DIRECCIÓN GENERAL DE SANIDAD VEGETAL Dirección del Centro Nacional de Referencia Fitosanitaria Área de Desarrollo, Validación de Protocolos y Diagnóstico Protocolo de Diagnóstico para la Detección de Globodera rostochiensis mediante PCR cuantitativa (qPCR) Elaborado por M.C. Liliana Elizabeth Ronces Frutos Revisado por M.C. José Manuel Cambrón Crisantos M.C. José Gustavo Torres Martínez Autorizado por M.C. José Abel López Buenfil Datos de Control Revisión Fecha de Elaboración Laboratorio Nº de páginas 00 Octubre de 2016 Desarrollo, Validación de Protocolos y Diagnóstico 30
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Detección de Globodera rostochiensis - gob.mx · raíces y reduce el suministro de nutrientes y agua a los tallos y hojas de las plantas. También se observa clorosis en el follaje,
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Protocolo de Diagnóstico
para la
Detección de Globodera rostochiensis
mediante PCR cuantitativa (qPCR)
Elaborado por
M.C. Liliana Elizabeth Ronces Frutos
Revisado por
M.C. José Manuel Cambrón Crisantos
M.C. José Gustavo Torres Martínez
Autorizado por
M.C. José Abel López Buenfil
Datos de Control
Revisión Fecha de
Elaboración Laboratorio Nº de páginas
00
Octubre de 2016
Desarrollo,
Validación de
Protocolos y
Diagnóstico
30
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TABLA DE CONTENIDO
ÍNDICE DE FIGURAS
ÍNDICE DE TABLAS
I. ANTECEDENTES
Información taxonómica
Hospedantes
Ciclo de Vida
Dispersión
Síntomas
II. IMPORTANCIA
III. TÉCNICAS DE DETECCIÓN
IV. PROCEDIMIENTO PARA EL DIAGNÓSTICO
1. Toma y envio de muestra
2. Recepción y almacenamiento del material
3. Extracción de ADN
a) Extracción de ADN a partir de quistes
b) Extracción de ADN a partir de juveniles J2
4. Amplificación de Ácidos Nucleicos
5. Resultados
6. Confirmación de resultados
V. DESTRUCCIÓN DE LA MUESTRA
VI. RECOMENDACIONES DE TRABAJO
VII. REFERENCIAS
VIII. ANEXOS
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ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Prevalencia y distribución mundial del nemátodo dorado de la papa (G.
rostochiensis).
Figura 2. Ciclo de Vida de G. rostochiensis.
Figura 3. Hembras de G. rostochiensis en raíces infectadas de papa.
Figura 4. Cultivo de papa mostrando síntomas de la infección por G. rostochiensis.
Figura 5. Resultados de la amplificación de una muestra positiva a G. rostochiensis
mediante qPCR.
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Secuencia de la sonda y oligonucleótidos usados para la amplificación de
G. rostochiensis
Tabla 2. Concentraciones para la mezcla de reacción para qPCR
Tabla 3. Condiciones de termociclaje para qPCR.
Tabla 4. Condiciones de termociclaje para la PCR punto final.
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I. ANTECEDENTES
El Nemátodo Dorado de la papa, nombre común con el que se conoce a Globodera
rostochiensis, forma parte, junto con Globodera pallida, del complejo de nemátodos
formadores de quistes en papa (PCN por las siglas en inglés de Potato Cyst
Nematodes). Es un endoparásito sedentario que ocasiona problemas a nivel mundial
en solanáceas, sobre todo el cultivo de papa Solanum tuberosum L. (Núñez et al.
2003)
Se considera originario de Sudamérica, específicamente de la Cordillera de los Andes,
que incluyen Perú, Chile y Bolivia, al sur del lago Titicaca (Mugniéry, 1999). Se cree que
el nemátodo fue llevado a Europa en el siglo XVI, pero fue hasta el siglo XVIII cuando
se diseminó debido al incremento en el uso de variedades mejoradas de papa
(OIRSA, 2015). Según lo reportado por la EPPO en 2016, G. rostochiensis tiene una
amplia distribución geográfica en todos los continentes (figura 1).
En México, este organismo fue detectado por primera vez en 1971 en un lote de
producción de papa en el estado de Nuevo león (Leo, 1972) y después apareció en
los municipios de Saltillo y Arteaga, Coahuila, impidiendo la comercialización de la
papa como semilla, ocasionando pérdidas económicas considerables en los
productores. Hasta 2009, el nemátodo se encontraba distribuido oficialmente en
nueve Estados de la República (Guanajuato, Nuevo León, Hidalgo, Tlaxcala, Puebla,
Veracruz, Estado de México y Ciudad de México) (SENASICA, 2013).
