Top Banner
143 DESIGNING IMMUNE RESPONSES WITH GENETIC IMMUNIZATION AND IMMUNOSTIMULATORY DNA SEQUENCES JOSE THALHAMER, WOLGANG LEITNER 1 , PETER HAMMERL, JULIUS BRTKO 2 Immunology Group, Institute of Chemistry and Biochemistry, University of Salzburg, Austria, 1 Surgery Branch, National Cancer Institute, NIH, Bethesda MD 20892, USA 2 Institute of Experimental Endocrinology, Slovak Academy of Sciences, Bratislava, Slovak Republic Email: [email protected] Genetic immunization or DNA vaccination represents a rapidly developing technology with new perspectives for the prevention and therapy of infectious diseases and it offers new approaches for the treatment of autoimmunity, tumors and even allergy. DNA vaccines are comprised of plasmid DNA which encodes antigen molecules directly in the transfected cells of a target organism. In contrast to protein-induced immune responses, DNA vaccines stimulate both humoral and cell- mediated immune reactions. In the present review we present a palette of unique features of genetic immunization like the effect of CpG motifs, the influence of mode and site of gene delivery and the modulation of immune responses by co-delivery of cytokines, colony stimulating factors, adhesion molecules and other stimulatory molecules. In addition, modulation of the immune response via translation, processing and presentation will be discussed, which in sum demonstrate the elegant possibilities of genetic immunization to induce tailor-made immune responses. ENDOCRINE REGULATIONS, Vol. 35, 143166, 2001 The first publications in 1990 (WOL et al. 1990) and 1992/93 (TANG et al. 1992, ULMER et al. 1993) demonstrating that injection of plasmid DNA (ig.1) is able to induce potent humoral and cellular immune responses against the encoded genes opened a new era of vaccine research. In vivo transfection of epi- dermal tissue with the gene gun obviously resulted in transcription and translation of genes followed by the proper presentation of gene products to the im- mune system. Considering the similarity of these events with the endogenous pathways involved in anti-viral responses, it was originally postulated that this new method would primarily be suitable for vac- cination against virus infections. However, within several years after the first publications, a large num- ber of reports had demonstrated the enormously broad range of possible applications (AGADJANYAN et al. 1997; ANGUS et al. 1996; BARRY et al. 1995; BOURNE et al. 1996; GEISSLER et al. 1997; GONZALEZ ARMAS et al. 1996; LOWRIE et al. 1994; MANICKAN et al. 1995; MOR et al. 1995; XIANG et al. 1994; XU and LIEW 1995; XU et al. 1998). Genetic immunization proved to induce protective immunity against bacterial and parasitic infections and also seemed to offer new perspectives for the treatment of cancer (CONRY et al. 1995; WANG et al. 1995) and even allergy (HARTL et al. 1999; HSU et al. 1996; RAZ et al. 1996). 1. Principles of DNA vaccination Although the precise mechanisms involved in the induction of an immune response following DNA immunization have not yet been determined, we have a fairly good understanding of how antigens are pro- cessed, presented and recognized by cells of the im- mune system (ig.2). In general, exogenous antigens are presented in the context of major histocompatibility complex (MHC) class II molecules. Internalization of proteins into endocytic compartments from the extracellular
24

designing immune responses with genetic immunization and - SAV

Mar 18, 2022

Download

Documents

dariahiddleston
Welcome message from author
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
Page 1: designing immune responses with genetic immunization and - SAV

�<�

���� ��� � ���������������?���� ������� ������I����

���� �������������@����� ��O������

F����� �� ������9��������� �������� ��� ��������F����J� :��

�##���$�./�����-������������&� (�#���/�������(�#���/����2����/��&���$4*��.��������������.��/�����(��������$� �����������������1�����(������0�6�;56�����

6�����������&���-��#����$��������$�./���$�2�:�����#/��&�������������$�2����$�2�:���-�*$

�#�$%�<���&'+(�$(�#��)�*.'�'��

"("/$)�$11.($Z+/$�(��#�����&+))$(+/$�(�#"2#"%"(/%�+,#+2$'�0�'"&"��2$(-�/")!(���-0�<$/!�("<2"#%2")/$&"%�*�#�/!"�2#"&"(/$�(�+('�/!"#+20��*�$(*")/$�.%�'$%"+%"%�+('�$/��**"#%�("<�+22#�+)!"%�*�#/!"�/#"+/1"(/��*�+./�$11.($/0��/.1�#%�+('�"&"(�+��"#-0������&+))$("%�+#"�)�12#$%"'��*�2�+%1$'����<!$)!�"()�'"%�+(/$-"(�1��").�"%�'$#")/�0�$(�/!"�/#+(%*")/"'�)"��%��*�+,/+#-"/��#-+($%1���()�(/#+%/�/��2#�/"$(4$('.)"'�$11.("�#"%2�(%"%������&+))$("%�%/$1.�+/"�8�/!�!.1�#+��+('�)"��41"'$+/"'�$11.("�#"+)/$�(%��(�/!"�2#"%"(/�#"&$"<�<"�2#"%"(/�+,2+�"//"��*�.($I."�*"+/.#"%��*�-"("/$)�$11.($Z+/$�(��$="�/!"

"**")/��*��2�1�/$*%��/!"�$(*�."()"��*�1�'"�+('�%$/"��*�-"("�'"�$&"#0�+('�/!"�1�'.�+/$�(��*�$11.("#"%2�(%"%�80�)�4'"�$&"#0��*�)0/�=$("%��)���(0�%/$1.�+/$(-�*+)/�#%��+'!"%$�(�1��").�"%�+('��/!"#%/$1.�+/�#0�1��").�"%���(�+''$/$�(��1�'.�+/$�(��*�/!"�$11.("�#"%2�(%"�&$+�/#+(%�+/$�(��2#�)"%%$(-+('�2#"%"(/+/$�(�<$���8"�'$%).%%"'��<!$)!�$(�%.1�'"1�(%/#+/"�/!"�"�"-+(/�2�%%$8$�$/$"%��*�-"("/$)$11.($Z+/$�(�/��$('.)"�/+$��#41+'"�$11.("�#"%2�(%"%�

�������������� ����������������>�����������

!"�*$#%/�2.8�$)+/$�(%�$(������39�����"/�+�������5+('�����7���3 ���"/�+��������������"/�+�������5'"1�(%/#+/$(-�/!+/�$(P")/$�(��*�2�+%1$'�����3�$-��5$%�+8�"�/��$('.)"�2�/"(/�!.1�#+��+('�)"��.�+#�$11.("#"%2�(%"%�+-+$(%/�/!"�"()�'"'�-"("%��2"("'�+,("<"#+��*�&+))$("�#"%"+#)!�����22��/#+(%*")/$�(��*�"2$4'"#1+��/$%%."�<$/!�/!"�-"("�-.(��8&$�.%�0�#"%.�/"'$(�/#+(%)#$2/$�(�+('�/#+(%�+/$�(��*�-"("%�*����<"'�80/!"�2#�2"#�2#"%"(/+/$�(��*�-"("�2#�'.)/%�/��/!"�$141.("� %0%/"1����(%$'"#$(-� /!"� %$1$�+#$/0� �*� /!"%""&"(/%�<$/!� /!"� "('�-"(�.%�2+/!<+0%� $(&��&"'� $(+(/$4&$#+��#"%2�(%"%��$/�<+%��#$-$(+��0�2�%/.�+/"'�/!+//!$%�("<�1"/!�'�<�.�'�2#$1+#$�0�8"�%.$/+8�"�*�#�&+)4)$(+/$�(� +-+$(%/� &$#.%� $(*")/$�(%�� �<"&"#��<$/!$(%"&"#+��0"+#%�+*/"#�/!"�*$#%/�2.8�$)+/$�(%��+,�+#-"�(.148"#��*�#"2�#/%�!+'�'"1�(%/#+/"'�/!"�"(�#1�.%�0�8#�+'#+(-"� �*� 2�%%$8�"� +22�$)+/$�(%� 3���F��;��� "/� +�����?E�����"/�+�������E�J���;�"/�+�������E�J����"/�+�������E���������"/�+������?E���������������"/+�������E���9����"/�+������>E������:���"/�+�������E

���� "/� +��� ����E�Q���� "/� +��� ���>E�Q� +('����9����E�Q�"/�+������D5��"("/$)�$11.($Z+/$�(�2#�&"'/��$('.)"�2#�/")/$&"�$11.($/0�+-+$(%/�8+)/"#$+��+('2+#+%$/$)� $(*")/$�(%� +('� +�%�� %""1"'� /�� �**"#� ("<2"#%2")/$&"%�*�#� /!"� /#"+/1"(/��*�)+()"#�3����;�"/+�������E�9���"/�+�������5�+('�"&"(�+��"#-0�3 �� �"/�+�������E� ��"/�+�������E�����"/�+�������5�

�!��+�(��2'�%�#:����� /���(/��#(

��/!�.-!�/!"�2#")$%"�1")!+($%1%�$(&��&"'�$(�/!"$('.)/$�(��*� +(� $11.("� #"%2�(%"� *����<$(-����$11.($Z+/$�(�!+&"�(�/�0"/�8""(�'"/"#1$("'��<"�!+&"+,*+$#�0�-��'�.('"#%/+('$(-��*�!�<�+(/$-"(%�+#"�2#�4)"%%"'��2#"%"(/"'�+('�#")�-($Z"'�80�)"��%��*�/!"�$141.("�%0%/"1�3�$-��5��(�-"("#+���"6�-"(�.%�+(/$-"(%�+#"�2#"%"(/"'� $(

/!"� )�(/"6/� �*�1+P�#� !$%/�)�12+/$8$�$/0� )�12�"63� �5�)�+%%����1��").�"%���(/"#(+�$Z+/$�(��*�2#�/"$(%$(/��"('�)0/$)�)�12+#/1"(/%�*#�1�/!"�"6/#+)"��.�+#

Page 2: designing immune responses with genetic immunization and - SAV

�<< ��� ���������� �������������� ���� ��;������������9

%2+)"�$%�*����<"'�80�'"(+/.#+/$�(�3��<�2 �+('�2#�4/"+%"%5�+('�'"-#+'+/$�(�0$"�'$(-�2"2/$'"�*#+-1"(/%��,%1+���*#+)/$�(��*�%.$/+8�"����4���+1$(��+)$'���(-2"2/$'"%�<$���8$('�/��� ��)�+%%����1��").�"%�� !"2"2/$'"4)�+%%����)�12�"6"%�+#"�/#+(%2�#/"'�/��/!"�)"��%.#*+)"�+('�+#"�#")�-($Z"'�80�+(/$-"(4%2")$*$)���>T

,)"��%�� !$%�/02$)+��2+/!<+0�*�#�+(/$-"(%�*#�1�/!""6/#+)"��.�+#�1$�$".�'�"%�(�/�+22"+#�/��8"�)�((")/"'<$/!�/!"�2#�)"%%$(-��*�"('�-"(�.%�2#�/"$(%��(� )�(/#+%/�� ��DT� �012!�)0/"%� #")�-($Z"

+,)�12�"6��*�/!"�� ��)�+%%��,1��").�"�<$/!�+(�"148"''"'�D4���+1$(��+)$'���(-�2"2/$'"�+(/$-"(�� !"'"*+.�/�%�.#)"��*�2"2/$'"%�2#"%"(/"'��(�� ��)�+%%�,1��").�"%�+#"�$(/#+)"��.�+#�2#�/"$(%�-"("#+/"'�802#�/"+%�1+��2#�)"%%$(-�� !"�#"%.�/$(-�2"2/$'"%�+#"'"�$&"#"'�$(/��/!"�"('�2�+%1$)�#"/$).�.1�3��5�&$+/!"�/#+(%2�#/"#�+%%�)$+/"'�<$/!�+(/$-"(�2#"%"(/+/$�(3 ��5��8�.('�/��� ��)�+%%��,1��").�"%�+('�'"�$&4"#"'�/��/!"�)"���%.#*+)"���%/#$)/� %"-#"-+/$�(��*� /!"�2#�)"%%$(-�2+/!<+0%

<�.�'�"6)�.'"�+(0�2#"%"(/+/$�(��*�+(/$-"(%�*#�1�/!""6/#+)"��.�+#�1$�$".��(�� ��)�+%%��,1��").�"%�+('"62�+$(%�/!"�2��#�"**$)+)0��*�2#�/"$(48+%"'�&+))$("%*�#�$('.)$(-�)0/�/�6$)� ,)"���3� �5�#"%2�(%"%�� �<4

"&"#�� /!"#"� $%� $()#"+%$(-� "&$'"()"� /!+/� /!$%� 8+##$"#8"/<""(�/!"�2#�)"%%$(-42+/!<+0%�$%�802+%%"'�+/��"+%/$(� )"#/+$(� +(/$-"(� 2#"%"(/$(-� )"��%� 3���5� %.)!� +%$11+/.#"���%��#�1+)#�2!+-"%�3 �� �+('����J�������E�:������"/�+�������E���"/�+�������E�����"/�+������D5�� !"%"�)"��%�+#"�+8�"�/��/+="�.2�"6�-"4(�.%� +(/$-"(%� *�#� )�+%%� �4#"%/#$)/"'� 2#"%"(/+/$�(3\)#�%%42#$1$(-\5�� !"�2�%%$8$�$/0�/!+/�/!"�%+1"�2#�4*"%%$�(+������1+0� %$1.�/+("�.%�0� 2#�)"%%� +('2#"%"(/�8�/!��� �4��+('�� �4���"2$/�2"%��*�+,%$(-�"2#�/"$(�$11.(�-"(�$(�/!"�+22#�2#$+/"�� ��)�(/"6/1+0�2#�&$'"�+,1")!+($%1� /�� $12#�&"��#� *+)$�$/+/")"��.�+#� )�11.($)+/$�(� 8"/<""(� +(/$-"(4%2")$*$)��>T� +('���DT� ,)"��%����#"�&"#�� +/� /!"� "**")/�#2!+%"��/!"�+)/$&+/$�(��*�8�/!� ,)"���%.8%"/%�1+0�"(4!+()"�/!"�%2")/#.1�+('�#"2"#/�$#"��*�+(/$42+/!�-"($11.("�1")!+($%1%� !"�"&"(/%� $(&��&"'� $(� /!"�+)/$&+/$�(��*� ,)"��%

+�#"+'0�#"2#"%"(/�+,'�<(%/#"+1�"&"(/�$(�/!"�$($/$+4/$�(��*�+(�+'+2/$&"�$11.("�#"%2�(%"�� ,)"���2#$1$(-#"I.$#"%�/!"�2#"%"(/+/$�(��*�+(/$-"(�80�2#�*"%%$�(+����%���.#/!"#1�#"��2#"%"(/+/$�(�1.%/��)).#�$(�/!")�(/"6/��*�)"#/+$(�)�%/$1.�+/�#0�%$-(+�%�� !"�+8%"()"�*�+22#�2#$+/"�)�%/$1.�$�#"%.�/%�$(�+("#-0��#�+)/$&+4/$�(� $('.)"'� )"��� '"+/!� 80� +2�2/�%$%� 3J����� "/� +������5���,(.18"#��*�%/.'$"%�!+&"�'"1�(%/#+/"'�/!+/��%� +#"� /!"�1�%/� "**")/$&"� )"��� /02"� /�� %"(%"� +('#"%2�('� /�� &+#$�.%� ['+(-"#\� %$-(+�%� 3������ "/� +�����?E��� ���������>E�� �����������5���(�-"("#+��%.)!�%$-(+�%�+#"�/!"�#"%.�/��*�/$%%."�+('7�#�)"���'+14+-"��8./�+�%��1��").�"%��*�8+)/"#$+���#$-$(�%.)!�+%�$2�2��0%+))+#$'"�3���5�+('�"&"(�8+)/"#$+������$/4%"�*�)+(�+)/�+%�+,'+(-"#�%$-(+�%�'."�/��/!"�2#"%"()"�*�.(1"/!0�+/"'��2�1�/$*%�+%�'$%).%%"'��+/"#�� !"�+//"#�%""1�/��#"*�")/�/!"�$(/"#+)/$�(��*�)"#/+$(�2+/!�4-"(%�<$/!�/!"�$11.("�%0%/"1�$(�+(�"&��./$�(+#0�)�(4/"6/���*/"#�8"$(-�+)/$&+/"'����%�+#"�)+2+8�"��*�)+24/.#$(-� +(/$-"(%� $(� /!"� 2"#$2!"#0� +('� %.8%"I."(/�01$-#+/"�/�� ,)"���+#"+%��*��012!�$'��#-+(%�%.)!�+%�012!�(�'"��#�%2�""(��<!"#"�/!"�$(/"#+)/$�(�<$/!�+('+)/$&+/$�(��*� ,)"��%�/+="%�2�+)"��("�I."%/$�(�+#$%$(-� *#�1� /!$%�<$'"�0�+))"2/"'

2$)/.#"��*�8+%$)�$11.("�1")!+($%1%�<+%�!�<����&+))$("%�+#"�+8�"�/��/#$--"#�/!"�'$**"#"(/�+#1%��*�/!"$11.("�%0%/"1��9$/!�#"%2")/�/��'+/+�$('$)+/$(-���(-4/"#1�-"("�"62#"%%$�(�+('�/#+(%�+/$�(��*�2#�/"$(%�$(/#+(%*")/"'�10�)0/"%�$/�<+%�$($/$+��0�2�%/.�+/"'�/!+//!"%"�)"��%�!+'�8""(�#")#.$/"'�+%�+(/$-"(�2#"%"(/$(-

��6��

���(�0&0��%%�(��/'��'�0�(�%�#:�/8���� /���(�!��"��6�(�

�(�#$�(6��"��/(��6�(�#:��(��+�%���%�&($�+��"���#(�+#'�#:

/8%�+#(6�2+#0#��+�7�(�0#%���/%�%�/8��A42+#0#��+9!��"�

2'/%0�$��%�+�2'��/��$��(��/���+�/�&%�(6�/82+#�/+�#����#+�6�(

#:�+�2'��/��#(�7#+�9!��/���+�/��/++)�(6��"��2'/%0�$�/+�

%�'����$��/%�$�#(�/(����#����+�%�%�/(��>�*"��"��%�0�$�/��$

�)��"��6�(���/++)�(6��"��+�%�%�/(���0/+5�+!

