Structura moleculei de imunoglobulin
Despre antigene
Antigene moleculare De cele mai multe ori, pentru antigenele
proteice, nu se face distincia dintre epitopii inductori ai
rspunsului imun i gruparea carrier, deoarece proteinele posed un
spectru continuum de determinani antigenici, ce corespund unor
secvene discrete ale suprafeei moleculare localizate n zonele cele
mai expuse contactului cu receptorii sistemului imunitar.
Antigenitatea moleculelor globulare este determinat adeseori, de
configuraia lor spaial, rezultat din plierea tridimensional. Pentru
cele mai multe proteine globulare (mioglobina, hemoglobina,
lizozimul, ribonucleaza etc.), aproape toi determinanii antigenici
sunt conformaionali, adic sunt rezultatul plierii spaiale a
moleculei, iar alii sunt secveniali, adic sunt reprezentai de o
secven particular de aminoacizi. Moleculele proteice fibrilare
(cheratina, colagenul, fibroina) au configuraii mai simple dect
cele globulare, catenele lor fiind aranjate sau rsucite pe o singur
dimensiune. Determinanii antigenici ai acestor proteine sunt
secveniali, formai din 3-6 aminoacizi.
Sistemul imunitar al unui organism recunoate un numr limitat de
determinani antigenici ai unei molecule proteice. Epitopii,
conformaionali sau secveniali, care stimuleaz rspunsul imun in
vivo, iar in vitro induc proliferarea limfocitelor, se numesc
epitopi dominani. O parte a determinanilor antigenici ai unei
molecule native, cel mai adesea, sunt neimunogeni (imunosilenioi),
nefiind accesibili sistemului imunitar al organismului, dar se pot
exprima ntr-un anumit set de condiii de imunizare (gazd, adjuvant
etc.). Acetia sunt epitopi interni ai proteinelor globulare. Un
determinant intern poate fi silenios n molecula nativ, dar devine
imunostimulator dup clivarea enzimatic a moleculei, in vivo sau in
vitro.De aceea, M. Sela a recomandat utilizarea termenului de
grupare imunodominant, pentru epitopul sau epitopii care se exprim
n anumite condiii(gazd, adjuvant, cale de administrare) i determin
specificitatea rspunsului imun.
Fig.2.Epitopii dominani sunt localizai la suprafaa moleculei
globulare. Epitopii subdominani devin accesibili dup clivarea
moleculei n etapa prelucrrii n macrofag, iar epitopii criptici sunt
inaccesibili fenomenului de recunoatere imunitar.
Imunogenitatea antigenelor proteice se modific n diferite
condiii.
Denaturarea moleculelor native sub aciunea agenilor chimici i a
cldurii, modificarea configuraiei moleculei sub aciunea agenilor
reductori sau hidroliza enzimatic, modific imunogenitatea.
Anticorpii specifici fa de proteina nativ precipit slab sau de loc
proteinadenaturat termic sau chimic.
Formaldehida i glutaraldehida sunt ageni de legare ncruciat a
moleculelor proteice, constituind reele multimoleculare stabile.
Aceti ageni produc denaturarea proteinelor i modific funciile celor
cu activitate biologic (toxine, enzime). Astfel, exotoxinele
tratate cu formaldehid, i pierd proprietile toxice, dar rmn
imunogene. Formaldehida i glutaraldehida se folosesc pentru
conservarea antigenelor cu greutate molecular mic (peptide), dar
sunt mai puin utilizate pentru conservarea proprietilor antigenice
ale moleculelor mari. Agenii chimici de legare ncruciat modific
imunogenitatea moleculelor proteice prin schimbarea conformaiei
moleculei i mascarea epitopilor sau prin modificarea chimic a
aminoacizilor epitopului.
Denaturarea semnific deplierea structurii rsucite a moleculelor
proteice i are loc prin modificarea pH, prin nclzire, prin
reducerea legturilor S-S sub aciunea ureii i a
beta-mercaptoetanolului sau a acidului performic. Prin denaturare,
proteina i pierde nu numai funcia biologic, dar i modific
specificitatea antigenic. De exemplu, cele 4 puni S-S ale RN-azei,
ntre resturile de cistin, sunt reduse de -mercaptoetanol i
transformate n 8 resturi de cistein, cu pierderea total a activitii
enzimatice. Anticorpii fa de RN-aza pancreatic bovin nativ nu
precipit moleculele de RN-az denaturat prin reducerea legturilor
S-S. Invers, anticorpii fa de RN-aza denaturat, nu precipit RN-aza
nativ. Modificarea specificitii anticorpilor sugereaz c reducerea
legturilor S-S determin pierderea epitopilor conformaionali.
Proteinele denaturate reverseaz greu la forma nativ, chiar prin
restabilirea condiiilor de mediu.
Hidroliza enzimatic modific configuraia spaial a moleculelor
proteice native i diminu imunogenitatea lor, cu att mai mult cu ct
fragmentele rezultate au dimensiuni mai mici. Prin clivare
enzimatic se anuleaz imunogenitatea epitopilor conformaionali i se
relev epitopi care n molecula nativ au statutul de epitopi
criptici.
O atenie special s-a acordat studiului imunogenitii unor
proteine ale cror proprieti biologic-active sunt uor de evaluat:
enzime, inhibitori enzimatici, hormoni proteici, toxine,
imunoglobuline (n calitatea lor de antigene), proteine ale capsidei
sau ale nveliului viral. Enzimele sunt antigenice, indiferent de
originea lor. Reacia moleculelor de enzim cu anticorpii specifici a
constituit o modalitate de determinare a poziiei epitopilor.
Anticorpii fa de diferii epitopi ai moleculei de enzim modific n
grade foarte diferite activitatea ei catalitic. Dac anticorpii sunt
specifici fa de epitopi localizai la nivelul situsului activ al
enzimei, molecula i pierde activitatea fa de substrat, deoarece
legarea anticorpilor la situsul activ inhib competitiv legarea
moleculelor de substrat. Gradul de inhibiie a activitii enzimatice
este cu att mai accentuat, cu ct molecula este mai mare. Efectul
inhibitor al anticorpilor nu se produce dac enzima a legat deja
substratul specific. Dac gruprile determinante de specificitate ale
moleculei de enzim sunt situate n afara situsului catalitic,
activitatea enzimei este parial inhibat, datorit modificrilor
conformaionale care survin dup reacia antigen-anticorp, sau rmne
intact. Foarte rar, complexul enzim-anticorp are un efect catalitic
superior, comparativ cu enzima nativ.
Hormonii sunt molecule slabimunogene, datorit uniformitii
relative a structurii lor chimice n regnul animal. Anticorpii
specifici fa de majoritatea hormonilor proteici se obin prin
asocierea lor prealabil cu adjuvantul Freund. Imunogenitatea
hormonilor este ntr-o relaie direct cu gradul deosebirilor chimice
existente ntre hormonul exogen i hormonul produs de organismul
receptor. Consecina este sinteza anticorpilor antihormon.
Proprietile antigenice ale insulinei sunt bine cunoscute,
datorit utilizrii clinice a hormonului. Molecula de insulin este
alctuit din dou catene polipeptidice, cu un numr total de 51 de
aminoacizi: 21 ai catenei A i 30 ai catenei B. Cele dou catene sunt
reunite prin puni S-S. Structura moleculelor de insulin de la
diferite specii este foarte asemntoare, 47 din cei 51 de aminoacizi
fiind identici. Deosebirile se gsesc n catena A pentru aminoacizii
8, 9 i 10 (la bovine Ala, Ser, Val,la om sunt Thr, Ser, Ile, iar la
ovine Ala, Gly, Val). In catena B, diferena este limitat la
aminoacidul C-terminal. Aceste mici diferene ale secvenei de
aminoacizi nu modific funcia hormonului. De aceea, insulina,
indiferent de provenien, este la fel de eficient pentru tratamentul
diabetului uman. Micile diferene de secven, n general, nu sunt
sesizate de organismul receptor. Totui, dup administrare prelungit,
organismele receptoare cu reactivitate imunitar mai nalt,
sintetizeaz anticorpi anti-insulin.
Polizaharidele, dei au complexitate structural relativ mare,
condiionat de multitudinea posibilitilor de legare a atomilor de
carbon, sunt molecule slabimunogene n stare nativ, comparativ cu
proteinele. Antigenitatea lor este conferit de succesiunea unitilor
componente, de configuraia spaial a moleculei i de greutatea
molecular. Cele cu greuti mai mici de 50 kD nu sunt imunogene.
Polizaharidele sunt antigene cu epitopi secveniali repetitivi i cel
puin uneori, n funcie de originea polizaharidului i de specia
imunizat, sunt imunogeni.
Din punctul de vedere al structurii moleculare, se disting dou
tipuri de polizaharide: a) cele care au o caten central pe care se
inser ramificaiile laterale; b) polizaharide lipsite de o caten
central, iar ramificaiile sunt dispuse aleatoriu, fr nici o
simetrie. Rolul catenelor centrale n conferirea imunogenitii este
controversat, dar ramificaiile laterale au o importan deosebit
pentru determinarea specificitii antigenice a polizaharidelor. Din
punctul de vedere al compoziiei chimice pot fi homo- sau
heteroplizaharide, iar n ceea ce privete sarcina, pot fi neutre sau
ncrcate. Oligo- i polizaharidele pot dobndi o structur teriar
(globular). Uneori, configuraia spaial a polimerului glucidic este
determinant pentru specificitatea sa antigenic. Schimbrile
conformaionale ale polizaharidelor se produc mai uor dect ale
proteinelor, pentru c au bariere energetice sczute. Pentru
polizaharide, denaturarea este practic necunoscut, ceea ce le
confer stabilitate. Dac imunogenitatea polizaharidelor native este
slab, adeseori ele se comport ca haptene, adic devin antigenice dup
cuplarea cu un purttor proteic, rezultnd lectine, cu o foarte larg
distribuie n lumea vie. In calitate de haptene, polizaharidele au
proprietatea de specificitate, adic se combin cu anticorpii
complementari fa de complexul glicoproteic.
Din motive de ordin practic, cele mai studiate polizaharide din
punct de vedere antigenic sunt cele de origine bacterian: dextranul
i polizaharidele capsulare.
Dextranii sunt polimeri ramificai de glucoz, resturile glucozil
fiind unite mai ales prin legturi de tip 1-6, dar n funcie de
specia productoare, punctele de ramificaie ale catenelor polimere
pot fi 1-2, 1-3 sau 1-4.
Dextranii sunt sintetizai n special de unele bacterii lactice,
din zaharoz, dup reacia:
Dextranaz
N(zaharoz)---------------(Glucoz)n+ (Fructoz)n
Dextranii au greuti moleculare foarte diferite (pn la 106D), n
funcie de gradul de polimerizare. Nu sunt imunogeni i de aceea se
folosesc ca nlocuitori ai plasmei. Prin transfuzii repetate cu
soluii de dextran la om i prin injectare repetat la oarece, s-au
sintetizat anticorpi antidextran. Specificitatea anticorpilor
antidextran este foarte nalt. In serul animalelor imunizate cu
dextrani s-au detectat dou tipuri de anticorpi: unii specifici fa
de resturile de glucozil legate 1-2 i alii specifici fa de
resturile de glucozil legate 1-3, ce nu dau reacii ncruciate, dei
deosebirea dintre cele dou categorii de molecule de dextran const
numai n modul diferit de legare a resturilor de glucozil ntre
ele.
Polizaharidele capsulare se pot gsi fie subforma moleculelor
libere (solubile), fie subform corpuscular (ataate celulelor
bacteriene capsulate).
Variaiile biochimice ale polizaharidelor capsulare, determinate
de compoziia glucidic a catenei, de secvena monomerilor sau de
modul de legare a lor n caten, confer tulpinilor bacteriene,
specificitate antigenic de tip. La Str. pneumoniae s-au identificat
peste 80 de tipuri antigenice ale polizaharidelor capsulare. In
compoziia lor intr hexoze, pentoze, derivaii lor aminai, metilai
etc. Specificitatea antigenic a polizaharidelor capsulare depinde
att de compoziia chimic, ct i de succesiunea monomerilor n catena
polizaharidic. Ca vaccinuri, polizaharidele induc starea de
toleran.
n stare purificat sunt molecule neimunogene, datorit uniformitii
lor structurale n lumea vie. Injectarea lor la animale nu induce
sinteza anticorpilor. Acizii nucleici nativi sunt conjugate
nucleoproteice, n care acizii nucleici au rolul de hapten.