De acuerdo a la normatividad fitosanitaria mexicana, G. rostoshiensis es considerada
plaga P2/P9 presente solamente en algunas áreas y sujeta a control oficial (NOM-025-
FITO-2000).
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Figura 1. Prevalencia y distribución mundial del nemátodo dorado de la papa (G. rostochiensis).
EPPO, 2016
Información Taxonómica
Los nemátodos del quiste de la papa pertenecen a la clase Nematoda. El sistema de
clasificación tradicional del nemátodo dorado está basado en la anatomía y
morfología de los especímenes. Adicionalmente, existe una nueva clasificación
basada en su filogenia que considera las propiedades del gen 16S del ARN ribosomal.
Anatomía y morfología (Siddiqui,
2000)
Reino: Animalia
Phyllum: Nematoda
Clase: Secernentea
Orden: Tylenchida
Familia: Heteroderidae
Género: Globodera
Especie: G. rostochiensis
16S del ARNr (De Ley et al., 2006)
Reino: Animalia
Phyllum: Nematoda
Clase: Chromadorea
Orden: Rhabditida
Familia: Meloidogynidae
Género: Globodera
Especie: G. rostochiensis
Hospedantes
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Los hospederos de este nemátodo son especies de cultivos y malezas de la familia
Solanaceae, como papas, tomate, pimentón, berenjena, tabaco, entre otras.
Algunos híbridos de Solanum spp y especies silvestres del género Solanum son
hospedantes, como: S. aviculare, S. gilo, S. indicum, S. marginatum, S. nigrum, S.
quitoense, S. dulcamara, S. rostratum, S. triflorum, S. elaeagnifolium, S. xantii, S.
integrifolium y S. Sarachoides, así como cuatro especies del subgenero Lycopersicon
(OIRSA, 2015, EPPO, 2016).
Ciclo de vida
El ciclo de vida de los nemátodos formadores de quistes comienza en primavera,
cuando la eclosión de los huevos se induce por estímulo de los exudados radiculares
del hospedante (INIA, 2016) (figura 2).
La fase infectiva es el segundo estadio juvenil (J2), el cual, al salir del huevo, es atraido
por los exudados radiculares y llega al hospedante . Los juveniles utilizan su estilete
para penetrar mecánicamente a las raíces y migrar a la vasculatura, donde se
convierten en endoparásitos sedentarios obligados (Davis et al., 2004).
Al pasar al tercer y cuarto estadio, los nemátodos se alimentan del periciclo, la
corteza y la epidermis de la raíz (Nicol et al., 2011, OIRSA, 2015). La disponibilidad de
alimento define el sexo de la población. Si el alimento es abundante y existen pocos
nemátodos, la población está constituida principalmente por hembras. Por el
contraio, cuando hay escases de alimento y un alto número de nemátodos,
predominan los machos (Franco, 1986).
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Figura 2. Ciclo de vida de G. rostochiensis. A) En primavera, cuando las condiciones ambientales son
óptimas, los huevos eclosan y se liberan los juveniles; B) Los juveniles penetran la raíz del hospedero y
se movilizan al interior de estas para comenzar a alimentarse; C) Después del apreamiento, las hembras
se adhieren al tejido para alimentarse y formar los huevos; D) Al final de la temporada, los quistes que
contienen los huevos son liberados al suelo, donde pueden permanecer viables por muchos años.
Modificado de INIA, 2016
Durante el cuarto estadio, las hembras maduras son esféricas, mientras que los
machos son vermiformes. Las hembras incrementan su tamaño, rompen la superficie
de la raíz y exponen sus cuerpos esféricos dejando la cabeza dentro de la raíz. Los
machos son atraídos por las hembras y ocurre la reproducción sexual y la fase de
producción de huevos (Brodie et al., 1993).
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Al alcanzar la madurez, la cutícula de las hembras se endurece y forma una capa
dura externa o quiste que le sirve para proteger los huevos. Cuando la hembra muere,
la cutícula de su cuerpo esférico cambia químicamente y el color que era blanco o
amarillo se torna marrón. La hembra muerta se convierte en un quiste duro, resistente
a las condiciones ambientales, que puede permanecer latente en el suelo hasta por
30 años conteniendo huevos viables (CABI, 2016, INIA, 2016, Mimee et al. 2015).