Page 3: designing immune responses with genetic immunization and - SAV

�<3��� ���������� �������������� ���� ��;������������9

)"��%�39�����"/�+�������5���0/�/�6$)�#"%2�(%"�<"#"/!�.-!/�/��8"�$('.)"'�80�/!"�2#�'.)/$�(��2#�)"%%$(-+('�2#"%"(/+/$�(��*�2�+%1$'4'"#$&"'�2#�/"$(��<!"#"4+%�/!"�#"�"+%"�3�#�%")#"/$�(5��*�%��.8�"�+(/$-"(�2#�4&$'"'�1+/"#$+��*�#� ,!"�2"#�)"���+)/$&+/$�(�+('�+�%�*�#�J,)"��%�+%�+,2#"#"I.$%$/"�*�#�%2")$*$)�+(/$8�'0�2#�4'.)/$�(���"&"#+��2.8�$)+/$�(%�+''#"%%$(-�/!"�$('.)4/$�(��*�� ��#"%2�(%"%�$(�8�("�1+##�<�)!$1"#+%�*��4��<$(-�����$11.($Z+/$�(�2#"%"(/"'�/!"�*����<$(-2$)/.#"G��(/#+1.%).�+#�+%�<"���+%�$(/#+'"#1+��$(P")4/$�(��*�2�+%1$'�����#"&"+�"'�/!+/�/!"�$($/$+/$�(��*)"��41"'$+/"'� $11.("� #"%2�(%"%� #"I.$#"'� +(/$-"(2#"%"(/+/$�(�80�2#�*"%%$�(+�����%�3�����"/�+�������E����"/�+�������E���"/�+������?E��9���:��"/�+������?E�����"/�+�������5�� !"�+)I.$%$/$�(��*�+(/$-"(%�80���%�$%�(�/�*.��0�.('"#%/��'��!�<"&"#��/!"�1")!+4($%1��*�)#�%%42#$1$(-�#"2#"%"(/%�+(�+//#+)/$&"�"62�+4(+/$�(� *�#�!�<�%��.8�"� +(/$-"(%� 3"�-�� /#+(%�+/"'� $(1.%)�"�)"��%��#�="#+/$(�)0/"%5�-+$(�+))"%%�/��/!"�� �)�+%%��,#"%/#$)/"'�2+/!<+0���"#0�#")"(/�*$('$(-%�"&"(%.--"%/�/!+/��("�1")!+($%1�*�#�/!"�$11.(�-"($)$/0

�*�����&+))$("%�)�(%$%/%�$(�/!"�2#"%"(/+/$�(��*�2"24/$'"%�/����>� ,)"��%�80�$(�&$&��2�+%1$'4/#+(%*")/"'10�)0/"%�3� ���"/�+�������5�

-!��"��+#'��#:��2 �0#��:%��(����� /���(�%

����&+))$("%�'��(�/��(�0�)+##0�/!"�-"("/$)�$(4*�#1+/$�(�*�#�/!"�+(/$-"(��*�$(/"#"%/�8./�+�%��'"�$&"#+(�+'P.&+(/4"**")/�'."�/��/!"�2#"%"()"��*�$11.(�4%/$1.�+/�#0��2�1�/$*%�<$/!$(� /!"�8+)/"#$+��8+)=48�("���()#"+%$(-�/!"�(.18"#��*��2�1�/$*%�$(�2�+%41$'%� .%"'� *�#� -"("/$)� $11.($Z+/$�(� $()#"+%"%� /!"$11.(�-"($)$/0�+('� /!"� !��8$+%��*� /!"����4$(4'.)"'�$11.("�#"%2�(%"�3 �� ��"/�+�������E� �� �"/�+�������E�:����"/�+������D5��J"%$'"%�$11.(�%/$14.�+/�#0��2� %"I."()"%�� ("./#+�$Z$(-��2�1�/$*%!+&"�8""(�.()�&"#"'�$(�+'"(�&$#+�������<!$)!�%.242#"%%�/!"�+'P.&+(/�"**")/��*�$11.(�%/$1.�+/�#0��2������"1�&+���*�%.)!�("./#+�$Z$(-��2�1�/$*%�*#�1$11.($Z+/$�(�&")/�#%�"(!+()"'�8�/!��/!"��-�+7�-�#+/$�� +%�<"��� +%�� �� +)/$&$/0� 3:���� "/� +��� ���D5�

��6�-

���"/(�%0%�#:�/(��6�(�2+�%�(�/��#(�/:��+������00&(�L/��#(,��#''#*�(6��+/(:����#(�7�9�#:�$�($+�������''%�7��9�#+

5�+/��(#�)��%� �/��!$!��(�����#(�7#+�0)#�)��%�/:��+��!0!��(�����#(9�2'/%0�$������%��+/(%'/��$��(�#�/(��6�(��)��#�"���''��)2�%!

�(��"������"��$�:/&'��2/�"*/)�:#+��($#6�(#&%�2+#���(��%�2+�%�(�/��#(�#(������'/%%��80#'��&'�%�/%��($��/��$�7-9!��(��6�(%

2+#$&��$��)�5�+/��(#�)��%�7�9�/+��/ /�'/�'��:#+��8��''%�7<9�/($���%�739��"&%��(��+�(6��"�������'/%%����2/�"*/)�7B9� �/

�($#%#0�%�/($��"�������'/%%��82/�"*/)� �/��+#%%42+�0�(6�7;9!��8"�'2�+���''%�/���/%�%��0&'/�#+%�:#+��#�"���HG���''%�7H9�/($

�8��''%�7�9!��(�/$$���#(>���%�0/)�/'%#��/5��/$ /(�/6��#:��"��+�#*(�/(��6�(�2+#$&���#(�7�.9!

����''�2+#��%%�(6�/($�2+�%�(�/��#(�#(������'/%%����0#'��&'�%�/%�*�''�/%������'/%%��82+�%�(�/��#(��)�5�+/��(#�)��%�"/ ��(#�

���(��#(%�$�+�$��(��"�%�$�/6+/0!��#�"���''��'/%%�%�2'/)�(#�0/�#+�+#'���(��"���(���/��#(�#:��"��+�%2#(%�����/&%��(���"�+�(/P �

�8��''%�(#+�5�+/��(#�)��%�$�%2'/)

Page 4: designing immune responses with genetic immunization and - SAV

�<B ��� ���������� �������������� ���� ��;������������9

!"#"*�#"��/!"�%.))"%%*.��'"%$-(��*�+,2�<"#*.�����&+))$("�#"I.$#"%�$(/$1+/"�=(�<�"'-"��*�/!"�"**")/%/!+/�����%"I."()"%�<$/!$(�+,����2�+%1$'�)+(�!+&"�(�/!"�!�%/N%�$11.("�%0%/"1�

-!�!���%�#+��/'�/($�6�(�+/'��/�56+#&($�#:� �"�

/���#(�#:��2 �0#��:%!� !"�+(/$/.1�#4"**")/%��*�1$4)#�8$+��1+/"#$+��<"#"�+�#"+'0�#")�-($Z"'�$(�/!"���/!

)"(/.#0���(��D����9��J.%)!�#"2�#/"'�/.1�#�#"-#"%%$�(*����<$(-�%"&"#"� $(*")/$�(�3J�� ��D��5��9�����"0<+%� /!"� *$#%/� /�� "62��#"� /!"�2�%%$8$�$/$"%��*� /#"+/$(-)+()"#�2+/$"(/%�<$/!��$&"��#�=$��"'�8+)/"#$+�8./�/!"�%.)4)"%%��*�%.)!�/#"+/1"(/�<+%��$1$/"'�'."�/��%"&"#"�%0%4/"1$)�/�6$)$/0��*�/!"%"�%�4)+��"'�[���"0a%�/�6$(%\�3��4��;��D�>5���.#$(-�/!"�*����<$(-�'")+'"%���$2�2��0%+)4)!+#$'"�3���5��*�-#+14("-+/$&"�8+)/"#$+�<+%�$'"(/$4*$"'� +%� /!"� )�12�("(/� #"%2�(%$8�"� *�#� 8�/!�� /.1�##"-#"%%$�(�+%�<"���+%�/�6$)$/0�� �<"&"#������'�"%�(�/"6"#/� /!"%"� "**")/%� '$#")/�0� 8./� /!#�.-!� +)/$&+/$(-+,&+#$"/0��*�$11.("�)"��%���1�(-�/!"1�+#"�1�%/�(�4/+8�0�1�(�)0/"%��1+)#�2!+-"%�+('���%�/!+/�#"%2�('/��/!"�%/$1.�+/$�(�<$/!�+,)�12�"6�2+//"#(��*�2!0%$�4��-$)+��)!+(-"%��%.)!�+%�"62#"%%$�(��*�)"#/+$(�%.#*+)"1��").�"%�+('�%")#"/$�(��*�%��.8�"�1"'$+/�#%�$()�.'4$(-�/.1�#�(")#�%$%�*+)/�#�+�2!+�3 ��4α5�3J� ����+('���������D�5�� 3����9���� "/� +��� ��?�5�� ��4α�� +�4/!�.-!��#$-$(+��0�'"%)#$8"'�+%�+(�+(/$4/.1�#�*+)/�#�!+%�(�<�8""(�<"���)!+#+)/"#$Z"'�+%�+,2#�4$(*�+11+4/�#0�)0/�=$("��J0�+)/$(-��(�&+%).�+#�"('�/!"�$+��)"��%$/�)+.%"%�'+1+-"�/��8���'�)+2$��+#$"%�+('��/!.%��1"'$4+/"%�8�/!��%�1"��*�/!"�)�$($)�%012/�1%�%""(�$(�%"2/$)%!�)=�+%�<"���+%�'"%/#.)/$�(��*� /.1�#� /$%%."�80�'"42#$&$(-�$/�*#�1�(./#$"(/%�+('��60-"(�3����:������5��(�+''$/$�(�/�������+,&+#$"/0��*��/!"#�1$)#�8$+��%.84

%/+()"%�%.)!�+%��$2�/"$)!�$)�+)$'�+('�1.#+10��'$2"24/$'"�*#�1�-#+142�%$/$&"�8+)/"#$+��#�1+((+(�*#�1�0"+%/+#"�2�/"(/�%/$1.�+/�#%��*�/!"�$((+/"�$11.("�%0%/"1��(/"#"%/$(-�0��/!"0�+)/�$(�1.)!�/!"�%+1"�<+0�+%������(� /!"���D�%�� /!"� $11.(�%/$1.�+/�#0�2#�2"#/$"%��*8+)/"#$+������<"#"� '$%)�&"#"'� 3 �:���� "/� +����D>5��3;����� ��"/�+�����DD5��J+)/"#$+������'$*4*"#%�*#�1�/!+/��*�1+11+�$+(%�$(�/!"�*#"I."()0��*��2'$(.)�"�/$'"%��<!$)!�+#"�+&�$'"'�3[�2�%.22#"%%$�(\5$(�1+11+�%���.#/!"#1�#"��$(�)�(/#+%/�/��1+11+�$+(����/!"�)0/�%$("�#"%$'."%�$(�8+)/"#$+���2�'$(.)�"4�/$'"%� +#"�-"("#+��0�(�/�1"/!0�+/"'� 3������� "/� +�����>5���/.'$"%�<$/!�%0(/!"/$)���$-�'"�60(.)�"�/$'"%!+&"�#"&"+�"'�+,!"6+1"#$)�)�(%"(%.%�%"I."()"�*�#�$14

1.(�%/$1.�+/�#0��2�1�/$*%�)�(%$%/$(-��*�+,)"(/#+��2�'$(.)�"�/$'"�*�+(="'�80�/<��2.#$("%�+/�/!"��a"('+('�/<��20#$1$'$("%�+/�/!"��a"('�3�a4�.�.��0�04�a5� 3:����"/�+�������5�� �<"&"#�� $/� /.#("'��./� /!+/8�/!��8+%"4%"I."()"�+%�<"���+%�8+)=8�("�)!"1$%/#0$(*�."()"�/!"�$11.("4%/$1.�+/�#0�"**$)+)0��*�$('$&$'4.+���2�1�/$*%�3���� �:;�+('����� �����5���('$&$'.4+���2�1�/$*%�+�%��"6!$8$/�1+#="'�%2")$"%�%2")$*$)$/03 �� �����+('�:��������5�� !$%�$%��*�2+#/$).�+#�$(4/"#"%/�<$/!�#"%2")/�/��&+))$("�'"%$-(�%$()"��2�1�4/$&"%�/!+/�2#�&"'��2/$1+��$(�+,1�.%"�1�'"��1+0�8"$("**")/$&"�$(�!.1+(%�

-!-!���#6(���#(� #:��2 �0#��:%!� !"� )"��.�+#"&"(/%��*�1+)#�2!+-"�+)/$&+/$�(�80��2�����%/#$=4$(-�0�2+#+��"��/!�%"�+)!$"&"'�<$/!��/!"#�1$)#�8$+��2#�'4.)/%�� !"%"�%.8%/+()"%�+#"�#")�-($Z"'�80�/!"�1+)#�2!4+-"�&$+�%�4)+��"'�[2+//"#(�#")�-($/$�(�#")"2/�#%\�3���5/!+/�<"#"�'"&"��2"'�"+#�0�$(�"&��./$�(�+('�#"2#"%"(/+,1")!+($%1��*�/!"�$((+/"�$11.("�%0%/"1�/��%$-(+�['+(-"#\�8+%"'��(�%/#.)/.#+�� %.#*+)"�)!+#+)/"#$%/$)%/!+/�+#"�%!+#"'�80�+,&+#$"/0��*�$(*")/$�.%�+-"(/%�8./+#"� +8%"(/��(�!�%/� )"��%���6+12�"%��*�����+#"� /!"1+((�%"�#")"2/�#�3�������"/�+������D5�����>�3���"/�+������>5�+('�%"&"#+��1"18"#%��*�/!"� ���4�$="�#"4)"2/�#�3 ��5�*+1$�0��J+%"'��(�/!"�-"("/$)�'$**"#"()"8"/<""(�����%"(%$/$&"�3�� 7 "�5�+('�����#"%$%/+(/3�� 7 "F5�1�.%"�%/#+$(%�� �#4>�<+%�$'"(/$*$"'�+%�/!"#")"2/�#�*�#�����3��� ���:�"/�+������D5�� �#4��$%�/!"#")"2/�#�*�#�8+)/"#$+��2"2/$'�-�0)+(���$2�/"$)!�$)�+)$'+('�10)�8+)/"#$+��)"���<+���)�12�("(/%�3�� 9���4����"/�+�������E����� ����"/�+�������5�+('��1�%/�#"4)"(/�0�� �#4��!+%�8""(�*�.('�/��8"�#"%2�(%$8�"�*�#�'"4/")/$(-��2������3 �����"/�+�������5�

-!�!���6(/'��+/(%$&���#(��($&��$��)��2 �0#4

��:%!��2�1"'$+/"'� $(/#+)"��.�+#�%$-(+�$(-�#"I.$#"%"('�)0/�%$%��*��2����7 �#4>�)�12�"6"%�+('�+)$'4$*$)+/$�(��*�"('�%�1"%���$-(+��/#+(%'.)/$�(�$(&��&"%/!"�10"��$'�'$**"#"(/$+/$�(�*+)/�#��0�DD�����:�+(' ������+)/$&+/$�(��*��=J�=$(+%"��1$/�-"(4+)/$&+/"'2#�/"$(�=$(+%"%��/!"�%/#"%%�=$(+%"%��4/"#1$(+��)4F.(=$(+%"%�F�:�7��+('�2�D�+('��*$(+��0��#"%.�/%�$(�/#+(4%)#$2/$�(+�� +)/$&+/$�(� �*�1.�/$2�"� -"("%� $(&��&$(-� �4�����4��+('���4=J�33 ��:���"/�+������DE� ��:4���"/�+�������E�����9������"/�+������?E�;��+('�:������D5���+(0�$11.(�#"-.�+/�#0�-"("%�)�(/+$(���4=J�#"%2�(%$&"�"�"1"(/%�$(�/!"$#�2#�1�/"#�#"-$�(%�+('

Page 5: designing immune responses with genetic immunization and - SAV

�<;��� ���������� �������������� ���� ��;������������9

$(!$8$/$�(��*���4=J�+�%��+8#�-+/"%��2�1"'$+/"'$11.("�)"���+)/$&+/$�(�3;��+('�:�������D5�

-!<!���''&'/+� +�%2#(%�%� �#��2 ����� !��� *+#�+,&+#$"/0��*�$11.("�)"���%2")$"%�!+&"�8""(�$'"(/$4*$"'�/!+/���'$#")/�0��#�$('$#")/�0���#"%2�('�/���2����� !"%"�$()�.'"�2#�*"%%$�(+�����%�31�(�)0/"%�1+)#�2!+-"%�+('���%5�+%�<"���+%��:��J,+('� ,)"��%3%""�/+8�"��5�� !"�'$#")/�+)/$�(����%�$%�2#�8+8�0�1�%/

$12�#/+(/�*�#�/!"�$11.(�%/$1.�+/�#0�"**")/��*��2����� !"%"�)"��%��<!"(�"()�.(/"#$(-��2�����.('"#-�� '#+1+/$)� 2!0%$���-$)+�� )!+(-"%� +**")/$(-8�/!�� /!"� $11.(�#"-.�+/�#0� *.()/$�(%��*� /!"����/!"1%"�&"%�+%�<"���+%���&$+�%")#"/$�(��*�)0/�=$("%��/!"�+)/$&+/$�(�%/+/.%��*��/!"#�$11.("�)"��%�

-!<!���/�+#2"/6�%!��+)#�2!+-"%�+#"�$('.)"'�80�2�����/��%")#"/"�+,2+("���*�)0/�=$("%��$(�2+#/$)4.�+#� /02"4�� $(/"#*"#�(%� 3���α7β5�� ��4�β�� � ��4α� �

�/�'���,

�$#")/�"���/02" "**")/ �**")/�#�1��").�"% �.()/$�(%

�+)#�2!+-"% 0"% ����α7β � �4��.24#"-.�+/$�(E+('�7��# ��2#�)"%%$(-E�"('#$/$)�)"��% ��2#"%"(/+/$�(

��4� +'!"%$�(�1��").�"%��("('�/!"�$+��)"��%E��4��.24#"-.�+/$�(

��4α +'!"%$�(�1��").�"%��("('�/!"�$+��)"��%E��4��.24#"-.�+/$�(E3+./�)#$("5�+)/$&+/$�(��*1+)#�2!+-"%E3&+%).�+#�'+1+-"5

��4� J4)"���'$**"#"(/$+/$�(�(/$8�'0�%")#"/$�(��+%%�%<$/)!

��4�� ���4γ�380��:�+('� !��)"��%5E !��)"���'$**"#"(/$+/$�(E�.22#"%%$�(��*� !��)"��%

� �4� ��2#"%"(/+/$�(�/����DT� )����4� %/+8$�$Z"%�)"��4)"���)�(/+)/��>� )�4%/$1.�+/�#0�%$-(+�����4��E��D� )�4%/$1.�+/�#0�%$-(+�

�+/.#+��=$��"#�)"��% (� ���4γ +)/$&+/$�(��*����E !��'"&"��21"(/E� �4��.24#"-.�+/$�(

�0/��0/$)�+)/$&$/0 '"%/#.)/$�(��*�/.1�#�)"��%

!��)"��% (� ���4γ +)/$&+/$�(��*����E !��'"&"��21"(/E� �4��.24#"-.�+/$�(

J�)"��% 0"% � �4�� ��2#"%"(/+/$�(�/����>T� !��>� )�4%/$1.�+/�#0�%$-(+�E��D� )�4%/$1.�+/�#0�%$-(+�E��4� J4)"���'$**"#"(/$+/$�(

�(/$8�'0�%")#"/$�(��+%%�%<$/)!