Majoritatea epitopilor conjugatului sunt conformaionali. O fracie
din anticorpii anti-conjugat se combin cu acizii nucleici.
Anticorpii anti-acizi nucleici se combin cu acizii nucleici n stare
pur, indiferent de provenien. Proteinele asociate acizilor nucleici
confer o nou specificitate antigenic i determin sinteza
anticorpilor care se combin cu proteina puttor.
Experimental, anticorpii anti-acizi nucleici se obin pe una din
urmtoarele ci:
1. Imunizarea cu bacteriofagi din seria T par (T2, T4, T6),
supui ocului osmotic. ADN al acestor fagi se deosebete de ADN din
celulele eucariote, prin prezena 5-hidroxi-metilcitozinei
glicozilate, n locul citozinei. Anticorpii au specificitate fa de
bazele glicozilate, ceea ce explic lipsa reaciilor ncruciate cu ali
acizi nucleici.
2. Imunizarea cu ribosomi din celulele vegetale sau animale.
Anticorpii sintetizai reacioneaz cu ARN de origine bacterian,
vegetal sau animal, precum i cu polinucleotidele sintetice(poli-A,
poli-C, poli-U), dar nu reacioneaz cu ADN nativ i nici cu ADN
denaturat.
3. Imunizarea cu conjugate hapten-protein, n care haptena este
reprezentat de baze azotate, ribonucleozide, dezoxiribonucleozide,
nucleotide, dinucleotide i trinucleotide. Anticorpii sintetizai
reacioneaz att cu haptena ct i cu ADN nativ sau denaturat.
4. Imunizarea cu complexe formate din acizi nucleici i albumin
metilat. Cele dou molecule formeaz un complex necovalent, datorit
interaciei dintre gruprile negative ale acizilor nucleici i cele
pozitive ale proteinei. Anticorpii sintetizai reacioneaz cu
complexul molecular, cu proteina, cu acidul nucleic nativ i
denaturat de diferite origini.
5. Anticorpii anti-acizi nucleici se gsesc n sngele pacienilor
cu lupus eritematos diseminat (LED).
Anticorpii sintetizai fa de acizii nucleici cu rol de haptene n
conjugatele cu proteine nu au specificitate, deoarece precipit ADN
monocatenar, ARN de diferite origini, poliribonucleotide i acizii
nucleici dublu catenari.
Lipidele sunt molecule neimunogene n stare nativ, dar se pot
cupla cu proteinele i n conjugatul format au rolul de haptene. Din
punct de vedere imunologic, cele mai importante lipide sunt
fosfatidele (sfingomielina i cefalina) i
glicosfingolipidele(galactocerebrozida).
O hapten lipidic cu o importan practic deosebit este
cardiolipina, din cordul mamiferelor. In sngele indivizilor
infectai cu T. pallidum se gsesc anticorpi care reacioneaz cu
cardiolipina nalt purificat (reacie ncruciat), extras din cordul
bovin.
Un alt antigen lipidic este antigenul Forssman, inductor al
sintezei anticorpilor hemaglutinani i n prezena complementului,
hemolitici.
Studiul imunogenitii lipidelor a fost ngreunat de
insolubilitatea lor n ap. Problema reactivitii anticorpilor cu
antigenele lipidice a fost depit parial, prin utilizarea lipidelor
auxiliare (lecitina i colesterolul) n suspensia antigenic.
Disponibilitatea liposomilor a permis studiul imunogenitii
lipidelor asociate cu membranele.
Haptene Haptenele(haptein, grec = a apuca) sunt substane chimice
naturale sau de sintez, cu molecul mic, a cror imunogenitate este
condiionat de cuplarea cu o molecul purttor, dar i pstreaz
proprietatea de specificitate, adic reacioneaz cu anticorpii
specifici a cror sintez a fost indus de haptena conjugat cu o
molecul cu rol de purttor.
Denumirea de hapten a fost introdus de Landsteiner pentru a
caracteriza din punct de vedere funcional un extract alcoolic de
rinichi de cal, neimunogen ca atare pentru iepure, dar capabil s se
combine cu anticorpii sintetizai dup imunizarea iepurelui cu
extractul alcoolic de rinichi de cal, cuplat cu o molecul purttor.
El a propus ca n categoria haptenelor s fie cuprins orice substan
natural sau sintetic, cu greutate molecular mic sau mare, care n
form nativ nu poate s induc un rspuns imun detectabil, dar dobndete
capacitatea imunogen, dup cuplarea sa in vivo sau in vitro, cu o
molecul purttor cu greutate molecular mare. Conjugatul este
imunogen nu numai n raport cu epitopii moleculei purttor, ci i cu
epitopul haptenei.
Din punct de vedere funcional, haptenele s-au numit jumti de
antigene, deoarece au numai una din cele dou proprieti eseniale ale
antigenelor: nu sunt imunogene, dar i pstreaz proprietatea de
specificitate. De aceea, termenul antigenic nu este sinonim cu cel
de imunogenic. Haptena este un antigen, dar n forma sa nativ, nu
este imunogen.
n general, haptenele sunt molecule mici, dei uneori,
macromoleculele pot funciona ca haptene. Extractul alcoolic de
rinichi de cal este o hapten complex. Haptenele simple sunt
reprezentate de polinucleotide, alcooli, formaldehida, unele
medicamente etc.
Utiliznd haptenele simple, prin reacii de cuplare cu o molecul
purttor s-au obinut antigene artificiale. Haptena din complexul
molecular are rolul gruprii determinante de specificitate. Studiul
imunogenitii conjugatelor hapten-molecul purttor a permis
determinarea mrimii gruprilor determinante de specificitate ale
antigenelor i indirect, determinarea situsului de combinare a
anticorpilor. Pe aceiai cale s-a evaluat specificitatea, afinitatea
i heterogenitatea anticorpilor. Haptenele au fost folosite pentru
studiile de cristalografie cu raze X a unui complex
antigen-anticorp.
Haptene autocuplante sunt molecule cu greutate molecular mic, a
cror particularitate const n aceea c, dup injectare, n organism se
combin spontan cu proteinele tisulare i formeaz conjugate
hapten-protein, in vivo. Conjugatele hapten-protein induc sinteza
anticorpilor i determin procese de hipersensibilitate sau iniiaz
maladii autoimune. Astfel se comport derivaii dinitrofenolului
substituii cu clor sau fluor, unii produi de degradare a
penicilinei.
Antigene corpusculare
Antigenele bacteriene sunt fie solubile (eliminate n mediul
extracelular), fie corpusculare (legate de celul). Din prima
categorie fac parte exotoxinele i polizaharidele capsulare libere,
iar din cea de a II-a, antigenul somatic O (endotoxina bacteriilor
Gram negative), antigenele polizaharidice din glicocalix,
flagelina, pilina, acizii teichoici, mureina etc.
Antigenele eritrocitare sunt glicoproteine ale suprafeei
eritrocitare, cu determinism biochimic cunoscut, n sistemul A, B,
0. Glicoproteinele eritrocitare de grup sanguin se gsesc i pe
suprafaa celulelor tisulare, dar i n secreiile exocrine (saliv, suc
gastric etc.), la circa 75% dintre indivizi, denumii secretori.
Glicoproteinele din secreii sunt hidrosolubile i studiul lor a fost
mai uor dect al moleculelor eritrocitare.
Gruprile glucidice ale glicoproteinelor membranei eritrocitare
au rol dominant n determinarea specificitii de grup sanguin, aa cum
au evideniat studiile de digestie enzimatic controlat. Eritrocitele
tuturor grupelor sanguine au un precursor antigenic comun antigenul
H (codificat de gena H), bine exprimat pe suprafaa antigenelor de
grup 0 i n cantiti progresiv descrescnde pe hematiile de grup A, Bi
Ab.
Specificitateaantigenic de grup 0 este conferit de L-fucoz.
Grupul A are o gen ce codific sinteza glicozil-transferazei, enzim
ce adaug N-acetil-D-galactozamina, la galactoza preterminal a
moleculei H. De aceea, specificitatea antigenic a eritrocitelor de
grup A este conferit de trizaharidul N-acetil-galactozamin,
galactoz i L-fucoz:
N-acetil galactozamin ( 1-3) Gal R(R = restul catenei
polizaharidice)
1-2
Fuc
Indivizii de grup B au o gen ce adaug D-galactoza (n loc de
N-acetil galactozamin) la galactoza preterminal a moleculei H, avnd
un determinant antigenic format din dou resturi terminale de
D-galactoza i L-fucoza.
Fig. 3.Oligozaharidele cu rol de epitopi determinani ai grupelor
sanguine ABO. Oligozaharidul este ancorat n membrana eritrocitului
prin intermediul sfingomielinei, denumit ceramid. 85% din indivizii
umani secret substanele de grup sanguin n saliv. La indivizii
secretori, oligozaharidelesunt prezente sub forma conjugatelor
cupolipeptidele codificate de genele secretoare (dup Roitt,
1997).
Prezena restului de fucoz (adic antigenul H) este esenial pentru
expresia epitopilor A i B. Gena H i antigenul su lipsesc la
fenotipul Bombay. De aceea, transferazele A i B nu pot aduga
glucidele specifice la restul Gal al polizaharidului i antigenele
de grup A i B nu sunt exprimate.
Exprimarea antigenelor ABO pe hematii poate fi modificat prin
tratamentul in vitro cu glicozidaze: o -glicozidaz (extras din
bobul de cafea verde) poate cliva restul de Gal de pe hematiile de
grup B i le convertete n hematii de grup 0, ce pot rmne funcionale
dup transfuzia la subieciide grup 0.
Antigenele de histocompatibilitate (descrise de J. Dausset,
1958) sunt molecule de suprafa ale majoritii esuturilor. Din punct
de vedere biochimic, ele sunt strict specifice fiecrui organism
uman i animal i confer individualitate biochimic proprie fiecrui
organism. Se numesc i antigene de transplantare, deoarece, dup
grefarea unui esut sau a unui organ, moleculele de
histocompatibilitate se comport ca antigene i declaneaz rspunsul
imun al organismului receptor, care determin respingerea
grefei.
Antigenele individuale de histocompatibilitate se evideniaz prin
reacia de respingere a grefei. n funcie de raportul genetic dintre
donor i receptor, antigenele de histocompatibilitate aparin
urmtoarelor categorii:
1) autoantigenele includ antigenele proprii de
histocompatibilitate, care, n condiii normale sunt tolerate de
sistemul imunitar. Sub aciunea unor factori fizici, chimici sau
biologici, antigenele de histocompatibilitate se modific devenind
autoantigene, generatoare ale conflictelor autoimune;
2) izoantigenele cuprind antigenele de transplantare comune
orga-nismelor identice din punct de vedere genetic, care aparin
unei linii genetic pure (inbred). Verificarea puritii genetice a
unei populaii de organisme se face prin transplantul de piele. Dac
grefa este acceptat, organismele respective aparin aceleiai linii
inbred. Termenii izoantigen i inbred nu au coresponden pentru
populaia uman;
3) aloantigenele (alos = altul) includ molecule care, dup
injectare declaneaz rspunsul imun la organisme ale aceleiai specii,
dar diferite genetic, de organismul donor. Aloantigenele sunt
inegal rspndite la indivizii unei specii i induc rspunsul imun la
organismele care nu posed antigenul respectiv. Aloantigenele se
evideniaz dup imunizarea unui organism, cu o suspensie celular
provenit de la organisme ale aceleiai specii, dar aparinnd unui
alotip diferit;
4) heteroantigenele (xenoantigene, xenos = strin) includ
molecule care se gsesc n/pe celulele tuturor indivizilor unei
specii i care se comport ca antigene fa de organismele altei
specii. Heteroantigenele se evideniaz prin sinteza anticorpilor fa
de antigenele celulelor provenite de la un organism al unei specii
diferite.
