidad y un
alto rendimiento para su malteado. Además, la identificación del papel de las
proantocianidinas derivadas de la malta en la formación de turbidez no biológica ha
llevado a la búsqueda de variedades de cebada con bajo contenido de
proantocianidinas.
El malteado es un proceso de germinación controlada (modificación), en el que se
sintetizan y movilizan enzimas y se liberan gránulos de almidón del endospermo. En
los últimos años se han logrado grandes avances en la mejora del proceso del
malteado, el cual ahora dura 8-9 días en comparación con los 14 días que constaba en
los años 50. Además, la cantidad de materia perdida durante el malteado se ha
reducido de un 10 hasta un 5% o menos.
Tras un secado y limpieza iniciales de los granos, estos se remojan a 10-16 ºC para
elevar su contenido en agua hasta el 42-46%, punto en el cual comienza la
germinación. Sin embargo, la discriminación entre remojo y germinación es artificial.
La cebada recién recolectada no germina debido a que se encuentra en un estado
durmiente, pero éste se puede acortar mediante un secado. La falta de oxígeno en el
agua de remojo también inhibe la germinación, pero esto se soluciona drenando y
aireando periódicamente los granos en remojo o bien aireando el agua. En el malteado
moderno se emplean cajas o tanques mixtos de remojo y germinación que se
caracterizan por tener un lecho poco profundo y un flujo de aire elevado.
Los principales avances en el proceso del malteado que se han conseguido en los
últimos años provienen del mejor conocimiento de la fisiología del grano de cebada. La
germinación se puede acelerar y uniformizar mediante la adición, tras el remojo, de
ácido giberélico para desencadenar la producción de enzimas por los gránulos de
aleurona. También es posible estimular el paso del ácido giberélico hacia las células de
la aleurona mediante el raspado mecánico de la cubierta y de la capa subyacente. Este
proceso se realiza comercialmente para acelerar el malteado o para facilitar el malteado
de cebada de no muy buena calidad. En la práctica moderna las condiciones durante la
germinación se controlan mediante el paso de aire, humedad y temperaturas
controladas a través de los granos. Durante el malteado se intenta que las pérdidas por
respiración y por el desarrollo de la raíz sean mínimas, lo cual se consigue mediante un
nuevo remojo. Una etapa final de remojo a 40 ºC se puede llevar a cabo para matar la
raíz.
La malta se moldura antes de mezclarla con agua. Antes eran frecuentes los molinos de
4 rodillos y rendían un buen extracto a partir de las maltas modificadas. Pero el
aumento del uso de maltas no también modificadas de la clase Lager y la necesidad de
una elaboración rápida ha llevado a la aparición de equipos con 6 rodillos. Se puede
aplicar una molienda en seco o en húmedo. (Varnam, 1997)
2.12 MICROBIOLOGIA DE LA MALTA2.12 MICROBIOLOGIA DE LA MALTA
La elaboración de la malta y la cerveza es un proceso similar en el cual se utilizan las
mismas materias primas y el mismo procedimiento en donde la diferencia consiste el
proceso de caramelización para la bebida de malta y la fermentación y maduración para
la cerveza. Teniendo en cuenta lo anterior, estos productos se ven afectados por los
mismos grupos microbianos durante el proceso de elaboración.
Las variaciones en las bebidas de malta o en los tipos de cerveza suelen estar
relacionadas con: el contenido alcohólico, la concentración de malta y de lúpulo
utilizados, la duración del envejecimiento, los sólidos totales existentes inicialmente
(que relaciona los carbohidratos fermentescibles existentes inicialmente con los que
quedan después de la fermentación) y la temperatura de fermentación. (Frazier, 1993)
Los microorganismos alteran la cerveza mediante la producción de sustancias que
causan olores y sabores desagradables o que producen turbidez. Entre los
microorganismos nocivos para la cerveza se encuentran levaduras elípticas capaces de
fermentarla pertenecientes al género Saccharomyces, Lactobacilos y también
bacterias productoras de ácido acético. Junto a estos microorganismos la cerveza
puede contaminarse durante su fabricación con levaduras, bacterias y mohos que no
plantean problemas importantes por que en las condiciones anaeróbicas de la cerveza,
a valores de pH comprendidos entre 4.0 y 4.5 y ante un contenido de alcohol superior
al 3% no se desarrollan o su desarrollo es insignificante. (Muller, 1981)
2.12.1 LEVADURAS2.12.1 LEVADURAS
La alteración producida por las levaduras varía de acuerdo con la levadura implicada en
la alteración, pero es corriente la aparición de una turbidez basta, exceso de gas,
exceso de acidez y aparición de malos aromas. Algunas levaduras salvajes producen
altos niveles de ácidos grasos, desde el C4 al C10, tales como el isobutirato y el
isovalerato, mientras que muchas especies no cultivadas de Saccharomyces
contienen el gen POF1 y generan malos aromas fenólicos por la descarboxilación de
los ácidos hidroxicianámicos, como el ferúlico y el p-cumárico.
En la alteración de la cerveza se ha implicado un amplio espectro de levaduras
procedentes del ambiente, entre las que hay diversas especies de Saccharomyces,
la mayoría de las cuales se clasifican en la actualidad bajo la misma denominación de
Saccharomyces ce rev i s i ae . Otras levaduras salvajes comunes son Pichia
membranae f a c i ens , Hansenu la anaerob ia , Mycoderma ce rev i s i ae y
algunas especies de Toluropsis . (Varnam, 1997).
- H a n s e n u l a s pH a n s e n u l a s p
Figura 8. Figura 8. H a n s e n u l a a n o m a l a .H a n s e n u l a a n o m a l a . FuenteFuente : : http:// www.itis-molinari.mi.it/documents/pea/hansenulaphoto.htm
Es una levadura ascosporógena que presenta células ovales, alargadas o esféricas y
con frecuencia un pseudomicelio. Se reproduce por gemación multipolar y de forma
sexual. En este último caso las esporas en forma de sombrero se producen en el
interior del asca. Comúnmente se encuentra en los cítricos, uvas y productos
derivados. (Jay, 1994)
Esta levadura origina turbidez , sedimentos y velos y sus productos metabólicos sobre
todo alcohol etílico y CO2, originados en la fermentación de los azúcares son también
tan perjudiciales como la formación de velos y ácido acético. Puede presentarse en las
distintas fases de elaboración de la bebida de malta, aunque frecuentemente es
responsable de fermentaciones durante el almacenamiento y la manipulación de la
bebida. Se presenta tanto en la cebada como en el azúcar que puede ser una buena
fuente para su crecimiento. Este microorganismo por ser osmofílico, presenta
fermentaciones que a veces dan lugar a la explosión de los envases como
consecuencia del CO2 originado. (Muller, 1981)
2.12.2 BACTERIAS2.12.2 BACTERIAS
- L a c t o b a c i l l u s s p .L a c t o b a c i l l u s s p .