02"���-+-�-"("�@�(��#�)"%%��$/+/$�(A��F,�$#���;<>����D4����������

Page 6: designing immune responses with genetic immunization and - SAV

�<H ��� ���������� �������������� ���� ��;������������9

��4��+('���4���3� ����"/�+������?E�:��������E�����49������"/�+������?E�� ���;�"/�+�������E����"/�+������D5+('���<!"(�2#$1"'�80����4γ���/��"62#"%%�$('.)$8�"($/#$)� �6$'"� %0(/!+%"� 3$���5� 3�9�� � "/� +��� ���D5��(/"#*"#�(%� .24#"-.�+/"� /!"� %.#*+)"� "62#"%%$�(� �*� �4��1��").�"%��(�1�%/� )"��� /02"%�� #"%.�/$(-� $($()#"+%"'�%"(%$/$&$/0�/����DT�� �41"'$+/"'�)"����04%$%�+%�<"���+%�"(!+()"'�+(/$-"(�2#"%"(/+/$�(�80�����<!$)!�$%�#"I.$#"'�*�#� 4)"���+)/$&+/$�(�3J�� ��"/�+�����?5���(/"#*"#�(%�+�%��"(!+()"�/!"�)0/��0/$)�+)/$&$4/0��*��:�)"��%� +('�� $(�!.1+(%�� *+)$�$/+/"� !�� )"��'"&"��21"(/�80�2#�1�/$(-�/!"�"62#"%%$�(��*���4��#")"2/�#��(�/!"%"�)"��%�3���9���������; ����?5����4�� $%� +,1"'$+/�#� �*� ��)+�� $(*�+11+/$�(� /!+/� +)/%� �("('�/!"�$+��)"��%�/��"�"&+/"�/!"�"62#"%%$�(��*��".=�4)0/"�+'!"%$�(�1��").�"%�+('��!"()"��!"�2%�/��#")#.$/$11.("�)"��%�/��/!"�%$/"��*�$(*")/$�(�� ��4α��<!"(2#�'.)"'�+/�!$-!�)�()"(/#+/$�(%��"�-��$(�/!"�)+%"��*%0%/"1$)� $(*")/$�(�� $%� +,)"(/#+��1"'$+/�#� $(� %"2/$)%!�)=���/���<"#�)�()"(/#+/$�(%� ��4α��%$1$�+#�0�/���4���+)/%��(�"('�/!"�$+��)"��%�/��#")#.$/�("./#�2!$�%+('�1�(�)0/"%�/��/!"�%$/"��*�$(*")/$�(��.#/!"#1�#"�� ��4α� +)/$&+/"%�1�(�)0/"%� +('

1+)#�2!+-"%�$(�+(�+./�)#$("�1+(("#�+('��8�/!�� ��4α�+('���4��+#"�2�/"(/�$('.)"#%��*���4�����4���$(�/.#(�2#�1�/"%� /"#1$(+��J4)"��� '$**"#"(/$+/$�(�� %")#"/$�(�*�+(/$8�'$"%�*#�1�2�+%1+�)"��%�+('�'$**"#"(/$+/$�(�*�10"��$'�%/"1�)"��%�� ��4��� $%�+,="0�)0/�=$("� *�#/!"�'"&"��21"(/��*�)"��41"'$+/"'�$11.($/0�+('�/!"'"&"��21"(/��*� !�4/02"�$11.("�#"+)/$�(%�$(�-"(4"#+���(�+''$/$�(�/��/!"%"�"**")/%���2�����$()#"+%"%

/!"�"62#"%%$�(��*�%"&"#+��%.#*+)"�1��").�"%��(�1+)4#�2!+-"%��%.)!�+%�� �4�������4�����>���#���D�7D��� !"%"�1��").�"%�+#"�$(&��&"'�$(�+(/$-"(�2#"%"(4/+/$�(�+('�+)/$&+/$�(��*��012!�)0/"%�� !"�+�/"#+/$�(%/#$--"#"'�80��2���$-�(.)�"�/$'"%�!+&"�8""(�%!�<(/��2"#%$%/�*�#�2#���(-"'�/$1"�$(�1$)"�+*/"#�$(P")/$�(�*��2���$-�(.)�"�/$'"%� +('� "(!+()"� +(� $11.("#"%2�(%"�<$/!� +, !��8$+%� /�� %.8%"I."(/�0� $(P")/"'+(/$-"(%�33:�J�;�� ��"/�+�������������5��)/$&+/"'�1+)#�2!+-"%�"6!$8$/�'$#")/� /.1�#�)04

/�6$)$/0�/!+/�<+%�$($/$+��0�+//#$8./"'�2#$1+#$�0�/��/!"2#�'.)/$�(��*� ��4α�+('�#"+)/$&"�($/#$)��6$'"�$(/"#41"'$+/"%�� �<"&"#��1+(0�/.1�#�)"����$("%�/!+/�+#"�0%"'�80�+)/$&+/"'�1+)#�2!+-"%� $(�+,)"��4)"���)�(4/+)/4'"2"('"(/�1+(("#�+#"�(�/�%"(%$/$&"�/��#")�18$4(+(/� ��4α��#����3�� ���"/�+�������5���.#/!"#1�#"�

+,%��.8�"�*+)/�#�/!+/�$%�'$%/$()/�*#�1� ��4α�+('���!+%�8""(�'"%)#$8"'�+('�2+#/$+��0�2.#$*$"'�3 ��9�Q�"/+�������E��� 9��J�����"/�+�������5�8./� /!"�"6+)/1")!+($%1��*�/!$%�=$('��*�1+)#�2!+-"�/.1�#�)0/�4/�6$)$/0�$%�(�/�0"/�*.��0�.('"#%/��'�

-!<!-!���($+�������''%!��"('#$/$)�)"��%�+#"�.($I."$(�/!"$#�+8$�$/0�/��+)/$&+/"�(+b&"� ,�012!�)0/"%�+('�/!"#"*�#"��2�+0�+,="0�#��"�+%�����*�#�/!"�$('.)/$�(�*�+,2#$1+#0�$11.("�#"%2�(%"���$1$�+#�/��1+)#�2!4+-"%��8�("�1+##�<4'"#$&"'���%�#"%2�('�'$#")/�0�/��2�����80�%")#"/$�(��*� ��4���4��+('���4��� !"0�+�%��"62#"%%�$()#"+%"'��"&"�%��*���>�����D�+('�� �4����(�/!"$#�%.#*+)"�3����9������"/�+������D5�

-!<!�!��/�&+/'�5�''�+� 7��9���''%!��)/$&+/"'��:)"��%�2�+0�+(�$12�#/+(/�#��"�$(�/!"�"+#�0�2!+%"��*�+($11.("�#"+)/$�(�� !"%"�)"��%�2#�&$'"�/!"�1+P�#$/0�*����4γ�8"*�#"�/!$%�)0/�=$("�$%�%.22�$"'�$(�#"�"&+(/)�()"(/#+/$�(%�80�+)/$&+/"'� ,)"��%�� �<"&"#��2.#$4*$"'��:�)"��%�+22"+#"'�(�/�/��8"�+)/$&+/"'�'$#")/�080��2�����8./�+#"�2�/"(/�0�%/$1.�+/"'�80�/02"4�$(/"#*"#�(%����4���+('� ��4α��/!+/�+#"�%")#"/"'�801+)#�2!+-"%� +('���%� $(� #"%2�(%"� /���2����3J������"/�+�������5�����4γ� $%� /!"�)"(/#+��)0/�=$("*�#�1+)#�2!+-"�+)/$&+/$�(���+)#�2!+-"%�2#$1"'�80/!$%�)0/�=$("�2#�'.)"�($/#$)��6$'"�+('�#"+)/$&"��604-"(� $(/"#1"'$+/"%� +('�� !"()"�� %!�<�"(!+()"'�1$4)#�8$)$'+�� +)/$&$/0� /�<+#'%�2!+-�)0/�%"'�1$)#��#4-+($%1%�� ���4γ� +�%�� 2#�1�/"%� /!"� "62#"%%$�(� �*� �4��+('�4���+%�<"���+%�)�4%/$1.�+/�#0�1��").�"%�%.)!�+%���>���#���D����(�+''$/$�(�����4γ�"(!+()"%/!"�"62#"%%$�(��*�1��").�"%�$(&��&"'�$(�+(/$-"(�2#�4)"%%$(-�$()�.'$(-�/!"�[/#+(%2�#/"#��*�+(/$-"($)�2"24/$'"%\�3 ��5��#�/!"�2#�/"+%�1"�%.8.($/%����4��+('���4?���$(+��0�� ���4γ�2�+0%�+,="0� #��"�'.#$(-� /!"'$**"#"(/$+/$�(� �*� ,�012!�)0/"� +('� 2#�1�/"%� /!""%/+8�$%!1"(/��*�+, !��/02"�"(&$#�(1"(/�80�%/$1.4�+/$(-���4���2#�'.)/$�(�J"%$'"%� 2#�&$'$(-� ���4γ���:�)"��%� +�%�� "6!$8$/

$()#"+%"'� )0/��0/$)� +)/$&$/0� <!"(� +)/$&+/"'� +%+,)�(%"I."()"��*�/!"�2#"%"()"��*��2�������22���(�*+)/���:�)"��41"'$+/"'�+(/$/.1�#�+)/$&$/0�<+%�/!"*$#%/�8$���-$)+��"**")/��*�8+)/"#$+������/!+/�!+'�8""('"%)#$8"'�3;����� ��"/�+�����DD5�

�(�%&00/+)>�/!"�+)/$&+/$�(��*�$11.("�)"��%�80�2�����$($/$+/"%�+,)�12�"6�("/<�#=��*�)"��4)"��$(/"#+)/$�(%�+('�)0/�=$("�2#�'.)/$�(�)+%)+'"%� /!+/#"%.�/� $(�+(��&"#+���"(!+()"1"(/��*� $11.("�*.()4/$�(%�$(�+(�+(/$-"(4$('"2"('"(/�1+(("#�� !.%���2

Page 7: designing immune responses with genetic immunization and - SAV

�<���� ���������� �������������� ���� ��;������������9

����!+%�8""(�%!�<(�$(�+,1.�/$/.'"��*�$('"2"('"(/%/.'$"%�/��8"�+,2�/"(/�+'P.&+(/�<!"(�+22�$"'�2#$�#�/��#�/�-"/!"#�<$/!�2#�/"$(��#�����&+))$("%�

-!3!��::���%�#:��2 �����#(��"���"�=�"-��)4

�#5�(���/'/(��!� "�2"#� ,)"��%�)+(�8"�'$&$'"'�$(/�+/��"+%/�/<��*.()/$�(+��0�'$**"#"(/�%.8%"/%�� !��+(' !�� �012!�)0/"%� 3�������� +('��������� ��D�5� !"%"���>T� ,)"��� 2�2.�+/$�(%� +#"� '"*$("'�80� /!"'$%/$()/�%"/%��*�)0/�=$("%�/!"0�2#�'.)"�����4γ�$%�/!"%$-(+/.#"�)0/�=$("��*� !��)"��%�<!"#"+%���4>����4�+('���4���+#"�2#�'.)/%�)!+#+)/"#$%/$)�*�#� !��)"��%� !"%"�)0/�=$("%�+�%����'$#")/�0��#�$('$#")/�0���)�(4/#���+('�%/+8$�$Z"� /!"� !�7��8+�+()"��*�+(�$11.("#"%2�(%"�/!#�.-!�/!"�*����<$(-�1")!+($%1%G�3�5����4γ�2#�1�/"%� !��)"��%�80�"(!+()$(-���4���2#�'.)/$�(80�1+)#�2!+-"%�+('�"62#"%%$�(��*���4���#")"2/�#%�(���>T� ,)"��%����4����$(�/.#(��1"'$+/"%�/!"�'$**"#4"(/$+/$�(��*� !��)"��%�80�+)/$&+/$�(��*�� � >���$41.�/+("�.%�0�����4γ�%.22#"%%"%�/!"�'"&"��21"(/��* !��)"��%��3�5���(&"#%"�0����4>�$%�#"I.$#"'�*�#� !�)"���'$**"#"(/$+/$�(�&$+�+)/$&+/$�(��*�� � ��<!$�"���4>�+('���4���2+#/$+��0�$(!$8$/���4���2#�'.)/$�(�� !$%)�(%"I."(/�0� %.22#"%%"%� /!"� '"&"��21"(/� �*� !�)"��%�J�/!�!"�2"#� ,)"���%.8%"/%�+#"�+%%�)$+/"'�<$/!�'$%4

/$()/�"**")/�#�*.()/$�(%G��, !��2#�*$�"��"+'%�/��$141.(�-��8.�$(� )�+%%� %<$/)!$(-� /�� �-�� +('� �-�� $(1$)"�+('� �->�+('� �-�� $(�!.1+(%�+('�� /!"#"*�#"�1"'$+/"%� �-�� +('� "�%$(�2!$�71+%/� )"��4'"2"('"(/$11.($/0�� !$%�/02"��*�#"%2�(%"�$%�$12�#/+(/�*�#�"�$14$(+/$(-�2+#+%$/"�$(*")/$�(%�8./�$%�+�%��$12�$)+/"'�$(+��"#-$)�'$%"+%"��� !��2#�*$�"�"(!+()"%� !�4+(/$8�'0�2#�'.)/$�(

80�J,)"��%�3�-�+�$(�1�.%"5E�$/�+)/$&+/"%�2!+-�)0/$))"��%�+-+$(%/�1$)#�8$+��$(*")/$�(%�+%�<"���+%��:�)"��%+('�$%�#"I.$#"'�*�#�/!"�'"&"��21"(/��*�� �41"'$+/4"'� $11.($/0� +-+$(%/� &$#+�� $(*")/$�(%� �#�1+�$-(+(/)"��%�� "()"��<$/!�#"%2")/�/��)+()"#�&+))$("�'"%$-(�/!"�1�%/�+//#+)/$&"�+%2")/��*��24�8+%"'�+'P.&+(/%$%� /!"� '"&"��21"(/� �*� +, !�48$+%"'� $11.($/0�� (�1+//"#��<!"/!"#�+,-$&"(�/.1�#�$%�1�#"�%"(%$/$&"�/�� �%��#�/�������$(&��&$(-��:�)"��%��(� +''$/$�(� /�� /!"� "**")/%� '"%)#$8"� +8�&"��1�%/

8+)/"#$+�� +'P.&+(/%� $('.)"� /�6$)�)0/�=$("%� %.)!�+% ��4α�+('���4��� !"%"�)0/�=$("%��<!"(�"62#"%%"'%0%/"1$)+��0� $(� �+#-"� +1�.(/%�1+0� �"+'� /�� %"&"#"%012/�1%�%.)!�+%�%"2/$)�%!�)=�� "()"��*�#�&+))$("

'"%$-(��/!"�1�%/�)!+��"(-$(-�+%2")/�$%�/��*$('�+'P.4&+(/%�/!+/�2#�1�/"�+(��2/$1+�� !��#"%2�(%"�<!$�"1$($1$Z$(-�/!"�2#�'.)/$�(��*�/�6$)�)0/�=$("%�+('�/!"+%%�)$+/"'�%$'"�"**")/%���/!�.-!�1+(0�2#�)"%%"%�/!+/��)).#�+*/"#�+)/$&+4

/$�(�<$/!�&+#$�.%�1$)#�8$+��2#�'.)/%�+#"�%/#$=$(-�0%$1$�+#���2�����1+0�8"�%.2"#$�#��&"#��/!"#�+'P.4&+(/%�'."�/��$/%�+8$�$/0�/��/#$--"#�/!"�#"�"+%"��*��+#-"+1�.(/%��*���4����9!"(�)�12+#$(-�/!"�"**")/��*����+('��2���$-�(.)�"�/$'"%��(� /!"�1+)#�2!+-"4�$=")"����$("���9��>�$(&"%/$-+/�#%�*�.('�/!+/�/!"��+//"#0$"�'"'�%$-($*$)+(/�0�1�#"���4���/!+(�����3��9���;"/�+�������5����4���!+%�+�#"+'0�8""(�1"(/$�("'�2#"4&$�.%�0�+%�/!"�="0�*+)/�#�*�#� !��'"&"��21"(/�� !.%�)�12+#$(-�+(�+'P.&+(/a%�2�/"(/$+�� /��$('.)"���4��&"#%.%� ��4α�3+('���4�5�1$-!/�2#�&$'"�+,1"+(%�*�#"&+�.+/$(-�$/%�+22�$)+8$�$/0�

�!��"��2#��(��/'�#:������00&(�L/��#(�:#+

/���(��+�%�/+�"

9$/!�./�+,'�.8/���("��*�/!"��./%/+('$(-�*"+/.#"%�*�����$11.($Z+/$�(�$%�/!"��22�#/.($/0�/��)�4'"4�$&"#�$(*�#1+/$�(�/�-"/!"#�<$/!�/��/!"�+(/$-"(4)�'4$(-�%"I."()"��(�/!"�2�+%1$'�������(�#")"(/�0"+#%%"&"#+�� %/#+/"-$"%� !+&"� %.))"%%*.��0� 8""(� .%"'� /�1�'.�+/"�/!"�$11.("�#"%2�(%"�+*/"#�����$11.($4Z+/$�(��%.)!�+%G�3$5�'$**"#"(/�1�'"%�+('�%$/"%��*�-"("'"�$&"#0��3$$5�)�4'"�$&"#0��*�-"("%��#�+'P.&+(/�1��"4).�"%�<$/!�#"-.�+/�#0�+('7�#�%/$1.�+/�#0�2#�2"#/$"%+('�3$$$5�1�'$*$)+/$�(��*�/!"�&")/�#�%"I."()"%�80�$(4%"#/$(-��#�'"�"/$(-�)0/�%��$)��#�"('�%�1+��/#+(%2�#/%$-(+�%� !"%"�2�%%$8$�$/$"%��"$/!"#�+%�%$(-�"�+22#�+)!"%��#

$(�'$**"#"(/�)�18$(+/$�(%��2"("'�+(�"(�#1�.%�2�+04-#�.('�*�#�"62"#$1"(/+/$�(�+('�"�$)$/"'�$(/"#"%/$(-+%2")/%�*�#�8�/!�&+))$("�'"&"��21"(/�+%�<"���+%�8+4%$)�$11.(���-$)+��2#�)"%%"%�

�!�!��"���(:'&�(���#:�0#$��/($�%����#:�6�(��$�4

'� �+)!� <��"+#�0�%/.'$"%�'"1�(%/#+/$(-�"**$)$"(/�!.41�#+��+('�)"��.�+#�#"%2�(%"%�80�$(P")/$�(��*�2�+%1$'����.%"'�+,8$��$%/$)�/")!(���-0�3-"("�-.(5��<!$)!<+%��#$-$(+��0�'"&"��2"'�*�#�$12#�&$(-�/#+(%*")/$�($(�2�+(/%�3 ���"/�+��������������"/�+�������5���(%.8%"I."(/�2.8�$)+/$�(%�+�%��$(/#+1.%).�+#�3����� "/�+������>E�9���"/�+�������E�9� ���J��"/�+�������E;��:��:���"/�+�������5�+('�$(/#+'"#1+������$(4