Dispersión
El nemátodo dorado de la papa es incapaz de desplazarse por sí solo a grandes
distancias debido a que no posee los medios naturales para hacerlo, por lo que se
considera que su dispersión es pasiva. El pequeño tamaño de los quistes facilita la
diseminación del nemátodo, ya que estos son llevados fácilmente de un lado a otro
en la tierra adherida a los tubérculos, maquinaria, herramientas o cualquier material
que implique traslado de suelo (INIA, 2016, CABI, 2016)
El movimiento de semilla-tubérculo, plántulas y suelo que estén contaminados con
este nemátodo y el movimiento de implementos agrícolas, contenedores y agua de
riego en campos infectados con G. rostochiensis, pueden influir en la diseminación de
los quistes de áreas infectadas hacia áreas libres (SENASICA, 2013).
Síntomas
Los nemátodos del quiste de la papa no causan síntomas aéreos inmediatamente,
por lo que pueden permanecer por años en el suelo sin que se detecte su presencia
(Mimee et al. 2015)
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La principal característica del ataque de estos nemátodos es la presencia de
pequeños cuerpos blancos, que corresponden a las hembras en proceso de
madurez, y de pequeños quistes en forma de globos (445 + m de largo por 382 + 61
m de ancho, en promedio) adheridos a las raíces y a la superficie de los tubérculos
(Brodie et al., 1993). El color de los quistes varía dependiendo de la madurez de la
hembra: al principio parecen perlitas blancas y poco a poco se tornan dorados,
anaranjados y finalmente cafés (figura 3) (INIA, 2016).
Figura 3. Quistes de G. rostochiensis en raíces de papa infectada.
Créditos: Central Science laboratory, York, GB.
Cuando las poblaciones de nemátodos son bajas no se observan síntomas específicos
que se puedan asociar directamente a la enfermedad, por el contrario, pueden ser
confundidos con síntomas de deficiencia de agua o algún nutriente (SENASICA, 2013,
OIRSA, 2015).
A medida que la población de nemátodos aumenta, los síntomas se hacen más
evidentes. En general, se produce una disminución en el desarrollo e inhibición en el
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crecimiento de las plantas (Bello et al., 2005). El nemátodo extrae los nutrientes de las
raíces y reduce el suministro de nutrientes y agua a los tallos y hojas de las plantas.
También se observa clorosis en el follaje, marchitez y, en casos de poblaciones muy
altas del nemátodo, muerte del cultivo (figura 4) (Bello et al., 2005, INIA, 2016). Ello se
traduce en una disminución en el rendimiento y, en consecuencia, pérdidas
económicas.
Los síntomas en campo son no-específicos. Se observa la presencia de manchones
en el cultivo que se extienden con el tiempo hasta generalizarse al total de la parcela.
Estos manchones pueden ser confundidos con un exceso de herbicidas, fitotoxicidad,
etcétera (Mackesy et al. 2014).
Figura 4. Cultivo de papa mostrando síntomas de la infección por G. rostochiensis.
Se aprecia la marchitez y clorosis del follaje, mismos que dan pie a los manchones
que se extienden a lo largo de los cultivos. Créditos: UNECE, 2016
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II. IMPORTANCIA
G. rostochiensis es uno de los principales problemas fitosanitarios de la papa a nivel
mundial, considerándose una amenaza en la producción de este cultivo. Se
considera una fuente limitante para la producción agrícola, ocasionando pérdidas
económicas importantes en las regiones donde se encuentra presente (Marks y
Brodie, 1998, Mackesy et al. 2014).
El incremento continuo de la población de G. rostochiensis en los suelos infectados se
debe a su alto índice de reproducción, a la capacidad de permanecer viable en el
suelo hasta por tres décadas en ausencia del hospedante y a la facilidad de ser
dispersado a través del suelo adherido a implementos agrícolas y material
propagativo (Nicol et al. 2011).
El daño causado por este nemátodo se relaciona con el número de huevos por
unidad de suelo y se refleja en el tamaño del tubérculo producido. Su impacto se
manifiesta en la disminución del rendimiento de cultivo, los altos costos en el control,
manejo y erradicación del patógeno, disminución en la rentabilidad de los campos
afectados, restricción o cierre de mercados y restricciones cuarentenarias impuestas
al país con presencia del nemátodo (SENASICA, 2013, CABI, 2016).
III. TÉCNICAS DE DETECCIÓN
Durante años, los métodos tradicionales de taxonomía clásica han sido empleados
para determinar la identidad de los nemátodos formadores de quistes. Los buenos
resultados obtenidos con estas metodologías dependen, en gran medida, de contar
con personal con amplias habilidades en nematología así como de la inversión de
mayor cantidad de horas-hombre.