Figura 9. Figura 9. L a c t o b a c i l l u s p l a n t a r u mL a c t o b a c i l l u s p l a n t a r u m Fuente:Fuente: http:// www.microbiologyatlas.kvl.dk/biologi/english/showmorf.asp?articleid=6
Son células largas, a veces bacilos cortos o cocobacilos en cadena, movilidad no
común, no esporulados, Gram positivos, pueden presentar cuerpos bipolares,
5.2.1 PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS5.2.1 PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
5.2.1.1 PRUEBA PILOTO5.2.1.1 PRUEBA PILOTO
Para realizar la prueba piloto para refrescos y bebidas de malta se realizó un pool de
microorganismos específicos así:
MICROORGANISMMICROORGANISM
OO
REFRESCOREFRESCO BEB IDA DE MALTABEB IDA DE MALTA MEDIO DE MEDIO DE
CULT IVOCULT IVO
Bacterias Bacil lus
l icheniformis
Lactobaci l lus sp 30 ml de peptona al
0.1%
Mohos Penici l l ium sp Penici l l ium sp 30 ml de caldo jugo
de tomate
Levaduras Rhodotoru la sp Hansenula sp 30 ml de caldo jugo
de tomate.
Tabla 8. Microorganismos para ensayos en refrescos y bebida de malta.Tabla 8. Microorganismos para ensayos en refrescos y bebida de malta. Fuente: Las autoras.Fuente: Las autoras.
Los microorganismos utilizados a lo largo de esta investigación fueron seleccionados
de acuerdo a anteriores trabajos de caracterización microbiológica realizada en los
productos en estudio por la empresa. (Barrios, 1999), (García, 2001) (Pérez, 2001)
Para determinar la población existente en cada uno de los pool (UFC) se realizaron
diluciones seriadas a fin de conocer la ideal para cada uno de los rangos de los
microorganismos a trabajar (bacterias 30-300 UFC, mohos 15-150 UFC y levaduras
20-200 UFC). Posteriormente se realizó la técnica de crioconservación (ver numeraver numera l l
5.3) 5.3) de cada uno de los microorganismos.
Posteriormente se tomaron las 30 muestras de producto correspondientes y se les
tomó las URL al igual que se realizó el recuento microbiológico sin inocular con el
propósito de descartar cualquier contaminación antes de agregar el inoculo.
Después asépticamente en cabina de flujo laminar se dispuso a agregar el inoculo
conocido de microorganismos (bacterias, mohos y levaduras) por separado a cada una
de las 30 muestras del refresco seleccionado (30 muestras de refresco de mora, 30 de
mango, 30 de durazno y 30 de naranja). El mismo procedimiento se realizó para la
bebida de malta.
Seguido de esto se tomaron las URL para cada una de las muestras inoculadas y se
procedió a realizar las respectivas siembras microbiológicas relacionadas a
continuación:
MICROORGANISMOMICROORGANISMO TECNICATECNICA AGARAGAR TEMP °CTEMP °C TIEMPOTIEMPO
Mesófilos Profundidad Plate Count 37°C 24-48 h
Mohos y Levaduras Profundidad PDA 25°C 3-5 días
Tabla 9. Análisis microbiológico de refrescos de fruta.Tabla 9. Análisis microbiológico de refrescos de fruta. Fuente: Las autorasFuente: Las autoras ..
MICROORGANISMOMICROORGANISMO TECNICATECNICA AGARAGAR TEMP °CTEMP °C TIEMPOTIEMPO
Mesófilos Profundidad SDA 37°C 24-48 h
Mohos y Levaduras Profundidad PDA 25°C 3-5 días
Tabla 10. Análisis microbiológico de bebida de malta.Tabla 10. Análisis microbiológico de bebida de malta. Fuente: Las autoras.Fuente: Las autoras.
5.2.1.25.2.1.2 PRUEBA FINALPRUEBA FINAL
A partir del tamaño muestral deducido por análisis estadístico de la prueba piloto, se
realizaron pruebas paralelas de bioluminiscencia y recuento en placa a los productos
en estudio induciendo contaminación con el mismo inoculo utilizado en la prueba
inicial (piloto) y realizando los siguientes recuentos de contaminación en placa a lo
largo de doce horas con un intervalo de 2 horas para cada medición:
MICROORGANISMOMICROORGANISMO TECNICATECNICA AGARAGAR TEMP °CTEMP °C TIEMPOTIEMPO
Mesófilos Profundidad Plate Count 37°C 24-48 h
Mohos y Levaduras Profundidad PDA 25°C 3-5 días
Tabla 11. Análisis microbiológico de refrescos.Tabla 11. Análisis microbiológico de refrescos. Fuente: Las autoras.Fuente: Las autoras.
MICROORGANISMOMICROORGANISMO TECNICATECNICA AGARAGAR TEMP °CTEMP °C TIEMPOTIEMPO
Mesófilos Profundidad SDA 37°C 24-48 h
Mohos y Levaduras Profundidad PDA 25°C 3-5 días
Tabla 12. Análisis microbiológico Tabla 12. Análisis microbiológico de bebida de malta.de bebida de malta. Fuente: Las autoras.Fuente: Las autoras.
Para la técnica de bioluminiscencia se midieron las Unidades Relativas de Luz (URL)
correspondientes al grado de contaminación inducido en los diferentes productos
(bebida de malta y jugos).
Se realizaron las respectivas replicas de acuerdo a los resultados dados por el análisis
estadístico.
5.35.3 CRIOCONSERVACIÓN CRIOCONSERVACIÓN
Una vez identificados y caracterizados los microorganismos a partir de la utilización de
pruebas rápidas de identificación API para bacterias y levaduras y Método de la cinta
para Mohos , se realizó una crioconservación con el fin de tener el inoculo puro y con
una concentración constante, para posteriormente ser utilizado en las pruebas a
realizar.
1. Se suspendió una colonia aislada de cada microorganismo en 30 ml de caldo de
cultivo específico.
2. se mezclaron 30 ml del caldo de cultivo estéril con glicerol al 60% con 30 ml de
caldo de cultivo + el inoculó y se agitó por 2 minutos.
3. De la suspensión anterior se agregó 1 ml a cada tubo Eppendorf (60 tubos)
4. Se llevó a un congelador a –35°C.
Entonces:
(30 ml de caldo + glicerol) +( 30 ml de caldo + inoculo)= 60 ml x 60 / 99% pureza del
glicerol = Cantidad de glicerol a agregar. (Amador, 1994)
Para controlar el método de crioconservación en bacterias se realizaron recuentos en
placa cada dos meses observando la morfología y el número de colonias en el medio
de cultivo especifico y microscópicamente observando la ausencia de
microorganismos contaminantes.