Celulele unei specii diferite aduc n organismul receptor nu
numai heteroantigene, ci i aloantigene i chiar autoantigene. De
aceea injectarea unui heteroantigen este una dintre cele mai
utilizate metode pentru a induce sinteza autoanticorpilor.
Antigenele de organ sunt molecule specifice care confer
particularitile biochimice i funcionale ale celulelor unui organ.
De exemplu, proteinele hepatice sau ale glandei mamare difer de
proteinele esutului renal al aceluiai organism.
Antigene artificiale a) Conjugatele hapten-protein au fost
utilizate de Landsteiner, n studiile cu privire la mecanismele
rspunsului imun. In conjugate, haptenele ndeplinesc rolul de
epitopi (grupri determinate de specificitate), iar mole-culele
proteice au rolul de carrier. Rspunsul imun nu este orientat strict
fa de epitopii haptenici, ci i fa de determinani antigenici ai
gruprii carrier.
Cuplarea hapten-purttor necesit existena unei grupri reactive a
haptenei, care s se lege covalent cu gruprile funcionale ale
purttorului, cu condiia pstrrii integritii funcionale a celor doi
reactani. Haptenele se pot cupla cu purttori foarte diveri, dar
proteinele naturale (albumina, globulinele) furnizeaz conjugate
foarte imunogene.
Landsteiner a cuplat amino-benzen-sulfonatul cu molecule
proteice, prin reacia de diazotare i a obinut azoproteine:
Dup cuplarea haptenei cu Tir, His sau Lys din structura unei
proteine, rezult un antigen artificial care induce formarea a dou
categorii de anticorpi cu specificiti diferite, dup cum reacioneaz
cu haptena, sau cu molecula purttor.
Conjugatele azoproteice au permis studiul influenei configuraiei
spaiale a haptenei, asupra specificitii antigenice. Gruparea
sulfonat a fost legat n poziia orto, meta sau para a haptenei
aminobenzen. Antiserurile obinute au specificitate fa de fiecare
izomer. Izomerul meta al aminobenzen-sulfonatului, cuplat cu
proteina, pstreaz capacitatea de a precipita cu anticorpii
specifici fa de proteina nativ, n timp ce conjugatele cu izomerii
orto- i para- dau reacie foarte slab de precipitare. Concluzia este
c izomerii de poziie induc modificri sterice (conformaionale) ale
haptenei.
Conjugatele hapten-protein se pot obine prin reacia de iodurare.
Proteinele puternic iodurate i modific specificitatea antigenic.
Ele induc sinteza anticorpilor care dau reacii ncruciate de
precipitare cu proteinele iodurate heterologe. Semnificaia este c
prin iodurare, proteinele i pierd specificitatea antigenic. Toate
proteinele iodurate induc sinteza anticorpilor fa de o grupare
iodurat, n special fa de tirozina iodurat, indiferent de
specificitatea gruprii purttor.
O alt reacie de obinere a conjugatului hapten-protein este cea
de substituie nucleofil. Cele mai folosite haptene sunt
2,4-dinitrofenolul(DNP) i 2,4,6-trinitrofenolul(TNP).
Mecanismul molecular al cuplrii este urmtorul: un atom de H din
gruparea OH-, NH2+sau S-SH a proteinei, este nlocuit de gruparea
haptenic prin eliminarea apei. Proteina pierde electroni, iar
nucleul benzenic i accept. Gruprile donoare de electroni sunt OH-,
NH2+, S-SH. Gruprile DNP i TNP sunt cuplate cu proteina purttor sub
forma 2,4-dinitrobenzen-sulfonatului de Na, a
2,4,6-trinitrobenzen-sulfonatului de Na sau subforma derivailor
halogenai.
Reacia dintre o protein i 2,4-dinitrobenzen-sulfonatul de sodiu
ilustreaz mecanismul atacului nucleofilic, reacie n care proteina
cedeaz electroni, iar nucleul benzenic i accept.
b) Conjugatele protein-protein se obin prin intermediul agenilor
bifuncionali de legare: diizocianaii i carbodiimidele. Deoarece
gruprile ciano au reactivitate diferit, reacia de cuplare se
realizeaz n trepte. De exemplu, gruparea din poziia 4 a
toluilen-diizocianatului este mai reactiv dect gruparea ciano din
poziia 2. Aceasta permite ca una dintre proteine s se cupleze n
poziia 4, iar ulterior, ntr-o nou etap a reaciei, cea de a II-a
protein se va cupla la gruparea ciano din poziia 2:
Carbodiimidele, utilizate ca ageni bifuncionali pentru cuplarea
proteinelor, sunt considerate anhidride simetrice ale ureii:
H2N C NH2 HOHOHN = C =NH((H2N C 4 N
UreeCarbodiimida simetricCianamida asimetric
Carbodiimidele pot fi substituite simetric sau asimetric cu
molecule proteice:
R1N= C = NR1 sau R1N = C = NR2.
Agenii bifuncionali de cuplare permit obinerea conjugatelor
proteice (conjugate anticorpi-feritin, insulin-albumin), dar se
folosesc i ca mediatori ai legrii diferitelor molecule proteice pe
suprafaa eritrocitelor.
Marcajul cu feritin este deosebit de important din punct de
vedere practic, deoarece se folosete pentru evidenierea
electrono-optic, la nivelul membranei, a diferitelor molecule
proteice.
c) Conjugatele protein-suport insolubil se obin prin cuplarea
proteinelor cu un suport insolubil, prin reacia de diazotare, prin
intermediul carbodiimidelor sau al BrCN. Ca suporturi insolubile se
folosesc derivai celulozici: sephadex, sepharoza, agaroza etc.
Legarea proteinei de suport, prin reacia de diazotare, se face prin
intermediul tirozinei, lizinei, histidinei, triptofanului sau
argininei.
Conjugatele anticorpi-suport insolubil se numesc imunosorbeni i
sunt folosii cu o eficien deosebit pentru purificarea proteinelor
dintr-un amestec, datorit specificitii lor de combinare cu
anticorpii corespunztori, fixai ntr-o coloan de material inert.
Antigenul complementar specificitii de legare a anticorpului fixat
n coloan, se leag necovalent de imunosorbent, dup care poate fi
eluat cu un agent chimic.
Anticorpii pot fi imobilizai pe un suport insolubil, prin
tratamentul cu un agent de legare ncruciat (glutaraldehid), dar
multe din situsurile reactive pt fi denaturate sau rmn ascunse.
Fig. 4.Principiul funcional al imunosorbenilor utilizai n
cromatografia de afinitate. Coloana conine sefaroz, pe care sunt
fixate moleculelede anticorp. Amestecul de antigene este trecut
prin coloan, unde va fi reinut numai antigenul care recunoate
specific anticorpul fixat. Cel mai bun suport de imobilizare este
agaroza, un polizaharid obinut prin fracionarea agarului. Agaroza
este rezistent la aciunea degradativ a enzimelor bacteriene i a
agenilor chimici i poate fi regenerat. Este disponibil subforma
sferelor poroase hidratate, cu diametrul de 40-300 m i conine 2-8%
agaroz n soluie apoas.
In coloana de imunosorbent se pot fixa nu numai anticorpii, ci i
antigenele sau chiar celule intacte.
Imunosorbenii se folosesc n activitatea de cercetare i n clinic,
pentru prepararea unor produse biologice i a medicamentelor.
Antigene sintetice Homopolimerii nu sunt imunogeni, cu excepia
poli-L-Pro, poli-L-Glu, poli-L-Arg, poli-L-Lys. Copolimerii formai
din doi aminoacizi nu sunt totdeauna imunogeni, dar cei rezultai
prin polimerizarea a trei aminoacizi diferii sunt totdeauna
imunogeni. Cu ct compoziia lor este mai heterogen, imunogenitatea
este mai accentuat. Prezena aminoacizilor aromatici confer o anumit
rigiditate a epitopilor i implicit, o imunogenitate superioar.
Pentru a fi imunogeni, copolimerii trebuie s fie catabolizai de
aparatul enzimatic al celulelor care prelucreaz i prezint
antigenul. Polipeptideleformate din D-aminoacizi sunt slab
imunogene, datorit incapacitii organismului de a cataboliza
polimerul. Polipeptidele sintetice s-au dovedit a fi foarte utile n
studiile de imunochimie, cu privire la:
- determinarea mrimii gruprii determinante de specificitate i
indirect, a situsului de combinare a anticorpilor specifici;
- rolul dimensiunilor moleculei asupra proprietilor de
imunogenitate;
- rolul configuraiei spaiale a moleculei n conferirea proprietii
de imunogenitate;
- identificarea epitopilor secveniali i conformaionali.
Determinanii antigenici De cele mai multe ori, antigenele sunt
macromolecule complexe sau chiar celule ntregi, dar rspunsul imun,
dup injectarea lor n organism, este orientat predominant fa de
situsuri discrete, strict limitate ale antigenului, denumite grupri
determinante de specificitate (gds), situsuri antigenice,
determinani antigenici sau epitopi.
Epitopul este regiunea limitat a antigenului care induce un
rspuns imun specific, se combin cu situsul activ al moleculei de
anticorp i determin specificitatea reaciei antigen-anticorp.
Antigenele proteice prezint cea mai mare diversitate de epitopi,
att n privina compoziiei chimice, ct i a configuraiei spaiale.
Studiile de cristalografie cu raze X permit identificarea atomilor
individuali ai unei molecule i determinarea mobilitii lor, exprimat
n factori de temperatur atomic. Factorii de temperatur ridicat
corespund regiunilor moleculare cu mobilitate nalt (regiuni calde).
In molecula proteic, epitopii corespund zonelor moleculare cu o
mobilitate nalt a atomilor. La temperatura biologic, aceste secvene
necesit cantiti mici de energie, pentru a trece dintr-o conformaie
n alta. Invers, regiunile moleculare cu mobilitate atomic redus au
factori termici de valoare sczut (regiuni reci) i necesit o
cantitate mai mare de energie pentru schimbarea conformaiei.
Adeseori, epitopii antigenici sunt localizai n regiunile calde ale
moleculei.
Capacitatea unei regiuni a moleculei de antigen de a funciona ca
epitop (adic de a stimula rspunsul imun) se numete imunopoten.
Mrimea gruprii determinante de specificitate s-a apreciat
indirect prin determinarea mrimii haptenei capabil s umpl complet
situsul de combinare al anticorpului. n acest scop s-a utilizat
sistemul dextran-antidextran, ntr-o reacie de precipitare.
Dextranul cu greutate molecular de 50 kD este imunogen i prin
injectare repetat la iepure, se obine serul imun anti-dextran.
Artificial se prepar oligozaharide cu dimensiuni controlabile.
Reacia de precipitare dextran-anticorpi specifici este inhibat
progresiv de oligozaharidul de glucoz i este complet n prezena
hexazaharidului. Oligomerul cu 6 resturi de glucoz corespunde celui
mai bun ligand care se cupleaz cu anticorpii anti-dextran (ligandul
este orice molecul capabil s formeze un complex cu o alt molecul).
Heptazaharidul, ca i oligozaharidele cu mai puin de 6 resturi de
glucoz inhib mai puin eficient reacia de precipitare a sistemului
dextran-antidextran.
Fig. 5.Oligozaharidul format din 6-7 resturi de glucoz, blochez
cu cea mai mare eficien, reacia de precipitare dintre dextran i
anticorpii specifici antidextran. Oligozaharidele mai mari sau mici
nu se combin eficient cu anticorpii i inhib ntr-o msur progresiv
mai mic reacia de precipitare cu dextranul. Cercetri similare s-au
fcut cu homopolimeri de aminoacizi (poli-Lys, poli-Ala), legai de
proteine purttor. Serul imun obinut pe iepure, fa de aceste
conjugate, conine predominant anticorpi specifici fa de haptena
homopolimeric. Reacia de precipitare dintre serul specific i
conjugatul hapten-protein, este inhibat de pentamerul de alanin,
ceea ce denot c acesta se leag cu cea mai mare afinitate de situsul
de combinare al anticorpului. Pentamerul corespunde mrimii
epitopului antigenic al conjugatului i reflect, indirect, mrimea
situsului de combinare al anticorpilor specifici.
n concluzie, mrimea unui epitop polizaharidic corespunde la 6-8
uniti monomerice, iar pentru antigenele proteice, epitopul are 4-6
aminoacizi.