Page 8: designing immune responses with genetic immunization and - SAV

�3. ��� ���������� �������������� ���� ��;������������9

P")/$�(�3����"/�+������>E��� ��"/�+�������E�� �����"/+��� ����5�<"#"�.%"'� /�� %/$1.�+/"'�+(/$-"(4%2")$*$)!.1�#+��+('�)"��.�+#�$11.("�#"%2�(%"%��(/"#"%/$(-�0��-"("�-.(�+('�$(/#+'"#1+���#�$(/#+4

1.%).�+#�+22�$)+/$�(�'$**"#"'�%/#$=$(-�0�$(�/"#1%��*/!"�/02"��*�$11.("�#"%2�(%"�$('.)"'�80�/!"�'$**"#4"(/�-"("4'"�$&"#0�1"/!�'%���,2#"'�1$(+(/� !��/02"#"%2�(%"�<+%��8%"#&"'�+*/"#�-"("�-.(�$11.($Z+/$�(<!"#"+%� $(/#+1.%).�+#� 3$�1�5� �#� $(/#+'"#1+�� 3$�'�5$(P")/$�(� "�$)$/"'� +,1�#"� !�� 8$+%"'� #"%2�(%"3��� ^� ��"/�+������?5� !"�'$**"#"(/�"**$)+)$"%��*�-.(�&"#%.%�(""'�"�$(4

P")/$�(�$(�'$**"#"(/�2+/!�-"(�1�'"�%�1+0�#"*�")/�/!"#"I.$#"1"(/��*�+, !���#� !��8$+%"'�#"%2�(%"� /02"*�#�"**$)$"(/�2#�/")/$�(�+-+$(%/�'$**"#"(/�2+/!�-"(%���#�8�/!�-"("�-.(�$11.($Z+/$�(�+%�<"���+%�*�#�(""4'�"� $(P")/$�(� %2")$*$)� +('� %.2"#$�#� 2#�/")/$�(� '+/+!+&"�8""(�'"1�(%/#+/"'�3J���� �"/�+�������E���� 4����"/�+������?����'1"���"/�+�������������E� �� �"/�+�������E�9�����"/�+�������5� !"�#"+%�(�<!0�'$**"#"(/�1�'"%�/+#-"/$(-�/!"�%+1"

%$/"�3%.)!�+%�/!"�'"�$&"#0��*�2�+%1$'�����$(/��/!"%=$(�80�-"("�-.(��#�80�(""'�"5�#"%.�/%�$(�%.)!�%/#$=4$(-�0�'$**"#"(/� /02"%��*� #"%2�(%"%� $%� %/$��� (�/� *.��0.('"#%/��'���(�8�/!�)+%"%���%�%.)!�+%��+(-"#!+(%)"��%�2�+0�+,)#.)$+��#��"�$(�/!"�2#$1+#0�#"%2�(%"�/#$-4-"#"'�80�/!"�����&+))$("%����/!�.-!�����$11.4($Z+/$�(�#"%.�/%�$(�/#+(%*")/$�(��*�+,%1+���2#�2�#/$�(�*���%��(�0��$/��"+'%�/��+,<$'"%2#"+'�+)/$&+/$�(��*��%�$(�/!"�'#+$($(-��012!�(�'"���+/��"+%/�+*/"#�-"("-.(�$11.($Z+/$�(�4�� /!.%�2#�&$'$(-�(")"%%+#0�%$-4(+�%�*�#�"**")/$&"� ,)"���+)/$&+/$�(�3��������"/�+�����D5���("�"62�+(+/$�(�*�#�/!"�'$**"#"()"�$(�/!"�'"4�$&"#0�1"/!�'%�$%�/!+/�/!"0�2#�&$'"�I.+�$/+/$&"�0�+('I.+(/$/+/$&"�0�'$**"#"(/�['+(-"#\�%$-(+�%�+/�/!"�%$/"�*� $(P")/$�(��9$/!� #"%2")/� /��-"("�-.(� $(�).�+/$�(+,%.**$)$"(/� +)/$&+/$�(� %$-(+�� *�#���%� +22+#"(/�0)�1"%�*#�1�/!"�8�18+#'1"(/��*�/!"�%=$(�<$/!�-��'2+#/$)�"%�$/%"�*�$('"2"('"(/��*�2�+%1$'�����3���4�����"/�+������D5��2�(�$�'��$(P")/$�(��*�%+�$("�����!�<"&"#��/!"�'�1$(+(/�+)/$&+/$(-�%$-(+��2#"%.1+8�0)�1"%� *#�1� $11.(�%/$1.�+/�#0� %"I."()"%� 3���5<$/!$(�/!"�2�+%1$'�����$/%"�*�3'$%).%%"'�$(�'"/+$��+/"#5�� !"%"�����)�(/+$($(-�+(�.(1"/!0�+/"'��2'$(.)�"�/$'"�)�#"� $(�+,'"*$("'�8+%"�)�(/"6/� 3[�21�/$*%\5�%/$1.�+/"� !��)0/�=$("%�%.)!�+%���4���+('���%�*#�1���%��1+)#�2!+-"%�+('��:�)"��%���(�+''$4/$�(���2�1�/$*%�"(!+()"�/!"�"62#"%%$�(��*�&+#$�.%

)�4%/$1.�+/�#0� �$-+('%� %.)!� +%���D�����>��� +('����4���(����%���22#�6$1+/"�0����4/$1"%�1�#"2�+%1$'�����$%�.%"'�*�#�$�'��(""'�"�$(P")/$�(�)�142+#"'�/��-"("�-.(�'"�$&"#0��<!$)!�1+0�8"�#"%2�(%$48�"�*�#�/!"�2#"'�1$(+(/� !��/02"�#"%2�(%"�3J���;+('�F� �� ������?5��(�%�1"�2+/!�-"(�1�'"�%�-"("�-.(�$11.($Z+/$�(

!+%�2#�&"(�/��8"�%.2"#$�#�/��"$/!"#�$�'���#�$�1��$(P")4/$�(��*�2�+%1$'�������(/"#"%/$(-�0��/!$%�<+%�(�/�#"4%/#$)/"'�/��!.1�#+��#"%2�(%"%�3J���� �"/�+�������E��� ����"/�+������?E���������"/�+�������E�9�����"/�+������5��<!$)!�)�.�'�!+&"�8""(�"62�+$("'�80�/!"�1�#""**$)$"(/�/#+(%*")/$�(��*�)"��%�<$/!�+,8$��$%/$)�'"&$)"�8./�+�%��+**")/"'�/!"�$('.)/$�(��*�� ��#"%2�(%"%�+('2#�/")/$&"� $11.("� #"%2�(%"%�� �()#"+%"'�� �� #"4%2�(%"%�+('�1�#"�"**$)$"(/�%"#�)�(&"#%$�(�<"#"�#"42�#/"'� +*/"#� -"("� -.(� $(P")/$�(� 3)�12+#"'� /�� $�1�(""'�"�$(P")/$�(5��*�2�+%1$'�����"()�'$(-�/!"�"(4/$#"��&+�8.1$(�3���5��#�+,%2")$*$)������ ��"2$/�2"3;�� ����"/�+�������5���,)�12+#$%�(��*�� ��#"%2�(%4"%�+*/"#�-"("�-.(��#�$�'��$(P")/$�(��*�+,#+%�2���1$($4-"("�����&+))$("�"()�'$(-�+,("%/"'�� ��"2$/�2"<$/!$(�+, 4!"�2"#�"2$/�2"�#"&"+�"'�+,%$1$�+#�%.2"#$4�#$/0��*�/!"�-"("�-.(�'"�$&"#041"/!�'�3J��� ���"/�+������5�� !$%�<+%�/#."�*�#�'$**"#"(/�)�18$(+/$�(%��*)�(%/#.)/%�"62#"%%$(-�&+#$�.%�#+%�1$($4-"("�%"I."()4"%�3� ��"2$/�2"�+('7�#�!"�2"#�"2$/�2"5�$(�'$**"#"(/*�#1%� 3<$/!��#�<$/!�./� +(���4/+#-"/$(-� �"+'"#� %"4I."()"5� $('$)+/$(-� /!+/� /!"�"(!+()"'�"**$)$"()0��*/!"�-"("�-.(�<+%�$('"2"('"(/��*�/!"�2!0%$)+��*�#1+('�2#"%"(/+/$�(��*�/!"�"()�'"'�1$($4-"("�31+(.4%)#$2/�$(�2#"2+#+/$�(5�9$/!�#"%2")/�/��/!"�2#"'�1$(+(/� !��/02"�#"%2�(%4

"%�$('.)"'�80�-"("�-.(��/!"�I."%/$�(�+#$%"%�!�<�+('<!0�-"("�-.(�'"�$&"#0�$%�+,%.2"#$�#�1"/!�'�*�#�/!"$('.)/$�(��*�� ��#"%2�(%"%���"%2")$+��0�*�#�/!"�/#"+/41"(/��*�/.1�#%���)�12+#"'�/��/!"� !�48$+%"'�$�'���#$�1��$(P")/$�(�1�'"�� ��+,)"#/+$(�"6/"(/�/!$%�+22+#4"(/�0� 2+#+'�6� �8%"#&+/$�(� 1+0� %$12�0� 8"+,)�(%"I."()"� �*� /!"� %/#$)/� '"*$($/$�(� �*� -"("� -.(#+$%"'� #"%2�(%"%�+%�%/#�(-� !��+('� $�'���#� $�1�� $(4'.)"'�#"+)/$�(%�+%�)�"+#� !��/02"���"%2$/"�+,'$%/$()/%"#���-$)+�� !��/02"�2#�*$�"�<$/!�!$-!��"&"�%��*��-�+('��-��8./���<��"&"�%��*��-�+�+(/$8�'$"%��$(�1+(0"62"#$1"(/%�-"("�-.(� $11.($Z+/$�(� $('.)"'�!$-!�"&"�%��*����4γ�$(�%.2"#(+/+(/%��*�%/$1.�+/"'�%2�""()"��%� 3���� ����� "/� +��� ����E�������� "/� +��� ����E;�� ����"/�+�������5�

Page 9: designing immune responses with genetic immunization and - SAV

�3���� ���������� �������������� ���� ��;������������9

�!-!��#$&'/��#(� #:� �00&(�� +�%2#(%�%� �)� �#4

$�'� �+)� #:� �00&(�� %��0&'�!��,.($I."� *"+/.#"� �*����&+))$("%�$%�/!+/�/!"0�1+="�$/�&"#0�"+%0�/��'"4�$&"#�+''$/$�(+��$(*�#1+/$�(�/��/!"�$11.("�%0%/"1� !$%�$%�-"("#+��0�'�("�80G�3$5�"62#"%%$�(��*�+''$/$�(4+��$(*�#1+/$�(�80�+,%"2+#+/"�)+%%"//"��(��("�2�+%1$')�(%/#.)/�� 3$$5� )�4$(P")/$�(� �*� +,%"2+#+/"� 2�+%1$'<!$)!�)�(/+$(%�/!"�+''$/$�(+��$(*�#1+/$�(�+('�3$$$5+'P.&+(/�%.8%/+()"%�

�!-!�!��#'#()�%��0&'/��(6�:/��#+%�/%�6�(�����/$4

�& /(�%!��,�+#-"� (.18"#� �*� 2.8�$)+/$�(%� !+&"� +'4'#"%%"'�/!"�)�4'"�$&"#0��*�$11.(�%/$1.�+/�#0�*+)4/�#%�$(�&+#$�.%�)�18$(+/$�(%�$(�'$**"#"(/�2+/!�-"(%�#�/.1�#�1�'"�%�� !"�-#+(.��)0/"41+)#�2!+-"�)��4�(04%/$1.�+/$(-�*+)/�#�3�4���5�$%��("��*�/!"�1�%/$(/"(%$&"�0�%/.'$"'�1��").�"%�#"-+#'$(-�$/%�)�%/$1.4�+/�#0�"**")/%� *�#�����$11.($Z+/$�(���4���� $%$12�#/+(/�*�#�-#�</!��'$**"#"(/$+/$�(�+('�1+/.#+/$�(�*� /!"�1�%/� 2�/"(/� 2#�*"%%$�(+�����%�� /!"���%3J��� ������ ���������E���������������������5'�(/#+1.%).�+#�$(P")/$�(��*�2�+%1$'�����"()�'4

$(-����4��+('����4�� #"%.�/"'� $(� $12#�&"'+(/$4/.1�#� $11.($/0� <!"(� /!"� 2�+%1$'� )�4"642#"%%"'��4����3+('�+�%����D�5�$(�+,J���1"�+4(�1+�1�.%"�1�'"��3J�����+('������������5��,%$1$�+#�+22#�+)!�<+%�.%"'�80�+(�/!"#�-#�.2�/!+/$11.($Z"'� #+/%�<$/!� +,8$)$%/#�($)� 2�+%1$'�<!$)!$('"2"('"(/�0�"62#"%%"'�/!"�+(/$-"(%�����#�����*/!"�!"2+/$/$%��,&$#.%�3 ��5�+('�/!"��4����-"("3����"/�+������D5�� !"�+(/$8�'0�#"%2�(%"�+%�<"���+%�012!�2#��$*"#+/$�(�<+%�%$-($*$)+(/�0�$()#"+%"'�80)�4"62#"%%$�(��*�/!"��4����-"("���(/#+1.%).�+#���� $11.($Z+/$�(�<$/!� +,!"#2"%� %$12�"6� &$#.%-"("�"()�'$(-�/!"� ��4��-��2#�/"$(�/�-"/!"#�<$/!+,2�+%1$'�)�'$(-�*�#��4����"(!+()"'� /!"�2#�4'.)/$�(��*��-���-��+('��-��+(/$8�'$"%���012!�24#��$*"#+/$�(�+('�)0/�=$("�%")#"/$�(�<!"(�)�12+#"'/��$11.($Z+/$�(�<$/!�/!"� ��4��-��-"("�+��("�3���"/�+������D5�� !"�'#+%/$)�$()#"+%"��*�/!"��-��+(/$48�'0�%.8)�+%%�$('$)+/"'�+, !��/02"�8$+%��*�/!$%�#"4%2�(%"���.#/!"#1�#"��)�4$(P")/$�(�$12#�&"'�2#�/")4/$�(�*#�1��"/!+��)!+��"(-"�<$/!� ��4����$1$�+#�%"4#���-$)+��#"%.�/%�<"#"�*�.('�$(�+,1�.%"�1�'"���*+"#�%��� /.8"#).��%$%�<$/!�2�+%1$'�����"()�'$(-/!"��'���*���$���4%")#"/"'�2#�/"$(%���� �>�+('�-D�J�3:��� �"/�+�������5���(/#+1.%).�+#�)�4$(4P")/$�(��*�+,2�+%1$'�)�(/+$($(-�/!"��4����-"(""�$)$/"'�"(!+()"'�!.1�#+��+('�)"��.�+#�$11.("�#"4

%2�(%"%�8./�'$'�(�/�$12#�&"�/!"�2#�/")/$&"�"**$)+)0+*/"#�)!+��"(-"� ��*$('�/!"�1�%/�"**")/$&"�!"1+/�2�$"/$)�-#�</!

*+)/�#�*�#�-"("/$)�&+))$(+/$�(�/!"�+./!�#%��*��("�%/.'0)�12+#"'�/!"�"**")/��*�)�%/$1.�+/$�(�<$/!��4�����4����+('�4����3:���"/�+�������5���%�<$/!� ��� ���+('� /.8"#).��%$%�� /!"� ��4������'"�$&"#"'/�-"/!"#�<$/!��4��������%!�<"'�$()#"+%"'�+(4/$8�'0�+('�2#��$*"#+/$&"�#"%2�(%"%�� "%/$(-�/!"�2�%4%$8�"� )�18$(+/$�(%� �*� +��� /!#""� -#�</!� *+)/�#%� #"4&"+�"'�/!+/��4����$(�+(0�)�18$(+/$�(�2#�&$'"'�/!"8"%/�"(!+()"1"(/��*���DT4� ��#"%2�(%"%�

�!-!-!��)�#5�(��6�(�%�/%��00&(#0#$&'/�#+%�:#+

6�(������00&(�L/��#(!��1�(-�/!"� 4)"���-#�</!�*+)4/�#%��/!"�)0/�=$("%���4��+('���4?��+('�/!"� !�48$+%$(-)0/�=$("%���4���+('����4γ�<"#"�$(/"(%$&"�0�%/.'$"'$(�)�4"62#"%%$�(�"62"#$1"(/%�� �(�+,!"2+/$/$%�J,&$#.%3 J�5�1�.%"�1�'"��8�/!�+,*.%$�(�)�(%/#.)/�"()�'4$(-�/!"�1$''�"�"(&"��2"�+('���4��2#�/"$(�+%�<"���+%+,8$)$%/#�($)�&")/�#� %"2+#+/"�0� "()�'$(-� /!"�1$''�""(&"��2"�2#�/"$(� +('� ��4��<"#"�.%"'� 3� �9�"/� +�����?5����"62#"%%$(-� ��4�� #"%.�/"'� $(�"(!+()"'�!.41�#+��+('�)"��.�+#�$11.("�#"%2�(%"%�+('�+,%�$-!/� !�/02"�1�'.�+/$�(�� �(� +''$/$�(�� &+))$("� "**$)+)0�<+%$()#"+%"'�80�+/��"+%/����4*��'�80�/!"�)�"62#"%%$�(��*��4��+%�1"+%.#"'�80�/!"�'�%"��*�&+))$("�(""'"'� !"�$11.("�#"%2�(%"�$(�1$)"�*����<$(-�-"("�-.(

$(�).�+/$�(��*�)�(%/#.)/%�"()�'$(-� ��4��-2�����#(.)�"�2#�/"$(� *#�1� $(*�."(Z+� %!�<%� +, !�48$+%3���;���"/�+������?5�� �<"&"#��/!"�)�4'"�$&"#0��*��4�����4?���#���4���2�+%1$'�����8��)="'�/!$%�"*4*")/�80�1+#="'�0�"(!+()$(-�-2���4�%2")$*$)����4γ2#�'.)/$�(��+('�%.22#"%%$(-���4>�+('��-��#"%2�(%"%��(�+(�/!"#�%/.'0��/!"�+./!�#%�+//"12/"'�/��1�'.4

�+/"�/!"�$11.("�#"%2�(%"�+-+$(%/� ��4��80�)�4'"4�$&"#0��*�-"("%�*�#���4���+('��4����+��(-�<$/!����&+))$("%�3:���"/�+������?5����4"62#"%%$�(��*��4���#"'.)"'�/!"�!.1�#+��#"%2�(%"�<!$�"��4���$()#"+%"'�+(/$8�'0�2#�'.)/$�(��J�/!�)0/�=$("%�1"4'$+/"'�%$-($*$)+(/�+(/$-"(4%2")$*$)� ,)"���%/$1.�+/$�(8./��(�0�)�4'"�$&"#0��*���4���#"%.�/"'�$(�+(�$()#"+%"$(�%2")$*$)�� ��#"%2�(%"%��$-($*$)+(/�"(!+()"1"(/��*� !��)"��%�3$()�.'$(-