Para las Levaduras se realizaron pruebas de viabilidad y vitalidad para ver la capacidad
de reproducción de la misma así como también recuentos en placa observando la
morfología, el color de la levadura, y el número de UFC.
Para los Mohos se realizo el método de la cinta para observar su morfología y al
mismo tiempo ver contaminación por otros microorganismos y recuento en placa para
ver el número de UFC.
5.4 ANALISIS ESTADÍSTICO5.4 ANALISIS ESTADÍSTICO
El modelo utilizado en este estudio es de tipo experimental caracterizado por la
introducción y manipulación del factor causal o de riesgo para la determinación
posterior del efecto. Para esa manipulación se organizó la muestra en dos grupos: Uno
es el grupo de estudio o experimental y el otro es el grupo control. En el primero se
aplicó la variable independiente o sea el factor de riesgo, para luego medir el efecto o
variable dependiente, solo se mide el efecto. La base del estudio está en comparar este
efecto en ambos grupos. (Pineda, 1997).
66 RESULTADOS Y DISCUSIONRESULTADOS Y DISCUSION
6.16.1 COMPORTAMIEN COMPORTAMIENTO MICROBIOLOGICO A TRAVES DEL TIEMPOTO MICROBIOLOGICO A TRAVES DEL TIEMPO
Las siguientes gráficas muestran los resultados obtenidos a partir del comportamiento
de los microorganismos a través del tiempo en los productos en estudio,
representadas en las unidades correspondientes a cada técnica: Unidades Formadoras
de Colonia (UFC) y Unidades Relativas de Luz (URL).
• ESTADISTICAESTADISTICA
Prueba t para B:Prueba t para B: Modelo de regresión simple.
γγ = = αα + + ββ x + e x + e
Donde:
γγ = = Valor típico de una de las poblaciones
αα y ββ = Coeficientes de regresión de la población. Geométricamente representan la
ordenada al origen y la pendiente de la recta.
ee = = Término de error.
HipótesisHipótesis
Ho: El promedio obtenido de los recuentos a través del tiempo son iguales.
Hi: El promedio obtenido de los recuentos a través del tiempo es diferente.
Si p < 0.05 se rechaza la Ho
Si p > 0.05 se acepta la Ho
ù Gráfica 1 y 2. Refresco de naranja + Gráfica 1 y 2. Refresco de naranja + B a c i l l u s l i c h e n i f o r m i sB a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s (UFC) (UFC) Y Y
(URL). (URL).
y = 14 + 0.05x y = 6.66 + 0.06x p = 0.06 p = 0.01 Ho = acepta Ho = rechaza
ù Gráfica 3 y 4. Refresco de naranja + Gráfica 3 y 4. Refresco de naranja + R h o d o t o r u l a s p R h o d o t o r u l a s p (UFC) Y (URL)(UFC) Y (URL)
N +B
0
5
10
15
20
25
0 2 4 6 8 10 12
TIEMPO (HORAS)
UF
CN + B
6
6,2
6,4
6,6
6,8
7
7,2
7,4
0 2 4 6 8 10 12TIEMPO (HORAS)
UR
L
N + L
6,2
6,36,4
6,56,66,7
6,8
0 2 4 6 8 10 12
TIEMPO (HORAS)
UR
L
N + L
0
10
20
30
40
0 2 4 6 8 10 12
TIEMPO (HORAS)
UFC
y = 31.3 + 0.30x y = 6.38 + 0.02x p = 0.48 p = 0.02 Ho = Acepta Ho = Rechaza
ù Gráfica 5 y 6 . Refresco de naranja + Gráfica 5 y 6 . Refresco de naranja + P e n i c i l l i u m s pP e n i c i l l i u m s p (UFC) Y (URL) (UFC) Y (URL)
y = 26.2 + 0.25x y = 6.94 + 0.01x p = 0.15 p = 0.008 Ho = Acepta Ho = Rechaza
ù Gráfica 7 y 8. Refresco de mora + Gráfica 7 y 8. Refresco de mora + B a c i l l u s l i c h e n i f o r m i sB a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s (UFC) Y (UFC) Y
(URL)(URL)
M + B
2,62,652,7
2,752,8
2,852,9
2,95
0 2 4 6 8 10 12
TIEMPO
URL
N + M
13141516171819
0 2 4 6 8 10 12
TIEMPO
UFC
N + M
6,86,856,9
6,957
7,057,1
7,15
0 2 4 6 8 10 12
TIEMPOU
RL
y = 16.2 + 0.10x y = 2.72 + 0.01x p = 0.92 p = 0.09 Ho = Acepta Ho = Acepta
ù Gráfica 9 y 10. Refresco de mora + Gráfica 9 y 10. Refresco de mora + R h o d o t o r u l a s pR h o d o t o r u l a s p (UFC) Y (URL) (UFC) Y (URL)
y = 30.2 + (-1.57x ) y = 2.7 + 0x p = 0.04 p = error Ho = Rechaza Ho = Acepta ù Gráfica 11 y 12. Refresco de mora + Gráfica 11 y 12. Refresco de mora + P e n i c i l l i u m s pP e n i c i l l i u m s p (UFC) Y (URL) (UFC) Y (URL)
M + B
13
14
15
16
17
18
19
0 2 4 6 8 10 12
TIEMPO
UFC
M + L
0
1
2
3
0 2 4 6 8 10 12
TIEMPO
UR
L
M + M
1515,5
1616,5
1717,5
1818,5
0 2 4 6 8 10 12
UFC
M + M
2,6
2,7
2,8
2,9
3
3,1
3,2
0 2 4 6 8 10 12
UR
L
M + L
0
10
20
30
40
0 2 4 6 8 10 12
TIEMPO
UFC
y = 16.8 + 0.08x y = 2.87 + 0.01x p = 0.26 p = 2.38 Ho = Acepta Ho = Acepta
ù Gráfica 13 y 14. Refresco de mango + Gráfica 13 y 14. Refresco de mango + B a c i l l u s l i c h e n i f o r m i sB a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s (UFC) Y (UFC) Y
(URL)(URL)
y = 21 + (-0.17x) y = 5.39 + 0.06x p = 0.28 p = 0.02 Ho = Acepta Ho = Rechaza ù Gráfica 15 y 16. Refresco de mango + Gráfica 15 y 16. Refresco de mango + R h o d o t o r u l a s pR h o d o t o r u l a s p (UFC) Y (URL) (UFC) Y (URL)
M + B
4,64,8
55,25,45,65,8
66,26,4
0 2 4 6 8 10 12
TIEMPO
URL
MN + L
05
101520253035
0 2 4 6 8 10 12
TIEMPO
UFC
MN + L
55,1
5,2
5,35,4
5,5
5,6
0 2 4 6 8 10 12
TIEMPO
UR
L
M + B
0
5
10
15
20
25
0 2 4 6 8 10 12
TIEMPO
UFC
y = 29.4 + (-1.35x) y = 5.27 + 0.01x p = 0.01 p = 0.13 Ho = rechaza Ho = Acepta
