Detección de inestabilidad de microsatélites mediante secuenciación de nueva generación S.J. Salipante, S.M. Scroggins, H.L. Hampel, E.H. Turner y C.C.

Detección de inestabilidad de microsatélites mediante secuenciación de nueva generación

S.J. Salipante, S.M. Scroggins, H.L. Hampel, E.H. Turner y C.C. Pritchard

Septiembre de 2014

www.clinchem.org/content/60/9/1192.full

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IntroducciónIntroducción La inestabilidad de microsatélites (MSI) es un fenotipo molecular de importancia

clínica usado en la evaluación de tumores.

Proporciona información sobre pronóstico, opciones terapéuticas y evaluación de riesgo de cáncer familiar.

La MSI se relaciona habitualmente con el cáncer colorrectal pero está presente en otros tipos de cáncer.

Definida por la presencia de nuevos alelos de microsatélites que son más grandes o más pequeños que los observados en el tejido de estirpe germinal emparejado.

Causada por la regulación incorrecta del sistema de reparación de los errores de emparejamiento (MMR).

Las mutaciones en MLH1, MSH2, MSH6, EPCAM o PMS2 son comunes en las condiciones de predisposición al cáncer hereditario.

La metilación del promotor de MLH1 es común en la enfermedad esporádica.

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Métodos de detección actualesMétodos de detección actuales La detección de inestabilidad por RCP en marcadores de

microsatélites informativos (MSI-PCR) es el principal método basado en ADN de uso clínico actual.

El número reducido (habitualmente 5) de marcadores de microsatélites de mononucleótidos que usan productos y cebadores marcados con fluorescencia se analizan mediante electroforesis capilar.

La MSI se diagnostica si al menos 2 de 5 marcadores son inestables.

Desventajas:

Requiere tejido normal emparejado Requiere interpretación manual subjetiva

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PreguntaPregunta

¿Pueden usarse los datos de secuenciación de nueva generación (NGS) como un diagnóstico clínico de la MSI?

La NGS se está usando cada vez más en la oncología molecular.

Debido a la prevalencia de las causas epigenéticas de la MSI, no se pueden observar simplemente las mutaciones que causan el fenotipo.

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Método (mSINGS)Método (mSINGS)1. Examen de microsatélites de monocucleótidos capturados de forma incidental durante el

enriquecimiento de copia del ADN.1. Habitualmente ADN intergénico o intrónico.

2. Establecimiento de estadísticas "de referencia" para la cantidad de fragmentos observados en cada locus de una población de muestras estables de microsatélites.

1. Incluso las muestras estables presentarán longitudes de fragmentos múltiples detectables debido al artefacto de "tartamudeo" - superposición de plantillas durante la RCP.

2. Cálculo del valor promedio y SD para la cantidad de fragmentos en cada locus.

3. Secuenciación del ADN tumoral mediante captura de genes dirigidos.

4. Evaluación de cada locus en comparación con el valor de referencia. 1. Recuento de la cantidad de fragmentos diferentes.2. Si es considerablemente mayor ( > valor inicial + 3 SD) que la cantidad de fragmentos de

referencia, se puntuará al locus como inestable.

5. Interpretación de la fracción de locus inestables para deducir la condición de la MSI.

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Figura 1. Detección de inestabilidad de microsatélites mediante MSI-PCR y secuenciación de ADN de nueva generación. La electroforesis capilar representativa es el resultado de la MSI-PCR (izquierda) y los "electroferogramas virtuales" de datos de secuenciación de ADN de nueva generación (derecha). La longitud (eje x) y abundancia relativa (eje Y) de las repeticiones de variantes están graficados. Las columnas representan los locus individuales y muestran datos emparejados de muestras con valores de MSI estables (superior) y muestras con valores de MSI inestables (inferior). Se muestran los diferentes locus de microsatélites para la MSI-PCR y secuenciación de ADN de nueva generación y no son directamente comparables.