!$-!�/$/"#%��*��-�+�+('�+,'")#"+%"'�2#�'.)/$�(��*�-��+(/$8�'$"%5�<+%��8/+$("'�+*/"#�)�4"62#"%%$�(�*���4���+('����4γ�/�-"/!"#�<$/!� J��2�+%1$'����3� �9�"/�+������D5���(�)�(/#+%/��)�4'"�$&"#0��*���4>$('.)"'�+,)�"+#� !��2#�*$�"�<$/!�$()#"+%"'�2#�'.)4

Page 10: designing immune responses with genetic immunization and - SAV

�3- ��� ���������� �������������� ���� ��;������������9

/$�(��*� �-��+(/$8�'$"%� +('� %.22#"%%$�(��*� �-�++(/$8�'$"%����4$(P")/$�(��*�/!"���4���#�/!"��4���-"("�"(!+()"'�/!"�'"&"��21"(/��*� !��)"��%��<!$�"/!"�'"&"��21"(/��*� !��)"��%�<+%�(�/�+**")/"'��+('/!"�2#�'.)/$�(��*��-��+('��-�+�+(/$8�'$"%�<"#"8�/!�$()#"+%"'����4���+('����4γ�!+'�/!"�1�%/�2#�4(�.()"'�"**")/��(�� ��#"%2�(%"%��<!"#"+%���4>�%.242#"%%"'�/!$%�+)/$&$/0��2�(�)!+��"(-"�<$/!� J%�-4"62#"%%$(-�%0(-"("$)�/.1�#%��%$-($*$)+(/�#"'.)/$�(�*�/.1�#�-#�</!�<+%��8%"#&"'�$(�1$)"�/!+/�<"#"�)�4+'1$($%/"#"'�/!"���4���-"("�8./�(�/�/!"���4>�-"("���4��� )�4"62#"%%$�(�<+%� +�%�� '"1�(%/#+/"'� /�� 8"(")"%%+#0�*�#�"**")/$&"�+(/$4/.1�#�$11.($/0�$('.)"'80�-"("�-.(�$11.($Z+/$�(�<$/!�2���1./+(/�2#�/"$(/"%/"'�$(�/!"��"/!��,%+#)�1+�1�'"��3 ���"/�+������5����4α� #"2#"%"(/%�+(�/!"#�2�/"(/$+��)+('$'+/"��*

+, !�48$+%$(-�)0/�=$("��<!$)!�$%�-"("#+��0�+%%�)$+/4"'�<$/!�&$#+�� $(*")/$�(%���%�<$/!���4������4�D�+('���4γ�� $/�<+%� %!�<(� /!+/� )�4"62#"%%$�(� �*� ���4α%!$*/"'�/!"�#"%2�(%"�/�<+#'%�+, !��2!"(�/02"�3 4���"/�+�������5�

�!-!�!��#4�(�����#(�#:����� /���(�%�/($�+��#04

��(/(���)�#5�(�%!��(�+''$/$�(�/��/!"�)�4'"�$&"#0�+%-"("%��)0/�=$("%�)+(�8"�+�%��)�4$(P")/"'�$(�/!"�*�#1�*� #")�18$(+(/�1��").�"%�� !$%�<+%�'"1�(%/#+/"'$(� +(� "62"#$1"(/+��1.#$("� /.1�#� "62#"%%$(-� /!"1�'"��/.1�#4+%%�)$+/"'�+(/$-"(�c4-+�+)/�%$'+%"�3c4-+�5� +('�2�+%1$'�����"62#"%%$(-�c4-+�� '"�$&"#"'80�-"("�-.(���$-($*$)+(/�#"'.)/$�(�$(�/!"�(.18"#��*"%/+8�$%!"'��.(-�1"/+%/+%"%�<+%��8%"#&"'�<!"(�!.41+(�#��4���1�.%"�#��4���!.1+(�#��4?���#�1�.%"�#��4���<"#"�+'1$($%/"#"'�+*/"#�����$(�).�+/$�(E�1�.%"#��4���+%�+(�+'P.&+(/�!+'�/!"�1�%/�2#�*�.('�"**")/3�������� ���������5� !"%"�+'P.&+(/�%/#+/"-$"%�!+&"�8""(�"6/"('"'�/�

2#$1+/"�1�'"�%�<$/!�%$1$�+#�#"%.�/%�+22�0$(-�)�4"642#"%%$�(�%/#+/"-$"%�<$/!���4������4�D�+('����4γ�/�4-"/!"#�<$/!� ���&+))$("%�3:���"/�+�������5�

�!-!<!��#4$�'� �+)�#:��#4%��0&'/�#+)�/($�/$"�4

%�#(�0#'��&'�%!��"#0�%��(�+*/"#� /!"�"%/+8�$%!1"(/�*�/!"�*$#%/�����$11.($Z+/$�(�2#�/�)��%��)�4%/$1.4�+/�#0�1��").�"%� %.)!� +%���D�� +('���D���<!$)!2#�&$'"�/!"�)#.)$+��%")�('�%$-(+��#"I.$#"'�*�#��2/$41+�� ,)"���+)/$&+/$�(��8")+1"�/!"�/+#-"/��*�$(/"(%$&"$(&"%/$-+/$�(�� !"�)�12�"6�$11.("�1�'.�+/$�(��*��D�����D������D�+('�� ��>�$(�����&+))$("%<"#"�$(&"%/$-+/"'�80�%"&"#+��-#�.2%����#�/!"�1�'"�

+(/$-"(�c4-+�+)/�%$'+%"�3 ��������"/�+������D5��*�# ��4��+(/$-"(%�3:���"/�+������?5�+('�*�#�/!"�(.)�"4�2#�/"$(��*� $(*�."(Z+� 3�9���:��"/�+������?5� /!"�+.4/!�#%�'"1�(%/#+/"'�/!+/�� ��$('.)/$�(�8./�(�/�!.41�#+��#"%2�(%"%�<"#"�2#$1+#$�0�+**")/"'�80�)�4"642#"%%$�(��*���D��+('���D��<$/!�+,1�#"�2#�(�.()"'"**")/��*���D��� �<"&"#��$11.($Z+/$�(�<$/!�2�+%41$'�����"()�'$(-�+,1$($1+��� ��"2$/�2"��*��&+�48.1$(�3���5�#"&"+�"'�'$**"#"(/�#"%.�/%�3�����"/�+�����?5����4"62#"%%$�(��*���D��<+%�1�#"�2�/"(/�+/%/$1.�+/$(-�� ��#"%2�(%"�/!+(���D����.#/!"#1�#"�$(�)!+��"(-"�"62"#$1"(/%�.%$(-����4/#+(%*")/"'�/.41�#%�)�4'"�$&"#0��*���D���8./�(�/��*���D���2#�4��(-"'�%.#&$&+����(�+,1.#$("�1+�+#$+�1�'"��<"�(�/4"'�/!+/�+(/$8�'0�#"%2�(%"%�+%�<"���+%�2#�/")/$�(�*#�1)!+��"(-"�<"#"�%/#�(-�0�+**")/"'�80�)�4$11.($Z+4/$�(�<$/!�+,���4����&+))$("�+('� /!"�J?���-"("��"2"('$(-��(�/!"�$(/"#&+��8"/<""(�/!"�)�4$11.($4Z+/$�(%�/!"�$11.("�#"%2�(%"�<+%�"$/!"#�%/#�(-�0�"(4!+()"'��#�%.22#"%%"'�39�9��"$/("#��F����0�(��.(42.8�$%!"'��8%"#&+/$�(5���#")"(/�%/.'0�$('$)+/"'�/!+/�+'!"%$�(�1��").�"%

1+0�+�%��%"#&"�+%�2�/"(/�)+('$'+/"%�*�#�$11.(�1�'4.�+/$�(�80�)�4$(P")/$�(��*� /!"� #"%2")/$&"�-"("%� /�4-"/!"#�<$/!�2�+%1$'�����3:���"/�+�������5�� "#"�/!"�+./!�#%�"6+1$("'�/!"�#��"��*�$(/#+)"��.�+#�+'!"4%$�(�1��").�"4�� 3����4�5�� �012!�)0/"� *.()/$�(+%%�)$+/"'4�� 3���4�5�� +('� &+%).�+#� )"��� +'!"%$�(1��").�"4�� 3����4�5�+��(-�<$/!�����$11.(�4-"(%���(/$-"(4%2")$*$)��012!�2#��$*"#+/$�(�+('�)04/�/�6$)�#"%2�(%"%�<"#"�"(!+()"'�80�)�4"62#"%%$�(�*�����4��+('����4����.#/!"#1�#"��)�4$(P")/$�(��*8�/!�/!"%"�)�(%/#.)/%�+�%��$()#"+%"'�/!"��"&"���*����4γ��1+)#�2!+-"�$(*�+11+/�#0�2#�/"$(4�α�+('�c�� !"2+/!<+0%�$(&��&"'�$(�����4��+('����4��)�%/$1.4�+/�#0�2#�)"%%"%�'��(�/�%""1�/��8"�+%%�)$+/"'�<$/!��D�7���D�2+/!<+0%�+('�1+0�+)/�%0("#-$%/$)+��0��22���(�/!"#�"6+12�"�*�#�/!"�$((�&+/$&"�.%"��*�)�%/$14

.�+/�#0��#�#"-.�+/�#0�*+)/�#%��*�/!"�$11.("�%0%/"1%$(�����&+))$("%�<+%�'"1�(%/#+/"'�80�.%$(-�)�142�("(/%��*�/!"�)�12�"1"(/�%0%/"1�/��"(!+()"�$141.(�-"($)$/0�3�����"/�+�������5��2�(�)�12�"1"(/+)/$&+/$�(��+,*#+-1"(/��*�/!"�/!$#'�)�12�"1"(/�2#�4/"$(�3��'5�$%�#"�"+%"'�+('�8$('%�/��������<!$)!�"64"#/%�J,)"���%/$1.�+/�#0�2#�2"#/$"%�3�������+('���� 4�������5���,����&+))$("�"()�'$(-�'$**"#"(/�*�#1%�*� !"1+--�./$($(� 3 �5� *#�1� $(*�."(Z+� &$#.%�<+%

Page 11: designing immune responses with genetic immunization and - SAV

�3���� ���������� �������������� ���� ��;������������9

*.%"'�/��/!#""�/+('"1�)�2$"%��*�/!"�1.#$("�!�1�4��-."��*���'���))�#'$(-�/��/!"�!02�/!"%$%�/!"� �1�$"/0��*�/!"�*.%$�(�<�.�'�8$('�/��+(/$4 ��$11.4(�-��8.�$(�#")"2/�#%��(�J,)"��%�+('�%$-(+��/!#�.-!/!"�J,)"���#")"2/�#��<!$�"�/!"���'�1�$"/0��*�/!"�*.4%$�(�<�.�'�8$('�/��������(�/!"�J4)"���%.#*+)"�+('%$-(+��/!#�.-!��������('""'��/!$%�+22#�+)!�"(!+()"'/!"�+&$'$/0�1+/.#+/$�(��*�+(/$8�'$"%�+-+$(%/� ��+('+))"�"#+/"'�/!"�+22"+#+()"��*� �4$(!$8$/$�(�+)/$&$4/0���.#/!"#1�#"��/!"�+))"�"#+/"'�+(/$8�'0�#"%2�(%"%)�##"�+/"'�<$/!�+,1�#"�#+2$'�+22"+#+()"��*�2#�/")4/$&"�$11.($/0����12�"/"�2#�/")/$�(�*#�1�)!+��"(-")�.�'�8"�+)!$"&"'�<$/!�%$-($*$)+(/�0���<"#�'�%"%��*/!"�&+))$("�

�!-!3!� �#4$�'� �+)� #:� �2��#2�%� +��+&���(6

�8"�'2�+���''%!� ,!"�2"#�)"��%�(�/��(�0�2�+0�+,="0�#��"$(�/!"�!.1�#+��8#+()!��*�/!"�$11.("�%0%/"1�8./�+�%�)0/�/�6$)�#"%2�(%"%�'"2"('��(����#�+#"�$12#�&"'�80�� ,)"���!"�2�� !$%�!+%�8""(�'"1�(%/#+/"'�*�#�+(/$4&$#+������&+))$("%�"()�'$(-�"(/$#"�-"("%�39����"/+�������5�+('�%$(-�"�"2$/�2"%�3����:���"/�+������D5��(�/!"��+//"#�%/.'0��+(�"$-!/�+1$(��+)$'4��(-�"2$/�2"*#�1�/!"�$(*�."(Z+��,&$#.%�!"1+--�./$($(�<+%�$(%"#/4"'� $(/�� /!"� !"2+/$/$%�J,%.#*+)"� +(/$-"(� %"I."()"�<!$)!���$(�/!$%�)�(/"6/���%"#&"'�+%�+, �!"�2"#�+(/$4-"(�*�#�/!"�$(*�."(Z+�1$($-"("�/!.%�$('$)+/$(-�/!+//!"�!"�2"#�"2$/�2"�)+(�8"��*�!"/"#���-�.%��#$-$(��(�+,#")"(/�%/.'0�3J��� ���"/�+�������5�<"�$(&"%/$4

-+/"'�+,����1$($4-"("�)�'$(-�*�#�+,%$(-�"�2"2/$'"%"I."()"�'"#$&"'�*#�1�/!"�#+%��()�-"("%�3�J����"/�+�������5�/!+/�)�(/+$("'�8�/!���DT�+('���>T� ,)"��"2$/�2"%� $(� +,("%/"'� )�(*$-.#+/$�(� 3�J����� "/� +������5�� !$%�2"2/$'"�#"2#"%"(/%�#+%�%"I."()"�>4����+(')�(/+$(%�/!"�%.8%/$/./$�(��*��0�/���+��+/�2�%$/$�(����"("�-.(�$11.($Z+/$�(�<$/!�/!$%�)�(%/#.)/�$('.)"'8�/!�+(/$-"(4%2")$*$)�2#��$*"#+/$&"�+('�)0/�/�6$)�#"4%2�(%"%�� !"%"�#"%.�/%�%.--"%/�/!+/�+,%$(-�"�2#�/"$($11.(�-"(� )�(/+$($(-� ("%/"'�1./+(/� #+%4%2")$*$)��>T�+('���DT� ,)"���"2$/�2"%�)+(�8"�2#�)"%%"'��22�� /�� $('.)"� 8�/!� %.8%"/4%2")$*$)� ,�012!�)0/"#"%2�(%"%� +('� �"+'%� /�� /!"� -"("#+/$�(� �*+,I.+(/$/+/$&"�0�"(!+()"'���DT�� ��#"%2�(%"���$="4�0�'."�/��/!"�$(/$1+/"�)�"6$%/"()"��#�)��2"#+/$�(��*��>T�!"�2�3J��� ���"/�+�������5�

�(�%&00/+)>�/!"�2#$()$2�"�2$)/.#"�#$%$(-�*#�1�/!$%%)"(+#$��2�$(/%�/��/!"�"(�#1�.%�)�18$(+/�#$+��2�%4%$8$�$/$"%��*�����&+))$("%� *�#�1�'.�+/$(-� /!"� $141.("�#"%2�(%"�+/�'$**"#"(/��"&"�%���/�2#"%"(/��!�<4

"&"#��$/�1.%/�8"�2�$(/"'��./�/!+/�-"("#+��)�()�.%$�(%(""'�/��8"�'#+<(�)+#"*.��0��8")+.%"�'$**"#"()"%� $(/!"�<+0��*�2#"%"(/+/$�(��/!"�*�#1��*�/!"�+(/$-"(�+('/!"�$11.($Z+/$�(�2#�/�)���1+0�0$"�'�'$**"#"(/��%�1"4/$1"%�2+#+'�6�#"%.�/%�

�!�!��#$&'/��#(� #:� �"�� �00&(�� +�%2#(%�� �/

�+/(%'/��#(>�2+#��%%�(6�/($�2+�%�(�/��#(!�"("/$)$11.($Z+/$�(� !+%� %.))"%%*.��0� 2#�'.)"'� +(/$8�'0#"%2�(%"%� +-+$(%/� %")#"/"'��1"18#+("48�.('� +(')0/�2�+%1$)+��0�%"I."%/"#"'�+(/$-"(%���"&"#+��2#�4/"$(%�%.)!�+%�#+8$"%�3Q����"/�+�������5�+('�!"2+/$4/$%�J,%.#*+)"�2#�/"$(�3� �9�"/�+������?5�<"#"�"I.+�4�0� $11.(�-"($)� $(� /!"$#�1"18#+("48�.('�+('�%"4)#"/"'�*�#1����#�+,(.18"#��*�+(/$-"(%�*#�1�'$**"#4"(/� %�.#)"%� 3$()�.'$(-� +��"#-"(%5� "62�#/� *#�1� /!")0/�%���'�"%�(�/�"&"(�%""1�/��8"�(")"%%+#0�� !$%�#+$%4"%�/!"�I."%/$�(�!�<�"**")/$&"�0�(+/$&"�+(/$-"(�$%�1+'"+))"%%$8�"�/�����%�+('�"%2")$+��0�/��J,)"��%�*�#�/!"$('.)/$�(��*�+,%/#�(-�+(/$8�'0�#"%2�(%"�3� ���"/+������DE� �� ��"/�+�������E� ��"/�+�������E�����"/+�������E������4������� �"/�+�������5�� !"#"�$%�+�%�"62"#$1"(/+��"&$'"()"� /!+/�+,-$&"(�+(/$-"(�)+(�8"!$-!�0�$11.(�-"($)�$(��("�*�#1�+('�2��#�0��#�(�(4$11.(�-"($)�$(�+(�/!"#���6+12�"%�*�#�%.)!�+(/$-"(%+#"�/!"�)$#).1%2�#�Z�$/"�2#�/"$(�3���5��*�2�+%1�4'$+�3��� ����"/�+������?E��� ��J� �����"/�+�������5+('�/!"��./"#�%.#*+)"�2#�/"$(��,3�%2�5��*�/!"��01"'$%"+%"�)+.%$(-�%2$#�)!"/"�39�����"/�+�������5��J�/!+(/$-"(%�(""'�/��8"�%")#"/"'�.%$(-�+(���4/+#-"/$(-%$-(+��%"I."()"�$(��#'"#�/��8")�1"�$11.(�-"($)��#2#�/")/$&"��"("/$)� $11.($Z+/$�(�<$/!� +,!"2+/$/$%�,&$#.%� (.)�"�)+2%$'� +(/$-"(� +('�<$/!� �&+�8.1$(*����<%�%$1$�+#�#.�"%�$(�/!+/�+,%")#"/$�(�%$-(+��'#+%/$4)+��0�$()#"+%"%�$11.(�-"($)$/0�3J�;���"/�+������?E��� �����"/�+������?5�� !"�)�12�"6$/0��*�/!"%"�2#�84�"1%�)+(�8"�'"2$)/"'�80�)�12+#$(-�/!"�#"%.�/%��84/+$("'� *#�1�"62"#$1"(/%�<$/!� /!"� #+8$"%�,2#�/"$(+('�/!"�1+�+#$+����G��"%2$/"�%$1$�+#�!.1�#+��+(')"��.�+#�#"%2�(%"%�+-+$(%/�%")#"/"'�+('�(�(4%")#"/"'+(/$-"(%��/!"�%")#"/"'�#+8$"%�,2#�/"$(�2#�&$'"'�$(4*"#$�#�2#�/")/$�(�� �(� )�(/#+%/�� /!"� %")#"/"'� *�#1��*����<+%�%.2"#$�#�/��/!"�(�(4%")#"/"'�*�#1�$(�/"#1%�*� /!"� !.1�#+�� #"%2�(%"� +%� <"��� +%� 2#�/")/$�(3�� ��J� �����"/�+�������5���.#/!"#1�#"��$()#"+%$(-%")#"/$�(�$(*�."()"'�/!"�/02"��*�#"%2�(%"�80�1"'$+/4$(-�+, !��8$+%�� !"�"**")/��*�/!"�2!0%$)+��*�#1��*�/!"+(/$-"(�(�/��(�0�2�+0%�+,#��"�$(�/!"�-"("#+��$11.(�4