Gráfica 17 y 18. Refresco de mango + Gráfica 17 y 18. Refresco de mango + P e n i c i l l i u m s pP e n i c i l l i u m s p (UFC) Y (URL) (UFC) Y (URL)
y = 28.07 + 0.82x y = 5.68 + 0.03x p = 0.06 p = 0.06 Ho = Acepta Ho = Acepta
ù Gráfica 19 y 20. Refresco de durazno + Gráfica 19 y 20. Refresco de durazno + B a c iB a c i l l u s l i c h e n i f o r m i sl l u s l i c h e n i f o r m i s (UFC) (UFC)
D + B
0
10
20
30
40
50
0 2 4 6 8 10 12
TIEMPO
UFC
D + B
5
5,25,4
5,65,8
66,2
6,4
0 2 4 6 8 10 12
TIEMPO
UR
L
MN + M
05
101520253035
0 2 4 6 8 10 12
TIEMPO
UFC
MN + M
0
10
20
30
40
0 2 4 6 8 10 12
TIEMPO
URL
Y (URL)Y (URL)
y = 41.3 + (- 2.03x) y = 5.46 + 0.06x p = 0.009 p = 0.0004 Ho = Rechaza Ho = Rechaza
ù Gráfica 21 y 22. Refresco de durazno + Gráfica 21 y 22. Refresco de durazno + R h o d o t o r u l a s pR h o d o t o r u l a s p (UFC) Y (URL) (UFC) Y (URL)
y = 19.8 + (-0.98x) y = 5.63 + 0.02x p = 0.01 p = 0.03 Ho = Rechaza Ho = Rechaza
ù Gráfica 23 y 24. Refresco de durazno + Gráfica 23 y 24. Refresco de durazno + P e n i c i l l i u m s pP e n i c i l l i u m s p (UFC) Y (URL) (UFC) Y (URL)
y = 84.8 + (-0.44x) y = 28.07 + (-0.82x) p = 0.17 p = 0.06 Ho = Acepta Ho = Acepta
D + L
0
5
10
15
20
25
0 2 4 6 8 10 12
TIEMPO
UFC
D + L
5,45,55,65,75,85,9
66,1
0 2 4 6 8 10 12
TIEMPO
UR
L
D + M
70
75
80
85
90
0 2 4 6 8 10 12
TIEMPO
UFC
D + M
0
123456
0 2 4 6 8 10 12
TIEMPO
UR
L
ù GrGráfica 25 y 26. Bebida de malta + áfica 25 y 26. Bebida de malta + L a c t o b a c i l l u s s pL a c t o b a c i l l u s s p (UFC) Y (URL) (UFC) Y (URL)
y = 23.75 + 0.66x y = 2.14 + 0.001x p = 0.0007 p = 0.89 Ho = Rechaza Ho = Acepta
ù Gráfica 27 y 28. Bebida de malta + Gráfica 27 y 28. Bebida de malta + H a n s e n u l a s pH a n s e n u l a s p (UFC) Y (URL) (UFC) Y (URL)
BM + B
0
10
20
30
40
0 2 4 6 8 10 12TIEMPO
UFC
BM + B
1,8
1,9
2
2,1
2,2
2,3
2,4
0 2 4 6 8 10 12TIEMPO
UR
L
BM + L
05
10
15
2025
3035
0 2 4 6 8 10 12
TIEMPO
UFC
BM + L
3
3,1
3,2
3,3
3,4
3,5
3,6
0 2 4 6 8 10 12
TIEMPO
UR
L
y = 29.9 + (-1.39x) y = 3.22 + 0.021x p = 0.01 p = 0.02 Ho = Rechaza Ho = Rechaza
ù Gráfica 29 y 30. Bebida de malta + Gráfica 29 y 30. Bebida de malta + P e n i c i l l i u m s p P e n i c i l l i u m s p (UFC) Y (URL)(UFC) Y (URL)
y = 70.2 + (-0.35x) y = 2.61 +(-0.001x) p = 0.71 p = 0.88 Ho = Acepta Ho = Acepta
BM + M
0
20
40
60
80
100
0 2 4 6 8 10 12
TIEMPO
UFC
BM + M
2,2
2,3
2,4
2,5
2,6
2,7
2,8
0 2 4 6 8 10 12
TIEMPO
UR
L
6.2 PRUEBA PARA DETERMINAR LA SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD DE LA 6.2 PRUEBA PARA DETERMINAR LA SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD DE LA
TÉCNICA DE BIOLUMINISCENCIA FRENTE AL RECUENTO ESTÁNDAR EN PLACA TÉCNICA DE BIOLUMINISCENCIA FRENTE AL RECUENTO ESTÁNDAR EN PLACA
PARA REFRESCOS DE FRUTA Y BEBIDAS DE MALTAPARA REFRESCOS DE FRUTA Y BEBIDAS DE MALTA
• ESTADÍSTICAESTADÍSTICA
La sensibilidad de un método puede definirse como la proporción de los
microorganismos buscados que pueden desarrollarse en las condiciones de la prueba y
PROBABILIDAD DE PROBABILIDAD DE HALLAZGO PARA URL (%)HALLAZGO PARA URL (%)
Refresco naranja + Bacteria 81.25 Refresco naranja + Levadura 77.25 Refresco naranja + Moho 53.8 Refresco mora + Bacteria 65.5 Refresco mora + Levadura 83.3 Refresco mora + Moho 77.7 Refresco mango + Bacteria 70 Refresco mango + Levadura 83.75 Refresco mango + Moho 29.83 Refresco durazno + Bacteria 81.25 Refresco durazno + Levadura 87.75 Refresco durazno + Moho 38.75 Bebida de malta + Bacteria 16.25 Bebida de malta + Levadura 85 Bebida de malta + Moho 72.5
Tabla 13. Probabilidad de hallazgo de microorganismos para laTabla 13. Probabilidad de hallazgo de microorganismos para la Técnica de Técnica de BioluminiscenciaBioluminiscencia
Los resultados obtenidos ( ver tablas de curvas de crecimiento) aplicando la técnica de
Recuento Estándar en Placa permiten conocer la sensibilidad y especificidad de la
técnica debido a que todos los recuentos para los diferentes microorganismos fueron
positivos. Este resultado pudo ser originado a partir del medio de cultivo especifico
utilizado para cada tipo de microorganismo el cual proporciona los nutrientes y las
condiciones requeridas para su óptimo desarrollo. Sin embargo, la población
inicialmente inoculada se vio afectada por diferentes factores tales como pH,
conservantes, saborizantes, estabilizantes y propiedades típicas de las frutas y de las
bebidas de malta que provocaron tanto la disminución como el aumento de la
población microbiana a lo largo del tiempo. Otra posible explicación a este fenómeno
(disminución y aumento de la población) puede ser que los microorganismos lleguen a
la fase críptica (conocida como la fase en donde en ausencia o disminución de
nutrientes, el microorganismo comienza a esporular para sobrevivir), originándose un
cambio en la curva de crecimiento.