MSI-PCR en comparación con mSINGSMSI-PCR en comparación con mSINGS

Electroferogramas de MSI-PCR representativosElectroferogramas de MSI-PCR representativos

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Datos de la pruebaDatos de la prueba Captura de exomas (44 Mbs, 30,000 genes).

Tipos de cáncer colorrectal de The Cancer Genome Atlas (Red de Investigación del Atlas del Genoma del Cáncer, TCGA).

2,957 locus incluidos.

ColoSeq (1.4 Mbs, 50 genes completos con cierta secuencia complementaria). Tumores colorrectales, de endometrio, ovario, mama y próstata. 146 locus incluidos.

UW-OncoPlex (0.85 Mbs, 194 exones de genes e intrones determinados). Tumor de colon, endometrio, pulmón, mama, ovario, melanoma y otros

tumores. 15 locus incluidos.

Valor de referencia establecido para cada análisis mediante los datos de ADN de sangre periférica (valor de MSI negativo, constitucionalmente).

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Figura 2. La fracción de locus de microsatélites inestables identificados mediante la secuenciación de nueva generación predice la condición de la MSI. La fracción de locus de microsatélites inestables (superior) y la distribución acumulativa de dicha fracción (inferior) se muestran para los diseños de captura de genes dirigidos por A. captura de exomas, B. ColoSeq y C. UW-OncoPlex. Los resultados están estratificados por la condición de MSI-PCR convencional y la fracción promedio de locus inestables está indicada mediante una línea horizontal continua. El umbral usado para interpretar la condición de la MSI está indicado con una línea entrecortada.

ResultadosResultados

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Exome = ExomaFraction Unstable Loci By NGS = Fracción de locus inestables mediante NGSAll Data = Todos los datosMSI Positive = Valores de MSI positivosMSI Negative = Valores de MSI negativosSpecimen Count = Recuento de muestras

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ResultadosResultados

Tabla 1. Sensibilidad y especificidad diagnósticas de los perfiles de NGS para la detección de MSI mediante mSINGS. Se muestran los resultados para cada uno de los tres análisis considerados en este estudio, así como en los datos agregados. Solo se encontró un resultado positivo falso y un resultado negativo falso (ambos en el diseño de captura ColoSeq).

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Tabla 1. Sensibilidad y especificidad diagnósticas de perfiles de NGS para la detección de MSI mediante mSINGS.

Perfil de captura Cantidad de locus Sensibilidad,a cantidad de resultados positivos por mSINGS/cantidad de resultados positivos por MSI-PCR (% [95 % ICb])

Especificidad,a cantidad de resultados negativos por mSINGS/cantidad de resultados negativos por MSI-PCR (% [95 % IC])

Exoma      ColoSeq      UW-OncoPlex      Combinación      

a Los cálculos se realizaron conforme a la suposición de la MSI-PCR como método de referencia. Solo se incluyó el subgrupo de 108 de las 324 muestras totales analizadas que presentaban datos de MSI-PCR de referencia.b Todos los IC se calcularon con el método Clopper-Pearson (exacto).

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Figura 3. Correlación cuantitativa de resultados de secuenciación de nueva generación y MSI-PCR. La fracción de marcadores de microsatélites inestables según lo determinado por la secuenciación de nueva generación está graficada con relación a la fracción de marcadores inestables.

ResultadosResultados

Fracción de marcadores inestables mediante NGS

Fracción de marcadores inestables mediante MSI-PCR

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Conclusiones y posibles ventajasConclusiones y posibles ventajas La mSINGS puede usarse para detectar el fenotipo molecular de la MSI

sin consideraciones especiales sobre el diseño de captura de genes.

La mSINGS proporciona una caracterización tumoral más integral a partir de los datos de NGS.

Comparación con MSI-PCR Proporciona información cuantitativa digital para la

identificación de locus inestables. Valores de corte estadísticos en lugar de cualitativos para la

inestabilidad. Permite el análisis de una cantidad mucho mayor de

microsatélites que las pruebas de MSI convencionales. Puede eliminar la necesidad de material normal emparejado.

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