Valena antigenului s-a definit convenional prin numrul de
epitopi ai unui antigen. Numrul de epitopi ai unei molecule
antigenice variaz n raport cu mrimea i complexitatea sa
structural.
Valena se evalueaz prin numrul moleculelor de anticorp care
reacioneaz cu o molecul de antigen. Pentru evaluarea numrului de
epitopi ai unui antigen, trebuie avut n vedere c molecula de
anticorp este bivalent (leag doi epitopi), dar i faptul c un
antiser nu conine anticorpi fa de toi epitopii unui antigen.
Studiile privind reacia antigen-anticorp in vitro, au condus la
concluzia existenei a trei tipuri de valene antigenice
(epitopi):
-valenele funcionale conformaionale sunt conferite de epitopii
conformaionali, situai la suprafaa moleculei native de antigen i
sunt accesibili sistemelor imunitare de recunoatere specific a
moleculei. Numrul lor este proporional cu greutatea molecular a
antigenului i este dependent de complexitatea conformaional a
moleculei. Un situs antigenic, teoretic, s-ar gsi la fiecare cteva
mii de daltoni;
-valenele funcionale interne sunt reprezentate de epitopi
interni, care, n molecula nativ sunt inaccesibile sistemului
imunitar. Ele devin funcionale, in vivo, dup degradarea parial a
moleculei, n celulele care prelucreaz antigenul;
-valene nefuncionale, reprezentate de epitopi criptici care nu
devin funcionale dup prelucrarea antigenului in vivo, dar se pot
releva dup clivarea enzimatic in vitro a moleculei.
Numrul total al epitopilor unui antigen nu se cunoate, dar se
poate evalua cu aproximaie, dup degradarea parial a moleculei de
antigen. De exemplu, albumina seric bovin nativ are 6 situsuri
funcionale conformaionale. Dup scindarea enzimatic menajat in
vitro, rezult 9 fragmente peptidice, fiecare dintre ele dnd reacie
de precipitare cu serul anti-albumin nativ. Pentru ca reacia de
precipitare s aib loc, sunt necesari cel puin doi epitopi, ceea ce
nseamn c molecula de albumin seric bovin are cel puin 18 epitopi,
care devin funcionali dup scindarea enzimaticamoleculei i induc
sinteza anticorpilor specifici.
Efectul de carrier Antigenele prezint o dualitate funcional
evident, conferit de faptul c specificitatea rspunsului imun este
orientat predominant, dar nu exclusiv, fa de gruprile determinante
de specificitate. La rndul su, suportul macromolecular (carrier)
are proprietatea de imunogenitate, dar confer i un grad de
specificitate a rspunsului imun. Rezultatele experimentale cu
conju-gate hapten-protein (dinitrofenol-albumin seric) au evideniat
c n cazul n care suportul carrier este nonself, rspunsul imun este
mai intens. Antigenul artificial s-a obinut prin cuplarea DNP cu
albumina de oarece. Injectarea conjugatului la oarece induce un
rspuns imun slab, cu un titru sczut al anticorpilor
anti-DNP(anti-hapten). Conjugatul DNP-albumin seric bovin, injectat
la oarece, stimuleaz intens rspunsul imun primar anti-hapten, ceea
ce demonstreaz c gruparea carrier are rol modulator asupra
rspunsului imun.
Rolul gruprii carrier n reactivitatea imunitar a fost evideniat
prin evaluarea titrului anticorpilor dup stimularea secundar.
Animalele stimulate repetat cu haptena A, cuplat cu purttorul B,
produc un rspuns imun secundar intens, cu anticorpi anti-hapten i
anti-carrier. ns, n rspunsul imun secundar, dac stimularea s-a fcut
cu haptena A, cuplat cu un carrier diferit (C) titrul anticorpilor
anti-hapten nu crete. Acest fenomen curios s-a denumit efect de
carrier.
Un purttor eficient pentru stimularea rspunsului imun trebuie s
fie imunogenic, adic s stimuleze rspunsul celulelor T. Moleculele
neimunogene sunt purttori ineficieni ai haptenelor, pentru
stimularea rspunsului imun. Aceasta arat c mecanismele de
recunoatere pentru hapten i pentru gruparea purttor sunt
diferite.
Imunizarea cu conjugate hapten-carrier, a indus numai sinteza
anticorpilor specifici anti-hapten, dac purttorul a fost un antigen
T-dependent. Moleculele neimunogene nu au caliti de carrier pentru
haptene.
Efectul de carrier denot c haptena i epitopii purttorului sunt
recunoscui separat, de limfocitele B i respectiv T. Cele dou
subpopulaii de celule coopereaz pentru a induce sinteza
anticorpilor cu specificitate de hapten.Factorii care condiioneaz
imunogenitatea
Antigenul este o substan nonself, care, la contactul cu celulele
sistemului imunitar, declaneaz sinteza anticorpilor specifici i a
receptorilor celulari cu care se combin in vitro i in vivo.
Definiia este nesatisfctoare, pentru c se refer la ce face
antigenul, fr s-l defineasc n termeni proprii. Definirea complet a
antigenului este rezultatul nsumrii unei serii de proprieti,
fiecare dintre ele fiind o condiie necesar a imunogenitii, dar nu i
suficient.
Condiiile imunogenitii au fost deduse prin studii experimentale,
utiliznd antigene artificiale i sintetice.
1. Caracterul strin al moleculei este condiia major a
imunogenitii. O molecul nonself este cu att mai imunogen, cu ct
este mai diferit de moleculele organismului receptor. In esen,
caracterul nonself al unei molecule nu este strict dependent de
raporturile taxonomice ale organismului donor cu cel receptor de
antigen, ci este consecina deosebirilor de structur molecular.
Cele mai multe proteine ale unei specii sunt nonself pentru alte
specii, dar uneori, proteinele omologe ale unor specii sunt lipsite
reciproc de imunogenitate. De exemplu, hemoglobina de cal nu este
imunogen pentru iepure, dei celelalte proteine de cal sunt
imunogene. Caracterul nonself nu implic n mod obligatoriu existena
unor molecule cu totul noi, nentlnite la organismul receptor, ci
numai modificri minime ale moleculei, conferite de existena ctorva
aminoacizi diferii n anumite poziii ale catenei proteice. Pentru
restul secvenei, molecula nonself poate fi asemntoare proteinelor
proprii organismului receptor de antigen. Micile diferene de secven
a aminoacizilor, au rolul de epitopi. De regul, proteinele aprute
timpuriu n evoluie au un grad superior de asemnare chimic
interspecific i sunt slab imunogene pentru speciile nrudite (de
exemplu, albumina seric), iar cele aprute mai trziu (de exemplu,
globulinele serice) sunt mai heterogene i mai imunogene.
2. Mrimea moleculei influeneaz imunogenitatea moleculelor
nonself. Pentru a fi imunogen, o molecul trebuie s aib dimensiuni
care s depeasc un prag limit. Moleculele cu o bun imunogenitate
sunt mai mari de 10 kD. Cu ct o molecul este mai mare, cu att
numrul epitopilor si este mai mare. Secvenele de aminoacizi cu rol
de epitopi au ansa repetrii de mai multe ori ntr-o molecul mai
mare. Proteinele mari (de exemplu, ovalbumina 40 kD, albumina seric
- 70 kD, hemocianina 6000 kD) sunt foarte imunogene, iar cele cu
molecul mic (insulina 5,7 kD, histonele 6 kd, glucagonul 3,5 kD)
sunt puin imunogene. Glucagonul este cea mai mic molecul natural fa
de care s-au obinut anticorpi, iar cea mai mic molecul sintetic
imunogen este un polipeptid de 1,4 kD.
Pentru polizaharide, limitele minime pentru imunogenitate sunt
mai mari. Dextranii sunt antigenici dac au peste 50 kD, cu variaii
mari de rspuns imun de la o specie la alta (omul i oarecele rspund
bine, cobaiul foarte puin).
Moleculele mici neimunogene sau slab imunogene pot dobndi o
imunogenitate optim, dup adsorbia pe particule inerte de colodiu,
caolin sau de crbune. Acestea au rol de purttori i asigur creterea
taliei moleculare.
3. Complexitatea molecular. Dimensiunile mari ale unei molecule
nonself nu sunt totdeauna suficiente pentru a-i conferi
imunogenitate. De exemplu, moleculele de polimeri sintetici
(poli-acrilamida, nylonul) sunt foarte mari, fiind formate dintr-un
numr mare de monomeri repetitivi, dar nu sunt imunogene pentru c nu
au complexitatea molecular minim necesar.
Moleculele naturale, n special proteinele au un grad nalt de
complexitate, datorit diversitii monomerilor componeni. Fiecare tip
de molecul proteic are o configuraie tridimensional unic,
determinat de secvena specific de aminoacizi.
Proteinele globulare au cea mai mare complexitate antigenic,
derivat din configuraia lor teriar. Ele posed epitopi exprimai pe
suprafaa moleculei native, accesibili fenomenului de recunoatere de
ctre celulele sistemului imunitar i epitopi interni, care pot
stimula rspunsul imun, dup clivarea enzimatic a moleculei n
celulele specializate pentru prelucrarea antigenelor. De exemplu,
serul imun anti- albumin seric bovin precipit cu fiecare din cele 9
fragmente peptidice rezultate prin clivajul enzimatic al moleculei
native, ceea ce sugereaz c in vivo, molecula este scindat i astfel
se relev epitopi interni, fa de care se sintetizeaz anticorpi
specifici.
Complexitatea unei molecule nu depinde numai de diversitatea
monomerilor, ci i de secvena lor i de efectul secvenei asupra
structurii secundare, teriare i eventual quaternare a
moleculei.
4. Starea fizic a antigenului. Imunogenitatea unei molecule este
condiionat de o anumit rigiditate a epitopilor si. Lipsa rigiditii
ar explica imunogenitatea redus a gelatinei, o protein denaturat,
derivat din hidroliza colagenului, foarte bogat n glicocol
(21-35%).
n mod obinuit, rotaia liber a unei molecule are loc numai ntre C
i legtura peptidic. Glicocolul nurealizeaz ramificaii ale catenei
polipeptidice n poziia C , ceea ce face ca molecula de gelatin s
prezinte rotaii libere n jurul axului longitudinal. Gelatina are o
proporie foarte mic de aminoacizi aromatici (Tir, His), iar
cisteina i triptofanul lipsesc. LegareaL-Tir, n proporie de 2%
mrete gradul de imunogenitate a gelatinei. Complexul induce sinteza
anticorpilor care precipit gelatina nativ.
5. Solubilitatea. Condiia solubilitii unui antigen pentru a fi
imunogen este sugerat de urmtarele observaii:
-polimerii macromoleculari sintetici care nu sunt solubilizai,
adic nu sunt hidrolizai, sunt lipsii de imunogenitate;
-organismele cu echipamente enzimatice hidrolitice mai active
(oarece) elaboreaz un rspuns imun mai amplu fa de un antigen greu
solubil(de exemplu, polizaharidul de pneumococ), n raport cu
organismele care hidrolizeaz mai greu (de exemplu, iepurele);
-antigenele corpusculare (celule, virioni) devin imunogene dup
solubilizarea i eliberarea componentelor imunogene n macrofag, unde
are loc degradarea menajat a antigenelor.
Hidroliza enzimatic a antigenului nu este totdeauna o condiie
prealabil obligatorie a imunogenitii. Studiile cu antigene
sintetice au artat c, n momentul recunoaterii de ctre celulele
sistemului imunitar, o parte a epitopilor sunt intaci, identici cu
aceia ai moleculei native.