Teniendo en cuenta las variaciones presentadas en la población los recuentos
obtenidos fueron:
PRODUCTO + PRODUCTO +
MICROORGANISMOMICROORGANISMO
RECUENTO ESTANDARRECUENTO ESTANDAR EN EN
PLACA (UFC/ml )PLACA (UFC/ml )
Refresco naranja + Bacteria 8 – 23
Refresco naranja + Levadura 19 – 53
Refresco naranja + Moho 10 – 91
Refresco mora + Bacteria 3 – 26
Refresco mora + Levadura 7 – 26
Refresco mora + Moho 2 – 38
Refresco mango + Bacteria 4 – 31
Refresco mango + Levadura 8 – 37
Refresco mango + Moho 1 – 100
Refresco durazno + Bacteria 6 – 120
Refresco durazno + Levadura 7 – 26
Refresco durazno + Moho 57 – 106
Rango Tota lRango Tota l 1 1 –– 120 120
Bebida de malta + Bacteria 20 – 39
Bebida de malta + Levadura 8 – 37
Bebida de malta + Moho 39 – 108
Rango tota lRango tota l 8 8 –– 108 108
Tabla 14. Rangos de UFC de productos en estudio Tabla 14. Rangos de UFC de productos en estudio
En esta tabla se expresan los rangos obtenidos a partir de las curvas de crecimiento
realizadas a lo largo del estudio. Las unidades utilizadas para estimar estos rangos
están dadas en Unidades Formadoras de Colonia por mililitro.
6.3 LÍMITES DE CONFIANZA PARA LA MEDIA DE UNA POBLACIÓN 6.3 LÍMITES DE CONFIANZA PARA LA MEDIA DE UNA POBLACIÓN
REPRESENTADA EN UFC Y URLREPRESENTADA EN UFC Y URL
La manera más informativa de cuantificar el error aleatorio es construir intervalos
(límites) de confianza de acuerdo a los resultados de la prueba. Los intervalos de
confianza permiten al lector observar el intervalo de valores compatible con los
resultados obtenidos, pudiéndolo comparar con el de otras pruebas. (Stephen, 1990)
Con base en el conocimiento adquirido acerca de la distribución normal, en general, se
sabe aún más sobre la distribución X X para este caso. Por ejemplo, se sabe que sin
importar donde se localiza, aproximadamente el 95% de los valores de X X que
constituyen la distribución, están a +/- 2 desviaciones estándar respecto a la media de
modo que el intervalo contiene aproximadamente el 95% de los valores posibles de X. X.
(Daniel, 1996)
Aplicando la siguiente formula se obtuvieron los siguientes resultados:
µµ = = X +/X +/-- t x s t x s NN Producto + microorganismoProducto + microorganismo URL/100microlitrosURL/100microlitros UFC/mlUFC/ml
Tabla 15. Limites de confianza para la media de la población en estudio.Tabla 15. Limites de confianza para la media de la población en estudio.
Los datos expresados en Unidades Relativas de Luz (URL) y Unidades formadoras de
Colonia (UFC) muestran los rangos obtenidos a partir de análisis estadístico realizado,
dando como resultado la equivalencia de unidades UFC con las URL. Esta tabla se
relaciona con datos obtenidos en el numeral 6.2 en donde se establecen las
probabilidades para la confiabilidad de la técnica de bioluminiscencia y su equivalencia
en UFC. Ejemplo: Si tomamos una muestra de refresco de mango alterado y la
analizamos en el luminómetro y nos da como resultado 5.6 URL podemos decir que
existe un 70% de probabilidad que la contaminación sea originada por bacterias o del
29.8% que sea originada por mohos. Esto viene establecido de acuerdo a las URL
obtenidas y clasificadas en la tabla anterior
6.4 TABLAS DE RESULTADOS CURVAS DE CRECIMIENTO6.4 TABLAS DE RESULTADOS CURVAS DE CRECIMIENTO
DATOS DE LOS RECUENTOS EN PLACA Y UNIDADES RELATIVAS DE LUZ DATOS DE LOS RECUENTOS EN PLACA Y UNIDADES RELATIVAS DE LUZ OBTENIDOS DE LAS CURVAS DE CRECIMIEOBTENIDOS DE LAS CURVAS DE CRECIMIENTO.NTO. Los datos presentados a continuación son el resultado de las curvas de crecimiento
realizadas para cada producto en estudio a lo largo de 12 horas con un intervalo de
toma de muestra de dos horas. Las tablas se resumen a continuación así:
- RSI: Refresco sin inocular. Es el que no tiene el microorganismo .
- URL: Unidades Relativas de Luz. Unidades en las que mide el ATP presente el
luminómetro.
- UFC: Unidades Formadoras de Colonia. Unidades para el Recuento en Placa.
- R ó BM + B: Refresco ó bebida de Malta + Bacteria.
- R ó BM + L: Refresco ó Bebida de Malta + Levadura.
- R ó BM + M: Refresco ó Bebida de Malta + Moho.
- Rango: Numero entre el cual oscila el crecimiento del microorganismo expresado
en UFC y URL.