Page 12: designing immune responses with genetic immunization and - SAV

�3< ��� ���������� �������������� ���� ��;������������9

-"($)$/0�8./�+�%��$(�/!"� !�7 !��8$+%�<!$)!�<+%�+�%�$('$)+/"'�80�/!"�#"%.�/%��*�+,%/.'0�.%$(-�/!"�/$)=48�#(""()"2!+�$/$%�&$#.%�"(&"��2"�2#�/"$(��,3�J�����"/�+������5���#�1�).##"(/�0�+&+$�+8�"�'+/+�<"�)+(�)�()�.'"/!+/�/!"�*�#1��*�/!"�+(/$-"(�$%�)#.)$+��*�#�/!"�$('.)4/$�(�+('�"**$)$"()0��*�/!"�$11.("�#"%2�(%"%���(�)"#4/+$(�)+%"%��!�<"&"#��/!"�(+/.#"��*�/!"�2#�/"$(�$/%"�*1+0�2�+0�+(�+''$/$�(+��#��"�;"/�+(�/!"#�%/#+/"-0�*�#�'"�$8"#+/"�0�1�'.�+/$(-

$(/#+)"��.�+#�"&"(/%�<+%�/!"�)�4'"�$&"#0��*�.8$I.$/$($(�/!"�*�#1��*�+,*.%$�(�2#�/"$(���(�)�(/#+%/�/��/!"�"*4*")/%�$('.)"'�80�/!"��"+'"#�%"I."()"%��/+--$(-�2#�4/"$(%�<$/!�/!$%��#�%$1$�+#�%"I."()"%�+))"�"#+/"%�+('$()#"+%"%� /!"� 2#�/"+%�1+�� '"-#+'+/$�(��9!$�"� /!$%+22#�+)!�<$���$12#�&"�/!"�$('.)/$�(��*�� ��#"%2�(%4"%�$/�<$���+�%��'#+%/$)+��0�'")#"+%"�/!"�+(/$8�'0�#"4%2�(%"�3��"/�+������DE���������"/�+������?E�����4����"/�+�������E�9�+('�:��������?5�� !$%�+22#�+)!!��'%�+,%$-($*$)+(/�2#�1$%"�*�#�/!"�'"%$-(��*����&+))$("%�+-+$(%/�/.1�#%����%/�%.))"%%*.��+(/$4/.1�##"%2�(%"%�+#"�8+%"'��(�)0/�/�6$)� ,)"��%�+('�(�/��(+(/$8�'$"%��%$(-�/!"�1"/!�'%�'"%)#$8"'�+8�&"��/!"$11.("�#"%2�(%"�$('.)"'�80�+,-"("/$)�&+))$("�)+(8"� /+$��#"'� /�� +)!$"&"� �2/$1+�� "**$)+)0� $(� &+#$�.%'$%"+%"�%0%/"1%�*�#�<!$)!�I.+�$/+/$&"�0�'$%/$()/�#"4%2�(%"%�+#"�#"I.$#"'��(� $12�#/+(/� +%2")/� �*� -"("/$)� &+))$("%� $%� /!"

)�'�(�.%+-"�$(�/!"�-"("%�"62#"%%"'�80�/!"�&+))$("��+($2.�+/$(-�/!"�)�'�(�.%+-"�+���<%��2/$1$Z+/$�(�*�+(/$-"(�"62#"%%$�(�+('7�#�$11.(�-"($)$/0��*�&+#4$�.%�2+/!�-"(�-"("%����#�"6+12�"�� $/�"(+8�"%�&+)4)$("�'"%$-("#%�/��#"2�+)"�)"#/+$(�)�'�(%�<$/!�$11.4(�%/$1.�+/�#0��2�1�/$*%�3'$%).%%"'�8"��<5�<$/!4�./�)!+(-$(-�/!"�+1$(��+)$'�%"I."()"��*� /!"�+(/$4-"(�� �"&"#+�� #"2�#/%� !+&"� '"1�(%/#+/"'� $12#�&"'$11.(�-"($)$/0�8+%"'��(�%.)!�1�'$*$)+/$�(%�3��4����"/�+������DE���� ��"/�+�������E�� �F����"/�+�����DE��������"/�+�������E����������"/�+�������5�9!"(�/!"�-"("�*�#�/!"�+(/$-"(��*�$(/"#"%/�)�1"%�*#�1+,2#�=+#0�/$)��#-+($%1�/!"�)�'�(�.%+-"�)+(�8"��2/$41$Z"'�*�#�"62#"%%$�(��*�/!$%�+(/$-"(�$(�/!"�".=+#0�/4$)�!�%/��(�)�()�.%$�(��/!"%"�'+/+�$('$)+/"�"6)$/$(-�2�%%$4

8$�$/$"%�*�#�1�'.�+/$(-�/!"�)�('$/$�(%��*�+(/$-"(�2#"4%"(/+/$�(�+/�+,&"#0�"+#�0�+('��8&$�.%�0�)#.)$+��%/+/"�*�/!"�$11.("�#"%2�(%"����#"+'0�(�<��&+#$�.%�)�148$(+/$�(%��*�/!"�+//"12/%�'"%)#$8"'�+8�&"�"(+8�"�.%/��2#�-#+1�+,%2")$*$)��./)�1"�*�#�/!"�$11.($Z+/$�(

<$/!�+(�"2$/�2"��2��0/�2"��#�"(/$#"�-"("�"()�'"'��(+,����&+))$("����#"� '"/+$�"'� =(�<�"'-"� +8�./1��").�"%�#"-.�+/$(-�/!"�/#+(%2�#/�1")!+($%1%�8"4/<""(� /!"� &+#$�.%� )�12+#/1"(/%�<$/!$(� )"��%�<$��1+="�"&"(�1�#"�%�2!$%/$)+/"'�+22#�+)!"%�*�#����&+))$("�'"&"��21"(/�2�%%$8�"�$(�/!"�*./.#"�

�!<!���(�46�(��/($�2#')�#2�46�(�� /���(�%!��(+''$/$�(�/��.%$(-�/!"�"(/$#"�)�'$(-�#"-$�(��*�+(�+(/$4-"(��(�+,2�+%1$'�����)�(%/#.)/��-"("/$)�$11.($4Z+/$�(�!+%�2#�&"(�/��8"�+(�"6)"��"(/�1"/!�'�*�#�$(4'.)$(-�$11.("�#"%2�(%"%�+-+$(%/�"&"(�%$(-�"� ,�#J,)"���"2$/�2"%��*�+(/$-"(%�� !$%�%�4)+��"'�1$($4-"("�#�1$($1+�4"2$/�2"�+22#�+)!�/+="%�+'&+(/+-"��*�/!"*+)/�/!+/�2�+%1$'�����"()�'"'�+(/$-"($)�2"2/$'"%)+(�8"���+'"'��(/��� ��)�+%%��,1��").�"%�&$+�/!""('�-"(�.%�+(/$-"(42#�)"%%$(-�2+/!<+0�� !"�2�/"(4/$+���*�/!$%�)�()"2/�*�#�/!"�/#"+/1"(/��*�&$#+��$(*")4/$�(%�+('�/.1�#%�<+%�*$#%/�'"1�(%/#+/"'�<$/!�+,1$($4-"("�)�'$(-� *�#�+,%$(-�"�"2$/�2"��*� ���-2�����#1./+(/�2����#"%2")/$&"�0�3������:�"/�+�������5���#�4/")/$&"�� ��#"%2�(%"%�<"#"�$('.)"'�$(�8�/!�)+%"%80�.%$(-�"2$'"#1+��'"�$&"#0�80�-"("�-.(��"("/$)$11.($Z+/$�(�<$/!�8�/!�/!"�"(/$#"�)�'$(-�#"-$�(�+%<"���+%�<$/!�+(�$11.(�'�1$(+(/�2"2/$'"�#"-$�(��*2���#"%.�/%�$(�/!"�$('.)/$�(��*�2�/"(/�)0/�/�6$)�+)4/$&$/0�3�� ������"/�+�������5��#�/")/$&"�+(/$4/.1�#�#"%2�(%"%�<"#"�+�%���8/+$("'

$(�+(�/!"#�%.##�-+/"�/.1�#�1�'"��3�D���)"��%�/#+(%4*")/"'�<$/!�+,2�+%1$'�)�'$(-�*�#� /!"�$(*�."(Z+�(.4)�"�2#�/"$(�����>?4���5�80�$(/#+1.%).�+#�$(P")/$�(�*�2�+%1$'�����"()�'$(-�/!"�"(/$#"�����#�/!"�1$(4$1+��"2$/�2"��>?4���� 3�9���:��+('�J��J������D5��"���'"2�"/$�(�"62"#$1"(/%�)�(*$#1"'�/!+/���DT�)"��%<"#"�#"%2�(%$8�"�*�#�2#�/")/$�(��.%$(-�/!"�"2$/�2"4)�'$(-�%"I."()"�<$/!�+(���4

/+#-"/$(-� �"+'"#� %"I."()"� )+(� *.#/!"#� "(!+()"� /!"$11.("�#"%2�(%"�/��+,1$($1+��"2$/�2"����#�/!"�1$($4-"("�+22#�+)!�/!$%�"**")/�<+%�'"1�(%/#+/"'�<$/!�/!"2���"2$/�2"�+*/"#�-"("�-.(�+22�$)+/$�(�3������:�"/+�������5��/!"�(.)�"�2#�/"$(�"2$/�2"��*�1"+%�"%�&$#.%+('�/!"����2#�/"$(�"2$/�2"��*�#"%2$#+/�#0�%0()0/$+�&$#.%�+*/"#�$(/#+'"#1+��$(P")/$�(%�3 ��"/�+������D5� !"�8+%$)�1")!+($%1�!"#"�$%�/��)$#).1&"(/�/!"�2#�4/"+%�1"���+('�/!.%�'"-#+'+/$�(��*�/!"�+(/$-"(���80'$#")/�/#+(%�+/$�(��*�+,%$-(+��%"I."()"�2�.%�2"2/$'"$(/�� /!"����� !"� %$-(+�� %"I."()"� $%� %.8%"I."(/�0)�"+&"'�80�+,%$-(+��2"2/$'+%"�/!.%�#"�"+%$(-�/!"�+(/$4

Page 13: designing immune responses with genetic immunization and - SAV

�33��� ���������� �������������� ���� ��;������������9

-"($)�2"2/$'"�$(/��/!"�����%$(-�/!$%�+22#�+)!��/!"+(/$-"($)�2"2/$'"���2#�&$'"'�/!+/�$/�$%��*�2#�2"#��"(-/!+('�!+%�/!"�+22#�2#$+/"�1�/$*�*�#�� ��)�+%%��,��+'$(-��$%�'$#")/�0�'"�$&"#"'�/��/!"�)�12+#/1"(/�<!"#"�$/�$%+%%�)$+/"'�<$/!�� ��1��").�"%��J02+%%$(-�/!"�2#�4/"+%�1+��)�12�"6�1+0�8"�2+#/$).�+#�0�$12�#/+(/�*�#/02$)+��� ��"2$/�2"%�3D4���+1$(��+)$'%���(-5�%$()"+(0�*.#/!"#�'"-#+'+/$�(��*�/!"%"�2"2/$'"%�<�.�'�#"4%.�/�$(�/!"���%%��*�8$('$(-�/��� ��)�+%%���� �<"&"#�*�#�����&+))$("%� "()�'$(-� "(/$#"� -"("%� 3+%� '$%4).%%"'�+8�&"5��/!"�%+1"�+22#�+)!�$�"���*.%$�(�<$/!+(���4/+#-"/$(-��"+'"#�%"I."()"��1"'$+/"%�$12#�&"'2#"%"(/+/$�(��(�� ��)�+%%����1��").�"%�+('� ,)"��!"�2�/!#�.-!�$()#"+%$(-�/!"�+1�.(/��*�%")#"/"'�(+4/$&"�+(/$-"(�+&+$�+8�"�*�#����%� !"�1$($4-"("� +22#�+)!�!+%� 8""(� "62+('"'�80

%�1"�$(&"%/$-+/�#%�<!���$(="'�%"&"#+��"2$/�2"%�/�4-"/!"#�/��)#"+/"�1.�/$4"2$/�2"%��#�2��0/�2"%�*�#�&+)4)$(+/$�(�� !"�*"+%$8$�$/0��*�/!$%�$'"+�<+%�'"1�(%/#+/"'<$/!�+,1$($4-"("�)+%%"//"�"()�'$(-�+,1$6/.#"��*�� �� ,!"�2"#� +('�J,)"��� "2$/�2"%� *#�1�!"#2"%� %$12�"6&$#.%�3 ��5�3;�"/�+������D5�� !$%�2��0/�2"�2�+%1$'����%/$1.�+/"'�"2$/�2"�%2")$*$)�)0/�/�6$)�#"+)/$�(%)�12+#+8�"�/��/!"�#"%2�(%"�$('.)"'�<$/!��$&"� ��� ,)"���2#��$*"#+/$�(��+(/$8�'0�2#�'.)/$�(�+('�2#�/")4/$�(�<"#"� %$-($*$)+(/� !�<"&"#� �"%%� "**")/$&"� /!+(/!�%"�$('.)"'�<$/!�/!"��$&"�&$#.%���(+��-."�+22#�+)!4"%�%!�<"'���(-4�+%/$(-�� ��#"%2�(%"%�-"("#+/"'�801.�/$2�"�)�(/$-.�.%�1$($1+��1.#$("�� ��"2$/�2"%3 ������ "/� +��� ���D5� +('� +,2��0"2$/�2"�1$($1+�&")/�#�"()�'$(-� /<��1.#$("�"2$/�2"%� *#�1�!.1+($11.(�'"*$)$"()0�&$#.%�+('�8$��#���#�&�$-���#3 ��:��"/�+������D5�

<!��"���(:'&�(���#:������00&(�L/��#(�/($

�2 �0#��:%�#(��"��+���#(#���/��$�+���2�#+�%�/�&%

�(�%2'��(�/($�#(��"��/��� ��)�#:��)2�

�8�#$#�")+#(�(��3Q4$��#$�(/%���(�'� �+

<!�!����(#���/��$�+���2�#+�!��"/$(�$'%�+('�#"/$(4�$)�+)$'�#")"2/�#%�3���5�#"2#"%"(/�<"���=(�<(�"64+12�"%�*�#�/!"�$(/"#+)/$�(��*�/<��$12�#/+(/�("/<�#=%�/!"� $11.("� %0%/"1� +('� /!"� "('�)#$("� %0%/"1�� �(-"("#+���#"/$(�$'%��$(�2+#/$).�+#��$$�������#"/$(�$)�+)$'3��5�� +#"� "%%"(/$+�� *�#� +,(�#1+�� '"&"��21"(/� +('!�1"�%/+%$%� �*� &"#/"8#+/"%�����4/#+(%� #"/$(�$)� +)$'+)/$�(��(�/!"�#"-.�+/$�(��*�%2")$*$)�-"("�"62#"%%$�($%�1"'$+/"'� 80� /!#""� '$%/$()/� (.)�"+#� #"/$(�$)� +)$'

#")"2/�#�%.8/02"%�����α��β��γ�8"��(-$(-�/��/!"�%/"4#�$'7/!0#�$'�(.)�"+#� #")"2/�#� *+1$�0�� !"�����#"4)"2/�#%�+)/�+%�/#+(%)#$2/$�(+��+)/$&+/�#%�80�8$('$(-/��#"/$(�$)�+)$'�#"%2�(%$&"�"�"1"(/%�3����%5�("+#/!"�2#�1�/"#%��*�/+#-"/�-"("%���+(0��*�����%�/!+/)�(%$%/��*�+,'$#")/�#"2"+/��*�/<��1�/$*%�3� ��5%"2+#+/"'�80�+,�48+%"�2+$#�%2+)"#�!+&"�8""(�$'"(/$4*$"'�$(�+,(.18"#��*�-"("%�/!+/�#"%2�('�/�����$(�&$&�3�������>5����+('����%�!+&"�8""(�'"1�(%/#+/"'�/��8"�$(4

&��&"'� $(� &+#$�.%� +%2")/%� �*� /!"� $11.("� %0%/"1��(/$-"(�2#"%"(/$(-�)"��%�3���5��$="��+(-"#!+(%�)"��%.24#"-.�+/"�/!"$#�+8$�$/0�/��2#"%"(/�+���4+(/$-"(%�80���3�������"/�+������>5�+('�1�(�)0/"%�+#"�$('.)"'/��2#�'.)"�$()#"+%"'� �4β�+('� ��4α��"&"�%�3���4J��"/� +������>5���62"#$1"(/%�.%$(-����γ� �� /#+(%4-"($)�+($1+�%�$('$)+/"'�+,#��"��*�����$('.)$(-�)04/�/�6$)� 4�012!�)0/"%�$(�&$&��+('��*�%=$(�-#+*/�#"4P")/$�(�3�� ��"/�+�������5���62#"%%$�(�%/.'$"%�$(�+(4/$-"(4%/$1.�+/"'� ,�012!�)0/"�).�/.#"%�'"1�(%/#+/"'+(�.2#"-.�+/$�(��*����α�1����80����/!.%�2�$(/4$(-�/��+,*.()/$�(��*����α�+%�+,�$-+('4$('.)$8�"�/#+(4%)#$2/$�(+��"(!+()"#�*+)/�#�3���������"/�+�������5��"/$(�$'%�+�%��+)/��(�J,)"��%�����4�$-+('%�+#"�+8�"/��$(!$8$/�)"���+)/$&+/$�(�+('�)+(�2#"&"(/�+2�2/�%$%$(�J,�012!�)0/"%�3�����"/�+������D5���.#/!"#1�#"�#"/$(�$)� +)$'4$('.)"'� -"("� /#+(%)#$2/$�(� %""1%� /�!+&"�%/#�(-�$12+)/%�+�%���(�/!"�"62#"%%$�(�+('�#"-4.�+/$�(��*�+'!"%$�(�1��").�"%��$="�����4��3���4F� �"/�+������>������E�J�J����"/�+�������E�J�����"/�+������5�+('�)0/�=$("%� �$="� $(/"#�".=$(4��3J����9�"/+������?�����������"/�+������>5�$(/"#�".=$(4>�3���:�"/�+�������5�+('����4γ�3����� �����"/�+�������5���"4)"(/�0��$/�!+%�+�%��8""(�#"2�#/"'�/!+/����$%�)+2+8�"/�� $(!$8$/� /!"�-#�</!��*�8#"+%/�)+()"#�)"��%�80�.24#"-.�+/$(-� ����4�� "62#"%%$�(� 3J�F� "/� +��� ����5���()"#($(-�/!"�#��"��*����+('�����$(�/!"�$11.("%0%/"1�� +(� $()#"+%$(-� (.18"#� �*� 2.8�$)+/$�(%� +#"*�).%"'��(�/!"�#"-.�+/$�(��*�+2�2/�%$%��$�"�����)+(2#"&"(/�+)/$&+/$�(4$('.)"'� ,)"���+2�2/�%$%�80�$(!$84$/$(-�/!"�$('.)/$�(��*��+%��$-+('�"62#"%%$�(�3J�F�"/+�������E������;�"/�+������DE�;���"/�+������>5�� .41+(�2"#$2!"#+��.(%/$1.�+/"'�J,)"��%�<"#"�*�.('�/�"62#"%%�1�����*�/!"����#")"2/�#�α��β��+('�γ�39���

"/�+������D5��+('�#"/$(�$)�+)$'�$%�+8�"�/��1"'$+/"�$/%-#�</!4$(!$8$/�#0�"**")/��(�J,�012!�)0/"%�&$+�/!"$#)�-(+/"� (.)�"+#� #")"2/�#%� 3������� +('�J��� �������5�

Page 14: designing immune responses with genetic immunization and - SAV

�3B ��� ���������� �������������� ���� ��;������������9

�(�+,#")"(/�%/.'0�<"�$(&"%/$-+/"'�$(�&$&��"**")/%�*����48+%"'� $11.($Z+/$�(� �*�1$)"� �(� 8$('$(-2+#+1"/"#%��*�+��4/#+(%�#"/$(�$)�+)$'�#")"2/�#%�3���%5$(�%2�""(�)"���(.)�"$�3J� :��"/�+�������5���(�".)+#04�/$)� "62#"%%$�(� &")/�#� "()�'$(-� /!"� -"("� *�#� /!"1�'"�� "(Z01"�c4-+�+)/�%$'+%"��*��%)!"#$)!$+� )��$<+%� .%"'� *�#� $(/#+'"#1+�� $(P")/$�(�� �.#/!"#1�#"�$11.(�%/$1.�+/�#0��2�1�/$*%��<!$)!�%/$1.�+/"�/!""62#"%%$�(��*� &+#$�.%� )0/�=$("%� +('�1+0� %"#&"� +%+,['+(-"#�%$-(+�\�*�#�/!"�1+11+�$+(�$11.("�%0%4/"1��<"#"�)�$(P")/"'�+%���$-�'"�60(.)�"�/$'"%�� !"#"%.�/%�'"1�(%/#+/"'�/!+/�/!"�)�()"(/#+/$�(��*����%<+%� %$-($*$)+(/�0� #"'.)"'� $(� /!"� �+/"� 2!+%"� �*� /!"2#$1+#0�$11.("�#"%2�(%"�3���'+0%�+*/"#�$(P")/$�(��*2�+%1$'�������$('$)+/"'�80�!$-!�+**$($/0��-�+(/$48�'$"%�+('����4γ�"62#"%%$�(5����$(P")/$�(��*��21�/$*%�'$'�(�/�)!+(-"�/!"�)�.#%"��*�/!"�!.1�#+��#"4%2�(%"�8./�"(!+()"'�+('�+))"�"#+/"'�/!"�2#��$*"#+4/$&"�#"%2�(%"�+('�"62#"%%$�(��*����4γ��<!$)!�)�##"4�+/"'�<$/!�/!"�#"'.)"'�����)�()"(/#+/$�(�

<!-!��)2���>��#$#�")+#(�(��3R4$��#$�(/%�!� 02"��� $�'�/!0#�($("��a4'"$�'$(+%"� 3�a4��5��+(�"(Z01")�(%$%/$(-��*�/<��$'"(/$)+���?4=�+�%.8.($/%�<$/!��("+/�1��*�%"�"($.1�2"#�1��").�"��)+/+�0Z"%�/!"�)�(4&"#%$�(��*�/!"�1+$(�%")#"/�#0�2#�'.)/��*�/!"�/!0#�$'�/!"�2#�!�#1�("�/!0#�6$("�3

>5�/��/!"�+)/$&"������a4

/#$$�'�/!0#�($("�3 �5��2#"'�1$(+(/�0�$(��$&"#��=$'("0�

+('�/!0#�$'�3:� ����"/�+�������5���(��$&"#��$/�$%���)+�4$Z"'�$(�/!"�)0/�%��$)+��0��#$"(/"'��"+*�"/��*�/!"�#�.-!+('�%1��/!�"('�2�+%1$)�#"/$).�.1�3�������J���:�"/�+�����?�5�� !"�#��"��*�/!"�)0/�=$("%�� ����$(/"#4�".=$(%�+('�$(/"#*"#�("%��(�/!"��a4���!+%�8""(�%/.'4$"'��8./�/!"�#"%.�/%�<"#"�)�(/#+'$)/�#0�'"2"('$(-��(/!"�"62"#$1"(/+��'"%$-(�+('�+($1+��1�'"��.%"'�$(/!"�%/.'0�3:� �������>5�� !"�%/.'0��*�/!"�'$#")/�"*4*")/%��*�)0/�=$("%�.2�(�/!"��a4���+)/$&$/0�$(�2!$��#+/�$&"#�)"��%�!+%� %!�<(� /!+/� /!#""�)0/�=$("%�� /.1�.#(")#�%$%� *+)/�#4α� 3 ��4α5�� $(/"#�".=$(4�c� 3��4�c5+('�$(/"#�".=$(4��3��4�5�%/$1.�+/"'�/!"��a4���+)/$&$4/0�� !"%"�'+/+�'��(�/�%.22�#/�/!"�!02�/!"%$%�/!+/�$(4*�+11+/�#0�)0/�=$("%�1+0�1"'$+/"�/!"�"./!0#�$'�%$)=%0('#�1"� 80� )+.%$(-� $(!$8$/$�(� �*� �a4��� +)/$&$/03�������"/�+������?5��(�+,%$1$�+#�+22#�+)!��$="�)$/"'�+8�&"�3J� :��"/

+�������5�<"�$(&"%/$-+/"'�/!"�"**")/��*� $(/#+'"#1+�����$11.($Z+/$�(�+('�)�4$(P")/$�(��*��2�1�/$*%�(�/!"�"62#"%%$�(��*��N����3J� :��"/�+�������5���#�1

/!"�'+/+�<"� )�()�.'"� /!+/� /!"� +)/$&$/0� �*� �a4��� $(1�.%"��$&"#�<!"(�)�12+#"'�/��(�(4$11.($Z"'�+($41+�%�3����B5�<+%�*�.('�/��8"�%$-($*$)+(/�0�"(!+()"'80�����$11.($Z+/$�(�/<��<""=%�3�?��?�B5��#�/!#""<""=%�3������B5�+*/"#�/!"�2�+%1$'�$(P")/$�(���(�+'4'$/$�(��/!"�+)/$&$/0��*�/!"��a4���$(�1�.%"��$&"#�<+%1+#="'�0�"(!+()"'� /<��<""=%� 3����>�B5��#� /!#""<""=%�3�>����B5�+*/"#�/!"�$(P")/$�(�<!"(��2�1�4/$*%�<"#"� +22�$"'� /�-"/!"#�<$/!� /!"�2�+%1$'����� !$%�$%�$(�-��'�+-#""1"(/�<$/!�/!"�2.8�$)+/$�(�'"14�(%/#+/$(-�/!"���2����'$#")/�"**")/��*�/!#""�)0/�=$("%3 ������4�c�+('���4�5��(�%/$1.�+/$�(��*�/!"��a4��+)/$&$/0� $(�2!$�� #+/� �$&"#� )"��%� 3������� "/� +��� ���?5+('�1+0�%"#&"�+%���22��"&$'"()"�(�/�%.22�#/$(-�/!"!02�/!"%$%�/!+/�$(*�+11+/�#0�)0/�=$("%�1"'$+/"�/!""./!0#�$'�%$)=�%0('#�1"�80�$(!$8$/$(-�/!"��a4���+)4/$&$/0��(�%.11+#0��8�/!�%/.'$"%�'"1�(%/#+/"�/!+/����4

8+%"'�$11.("�#"%2�(%"%��%$1$�+#��$="�2#�/"$(48+%"'#"%2�(%"%�3J� :��"/�+�������E����������"/�+�������E�������"/�+������>E����J��"/�+������>5��$(&��&"�$142�#/+(/�"('�)#$("�2+/!<+0%���2�1�/$*%��/!"����&+))$("4$(!"#"(/�+'P.&+(/�2+#/��%""1�/��+''$/$�(+��0"(!+()"��#�+))"�"#+/"� /!"� $(/"#+)/$�(%�8"/<""(�/!""('�)#$("�+('�/!"�$11.("�%0%/"1��/�2#"%"(/��<"�)+((�/�$(/"#2#"/�/!"%"�#"%.�/%�*#�1

+,*.()/$�(+��2�$(/��*�&$"<��8")+.%"�����+('��N4��+#"�$(&��&"'�$(�&+#$�.%�+%2")/%��*�/!"�$11.("�%0%4/"1�$(�+,&"#0�)�12�"6�)�(/"6/�� �<"&"#�� /!"�'+/+)�"+#�0�'"1�(%/#+/"�/!+/�����%2")$*$)�8$('$(-�)!+#4+)/"#$%/$)%��#��N4���+)/$&$/0�+#"�$(*�."()"'�80�$(�&$&�$11.("�#"%2�(%"%���.#/!"#1�#"��<"�+�%��)�()�.'"�/!+/�� '"%2$/"� '$**"#"(/� 2+/!<+0%� �*� 2#�)"%%$(-� +('2#"%"(/+/$�(��*�+(/$-"(�80�$11.($Z+/$�(�<$/!�2#�4/"$(�$(�)�12+#$%�(�<$/!�$11.($Z+/$�(�<$/!�2�+%1$'�����%$1$�+#�8+%$)�$11.("�1")!+(%$1%�+#"�$('.)"''.#$(-�+,2#$1+#0�#"%2�(%"�

3!��/:��)�#:����� /���(�%�/($��2 ��/%�$

/$�& /(�%

3!�!����� /���(�%!� !#""�="0�+#"+%��*�)�()"#(!+&"�8""(�$'"(/$*$"'�80�#"-.�+/�#0�+-"()$"%�)�(%$'4"#$(-�/!"�+22�$)+/$�(��*�����&+))$("%�$(�!.1+(%G3$5�/!"�2�/"(/$+���*�-"(�1$)�$(/"-#+/$�(��*�/!"�����3$$5�$('.)/$�(��*�+(/$4����+(/$8�'$"%�$('.)"'�80�/!"$(P")/"'�2�+%1$'�����+('�3$$$5�$('.)/$�(��*�+./�$141.($/0�3�#�/��"#+()"5�+%�+,#"%.�/��*�/!"�%2")$+��*"+4

Page 15: designing immune responses with genetic immunization and - SAV

�3;��� ���������� �������������� ���� ��;������������9

/.#"%��*�����$11.($Z+/$�(���,(.18"#��*�2.8�$)+4/$�(%�!+&"�+''#"%%"'�/!"%"�+%2")/%���(�1$)"�$(P")/"'$�1��<$/!�2�+%1$'�����"()�'$(-�$(*�."(Z+����(�$(/"-#+/$�(��*�/!"�$(P")/"'�2�+%1$'�!+%�8""(�'"/")/4"'�%��*+#�3��� ����"/�+�������5����%����<�'�%"%��*����&+))$("%�!+&"�(�/�8""(�%!�<(�/��$('.)"�/��"#4+()"�3���"/�+������?5�+('�$('.)/$�(��*�+./�$11.($4/0�)+.%"'�80�1+%%$&"�$11.("�'"%/#.)/$�(�)+(�+�%�8"�"6)�.'"'�39�����"/�+�������5���.#/!"#1�#"��+($41+��%/.'$"%�+�%��%.--"%/�/!+/�/!"�$('.)/$�(��*�+(/$4����+(/$8�'$"%�80�����&+))$("%�$%�.(�$="�0�3F���"/�+�������E�:� ����"/�+������>5��"#0�#")"(/�2!+%"��,)�$($)+��%/.'$"%�$()�.'$(-����

&+))$("%�+-+$(%/� ��4�� 3��������"/� +������D5�!"2+/$/$%�J,%.#*+)"�+(/$-"(�3��;�"/�+�������E� ��:� "/� +��� ����5��1+�+#$+� 3��� "/� +��� ����5� +('�2#�%/+/")+()"#�3���� ����"/�+�������5�)�(*$#1"'�/!"�2$)/.#""1"#-$(-�*#�1�/!"�+($1+��%/.'$"%�� !"�#"%.�/%�'"14�(%/#+/"'�/!+/�����&+))$("%�+#"�<"���/��"#+/"'�<$/!(���#� �(�0�1$�'� ��)+�� #"+)/�-"($)$/0� +('� %0%/"1$)%012/�1%�����+(/$4����+(/$8�'$"%��#�1.%)�"�"(4Z01"�"�"&+/$�(%�)�.�'�8"�'"/")/"'�3��������"/+������D5�

3!-!��2 �0#��:%!��,.($I."�*"+/.#"��*��2����8+%"'�+'P.&+(/%��"&"(�<!"(�)�12+#"'�/���/!"#�8+)4/"#$+��2#�'.)/�'"#$&"'�+'P.&+(/%��$%�/!"$#�%/#�(-�+8$�4$/0�/��$('.)"���4����/!"�)"(/#+��1"'$+/�#��*� !��#"4+)/$�(%�3��9���;�"/�+�������E�����9������"/�+������D5� !$%�$%��*�%2")$+��$(/"#"%/�<$/!�#"%2")/�/��1+(0�*�#1%�*�$11.(�/!"#+20�3"�-��%.))"%%*.��+(/$4/.1�#�$11.4($Z+/$�(�#"�$"%��(�/!"�$('.)/$�(��*�%.**$)$"(/�0�%/#�(-)"��.�+#�$11.($/0��$(�2+#/$).�+#�$('.)/$�(��*�/.1�#%2")$*$)�� ��+('�/!"%"�#"I.$#"�+, !��)0/�=$("�2#�4*$�"�/��2#��$*"#+/"�+('�'$**"#"(/$+/"5� �<"&"#�� /!"�'�<(%/#"+1�"&"(/%��*��2����

+('��/!"#�8+)/"#$+��2#�'.)/%��%.)!�+%�����+#"�#"1+#=4+8�0� %$1$�+#� +('�1.�/$2�"� %/.'$"%�!+&"� %!�<(� /!+/�2�����$('.)"� ��4α���2����+('���22��3����49������"/�+������?+�8E�� ���;�"/�+�������5�� "()"��$/)+((�/�8"�#.�"'��./�)�12�"/"�0�/!+/�+'1$($%/#+/$�(�*��2�����1+0�)+##0�+,2�/"(/$+��#$%=���(�%"�")/"'"62"#$1"(/+�� %0%/"1%��2����� $('.)"'� %"2/$)%!�)=� %012/�1%��#� 2#�1�/"'� /!"� '"&"��21"(/� �*+./�$11.($/0���(��("�%/.'0��+'1$($%/#+/$�(��*�8+)/"4#$+�������#��2���$-�(.)�"�/$'"%� )+.%"'� +,#+2$'$()#"+%"�$(� ��4α�%"#.1��"&"�%�+('��$(�-+�+)/�%+1$("%"(%$/$Z"'�1$)"��#"%.�/"'�$(��"/!+��%"2/$)�%!�)=�3����4

9������"/�+������?+��85���.#/!"#1�#"��/!"%"�+./!�#%+('��/!"#%�+�%��*�.('�/!+/��2�����+('�����%0(4"#-$Z"'�$(�/!"�$('.)/$�(��*� ��4α�3��9���;�"/�+������5�� !"�2�/"(/$+��2#�1�/$�(��*�+./�$11.($/0�80�2�����<+%�$(&"%/$-+/"'�$(���J79�1$)"��<!$)!+#"�2#�("�/��%0%/"1$)��.2.%�"#0/!"1+/�%.%4�$="�%0(4'#�1"���11.($Z+/$�(��*�/!"%"�1$)"�<$/!��'�$����8./�(�/�<$/!�)+�*�/!01.%�����#"%.�/"'�$(�"�"&+/"'�"&"�%��*�+(/$����4+(/$8�'$"%���"&"#/!"�"%%��/#"+/41"(/��*�/!"%"�1$)"�<$/!��'�$�����$12#�&"'�%.#4&$&+��+('�#"'.)"'�/!"�+./�$11.("�%012/�1%�$(�/!"%"+($1+�%�'"%2$/"�/!"�$()#"+%"�$(�+(/$����4+(/$8�'$"%3��:�����"/�+�������5���(�+(�/!"#�1�'"����2����$('.)"'�"62"#$1"(/+��+./�$11.("�"()"2!+��10"�$4/$%�3���5�80�+)/$&+/$�(��*� !��"**")/�#�)"��%�%2")$*$)*�#�10"�$(�8+%$)�2#�/"$(�+('�/!$%�"**")/�<+%�'"2"(4'"(/��(�/!"��2����41"'$+/"'�$('.)/$�(��*���4��3�����"/�+������?5�� !"%"�'+/+�)�"+#�0�$('$)+/"�/!"(")"%%$/0� �*� *.#/!"#� $(&"%/$-+/$�(%� /�� $12#�&"� �.#=(�<�"'-"�+8�./�/!"�)�12�"6�$(�&$&��$(*�."()"%��*�2�1�/$*%�'.#$(-�$11.("�#"%2�(%"%�

B!��"��:&�&+��#:����� /���(�%�/($����4�/%�$

/$�& /(�%!