6. Accesibilitatea determinanilor antigenici. Pentru ca un
epitop s fie imunogen, trebuie s fie expus la suprafaa moleculei,
pentru a fi accesibil mecanismelor de recunoatere imunitar. De
exemplu, un polimer de L-Lys, cu rol de purttor pentru tripeptidul
Tir-Ala-Glu este imunogen. Dup mascarea epitopilor tripeptidici cu
catene de poli-Ala, molecula i pierde imunogenitatea. Fig. 6.Rolul
accesibilitii determinanilor antigenici n imunogenitate.
Copolimerul multicatenar format din acidul L-glutamic (G) i
tirozina (T), legat prin intermediul poliL-alaninei (A-A), de
purttorul polilizin este imunogen. Acelai copolimer, legat direct
depurttorul polilizin, dar mascat de polialanin, este
neimunogen.
7. Configuraia spaial a moleculei este un factor decisiv pentru
imunogenez. Studiile privind imunogenitatea antigenelor sintetice,
au evideniat c cel mai adesea, anticorpii se formeaz fa de o anumit
secven de aminoacizi, care are rol de epitop. Dar, uneori,
anticorpii sunt specifici fa de configuraia spaial a unui
determinant antigenic. Concluzia a reieit din specificitatea
distinct a anticorpilor fa de dou polipeptide sintetice cu aceiai
compoziie chimic, dar cu configuraii spaiale diferite. In primul
caz, determinantul antigenic este tripeptidul Tir-Ala-Glu, legat de
un polimer sintetic, cu rol de purttor. La iepure, se sintetizeaz
anticorpi specifici fa de tripeptidul Tir-Ala-Glu.
n al II-lea caz, prin polimerizarea tripeptidului se obine o
molecul cu structura periodic a secvenei Tir-Ala-Glu, care dobndete
configuraie -helical. Dup imunizarea iepurelui, se sintetizeaz
anticorpi care precipit moleculele cu structur spaial -helical, dar
nu precipit tripeptidul simplu. Pe baza acestor observaii, M. Sela
recunoate existena a dou tipuri de determinani antigenici:
-determinani secveniali, a cror specificitate este dat de
secvena subunitilor componente (aminoacizi, monozaharide),
indiferent de structura spaial a moleculei. Epitopii secveniali
sunt comuni pentru toate polipeptidele care au secvene de
aminoacizi identice sau asemntoare i existena lor este o surs a
reaciilor imune ncruciate;
Fig. 7.Tipuri de epitopi. Epitopi secveniali i conformaionali,
continui i discontinui. -determinani antigenici conformaionali, a
cror specificitate deriv din configuraia spaial a moleculei.
Epitopii conformaionali sunt de dou feluri: continui i discontinui.
Cei discontinui sunt formai din regiuni distincte ale moleculei,
care ajung n juxtapoziie cnd molecula se pliaz n configuraia sa
nativ.
Meninerea integritii determinanilor conforma-ionali este
condiionat de integritatea legturilor S-S. Dup fragmentarea
enzima-tic a moleculei, epitopii conformaionali discontinui i pierd
integritatea i semnificaia funcional, iar cei continui au o soart
variabil: i pierd sau i pstreaz configuraia avut n molecula
nativ.
Importana epitopilor conformaionali a fost evi-deniat pentru
molecula de lizozim din albuul de ou de gin. Bucla format de
aminacizii 64-80 este nchis de o legtur S-S ntre dou resturi de
cistein. Secvena buclei a fost sintetizat artificial i legat de
polimerul Ala-Lys, cu rol de carrier. Complexul format induce
sinteza anticorpilor laiepure, specifici fa de aceast secven, dar
dau reacie de precipitare i cu molecula nativ de lizozim.Fig.
8.Bucla format din aminoacizii 64-80 ai secvenei moleculei de
lizozim din albuul de ou, formeaz un determinant conformaional. n
general, anticorpii care se sintetizeaz fa de antigenele proteice
naturale au specificitate, n primul rnd, fa de epitopii
conformaionali i mai rar fa de cei secveniali, ceea ce denot c
sistemul imunitar recunoate molecula nativ sau regiuni ale ei, cu
configuraia spaial iniial.
n concluzie, studiul antigenelor sintetice a avut un rol decisiv
pentru definirea condiiilor de imunogenitate. Polizaharidele sunt
molecule cu o slab imunogenitate, corespunztoare unei complexiti
moleculare limitate. Acizii nucleici i lipidele sunt molecule
neimunogene n stare nativ, dar dup cuplarea cu un suport proteic,
ndeplinesc rolul de haptene i devin foarte imunogene. Din aceast
cauz, nucleoproteinele i lipoproteinele sunt antigene foarte
eficiente. Proteinele native sunt imunogene, dar pentru exprimarea
la un nivel superior a acestei proprieti, trebuie s ndeplineasc
condiiile enumerate. Acestea, luate n parte, sunt necesare, dar nu
suficiente. O bun imunogenitate este rezultatul cumulrii unui numr
ct mai mare de condiii.
Un antigen ideal trebuie s fie greu degradabil (pentru o
persisten ct mai lung n organism), s fie timodependent i s aib un
numr ct mai mare de semnale imunogene (epitopi), conectate ntr-un
ansamblu funcional, denumit imunon.Antigenele heterofile
Reaciile imune ncruciate pe care antigenele de tip Forssman le
dau cu serul imun obinut fa de unul din antigenele grupului se
explic prin asemnarea structurii chimice a acestor molecule. Cele
mai multe antigene heterofile sunt glicoproteine sau glicolipide, n
care gruprile glucidice au rolul de haptene. Componentele glucidice
ale antigenelor heterofile sunt foarte asemntoare din punct de
vedere chimic, chiar dac aparin unor organisme cu poziie sistematic
foarte diferit. Antigenul Forssman este un glico-sfingolipid, la
care determinantul antigenic este format din dou resturi de
N-acetil-galactozamin.
Polizaharidele antigenelor de tip Forssman, n stare purificat,
nu sunt imunogene, sunt rezistente la fierbere i chiar la
autoclavare.
Adjuvanii Substanele sau amestecurile de substane, care n
asociaie cu un antigen sau injectate simultan cu acesta, intensific
rspunsul imun specific fa de antigenul respectiv sunt denumite
adjuvani (adjuvere, latin = a ajuta). Punctul de plecare al
introducerii adjuvanilor n practica imunologic a fost un fapt de
observaie: dup asocierea unui vaccin bacterian celular, cu un
vaccin macromolecular (anatoxin), rspunsul imun antitoxin este mult
mai intens dect n cazul n care cele dou vaccinuri se administreaz
separat. Dup injectarea vaccinului celular anti-tifoparatific A i
B, mpreun cu anatoxina tetanic (TAB), titrul anticorpilor fa de
anatoxina tetanic este de 20-30 de ori mai mare dect n cazul
injectrii separate a anatoxinei tetanice. Explicaia acestui fenomen
a fost dat ulterior: la locul injectrii vaccinului, corpii celulari
bacterieni determin un proces inflamator, adic un aflux local de
celule efectoare ale rspunsului imun (limfocite, macrofage).
Macrofagele capteaz i fixeaz anatoxina ntr-un stoc, de unde este
eliberat treptat i astfel se prelungete durata de stimulare a
sistemului imunitar.
Cel mai cunoscut i folosit pentru studiul experimental al
imunogenitii antigenelor este adjuvantul Freund, o emulsiede ap n
ulei mineral de parafin. Antigenul se suspend n ap. Emulsia de ap n
ulei se realizeaz cu un emulgator care conine grupri lipofile i
hidrofile (lanolina, arlacel A). Acesta este adjuvantul Freund
incomplet. Dup adugarea celulelor omorte de M. tuberculosis, rezult
adjuvantul Freund complet. Principiul imunostimulator al celulelor
de M. tuberculosis este reprezentat de glicolipidele i
glicolipopeptidele(denumite ceruri) din structura peretelui
celular. Glicolipopeptidele sunt formate din acizi micolici
esterificai cu un polizaharid (arabinogalactan) ce conine arabinoz,
galactoz, manoz, la care se leag un fragment peptidic ce conine D i
L-alanin, acid D-glutamic, acid diaminopimelic.
Fig. 9.Reprezentarea schematic a interaciunii moleculelor
componente ale adjuvantului Freund.
Adjuvantul Freund determin urmtoarele efecte:
a) persistena antigenului n organism prin ntrzierea degradrii
sale i eliberarea treptat n circulaie;
b) picturile de emulsie vehiculeaz antigenul pe cale limfatic, n
tot organismul, inclusiv spre ganglionii limfatici, unde se va
declana rspunsul imun; c) adjuvantul Freund complet i incomplet fac
imunogene doze mici de antigene, care altfel nu ar fi imunogene i
mresc semnificativ titrul anticorpilor fa de oricare antigen.
Amestecul de adjuvant i antigen se administreaz subcutan sau
intradermic. Administrarea intravenoas anuleaz efectul
adjuvantului. Este posibil administrarea decalat la interval de
cteva zile (mai nti a adjuvantului), dac cele dou injectri se fac n
acelai loc.
Efectul stimulator al adjuvantului Freund este foarte intens
pentru dozele mici de antigen. Este foarte eficient n asociaie cu
antigenele proteice, stimulnd sinteza IgG. Utilizarea sa la om este
limitat de efectele secundare pe care le produce (artrita de
adjuvant).
Endotoxinele bacteriilor Gram negative (Salmonella, Brucella,
Bordetella etc.) au efect adjuvant. Ele sunt n acelai timp
adjuvani, antigene, toxine i factori pirogeni. Efectul maxim se
obine numai dac endotoxina se administreaz simultan sau la mai puin
de 6 ore dup injectarea antigenului. Nu se adaug vaccinurilor umane
pentru c produce febr.
Srurile de aluminiu (Al(OH)3, Al(SO4)2.12 H2O), fosfatul de
aluminiu) i cele de calciu au efect adjuvant, deoarece se combin cu
imunogenul i formeaz un complex insolubil la situsul subcutan sau
intramuscular al injectrii, mrind intervalul de timp n care
celulele imunitare pot fi activate. Se stimuleaz afluxul de
fagocite i funcia de fagocitoz.
Compuii aluminiului sunt singurii adjuvani acceptai n clinica
uman i veterinar, dei prezint unele dezavantaje: stimuleaz rspunsul
imun mediat humoral, dar nu i imunitatea mediat celular;
vaccinurile care conin compui ai Al nu pot fi conservate prin nghe
i nici liofilizate i de aceea necesit transport refrigerat.
Ali adjuvani acioneaz prin stimularea activitii enzimelor
lizosomale. Vitamina A i srurile de beriliu, de siliciu, srurile
quaternare de amoniu mobilizeaz macrofagele la locul injectrii i
stimuleaz activitatea lor fagocitar i degradativ.
Despre anticorpi
Structura moleculei de imunoglobulin Structura moleculei de
imunoglobulin (Ig) s-a stabilit prin analiza proteinelor omogene
secretate de plasmocitoame, cu metodologii complexe: biochimice,
analitice, cristalografia prin difracie cu raze X.
Unitatea structural de baz a moleculei de Ig estemonomerul.
Acesta este o unitate tetrapeptidic, format prin asocierea a dou
lanuri grele (H,Heavy = greu), fiecare avnd circa 450 de aminoacizi
i o greutate molecular cuprins ntre 50-76 kD i dou lanuri uoare
(L,Light = uor), fiecare avnd circa 216 aminoacizi i o greutate
molecular de 25 kD. Cele 4 catene polipeptidice sunt legate ntre
ele prin puni S-S i se rsucesc n spiral - att unul fa de altul, dar
i fiecare separat fa de propria-i ax, rezultnd o configuraie
tridimensional, stabilizat prin 16-24 legturi S-S i prin alte
interaciuni necovalente. Monomerul tetrapeptidic tridimensional are
form de T sau de Y.
n funcie de secvena aminoacizilor, fiecare lan polipeptidic este
alctuit din dou regiuni distincte:
a)regiunea constant(C ) corespunde jumtii C-terminale a celor 4
catene polipeptidice. Are o secven relativ uniform a aminoacizilor
i asigur unitatea structural i funcional a moleculei de Ig;
b)regiunea variabil(V) cuprinde o secven de circa 110 aminoacizi
n jumtatea N-terminal a celor 4 catene polipeptidice. Mrimea sa nu
este fix, deoarece intervin inserii sau deleii de 3-6 aminoacizi.