CURVAS DE CRECIMIENTO CURVAS DE CRECIMIENTO B a c i l l u s l i c h e n iB a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s f o r m i s Sobre refresco de naranja UHT(10)Sobre refresco de naranja UHT(10)
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 6,5 URLURL 6,5 6,7 7,1 7,3 7,5 7,4 7 0 UFCUFC 17 8 9 13 18 20 21
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 6,5 URLURL 6,6 6,8 7,1 7,2 7,4 7,2 7,3 0 UFCUFC 8 8 16 14 11 15 18
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 6,5 URLURL 6,5 6,6 6,6 7,2 7,3 7,4 7,2 0 UFCUFC 14 17 16 18 21 15 22
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 6,5 URLURL 6,6 6,7 7,1 7,2 7,3 7,4 7,3 0 UFCUFC 13 15 13 14 17 21 23
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 6,5 URLURL 6,5 6,6 7,2 7,4 7 7,1 7,2 0 UFCUFC 16 18 13 18 16 21 23
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 6,5 URLURL 6,6 6,6 7,1 7,3 7,4 7,3 7,3 0 UFCUFC 12 18 16 18 16 22 21
R S I R S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 6,5 URLURL 6,7 6,8 7,1 7,2 7,3 7,4 7,1 0 UFCUFC 12 15 18 10 15 17 22
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 6,5 URLURL 6,6 6,5 7,1 7,2 7,3 7,3 7,1 0 UFCUFC 12 21 14 14 18 20 23
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 6,5 URLURL 6,7 6,8 7,1 7,2 7,3 7,1 7,1 0 UFCUFC 14 14 17 14 13 18 20
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 6,5 URLURL 6,5 6,6 7,1 7,2 7,3 7,1 7,2 0 UFCUFC 16 15 12 18 16 20 13
CURVAS DE CRECIMIENTOCURVAS DE CRECIMIENTO B a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s B a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s Sobre refrSobre refresco de mora UHT(10)esco de mora UHT(10)
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,7 URLURL 2,6 2,8 2,8 2,7 2,8 2,7 2,7 0 UFCUFC 9 24 3 19 17 10 13
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,8 URLURL 2,7 2,8 2,8 2,8 2,9 2,8 2,9 0 UFCUFC 22 15 24 12 14 15 17
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,7 URLURL 2,7 2,7 2,9 2,8 2,9 2,8 2,8 0 UFCUFC 12 10 13 17 15 18 11
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,8 URLURL 2,7 2,8 2,7 2,8 2,9 2,9 2,7 0 UFCUFC 21 16 13 11 26 21 22
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,7 URLURL 2,6 2,8 2,8 2,8 2,9 2,9 2,8 0 UFCUFC 25 21 20 17 12 21 20
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,7 URLURL 2,7 2,7 2,8 2,8 2,8 2,7 2,8 0 UFCUFC 15 17 16 17 10 18 19
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,7 URLURL 2,6 2,7 2,8 2,7 2,9 2,9 2,8 0 UFCUFC 21 18 19 25 15 22 13
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,7 URLURL 2,8 2,7 2,8 2,8 2,8 2,9 2,9 0 UFCUFC 13 18 19 14 17 15 21
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,8 URLURL 2,8 2,8 2,8 2,9 2,9 2,9 2,8 0 UFCUFC 19 16 20 20 18 21 23
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,7 URLURL 2,7 2,7 2,8 2,8 2,8 2,9 2,9 0 UFCUFC 22 11 18 22 15 18 22
R S IR S I R + BR + B R + BR + B
URLURL URLURL UFCUFC
2,7-2,8 2,7 9-25 2,7-2,9=3-26 UFC
2,8 3-24 <2.7= 0 UFC
2,9 13-26
RangoRango 2,72,7 --2,92,9 33 --2626
CURVAS DE CRECIMIENTO CURVAS DE CRECIMIENTO B a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s B a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s Sobre refresco de mango UHT(10)Sobre refresco de mango UHT(10)
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 11 22 5,5 URL 5,4 5,4 5,7 5 6 6,2 6,3 0 UFC 18 21 19 15 15 18 20
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,6 URL 5,3 5,5 5,7 5,8 6 6,1 6,2 0 UFC 15 20 4 20 11 16 18
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,6 URL 5,7 5,8 5,9 6 6,1 6 6,3 0 UFC 24 21 16 15 18 18 21
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,5 URL 5,6 5,9 6 6 6,1 6,2 6,2 0 UFC 19 24 25 21 31 28 22
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,5 URL 5,5 5,7 5,9 6 6,1 6,2 6,2 0 UFC 25 15 28 25 28 30 24
R S IR S I HORAS 0 2 4 6 8 10 12 5,65,6 URLURL 5,45,4 5,55,5 5,65,6 5,85,8 66 6,26,2 6,36,3 0 UFC 24 22 15 17 14 19 21
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,6 URL 5,3 5,5 5,7 5,8 6 6,1 6,2 0 UFC 29 15 18 24 14 16 19
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,5 URL 5,7 5,8 5,9 6 6,1 6,2 6,3 0 UFC 17 26 21 25 14 19 20
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,6 URL 5,6 5,9 5,9 6 6,1 6,1 6 0 UFC 30 18 28 25 10 18 22
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,5 URL 5,6 5,7 5,9 6 6,2 6,1 6,2 0 UFC 19 27 22 12 15 11 21
R S IR S I R + BR + B R + BR + B URLURL URLURL UFCUFC
CURVAS DE CRECIMIENTO CURVAS DE CRECIMIENTO R h o d o t o r u l a s p . R h o d o t o r u l a s p . Sobre refresco de naranja UHT(5)Sobre refresco de naranja UHT(5)
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 6,3 URLURL 6,5 6,6 6,4 6,6 6,8 6,7 6,6 0 UFCUFC 42 32 30 22 53 48 45
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 6,3 URLURL 6,5 6,6 6,5 6,7 6,7 6,7 6,6 0 UFCUFC 35 24 44 23 46 40 41
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 6,1 URLURL 6,2 6,3 6,4 6,6 6,7 6,7 6,6 0 UFCUFC 36 39 30 33 29 34 32
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 6,1 URLURL 6,2 6,3 6,4 6,6 6,6 6,7 6,5 0 UFCUFC 29 33 19 15 30 26 24
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 6,1 URLURL 6,4 6,5 6,4 6,6 6,8 6,8 6,6 0 UFCUFC 49 35 35 23 35 32 30
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 6,4 URLURL 6,6 6,6 6,6 6,6 6,7 6,6 6,7 0 UFCUFC 38 30 30 28 37 35 36
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 6,1 URLURL 6,2 6,3 6,4 6,7 6,8 6,6 6,6 0 UFCUFC 38 35 30 49 26 30 34
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 6,1 URLURL 6,3 6,3 6,4 6,6 6,6 6,6 6,4 0 UFCUFC 27 34 18 30 43 38 39
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 6,3 URLURL 6,5 6,6 6,4 6,6 6,8 6,6 6,6 0 UFCUFC 42 37 31 33 43 38 36