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Sin embargo, la gran similitud morfológica existente entre G. rostochiensis y G. pallida
ha impulsado el desarrollo de técnicas bioquímicas que permitan diferenciar estas
dos especies (Schots et al., 1990, Karssen et al., 1995). Por otra parte, la
implementación de metodologías complementarias más versátiles y rápidas, como el
análisis de material génico mediante técnicas moleculares, ha solucionado los
problemas de ambigüedad en la identificación, además de agilizar el diagnóstico y
favorecer el incremento de la robustez y confiabilidad de los resultados (Carta y
Handoo, 2005).
Por lo general, la discriminación molecular de G. rostochiensis y G. pallida se realiza
mediante la amplificación de las regiones del espacio inter transcrito (ITS, por sus siglas
en inglés) y la posterior digestión enzimática de los productos de amplificación
(Skantar et al., 2011). Actualmente, el SENASICA cuenta con un protocolo de
diagnóstico para nemátodos en papa que combina los métodos taxonómicos con el
uso de marcadores moleculares y el análisis de polimorfismos de longitud de
fragmentos de restricción (RFLP´s) (SENASICA, 2014).
Dentro de las técnicas moleculares, la Reacción en Cadena de la Polimerasa
cuantitativa (qPCR) ha ido ganando aceptación en la identificación de patógenos
debido a que, en comparación con la PCR convencional, es un método de
detección rápido, róbusto y más sensible que permite monitorear el producto de
amplificación conforme transcurre la reacción, sin que sea necesario el empleo de
geles de agarosa para saber si la reacción fue exitosa, además de que reduce el
riesgo de contaminación (Tamay de Dios, 2013).
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Por esta razón, en el presente protocolo se propone el diagnóstico de Globodera
rostochiensis mediante qPCR con ayuda de oligos específicos que permiten su
diferenciación de G. pallida así como de otras especies del género Globodera
similares morfológicamente. De este modo, se generará un diagnóstico acertado y
eficiente en un menor tiempo, lo que se verá reflejado en la oportuna toma de
decisiones relacionadas a la regulación de este patógeno en México.
IV. PROCEDIMIENTO PARA EL DIAGNÓSTICO
1. Toma y envío de muestra
Todas las muestras para la detección del nematodo dorado de la papa deberán ser
enviadas al Centro Nacional de Referencia Fitosanitaria (CNRF) debidamente
etiquetadas y acompañadas por el formato de solicitud de diagnóstico (Ver Anexo
1).
La toma y envío de las muestras se deberá realizar con apego al procedimiento
especificado en el apéndice final de la NOM-040-FITO-2002 que establece los
requisitos y especificaciones para la producción y movilización nacional de papa
comercial (Anexo 2).
2. Recepción y almacenamiento del material
El almacenamiento y tratamiento dado a las muestras depende de la naturaleza del
sustrato (suelo, raíces, tubérculos) que se pretende analizar.
El diagnóstico molecular requiere que se cuente con los especímenes aislados,
preferentemente hembras, ya que estas han mostrado ser más adecuadas para la
identificación morfológica.
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Los métodos de aislamiento a partir de un sustrato dado se pueden consultar en el
Protocolo de Diagnóstico para Nemátodos de Importancia Cuarentenaria en papa
para México (SENASICA, 2014).
3. Extracción de ADN
El protocolo de Diagnóstico para Nemátodos del SENASICA propone dos técnicas de
extracción de material génico para estos patógenos, uno para quistes y otro para
especímenes individuales (Juveniles J2). En ambos casos es necesaria la observación
previa al microscopio, ya sea para confirmar que los quistes contengan masas de
huevecillos o para realizar el análisis morfométrico y así asegurar una extracción
exitosa.
El procedimiento para llevar a cabo la extracción de ADN se encuentra detallado en
el anexo 3. Para más información, consultar el Protocolo de Diagnóstico para
Nemátodos de Importancia Cuarentenaria en papa para México (SENASICA, 2014).
4. Amplificación de ácidos nucleicos
El diagnóstico molecular de G. rostochiensis se emplea, generalmente, como un
método complementario al diagnóstico taxonómico. Sin embargo, también puede
ser utilizado como único método de diagnóstico cuando las condiciones de las
muestras así lo requieran, siempre y cuando se cuente con material génico de buena
calidad a concentraciones adecuadas.
En este protocolo se propone la identificación del nemátodo dorado de la papa
mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa cuantitativa (qPCR), la cual
requiere el uso de oligonucleótidos específicos que generen amplicones de un
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tamaño que oscile entre 100-150 pb y un sistema reportero de fluorescencia para
detectar los productos amplificados (sonda). Los oligonucleótidos y sonda específicos
para el nemátodo dorado de la papa fueron diseñados por Nakhla y colaboradores
(2010) a partir de la región ITS1 y se describen en la tabla 1.
Tabla 1. Secuencia de la sonda y oligonucleótidos usados para la amplificación de