Regiunile variabile ale fiecrei perechi de catene formeazsitusul de
combinareal moleculei de Ig, care confer specificitate de legare cu
antigenul.
Variabilitatea maxima secvenei de aminoacizi a catenei L se
concentreaz n poziiile 24-34, 50-55, 89-97, iar a catenei H, la
secvenele30-36, 50-56, 86-91 i 95-100. Aceste secvene
formeazregiunile hipervariabilesauregiunile determinante de
complementaritate(RDC), fa de configuraia spaial a epitopului.
Aminoacizii acestor secvene intr n alctuirea situsului de combinare
al moleculei de Ig.
Secvenele relativ invariante se numesc regiuni cadru (RC) i
formeaz 80-85% din regiunea variabil a moleculei de Ig. Variaia
secvenei aminoacizilor la nivelul regiunilor cadru este limitat la
5%. Secvena regiunilor cadru i a celor determinante de
complementaritate alterneaz astfel: RC1, RDC1, RC2, RDC2, RC3,
RDC3, RC4, RDC4.
Aproape de jumtatea catenelor H se gsete o secven de circa 15
aminoacizi, n care sunt grupate toate resturile de cistein ce
formeaz puni S-S intercatenare. Aceast secven se numeteregiunea
balama. Este sensibil la aciunea proteazelor fiind clivat de
papain, pepsin etc. La IgM i IgE, regiunea balama lipsete, dar cea
omolog balamalei este clivat de proteaze. Regiunea balama
asigurflexibilitateamoleculei de Ig, permind mobilitatea
fragmentelor Fab, care, teoretic, pot forma unghiuri variabile,
ntre 0-180o, conferind moleculei o geometrie variabil. Cele 16-24
legturi S-S ale monomerului tetrapeptidic sunt constante ca numr i
localizare pentru diferitele clase de Ig. Se disting 3 categorii de
puni S-S:
- legturi intercatenare H-H sau L-H, ale unui monomer. Legturile
L-L s-au descris la IgA2i la proteinele Bence-Jones, care sunt
dimeri de lanuri L;
- legturi intracatenare, care determin structura teriar a
fiecrui lan polipeptidic.
- legturi intercatenare, ntre lanurile H ce aparin unor monomeri
diferii, la IgA2i IgM, care formeaz complexe moleculare
polimerice:
moleculei de Ig se formeaz prin plierea fiecreia din cele 4
catene polipeptidice i prin rsucirea lor n spiral. Domeniile sunt
regiuni globulare ale moleculei, legate ntre ele prin secvene
lineare scurte. Domeniile se pliaz ntr-o conformaie stabil,
conferit de secvena proprie de aminoacizi. Comparativ cu secvenele
lineare, domeniile pliate sunt mai rezistente la proteoliz.
Catena L are dou domenii: unul corespunztor regiunii variabile
(VL) i altul corespunztor regiunii constante (CL).
Catena H are 4 domenii: unul corespunztor regiunii variabile
(VH) i trei domenii ale regiunii constante: CH1, CH2, CH3.Fig.
11.a.Reprezentarea schematic astructurii primarea moleculei de
imunoglobulin.
Fig. 11.b.Localizarea diferitelor funcii ale moleculei de
anticorp.Fiecare caten H a moleculelor de IgM i IgE are 5 domenii:
unul n regiunea variabil (VH) i 4 n regiunea constant (CH1
CH4).
Secvena de legtur ntre regiunea constant (CH1) i cea variabil a
fiecrei catene se numetezon de comutare(s = switch).
Fiecare domeniu are o form cilindric sau globular, cuprinde o
secven de circa 60 de aminoacizi i este stabilizat prin interaciuni
necovalente de tiptrans, cu domeniul omolog din lanul opus i de
tipcis, cu domeniul vecin al aceleiai catene.
Domeniile fiecrui lan, mpreun cu cele omologe ale lanului opus,
formeaz uniti funcionale denumitemodule. Cooperarea lor funcional
este ilustrat de faptul c domeniile VL i VH separate, au o
capacitate foarte limitat de legare a antigenului, n timp ce forma
lor asociat (care constituie situsul de legare al moleculei) este
foarte eficient n legarea antigenului.
Fig. 12.Reprezentarea schematic adomeniilorpliate i stabilizate
ale moleculei de IgG.
Fig. 13.Clivajul enzimatical moleculei de IgG1umane. Pepsina
cliveaz catena H i elibereaz fragmentele F(ab)2i regiunea Fc
(segmentul cristalizabil). Hidroliza prelungit taie fragmentul Fc n
peptide scurte. Papaina cliveaz molecula n regiunea balama (la
restul 224) i elibereaz dou fragmente Fab i un fragment Fc (dup
Roitt, 1984). Moleculele de imunoglobuline exist sub dou
forme:secretate, ca anticorpi n umorile organismului ilegatede
membrana limfocitelor B, ndeplinind funcia de receptori de antigen.
Forma legat prezint o secven hidrofob la captul C-terminal, de
circa 30 de aminoacizi, care strbate membrana i se ancoreaz n
structura ei.
Metodele declivarei dedenaturare chimica moleculei de
imunoglobulin au contribuit la nelegerea structurii i funciei sale.
Clivarea s-a realizat cu enzime proteolitice (papain, pepsin,
tripsin) sau prin cianoliz cu BrCN.
Papaina scindeaz mo-lecula de imunoglobulin la nivelul regiunii
balama (aminoacidul 224) i elibe-reaz dou fragmenteFab(Fragment
antigen binding) i fragmentulFc(cristalizabil). Fiecare fragment
Fab (50 kD) conine un lan L ntreg i jumtatea N-terminal a lanului
H, notat cu Fd (difficult), care cuprinde domeniile VH i CH1.
Frag-mentul Fab poate fi scindat transversal i rezult frag-mentul
Fv (variabil) format din domeniile VL i VH, se-parat de domeniile
CL i CH1.
Fragmentul Fc (50 kD) este format din jumtile C-terminale ale
celor dou catene H, unite printr-o legtur S-S i prin legturi
necovalente.
Pepsina cliveaz lan-urile H sub regiunea balama i elibereaz
fragmentul Fc, mai mic dect fragmentul Fc papainic i dou fragmente
Fab legate ntre ele (Fab)2, prin puni S-S intercatenare.
BrCN scindeaz lanurile polipeptidice la nivelul secvenelor cu
Met, pe care o transform n homoserin. Fragmentele rezultate sunt
heterogene ca mrime, n funcie de frecvena metioninei. Polipeptidele
rezultate prin clivare enzimatic, ct i prin cianoliz, se separ prin
tehnici cromatografice.
Denaturarea moleculei de imunoglobulin prin reducerea legturilor
S-S. Agenii reductori (mercaptoetanolul, mercaptoetanolamina,
ditiotreitolul) au o grupare SH liber i reduc legturile S-S
intercatenare i intracatenare.
HO CH2 CH2 SH (Mercaptoetanolul)
Legturile intercatenare (H-H sau H-L) sunt reduse mai uor, iar
cele intracatenare, care stabilizeaz buclele domeniilor moleculei
de imunoglobulin, sunt disociate mai greu.
Reducerea legturilor S-S este reversibil. Dup ndeprtarea
agentului denaturant, renaturarea este rapid i complet. Din acest
motiv, agenii denaturani se ncorporeaz n sistemul supus denaturrii.
Denaturarea se poate stabiliza prin diferite metode chimice.
Funciile moleculei de imunoglobulin n ansamblul efectorilor
sistemului imunitar, moleculele de imunoglo-bulin ndeplinesc dou
categorii de funcii:
- funcii despecificitate- funcii grupate sub denumirea
deactiviti biologice efectoare Specificitatea imunoglobulinei fa de
un antigen este exprimat prin capacitatea de recunoatere fin a
epitopului complementar al antigenului i de combinare cu acesta.
Specificitatea moleculei de imunogobulin este conferit de situsul
su de combinare. Marea diversitate a moleculelor de anticorpi,
asigur o diversitate uria a situsurilor de combinare, de ordinul a
108 109specificiti de legare.
Specificitatea de legare este dat de structura spaial a
situsului de combinare cu antigenul, conferit de resturile de
aminoacizi ale regiunilor hipervariabile ale catenelor H i L.
Aminoacizii care formeaz situsul de combinare al moleculei de
imunoglobulin, prin plierea regiunilor hipervariabile, delimiteaz
ocavitate molecularce difer ca form i mrime.
Cavitatea prezint substructuri (proeminene i depresiuni), pe
care le formeaz secvenele hipervariabile, n timp ce restul
regiunilor variabile ale celor dou catene confer structura
tridimensional a cavitii moleculare.
Potrivirea spaial dintre situsul de combinare al moleculei de
anticorp i epitopul specific, din punctul de vedere al configuraiei
spaiale, este perfect. Eventualele imperfeciuni geometrice pot fi
ocupate de moleculele de ap. Potrivirea perfect a celor dou uniti
combinante este sugerat de metafora cheie-broasc.
Dup combinarea cu antigenul, modificrile spaiale ale situsului
de combinare a anticorpului sunt minime, nedectabile. Epitopul
antigenic are un rol important n potrivirea conformaional perfect
cu situsul de combinare a anticorpului, deoarece corespunde unei
regiuni moleculare cu factor de temperatur mai ridicat, ceea ce
sugereaz o flexibilitate mai accentuat a secvenei moleculare
respective.
Flexibilitatea unui determinant antigenic i permite s se
adapteze mai uor ntr-un situs de legare preexistent al moleculei de
anticorp, chiar dac epitopul nu se potrivete exact geometriei
situsului de combinare a anticorpului. Datorit flexibilitii
epitopului, legarea antigenului cu anticorpul se aseamn cu ntlnirea
a doi nori i nu cu aceea a dou pietre.
Anticorpii specifici fa de secvenele peptidice mobile (calde)
ale antigenului proteic, se leag cu afinitate mai mare de proteina
nativ. Aceste rezultate sunt foarte importante din punct de vedere
practic, pentru selectarea segmentelor peptidice n vederea obinerii
vaccinurilor sintetice subunitare.
Dimensiunile situsului de combinare s-au dedus indirect, prin
determinarea mrimii haptenei care blocheaz reacia de combinare a
anticorpilor cu antigenul nativ: oligozaharidul format din6-8 uniti
monomericeocup complet situsul de combinare al moleculei de
anticorp. Oligozaharidele mai mici inhib parial reacia specific de
precipitare. Pentru anticorpii specifici fa de antigene
proteice,tetrapeptideleau blocat cu maxim eficien reacia de
precipitare dintre anticorpi i antigenul nativ.
Funciile biologice efectoare sunt amorsate de reacia
antigen-anticorp. Numrul funciilor biologice efectoare este mai mic
i sunt dependente de regiunile constante ale moleculei de
imunoglobulin.
Fiecare domeniu al regiunii constante a moleculei de
imunoglobulin ndeplinete anumite funcii:
- legarea antigenului pe imunoglobulinele de suprafa care
funcioneaz ca receptori pe limfocitele B, declaneazproliferarea i
diferenierealor, iar legarea antigenului cu imunoglobulinele
citotrope pentru mastocite, declaneazdegranulareaacestor
celule;
- dup cuplarea cu antigenul, moleculele de imunoglobulin expun
fragmentul Fc, recunoscut ulterior de receptorii specifici pentru
Fc de pe suprafaa monocitelor, macrofagelor, PMNN. Astfel se
stimuleaz procesul de fagocitoz a celulelor nonself tapetate cu
imunoglobuline, denumitimunofagocitoz; - celulele K, prin
intermediul receptorilor pentru Fc, interacioneaz cu celulele
nonself tapetate cu IgG i realizeaz liza de contact prin fenomenul
decitotoxicitate;
- interaciunea antigen-anticorp genereaz un semnal care se
transmite regiunii Fc. Aceasta i modific configuraia spaial i
expune unsitus de recunoatere(pentru IgG situat ntre Glu 318 i Lys
322), de care se leag C1q;
- regiunea balama este transductoare de semnale i are un rol
important n flexibilitatea moleculei de imunoglobulin, permind
variaia unghiului dintre fragmentele Fab: ele trec reversibil de la
forma T la Y. Geometria variabil a moleculei de imunoglobulin mrete
eficiena de legare a antigenului, deoarece ajusteaz poziia celor
dou situsuri de combinare ale anticorpului, n funcie de distana la
care se gsesc determinanii antigenici pe suprafaa unui antigen
particulat (virus sau celul);
- regiunea balama a moleculelor de IgG i IgD este sensibil la
aciunea enzimelor proteolitice, iar a moleculei de IgA este
rezistent.