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 6,3 UFCUFC 6,6 6,4 6,6 6,7 6,7 6,6 6,7 0 UFCUFC 39 32 39 29 36 35 38
R S I R + L R S I R + L R + LR + L
URLURL URLURL UFCUFC
6,1-6,3 6,2 29 - 38
6,3 33 - 39 6,2-6,8=19-53 UFC
6,4 19 - 49 <6,3=0 UFC
6,5 24 - 44
6,6 22 - 45
6,7 23 - 49
6,8 26 - 53
RangoRango 6,26,2 --6,86,8 1919 -- 53 53
CURVAS DE CRECIMIENTO CURVAS DE CRECIMIENTO R h o d o t o r u l a . s p . R h o d o t o r u l a . s p . Sobre refresco de mora UHT(1Sobre refresco de mora UHT(12)2)
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,6 URLURL 2,7 2,7 2,7 2,7 2,7 2,7 2,7 0 UFCUFC 31 18 21 16 10 15 13
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,6 URLURL 2,7 2,7 2,7 2,7 2,6 2,7 2,7 0 UFCUFC 32 27 21 17 11 14 13
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,7 URLURL 2,7 2,7 2,7 2,7 2,7 2,7 2,7 0 UFCUFC 47 33 15 12 14 18 20
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,6 URLURL 2,6 2,7 2,7 2,7 2,7 2,7 2,7 0 UFCUFC 38 28 13 19 12 18 16
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,7 URLURL 2,7 2,7 2,6 2,7 2,8 2,7 2,8 0 UFCUFC 33 20 12 21 6 14 19
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,6 URLURL 2,7 2,7 2,7 2,7 2,7 2,7 2,7 0 UFCUFC 30 20 22 19 16 18 20
CURVAS DE CRECIMIENTO CURVAS DE CRECIMIENTO R h o d o t o r u l a . s p . R h o d o t o r u l a . s p . Sobre refresco de mango UHT(6)Sobre refresco de mango UHT(6)
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,1 URLURL 5,2 5,3 5,3 5,4 5,5 5,4 5,5 0 UFCUFC 29 22 15 19 22 18 20
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,1 URLURL 5,3 5,4 5,2 5,4 5,6 5,2 5,4 0 UFCUFC 33 22 15 17 18 20 19
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,1 URLURL 5,3 5,4 5,4 5,5 5,6 5,3 5,5 0 UFCUFC 37 24 14 8 9 10 12
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,2 URLURL 5,4 5,4 5,3 5,2 5,4 5,2 5,2 0 UFCUFC 32 30 25 16 13 9 12
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,1 URLURL 5,3 5,4 5,3 5,4 5,6 5,3 5,5
0 UFCUFC 36 34 20 21 21 20 18 R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,1 URLURL 5,2 5,3 5,2 5,3 5,4 5,1 5,3 0 UFCUFC 35 28 16 22 17 18 20
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,1 URLURL 5,3 5,4 5,4 5,5 5,7 5,4 5,6 0 UFCUFC 26 31 26 12 11 15 9
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,2 URLURL 5,2 5,3 5,3 5,3 5,4 5,1 5,4 0 UFCUFC 37 32 32 23 16 20 21
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,1 URLURL 5,1 5,3 5,3 5,4 5,5 5,6 5,5 0 UFCUFC 28 37 18 30 21 25 19
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,2 URLURL 5,3 5,4 5,4 5,5 5,7 5,6 5,7 0 UFCUFC 36 32 19 15 14 18 20
R S IR S I R + LR + L R + LR + L URLURL URLURL UFCUFC 5,1 5,2 12-29 5,2-5,6=8-47 UFC
5,3 13-37 <5,1=0 UFC 5,4 9-32 5,5 8-22 5,6 9-21
RangoRango 5,25,2 --5,65,6 8-37
CURVAS DECURVAS DE CRECIMIENTO CRECIMIENTO R h o d o t o r u l a s p . R h o d o t o r u l a s p . Sobre refresco de durazno UHT(10)Sobre refresco de durazno UHT(10)
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,5 URLURL 5,7 5,8 5,7 5,7 5,8 6 5,8 0 UFCUFC 18 20 8 8 13 11 9
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,5 URLURL 5,7 5,8 5,8 5,9 5,9 6,1 5,9 0 UFCUFC 18 20 12 7 8 10 8
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,4 URLURL 5,6 5,7 5,6 5,7 5,8 6 5,6 0 UFCUFC 17 17 17 8 7 9 11
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,4 URLURL 5,6 5,4 5,8 5,8 5,8 6 5,7 0 UFCUFC 25 19 12 13 7 12 13
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,5 URLURL 5,5 5,7 5,6 5,7 5,8 5,9 5,7 0 UFCUFC 20 20 10 10 12 11 10
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,6 URLURL 5,7 5,8 5,8 5,9 5,9 6,1 5,8 0 UFCUFC 14 18 15 13 9 12 13
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,4 URLURL 5,7 5,8 5,9 5,8 5,9 6 5,9 0 UFCUFC 22 26 16 13 9 8 10
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,4 URLURL 5,7 5,8 5,9 5,8 5,9 5,7 5,9 0 UFCUFC 18 21 16 9 10 12 14
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,5 URLURL 5,4 5,7 5,7 5,7 5,8 5,7 5,8 0 UFCUFC 21 19 14 7 16 14 12
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,5 URLURL 5,6 5,7 5,7 5,7 5,8 5,7 5,8 0 UFCUFC 22 23 16 14 10 14 11
R S I R S I R + L R + L R + LR + L URLURL URLURL UFCUFC
CURVAS DE CRECIMIENTO CURVAS DE CRECIMIENTO P e n i c i l l i u m s p . P e n i c i l l i u m s p . Sobre refresco de naranja UHT (26)Sobre refresco de naranja UHT (26)
RR S I S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 6,6 URLURL 6,6 6,6 7 7,1 7,1 6,9 6,9 0 UFCUFC 73 87 63 64 78 43 88
CURVAS DE CRECIMIENTO CURVAS DE CRECIMIENTO P e n i c i l l i u m s p . P e n i c i l l i u m s p . Sobre refresco de mora UHT(31)Sobre refresco de mora UHT(31)
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,8 URLURL 3,2 3,3 3,2 2,8 2,8 3 2,8 0 UFCUFC 11 21 11 28 32 16 22
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,8 URLURL 3,2 3,3 3,2 2,8 2,8 3 3 0 UFCUFC 14 30 13 14 23 25 21
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,8 URLURL 3 3,1 3,2 3 3,1 3 2,7 0 UFCUFC 16 24 18 16 22 24 23
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 11 00 1212 2,7 URLURL 2,9 3 3,2 3,2 3,3 3,1 3,2 0 UFCUFC 10 7 9 11 13 16 18
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,6 URLURL 2,7 2,7 2,8 2,8 2,9 2,7 2,8 0 UFCUFC 18 6 12 14 13 16 14
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,8 URLURL 2,7 2,7 2,8 2,8 2,9 2,7 2,8 0 UFCUFC 10 9 18 11 9 10 10
R S R S II HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,7 URLURL 2,7 3 3 3 2,8 2,8 2,8 0 UFCUFC 29 22 12 16 13 10 12
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,7 URLURL 2,9 3 3,2 3 3,3 3,1 3,2 0 UFCUFC 6 7 11 17 14 18 19
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,7 URLURL 2,9 2,9 3 3 2,9 2,7 2,9 0 UFCUFC 8 6 2 5 4 15 15
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,7 URLURL 2,8 3,1 3 3,1 3,1 3,1 3 0 UFCUFC 26 29 28 23 23 25 24
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,7 URLURL 2,8 2,8 3 2,9 3 3 2,9 0 UFCUFC 24 27 26 25 23 24 24
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,6 URLURL 2,8 3 3,1 3,1 3 3,1 3 0 UFCUFC 21 32 24 26 38 30 34
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,6 URLURL 2,7 3 2,8 2,9 3,1 3 3,1 0 UFCUFC 8 14 14 15 10 6 9
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,7 URLURL 2,8 2,9 2,9 3 3,1 3,3 3,2 0 UFCUFC 16 18 18 25 13 7 11
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,6 URLURL 2,8 3 3,1 3,2 3,3 3,3 3,2
0 UU FCFC 12 13 14 15 9 14 15 R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,7 URLURL 2,7 2,9 3,1 3,1 3,2 3,2 3,3 0 UFCUFC 15 20 20 22 25 18 24
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2 URLURL 2,7 2,9 3 3,1 3,2 3,1 3,2 0 UFCUFC 11 17 17 15 13 8 12
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,6 URLURL 2,7 2,9 3,1 3,1 3,2 3 3,3 0 UFCUFC 20 18 14 21 22 10 18
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,6 URLURL 2,8 3 3,1 3,2 3,1 2,8 3 0 UFCUFC 8 9 12 17 18 12 16
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,6 URLURL 2,9 2,9 3,1 3,2 3 2,8 2,9 0 UFCUFC 15 19 12 20 18 10 12
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,6 URLURL 2,8 3 3,2 3,1 2,9 2,7 2,8 0 UFCUFC 19 20 13 17 16 10 14
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,6 URLURL 2,7 2,7 2,5 2,5 2,6 2,7 2,9 0 UFCUFC 22 20 28 17 16 16 11
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,7 URLURL 2,7 3 3 2,9 3 2,8 2,9 0 UFCUFC 18 25 23 17 16 16 11
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,7 URLURL 2,8 2,8 3,1 2,9 3 3 2,9 0 UFCUFC 23 25 26 26 28 27 25
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,7 URLURL 2,8 3,1 3 3,1 3,1 3,1 3 0 UFCUFC 9 24 30 26 22 24 25
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,6 URLURL 2,8 3 3,1 3,1 3 3,1 3,1 0 UFCUFC 21 16 30 24 23 25 25
R R S IS I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,6 URLURL 2,7 3 2,8 2,9 3,1 3,2 3,3 0 UFCUFC 18 8 10 15 11 13 25
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,7 URLURL 2,8 2,9 2,9 3 3,1 3,3 3,3 0 UFCUFC 16 19 17 17 13 18 25
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,6 URLURL 2,8 2,8 2,8 3,2 3,3 3,3 3,2 0 UFCUFC 7 13 13 12 10 20 19
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,7 URLURL 2,7 2,9 3,1 3,1 3,2 3,1 3,2 0 UFCUFC 25 18 18 21 20 17 19
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,6 URLURL 2,7 2,9 3 3,1 3,1 3 3,1 0 UFCUFC 10 16 18 18 15 17 19
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,6 URLURL 2,7 2,9 3,1 3,1 3,2 3 3
0 UFCUFC 21 22 17 20 19 17 18
R S IR S I R + MR + M R + MR + M URLURL URLURL UFCUFC
CURVAS DE CRECIMIENTO CURVAS DE CRECIMIENTO P e n i c i l l i u m s p . P e n i c i l l i u m s p . Sobre refresco de mango UHT(31)Sobre refresco de mango UHT(31)
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,4 URLURL 5,4 5,3 5,3 5,3 5,5 5,5 5,5 0 UFCUFC 67 83 64 79 45 91 86
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,5 URLURL 5,6 5,4 5,3 5,3 5,6 5,5 5,4 0 UFCUFC 41 100 68 86 66 75 62
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,6 URLURL 6 6 5,8 5,8 5,8 5,7 5,7 0 UFCUFC 19 19 16 28 13 20 20
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,6 URLURL 6 6 5,8 5,8 5,8 5,8 5,9 0 UFCUFC 19 20 21 18 14 27 17
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,3 URLURL 5,5 5,8 5,9 5,4 5,7 5,8 5,7 0 UFCUFC 10 20 21 17 33 37 40
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,3 URLURL 5,7 5,8 6 6,1 5,9 5,8 5,9 0 UFCUFC 10 12 18 22 16 15 16
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,3 URLURL 5,7 5,8 6 6,1 5,9 5,8 5,9 0 UFCUFC 11 15 15 10 9 13 18
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,9 URLURL 5,9 5,9 6,1 6,1 6,3 6 6,1 0 UFCUFC 12 9 18 15 21 10 18
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,9 URLURL 5,9 5,9 6,1 6,1 6,3 6 6,1 0 UFCUFC 13 18 15 20 21 11 15
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 6,1 URLURL 6,1 6,1 6,1 6,1 6,2 6 6,1 0 UFCUFC 7 6 1 4 7 1 1
CURVAS DE CRECIMIENTO CURVAS DE CRECIMIENTO P e n i c i l l i u m s p P e n i c i l l i u m s p sobre refresco de sobre refresco de durazno (10)durazno (10)
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5 URLURL 4,9 5 5,2 5,2 5,3 4,2 4,6 0 UFCUFC 78 98 86 84 85 92 96
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,1 URLURL 4,2 5 5,2 5,2 5,3 3,5 5 0 UFCUFC 93 81 86 77 69 92 85
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,2 URLURL 4,3 5,1 5,2 5,2 5,3 4,5 4,9 0 UFCUFC 84 66 89 102 66 64 68
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,1 URLURL 4,5 5,1 5,2 5,2 5,3 4,1 5,1 0 UFCUFC 74 89 57 79 94 70 84
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5 URLURL 4,4 5,1 5,2 5,2 5,3 4 4,9 0 UFCUFC 106 84 83 90 102 67 74
CURVAS DE CRECIMIENTO CURVAS DE CRECIMIENTO L a c t o b a c i lL a c t o b a c i l l u s s p l u s s p sobre Bebida de Malta (10)sobre Bebida de Malta (10)
BM S IBM S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,2 URLURL 2,4 2,5 2,2 2,3 2,1 2,2 2,4 0 UFCUFC 26 24 32 25 24 28 30
BM S IBM S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,4 URLURL 2,6 2,6 2,1 2,3 2 2,1 2,2 0 UFCUFC 28 21 25 35 33 32 34
BM S IBM S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,2 URLURL 2,6 2,3 1,8 1,9 2,2 2 2,1 0 UFCUFC 28 28 32 34 28 30 31
BM S IBM S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,6 URLURL 2,6 2,5 1,9 2,2 2,4 2,3 2,3 0 UFCUFC 28 29 23 34 26 24 27