Componenta glucidic a imunoglobulinei ndeplinete urmtoarele
funcii;
- realizeaz i menine o conformaie a moleculei de imunoglobulin,
esenial pentru secreie;
- mrete solubilitatea moleculelor de imunoglobulin;
- are rol de spaiator ntre domeniile unui lan i ntre catenele
moleculei;
- particip la funciile citotrope ale moleculei de
imunoglobulin;
- are rol n legarea C1q, component a sistemului complement.
Heterogenitatea anticorpilor Moleculele de imunoglobuline din
plasma oricrui organism sunt foarte heterogene, att datorit
diversitii epitopilor fa de care s-au sintetizat ceea ce induce
variaii ale secvenelor hipervariabile ale moleculei, ct i datorit
variaiilor secvenei de aminoacizi n regiunile constante ale
moleculei.
Heterogenitatea anticorpilor este ordonat n clase, subclase,
tipuri, alotipuriiidiotipuri, pe baza variaiei secvenei de
aminoacizi. Moleculele de imunoglobuline au caliti duble: ele se
comport nu numai camolecule de recunoatere, care recunosc specific
antigenul, dar la rndul lor sunt recunoscute caantigene. Pentru
sporirea gradului de imunogenitate, moleculele de imunoglobuline se
asociaz cu adjuvantul Freund i se injecteaz la animale de experien.
Variaiile de structur chimic a imunoglobulinelor se comport ca
determinani antigenici i induc sinteza anticorpilor
anti-imunoglobulin. Variaiile de ordin chimic ale imunoglobulinelor
se evideniaz prin metode imunochimice de precipitare ntre
moleculele de imunoglobulin cu rol de antigen i anticorpii
anti-imunoglobulin din serul imun. Din punctul de vedere al
manifestrii imunopotenei determinanilor antigenici ai
imunoglobulinelor, s-au definit trei nivele de
heterogenitate:izotipic, alotipiciidiotipic.
Heterogenitatea izotipic Heterogenitatea izotipic (izos= acelai)
definete variantele biochimice ale imunoglobulinelor, comune pentru
toi indivizii unei specii. Variantele biochimice se datoreaz
variaiilor secvenei de aminoacizi n regiunea constant a catenei H.
Ele se comport ca determinani antigenici dup injectarea n
organismul altei specii. Pentru identificarea epitopilor izotipici
ai moleculelor de imunoglobulin uman, acestea, n asociaie cu
adjuvantul Freund, se injecteaz la iepure.
Fiecare individ al unei specii exprim toate variantele
antigenice izotipice caracteristice speciei.
Variantele antigeniceizotipiceale imunoglobulinelor umane s-au
identificat iniial,n regiunea constant a catenei H.
Exist 5 variante antigenice distincte ale catenelor H n regiunea
constant, notate cu g, m, a, d, e, corespunztoare celor 5 clase de
imunoglobuline: IgG, IgM, IgA, IgD, IgE. Serul imun fa de un
determinant antigenic de clas nu d reacii ncruciate cu celelalte
tipuri de determinani, deoarece catenele H ale diferitelor clase de
imunoglobuline prezint diferene mari de ordin chimic ntre domeniile
echivalente, care merg pn la circa 60% din totalul
aminoacizilor.
Determinanii antigenici ai unei clase de imunoglobuline sunt
comuni tuturor indivizilor unei specii i se evideniaz nserul imun
heterolog, obinut prin imunizarea organismelor altei specii. De
exemplu, un antiser fa de lanul uman , obinut pe iepure, va
precipita numai anticorpii clasei IgG din orice ser uman.
Ulterior, determinanii antigenici s-au identificat in regiunile
constante ale catenelor L. Determinanii antigenici ai catenelor L
determintipurilede imunoglobuline.
Catena L are dou variante antigenice, notate cuki l, care se
gsesc la toate cele 5 clase de imunoglobuline. Cele dou tipuri
structurale de lanuri L (k i l) prezint deosebiri de secven a
aminoacizilor n regiunea constant i nu au determinani antigenici
comuni. De aceea, nu dau reacii imune ncruciate. Serul imun
heterolog anti-molecule de imunoglobuline umane cu caten Lk,obinut
pe iepure, precipit toate moleculele de imunoglobuline umane care
conin catena Lk, indiferent de clas. Serul imun anti-Lk nu precipit
moleculele de imunoglobuline care conin catena L l.
O molecul de imunoglobulin are dou catene de tip k sau l.
Formula general a diferitelor clase de imunoglobuline esteg2k2(sau
g2l2), m2k2(m2l2), a2k2(a2l2).
Catenele L de tip k i l determintipurile molecularede
imunoglobuline. La om, raportul Ig k/ l este 7/3, iar la oarece
este 19/1, valori care probabil reflect raportul numeric al genelor
codificatoare pentru cele dou tipuri de catene.
Izotipurile catenelor H nu influeneaz funcia de specificitate a
moleculelor de imunoglobuline: acelai antigen poate fi legat de
oricare din cele 5 clase de imunoglobuline.
Pe lng variantele antigenice menionate clase i tipuri s-au
identificat diferene mai subtile ale moleculelor de IgG i IgA, n
ceea ce privete proprietile fizice, chimice i biologice, diferene
care corespund subclaselor antigenice. Aceasta nseamn c, pe lng
determinanii antigenici de clas, exist i alte variante antigenice
aleregiunii constante ale catenei H, corespunz toare subclaselor.
Ele se noteaz cu litera clasei, urmat de o cifr: IgG1, IgG2, IgG3,
IgG4, respectiv IgA1, IgA2.
Moleculele de imunoglobuline ale subclaselor au n comun
determinanii antigenici proprii fiecrei subclase, aducnd un nivel
superior de heterogenitate a catenelor H.
Diferenele secvenei de aminoacizi ai catenei H, ntre diferite
subclase sunt mici: 24 de aminoacizi ntre IgG1i IgG4. Cea mai
important deosebire const n numrul legturilor S-S
intercatenare.
Moleculele diferitelor subclase sunt sintetizate de celule
diferite.
Variantele alotipice Descoperirea alotipiei (alos= altul) a
pornit de la urmtorul fapt de observaie: n serul pacienilor cu
artrit cronic reumatoid se gsesc molecule de tip special, ncadrate
n categoria factorilor reumatoizi (FR). Factorii reumatoizi sunt
molecule de auto-anticorpi, adic IgM anti- IgG.
Factorii reumatoizi se evideniazin vitro, prin capacitatea lor
de a determina aglutinarea eritrocitelor tapetate cu o doz
subaglutinant de anticorpi specifici antieritrocitari (IgG).
Grubb (1956) a observat c FR seric, uneori, aglutineaz hematiile
tapetate cu auto-anticorpi specifici (care se sintetizeaz n anemia
hemolitic autoimun) ale unor pacieni, iar alteori, reacia de
hemaglutinare nu se produce, testul evidenieriiFRin vitrofiind fals
negativ. Concluzia reaciei de hemaglutinare pe care, uneori, FR din
serul pacienilor de artrit reumatoid o produce asupra hematiilor
tapetate cu o doz subaglutinant de anticorpi specifici, a fost
urmtoarea: autoanticorpii de pe suprafaa eritrocitelor unor
indivizi cu anemie hemolitic autoimun, posed determinani antigenici
diferii, pe care FR poate s-i recunoasc. Astfel s-a dedus c
moleculele de imunoglobulin de la indivizi diferii, sunt diferite
din punct de vedere antigenic. n consecin, imunizarea unui individ
cu imunoglobulinele provenite de la alt individ al aceleiai specii,
determin sinteza anticorpilor fa de determinanii antigenici ai
moleculelor imunoglobulinice ale donorului.
Imunoglobulinele sunt aloantigene ineficiente dac sunt injectate
ca proteine solubile n organismul uman. De aceea, transfuziile de
snge total, de plasm sau injectarea imunoglobulinelor solubile, de
cele mai multe ori, nu induc sinteza anticorpilor
anti-imunoglobuline ale donorului. Moleculele de imunoglobuline
devin antigenice dup asocierea lor cu adjuvantul Freund.
Semnificaia variantelor antigenice alotipice ale moleculelor de
imunoglobuline este analog celei a antigenelor de grup sanguin.
Fenomenul este general, adic i alte molecule provenite de la un
organism pot fi imunogene pentru alte organisme ale aceleiai
specii, la care se comport ca aloantigene.
Variantele alotipice ale imunoglobulinelor se detecteaz n reacia
de precipitare cu aloantiseruri obinute pe organisme ale aceleiai
specii, dar cu alotip diferit de acela al organismului donor al
antigenului imunoglobulinic.
Variantele moleculare alotipice sunt consecina existenei genelor
alele perechi (aa), o caracteristic general a organismelor
diploide. Prin mutaii succesive, n acelai locus, apar mai multe
alele care formeaz o serie polialelic - a1, a2, a3 an. Genele alele
ocup acelai locus pe cromosomii omologi, ca i gena de tip slbatica.
Fiecare individ va avea o combinaie de gene alele: aa1, aa2..
aansau a1a2, a1a3 a1an, cu variante antigenice distincte.
Alotipurile imunoglobulinelor sunt rezultatul variaiilor
secvenei aminoacizilor n regiunile constante ale catenelor H i L,
ceea ce le confer un grad superior de heterogenitate, consecin a
alelelor codominante la acelai locus.
Pentru moleculele imunoglobulinice umane s-au descris trei
categorii de markeri alotipici:
- factorii Gm (gamamarker), numerotai de la 1 la 25, pe catena H
a subclaselor de IgG. De exemplu, markerul G1m(a) pe moleculele de
IgG1are secvena Asp-Glu-Leu-Thr-Lys, iar moleculele altor indivizi
au secvena Glu-Glu-Met-Thr-Lys, adic doi aminoacizi diferii. Pentru
IgG3sau descris 14 alele;
- factorii A2m(1) i A2m(2), identificai pe catenele H ale
subclasei IgA2;
- factorii Km(Inv), pe catenele Lk, n numr de trei;
- dou variante alelice pentru IgE.
Foarte rar, determinanii antigenici alotipici sunt localizai n
domeniile variabile ale moleculei.
Ca i n alte sisteme alelice, indivizii pot fi homozigoi sau
heterozigoi pentru genele care codific markerii. Genele se exprim
codominant i se transmit n descenden dup mecanismul mendelian. De
exemplu, alotipurile b4b5pe catenele L ale imunoglobulinelor de
iepure se exprim astfel: un organism homozigot b4b4sau b5b5exprim
alotipul b4, respectivb5. Dar genotipul b4b5rezultat n descendena
lor exprim markerul b4pe o fracie a moleculelor i markerul b5, pe
restul moleculelor de imunoglobuline.
Variantele idiotipice Idiotipul (idios= individual) este
reprezentat de o populaie omogen de molecule de anticorpi,
sintetizate de descendenii unei clone celulare, care recunosc i se
combin cu un singur determinant antigenic (epitop).
Specificitatea idiotipic a unei populaii de anticorpi s-a dedus
pe cale experimental:
- antigenul (celule deS. typhi) s-a injectat la organismele A i
B (iepuri), identice din punct de vedere genetic. Se sintetizeaz
anticorpi aglutinaniantiS. typhi;
- anticorpii aglutinani 1(produi de organismul A) s-au injectat
la organismul C (iepure din aceiai linie genetic). Se sintetizeaz
anticorpi anti-anticorpi 1, evideniai n reacia de precipitare.
Surprinztor, anticorpii anti-anticorpi 1 nu precipit anticorpii
2, dei anticorpii 1 i anticorpii 2 au aceiai specificitate fa de
antigeneleS. typhi, iar organismele A, B, C aparin aceluiai
alotip.
Concluzia este c anticorpii 1 i anticorpii 2, dei au aceiai
specificitate fa de antigenul deS.typhi, la rndul lor, au
determinani antigenici proprii. De aceea, anticorpii anti-anticorpi
1 nu precipit anticorpii 2, sintetizai de un alt organism.
Moleculele de anticorpi cu aceiai specificitate de combinare fa de
un antigen, sintetizate de organisme identice genetic, au o
individualitate antigenic distinct, denumitspecificitate
idiotipic.
Heterogenitatea idiotipic este consecina determinanilor
idiotipici, localizai n regiunile hipervariabile ale catenelor H i
L. Specificitatea idiotipic a moleculelor de anticorpi sintetizai
de o clon de celule este conferit de unicitatea secvenei de
aminoacizi de la nivelul secvenelor hipervariabile ce particip la
formarea situsurilor de combinare, care determin epitopi cu
caracter strict individual denumiiidiotopi. Unii idiotopi sunt
localizai chiar n interiorul situsului de combinare sau n imediata
sa vecintate. Dovada o constituie faptul c legarea epitopului
specific de situsul de combinare a anticorpului, blocheaz ntr-o
msur mai mare sau mai mic, legarea anticorpilor
anti-idiotipici.
Fig. 14.Ilustrarea diagramatic aheterogenitiianticorpilor.
Colecia de idiotopi ai situsului de combinare a unei molecule de
imunoglobuline formeazidiotipulei. Idiotipul este rezultatul
configuraiei spaiale unice a regiunilor hipervariabile ale
catenelor H i L, conferit de o secven unic a aminoacizilor.
Repertoriul idiotipurilor este de acelai ordin de mrime cu acela
al specificitii situsurilor de com-binare. Pentru situsul de
combinare al moleculei de imunoglobulin s-a pro-pus denumirea
deparatop.
La alctuirea idiotipului particip ambele catene. Cele dou catene
disociate nu pot s lege anti-idiotipul sau l leag cu o eficien
foarte sczut.
IgG Imunoglobulinele reprezint circa 20% din totalul proteinelor
serice. IgG este dominant cantitativ n serul uman normal,
reprezentnd 70-75% din cantitatea total de imunoglobuline.
Concentraia sa medie n ser este de 1250 mg/100 ml, cu variaii
individuale normale ntre 800 2000 mg/100 ml.
IgG este cea mai heterogen dintre imunoglobuline n ceea ce
privete sarcina electric. Din aceast cauz, n cmpul electroforetic
se distribuie n fraciile g 1 i g 2 ale serului.
Din punct de vedere structural, IgG este un monomer cu greutatea
molecular de 150 kD i cu constanta de sedimentare 7S. Componenta
glucidic reprezint circa 3% din greutatea molecular a IgG.
Fig. 15.Modelulstructuralal IgG1. Domeniile variabile ale celor
dou catene (VH i VL) formeaz situsul de legare a
antigenului.Cercurilenegre indic poziia gruprilor glucidice. HR =
regiunea balama. IgG se sintetizeaz tardiv n rspunsul imun pri-mar,
dar este imunoglobulina predominant arspunsului imun secundari se
distribuie uniform n compartimentele intra- i extravasculare.
IgG se prezint sub forma a 4 variante antigenice, conferite de
compoziia n aminoacizi a catenei g: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4.
Proporia normal a celor 4 subclase este de 66% pentru IgG1, 23%
pentru IgG2, 7% pentru IgG3i 4% pentru IgG4.
IgG3 este mai grea, datorit catenei g 3 i are o regiune balama
extins, codificat de civa exoni, iar IgG4are o regiune balama scurt
i rigid, ceea ce produce o nepotrivire steric pentru fixarea
complementului.
IgG este singura imunoglobulin care traverseaz placenta,
asigurnd astfel protecia ftului i nou-nscutului n primele luni de
via. Pe membrana sinciio-trofoblastului se gsesc receptori pentru
regiunea Fc a IgG, care mediaz transferul placentar al
moleculei.
In vivo, funcia esenial a IgG este neutralizarea toxinelor
bacteriene. IgG activeaz sistemul complement i produce liza
celulelor bacteriene i a particulelor virale, dar are i rol
opsonizant.In vitro, IgG particip la reaciile de aglutinare i
precipitare.
Termenul de njumtire al IgG este de 21 de zile.
n toate serurile imune, o proporie de 5-15% din moleculele de
IgG, pare s conste din molecule asimetrice, cu un singur situs
funcional de legare (molecule monovalente). Aceste molecule nu
particip la reaciile secundarein vitro(aglutinare, precipitare).
Cellalt situs este blocat stereochimic de un polizaharid bogat n
manoz, legat de primul domeniu constant (CH1).
IgA
Unitatea de baz a structurii IgA estemonomerul, alctuit din dou
catene grele (H) cu specificitate de clas (izotipic) a i dou catene
uoare (L) de tip l sau k.
Unitatea monomeric (l)2sau (a-k)2are o tendin constant de a
produce structuri moleculare polimerice, formate din 2, 3, 4 sau 5
monomeri (10S, 13S, 15S, respectiv 17-18S), care n ser se gsesc n
concentraii descrescnde.
La microscopul electronic, molecula de IgA monomer are aspectul
literei Y. Complexele dimerice au forma a dou litere Y, aezate una
n prelungirea celeilalte. Cele dou fragmente Fc formeaz un lan lung
i rigid.
IgA se gsete att n plasma sanguin, ct i n secreiile externe:
salivar, lacrimal, gastric vaginal, intestinal, biliar, pancreatic,
lactat.
Pe baza unor diferene de structur molecular (numrul punilor S-S,
secvena aminoacizilor n regiunea balama) au fost descrise dou
subclase de IgA: IgA1i IgA2. Ele difer prin 22 de aminoacizi, n
primul rnd datorit deleiei a 13 aminoacizi din regiunea balama a
IgA2, dar care se gsesc la IgA1. Aceast diferen structural confer
rezisten moleculei de IgA2la aciunea unor proteaze bacteriene, care
cliveaz specific IgA1n regiunea balama.
n funcie de localizare se distingIgA sericiIgA din secreii.
Fig. 16.StructuraIgA1uman. Sunt indicate poziiile punilor
disulfurice inter- i intracatenare, precum i poziia ipotetic a
catenelor polizaharidice. O punte disulfuric suplimentar
stabilizeaz domeniul C a 2 i o alta leag lanul J n polimerul de
IgA. IgA sericeste reprezentat n primul rnd de IgA1(90%) i este
monomer n proporie de 80%. Catenele L i H sunt reunite prin dou
puni S-S. Subclasa IgA2reprezint numai 10% din IgA seric. Pe baza
markerilor alotipici ai catenei H, IgA2se subdivide n dou variante
alotipice: A2m1(la populaiile caucaziene) i A2m2(la populaiile
mongoloide-negroide)
Funciile IgA seric nu sunt bine precizate, datorit dificultilor
de purificare. Rolul su cel mai important ar fi acela de a ndeprta
cantitile mici de antigene, provenite din alimente sau antigenele
solubile ale microorganismelor, absorbite n circulaia general.
Eliminarea timpurie mpiedic accesul acestor antigene la celulele
sistemului imunitar i stopeaz declanarea unui rspuns imun de
amploare, care ar devia forele de aprare a organismului, de la
funcia sa esenial, aceea a proteciei antiinfecioase.
In vivo, IgA nu activeaz complementul pe calea clasic i nu
produce liza antigenelor celulare, dar moleculele agregatein
vitrode IgA1i IgA2activeaz calea altern. Funcia opsonizant a IgA
este controversat. IgA nu produce reacii de precipitare cu
antigenele moleculare.
IgA din secreii(sau IgA secretor) se gsete n secreia mucoaselor
(digestiv, respiratorie, urinar), n secreia biliar i pancreatic. De
aici deriv i denumirea sa improprie,IgA secretoare (sIgA), dei mai
corect ar fi denumirea de IgA din secreii.
Fig.17.StucturasIgA1uman. Piesa secretoare, probabil este rsucit
n jurul dimerului de IgA i se leag prin puni disulfurice de
domeniul C a 2 al fiecrui monomer. Piesa J este amplasat la
jonciunea celor doi monomeri. Puntea disulfuric ce leag domeniul C
a 2 de regiunea balama nu este figurat (dup Roitt, 1984).
sIgA se gsete n special n form dimeric (80%), iar restul ca
monomer sau alt tip de polimer. Compartimentul seric al IgA nu
influeneaz semnificativ concentraia IgA din secreii i invers, IgA
din secreii nu este absorbit n circulaie.
sIgA se sintetizeaz local, n structurile limfoide asociate
mucoaselor: n mucoasa tractului respirator, dar mai ales cea nazal,
a tractului digestiv (n special n mucoasa antrului piloric i a
intestinului subire), n lamina propria a acinilor secretori ai
glandelor salivare i mamare, n glandele lacrimale. In toate aceste
structuri se gsesc numeroase plasmocite i precursorii lor.
Imunizarea oral stimuleaz n primul rnd, sinteza IgA.Structura
moleculei de sIgA Molecula de sIgA este alctuit din doi monomeri de
IgA, legai princatena J(joining) i o caten suplimentar,
denumitcomponent secretoare(CS). Formula general a sIgA dimer este
(IgA)2J CS i are greutatea molecular de 385 kD i constanta de
sedimentare 10S.
Complexul molecular (IgA)2J CS este foarte rezistent la
proteoliz datorit conformaiei speciale dobndit dup legarea catenei
J i a catenei CS, precum i datorit capacitii sale de a se lega de
mucinele din secreii.
Catena Jeste un glicopeptid de 15-16 kD (136 aminoacizi) i se
sintetizeaz nplasmociteleproductoare de IgA. Este bogat n acizi
glutamic i aspartic i conine un oligozaharid legat de Asp din
poziia 43. Conine 7-8 resturi de cistein. Lanul J se leag prin puni
S-S de regiunea Fc a IgM polimeric i de sIgA. Prezena catenei J s-a
stabilit la imunoglobulinele polimerice de la toate clasele de
vertebrate, iar ARNm pentru catena J s-a detectat la numeroase
nevertebrate. In complexele moleculare cu un grad superior de
polimerizare, numai dou molecule de IgA sau IgM se leag prin
intermediul catenei J, celelalte fiind legate una de alta prin puni
S-S. Polimerizarea moleculelor de IgA n citoplasma celulei
productoare este esenial pentru transportul lor la suprafaa
mucoasei. Lanul J se gsete n citoplasma limfocitelor B, n cursul
diferenierii spre plasmocit. Aproape toate limfocitele din
structurile limfoide asociate mucoaselor (digestiv, respiratorie),
din esutul interstiial mamar, salivar i lacrimal, exprim lanul J
intracelular. Catena J este sintetizat i de unele celule care
produc IgG sau IgD din aceste structuri, dar este degradat n
citoplasm. Plasmocitele din mduva osoas care produc IgA sau IgG
sunt negative pentru lanul J.
Componenta secretoarea sIgA este o glicoprotein din categoria
betaglobulinelor, nenrudit cu imunoglobulinele, bogat n glucide
(8,7%). Secvena catenei cuprinde 750 de aminoacizi, distribuii n
trei domenii: domeniul citoplasmatic (103 aminoacizi),
transmembranar (23 aminoacizi) i extracelular (circa 625
aminoacizi), la care se adaug o secven semnal de 18 aminoacizi,
care este clivat dup sintez.
Componenta secretoare se sintetizeaz ncelulele epiteliale ale
mucoaselor. Dup prelucrarea n complexul Golgi (unde are loc
glicozilarea), CS migreaz pentru a fi integrat n plasmalema bazal i
lateral a celulelor. Sinteza CS este independent de IgA. La noul
nscut, CSse sintetizeaz n sptmna a 8-a (nainte de apariia
plasmocitelor). Este prezent chiar la persoanele n ale cror secreii
IgA lipsete.
Funciile componentei secretoare. Componenta secretoare are rol
dereceptorpentru moleculele dim