��(%$'"#$(-� /!"� +&+$�+8$�$/0� �*� �/!"#� &+))$("%�(+1"�0�#")�18$(+(/�+('�+//"(.+/"'�&$#.%"%�+('�#"4)�18$(+(/�2#�/"$(���("�)+((�/�!"�2�+%=$(-�/!"�I."%4/$�(G����<"�#"+��0�(""'�%.)!�+,#+'$)+��0�("<�+22#�+)!U�3��� ��������5� !"�%$12�"�+(%<"#�$%�/!+/�+���/!").##"(/�0�.%"'�&+))$("%�!+&"�2#+)/$)+��2#�8�"1%����#1+(0�'")+'"%��+,&+#$"/0��*�+//"(.+/"'�&$#.%"%�!+&"%.))"%%*.��0� 2#�/")/"'� .%� +-+$(%/� /!"$#�<$�'4/02"8#"/!#"(�� �<"&"#��%.)!�&$#+��&+))$("%�+�<+0%�)+##0/!"� #$%=��*� $(+'&"#/"(/� $(*")/$�(�<!"(� /!"�&$#.%� $%(�/�%.**$)$"(/�0�<"+="("'���,#")"(/��./8#"+=��*���4�$��)+.%"'�80�+(�.(%.**$)$"(/�0�+//"(.+/"'�&+))$("!+%� %"#&"'� +%� +,2+$(*.�� #"1$('"#� �*� /!$%� 2#�8�"13����������������5���(�-"("#+���%/#�(-"#�+//"(.+4/$�(�1+="%�+,-$&"(�&+))$("�%+*"#�+/�/!"�)�%/��*�'"4)#"+%"'�"**$)+)0���.#/!"#1�#"��&+))$(+/$�(�<$/!�+(+//"(.+/"'�&$#.%�1+0�8"�.(+))"2/+8�"�$(�/!"�)+%"��*!$-!�0�2+/!�-"($)�&$#.%"%�%.)!�+%� ����#��8��+��#"4-+#'�"%%��*�/!"�'"-#""��*�+//"(.+/$�(��(�/!"��/!"#�!+('��%"�")/$(-�#")�18$(+(/�2#�/"$(%

*#�1�/!"�2+/!�-"(�+%�/!"�+)/$&"�)�12�.('��*�&+)4)$("%�)+##$"%�+8%��./"�0�(��#$%=��*�$(*")/$�(��8./�'$%42�+0%�/!"�%!�#/)�1$(-%��*�%/$1.�+/$(-��(�0��("�+#1

Page 16: designing immune responses with genetic immunization and - SAV

�3H ��� ���������� �������������� ���� ��;������������9

�*�/!"�$11.("�%0%/"1��+(/$8�'0�2#�'.)/$�(��<!$�"*+$�$(-� /�� "**")/$&"�0� +)/$&+/"� /!"� )"��.�+#� 8#+()!��.#/!"#1�#"��#")�18$(+(/�2#�/"$(�&+))$("%�#"I.$#"%/#�(-�+'P.&+(/%�+('�1+0�/!"#"*�#"�(�/�8"�%+*"�*�#!.1+(%�����&+))$("%��$(�)�(/#+%/��+#"�&"#0�)!"+2��"+%0

/��)�(%/#.)/��+('�)+2+8�"��*�%/$1.�+/$(-�8�/!�)"��.4�+#�+('�!.1�#+��#"%2�(%"%������&+))$("%�<�.�'�+�%�1""/�/!"�#"I.$#"1"(/%�*�#�8#�+'�+22�$)+8$�$/0�$(� !$#'9�#�'�)�(/#$"%��$()�.'$(-�"+%0�1+(.*+)/.#$(-�+%�<"��+%�.()�12�$)+/"'�/#+(%2�#/+/$�(�+('�%/�#+-"��2�+'P.&+(/%�$(�)�18$(+/$�(�<$/!�����&+))$("%

3+('�+�%��<$/!�2#�/"$(�&+))$("%5�"62+('�/!"�#+(-"��*2�%%$8�"� $11.("�1�'.�+/$�(%����$-�'"�60(.)�"4�/$'"%�)�(/+$($(-��2�1�/$*%�'$#")/�0��#�$('$#")/�0+)/$&+/"�&+#$�.%� /02"%��*�)"��%��*� /!"� $11.("�%0%4/"1���,="0�*"+/.#"�<$/!�#"%2")/�/��$11.(�%/$1.�+4/$�(�$%�/!"�+)/$&+/$�(��*����%��<!$)!�#"%2�('�80�$(4)#"+%"'�+(/$-"(�2#�)"%%$(-�+('�2#"%"(/+/$�(�+('�80%")#"/$�(��*�)0/�=$("%���12�#/+(/�0���2�����$(4'.)"%� �+#-"� +1�.(/%� �*� ��4����<!$)!� $%� +,)"(/#+�1"'$+/�#� �*� !�� $11.("� #"+)/$�(%���,%/#�(-� !�"(&$#�(1"(/�2#�1�/"%��:�)"���+)/$&$/0�+('�/!"�'"4&"��21"(/��*�� ����:�+('�� ��1"'$+/"'�$11.($4/0�#"2#"%"(/�$12�#/+(/�"**")/�#�1")!+($%1%�*�#�/!""#+'$)+/$�(��*�&$#.%"%�+('�/.1�#�)"��%�� �/�!+%�8""(%.--"%/"'�80�+,%"#$"%��*�$('"2"('"(/�%/.'$"%�/!+/��28+%"'�+'P.&+(/%�1+0�8"�1�#"�+//#+)/$&"�*�#�)�$($)+�+22�$)+/$�(%�/!+(��/!"#�1$)#�8$+��'"#$&+/$&"%�8")+.%"�*�/!"$#�)�12+#+8�0���<"#�/�6$)$/0���%$'"�*#�1�/!".('$%2./"'� 2�/"(/$+�� *�#� &+))$("� #"%"+#)!� +-+$(%/2+/!�-"(%������&+))$("%� +('��2�+'P.&+(/%� +#"$(/"(%$&"�0�$(&"%/$-+/"'�)�()"#($(-�/!"$#�.%"*.�("%%$(�)+()"#�&+))$(+/$�(�+('�/#"+/1"(/��"&"#/!"�"%%������&+))$("%�+#"�*+#�*#�1�8"$(-

2"#*")/�#"2�+)"1"(/%�*�#�)�(&"(/$�(+���("%��9!$�"$/� %!�.�'� (�/� 8"� /!"$#� 2#$1+#0� 2.#2�%"� /�� #"2�+)").##"(/�0�.%"'�&+))$("%�<$/!�+,-��'�/#+)=�#")�#'��$�"�!$-!�"**$)+)0�+('�*"<�%$'"4"**")/%��("<�+22#�+)!"%+#"�.#-"(/�0�(""'"'�*�#�'$%"+%"%�/!+/�!+&"�%��*+#�#"4%$%/"'�&+))$(+/$�(�+//"12/%���("��*�/!"�1+P�#�+'&+(4/+-"%� �*�����&+))$("%� $%� /!"� #+2$'� #"+�$Z+/$�(� �*(�&"��%)$"(/$*$)�*$('$(-%�+('�$(%$-!/%���(�)�(/#+%/�/�+(0��/!"#�<+0��*�&+))$("�'"&"��21"(/������&+)4)$("%�"(+8�"�)�(%/#.)/$�(�+('�"&+�.+/$�(��*�("<�&+)4)$("�)�()"2/%�+('�%/#+/"-$"%�$(�+($1+��1�'"�%�<$/!4$(�1�(/!%���.#/!"#1�#"��/!"�"(�#1�.%�2�/"(/$+���*%2")$*$)�1�'.�+/$�(%��*�$11.("�#"%2�(%"%�3<$/!��#

<$/!�./�+''$/$�(+���2�+'P.&+(/%5��2"(%�/!"�2�%%$48$�$/$0�*�#�+,/+$��#41+'"�$11.("�#"%2�(%"�+-+$(%/�+(0-$&"(�2+/!�-"(��))�#'$(-�/���.#�).##"(/�=(�<�"'-"������&+)4

)$("%� #"2#"%"(/� +,)�"+(� +('� %+*"�<+0� /�� $('.)"� +($11.("�#"%2�(%"�/��<"��4'"*$("'�+(/$-"(%�+('�/!$%"6)$/$(-� +('� 2#�1$%$(-� ("<� /")!(���-0� '"%"#&"%+,*+$#�)!+()"�/��2#�&"�$/%"�*�

�:�+�(��%

�J�����F ���J������9��������������� ����;�:����:������������9��J�������� ������QG��,����$11.4($Z+/$�(�1�'"��%/.'0�<$/!�)�(%/#.)/%�"62#"%%$(-/!"�/$)=48�#("�"()"2!+�$/$%�&$#.%�"(&"��2"�2#�/"$(�,$(� '$**"#"(/� 2!0%$)+�� *�#1%�� F,�11.(����B�>�?��4�?��������

�J��������� ����� �� ����:;���� ����FG��./+(/�#+%"2$/�2"%� +%� /+#-"/%� *�#� )+()"#� &+))$("%�� �"1$(�()���-�>���D4��>������

�J���������� ��������������������������J������� ���FG��'"(/$*$)+/$�(��*��&"#�+22$(-�"2$/�2"%�$(�1.4/+(/�#+%��()�-"("�2"2/$'"%�/!+/�+)/$&+/"���>T�+('��DT� ,)"���#"%2�(%"%���.#�F,�11.(���-B>�>��4>>�������

����:���G����"��*�/.1�#�(")#�%$%�*+)/�#�$(�/!"�2+/!�-"(4"%$%��*�$(/#+&+%).�+#�)�+-.��2+/!0��*�%"2%$%G�2�4/"(/$+��("<�/!"#+2"./$)�$12�$)+/$�(%���%#�F,�"'��)$-;>���4��������

���F��;������ �����������:�� ��:������J���� ����������9���������J�;���F�����;�������:��:���FF��9�������JG��(� ���/02"�������&+)4)$("� $('.)"%� )#�%%4#"+)/$&"� $11.("� #"%2�(%"%+-+$(%/� ���/02"���+('������������"%� .1��"/4#�&$#.%"%���>�����4��?������?

��������������J���J�����F���� �� �9��J� �������� ���FG��()#"+%"'�$11.("�#"%2�(%"�"�$)$/"'�80����&+))$(+/$�(�<$/!�+,%0(/!"/$)�-2����%"I."()"�<$/!�2/$1$Z"'�)�'�(�.%+-"�� F,�$#���;->��>�?4��������D

�����9��:����� ������9;����F��:������F�G��.4)�"$)�+)$'�&+))$(+/$�(�+-+$(%/� �6�2�+%1+�-�(4'$$� $(�1$)"�� F,�.=+#0�/��$)#�8$��� <�>� ��?������

���F� ����J��������� �� �9���������J���������� ��G��"-.�+/$�(��*�$(/"#)"��.�+#�+'!"%$�(�1��").�"4��"62#"%%$�(�80�#"/$(�$)�+)$'G�+(+�0%$%��*�/!"��]#"-.�+/�#0� #"-$�(��*� /!"�-"("�� �(/� F,�+()"#�3H>�>�4�>�������>

���F� ����J��� ���������������������� �� �9������� ���G� "/"#�'$1"#$)�#"/$(�$)�+)$'�#")"24/�#48"/+�+('�#"/$(�$'�Q,#")"2/�#4+�2!+�)�12�"64

Page 17: designing immune responses with genetic immunization and - SAV

�3���� ���������� �������������� ���� ��;������������9

"%�%/$1.�+/"�"62#"%%$�(��*�/!"�$(/"#)"��.�+#�+'!"4%$�(�1��").�"4��-"("���"���#�</!��$**"#�B>����4����������

�������J���:����� ��� �����:� ����FG��"4"6+1$(+4/$�(��*�/!"�%.8)"��.�+#���)+�$Z+/$�(��*�/!0#�6$("�]4�'"$�'$(+/$�(�$(�#+/��$&"#��J$�)!"1�F,�H.>��?�4�?�����?�

J�J���������������:�� ����J�G��"/$(�$)�+)$'�.24#"-.4�+/"%�10"��$'�����4��"62#"%%$�(�+('�*.()/$�($(�+,)"��4%2")$*$)�*+%!$�(d"&$'"()"�*�#�#"/$(�$'%$-(+�$(-� 2+/!<+0%� $(� /!"�1+%/� )"��� �$("+-"�F,�".=�)�J$���B�>����4�?��������

J�F����������������������� �J�������������������4��������G����4/#+(%�#"/$(�$)�+)$'�$(!$8$/%�/!"�-#�</!�*�8#"+%/�)+()"#�)"��%�80�.24#"-.�+/$(-�����4�"62#"%%$�(��F,J$����"-.�� �1"�%/��-"(/%���>����4����������

J�������:�����������9���:������G��('.)/$�(��*��:+)/$&$/0�$(�1.#$("�+('�!.1+(�)"��%�80��2�1�4/$*%�$(���$-�'"�60(.)�"�/$'"%�+('�8+)/"#$+������F,�11.(����3;>��D>�4�D>�������

J����9����Q�����������J����F��J����:;��������������� �G��"/$(�$)�+)$'4$('.)"'�1�'.�+/$�(��*���4��1����2#�'.)/$�(�+('���4��#")"2/�#�"62#"%4%$�(��(� ,)"��%���(/��#)!����"#-0��11.(������>��?4���������?

J��� �����F��J�����������Q��������� �F����J��^�������;F�����������J������:��:G��11.(�8$���4-0��*�'"('#$/$)�)"��%���((.��"&��11.(����H>�?�?4D��������

J���;�����F� �� �����G�J$���-$)+��*"+/.#"%��*�-"("/$)$11.($Z+/$�(���+))$("��3>�?DD4?�������?

J���;���������9��� F� �� �����G��#�/")/$�(� +-+$(%/10)�2�+%1+� $(*")/$�(� .%$(-� "62#"%%$�(4�$8#+#0$11.($Z+/$�(���+/.#"��;;>����4���������

J���������� �������������������������������������������G��"/$(�$)�+)$'� $('.)"%� $(/"#)"��.�+#�+'!"%$�(1��").�"4�� !02"#"62#"%%$�(� $(� !.1+(� /!0#�$')+#)$(�1+�)"����$("%��F,��$(��('�)#$(����"/+8�H.>����4�����������

J���� ������ ����� ���F�����:��������F���J�����9������������G�"("�-.(�1"'$+/"'�&+))$(+4/$�(�$%�%.2"#$�#�/��1+(.+��'"�$&"#0�*�#�$11.($4%+/$�(�<$/!�����&+))$("%�"62#"%%$(-�2#�/")4/$&"�+(/$-"(%�*#�1�;"#%$($+�2"%/$%��#��"("Z."4�+(��I.$("��()"2!+�$/$%�&$#.%���+))$("��H>��DD4���������

J� ����J����������G��+)!")/$(7/.1�#�(")#�%$%�*+)/�#G+(�"('�-"(�.%�1"'$+/�#��*�%!�)=�+('�$(*�+11+4/$�(���11.(����"%�3>��D�4�������D�

J�� ����:����� ����� ���� �9����F�G��"��.�+#�#"4%2�(%"%�/��$(/"#*"#�(4-+11+���((.��"&��11.4(����3>�?>�4?�������?

J������ ��������F��������F��F���� �������� ���������� ��� �� ��������JG����D�)�%/$1.�+/$�()+(�2#�1�/"� ,)"���%.#&$&+��80�"(!+()$(-�/!"�"642#"%%$�(��*�J)�4Q����11.($/0��>�D?4�D������

J��������� ��J���;�����J���� ����������9��G����$11.($Z+/$�(�+-+$(%/�"62"#$1"(/+��-"($/+��!"#24"%�%$12�"6�&$#.%�$(*")/$�(��F,�(*")/��$%��;�>�D��4D�?������

J�;���F���:�������������9���G��(*�."()"��*�)"��.�+#���4)+/$�(� �*� "62#"%%"'� +(/$-"(� �(� /!"� "**$)+)0� �*����&+))$(+/$�(G�)0/�/�6$)� ,�012!�)0/"�+('�+(4/$8�'0�#"%2�(%"%�+#"�%.8�2/$1+��<!"(�+(/$-"(�$%)0/�2�+%1$)�+*/"#�$(/#+1.%).�+#�����$11.($Z+4/$�(���(/��11.(����>��D�?4���������?

J��� ���F������������������������� �� �����F���J�������G�'"(/$*$)+/$�(��*�+,#+%��()�-"("�2"2/$'"�/!+/�)�(4/+$(%�8�/!���>3T5�+('���D3T5� ,)"���"2$/�2"%�$(+,("%/"'�)�(*$-.#+/$�(�+('�"�$)$/%�8�/!� ,)"���%.8%"/#"%2�(%"%�80�2"2/$'"��#�����$11.($Z+/$�(�@�(��#�4)"%%��$/+/$�(A���"����11.(���-.3>�?�4D�������

J� :��F�� �� �����9��������J��� �� ������ ��J� ���������� J��:���� �� �����FG�����$11.($Z+4/$�(�$(�&$&��'�<(4#"-.�+/"%�(.)�"+#�+��4/#+(%�#"/4$(�$)�+)$'�#")"2/�#%�$(�1�.%"�%2�""(�)"��%������"����('�)#$(����B3>���?4����������

J� :��F�� �� �����9���������� ��J� ����������� J���:

��� �� �����FG��"/$(�$)�+)$'�#")"2/�#�%/+/.%�$(1�.%"�%2�""(�'.#$(-�+,2#$1+#0�$11.("�#"%2�(%"+-+$(%/�8"/+4-+�+)/�%$'+%"���('�)#��"-.���<>����4��D�������

J� :��F����� J��:������ ��J� �������� �� ����� ��4 �����FG�����$11.($Z+/$�(�$%�+%%�)$+/"'�<$/!$()#"+%"'�+)/$&$/0��*�/02"��,$�'�/!0#�($("��]4'"$�4'$(+%"�$(�1�.%"��$&"#�������"����('�)#$(����3->D�4D��������

J����� �����������G��('.)/$�(��*�+(/$-"(4%2")$*$)�/.41�#� $11.($/0�80�-"("/$)� +('� )"��.�+#� &+))$("%+-+$(%/����G�"(!+()"'�/.1�#�2#�/")/$�(�80�)�4"62#"%%$�(��*�-#+(.��)0/"41+)#�2!+-"�)���(04%/$14.�+/$(-�*+)/�#�+('�J?4��������"'�->��>�4���������

J�� �9G��"#!+('�.(-"(�e#Z/�$)!"#�"%"��%)!+*/"(��J"#4�$("#�:�$(��9�)!"(%)!#$*/�-�>��>�4�>����D��

�����������J���������; �������:�������G��"#&+%$&"�2� %.22#"%%$�(� $(� +($1+��1$/�)!�('#$+�� -"4(�1"%���#�)��+/���)+'��)$�,���,��>��?��4�D������>

����9�������������F��:��������������������������9����������JG��(�"('�/�6$(4$('.)"'�%"#.1�*+)4/�#�/!+/�)+.%"%�(")#�%$%��*�/.1�#%���#�)��+/���)+'�)$�,���,;->�����4��?�����?�

�������������� �������������� ����G��#$-$(��1+/.#+4/$�(�+('�+(/$-"(�2#"%"(/$(-�*.()/$�(��*�'"('#$/$))"��%���.##��2$(��11.(����>���4�������?

Page 18: designing immune responses with genetic immunization and - SAV

�B. ��� ���������� �������������� ���� ��;������������9

� ����F �� ��:�������������� ����:���:����������94���;�F�G�J+)/"#$+�����4$('.)"'��:�)"��� ���4-+11+�2#�'.)/$�(�$%�'"2"('"(/��(�1+)#�2!+-"%")#"/$�(��*���4������$(��11.(����11.(�2+/!��H<>��D�4��������?

� ����9��J�F������� ���������������G��,&")/�#����&+))$("�"()�'$(-�2%".'�#+8$"%�&$#.%�$11"4'$+/"�"+#�0�2#�/"$(�'"1�(%/#+/"%�2+#/$+��2#�/")/$�($(�1$)"�+-+$(%/��"/!+��&$#.%�)!+��"(-"���$#+���141.(�����>��?4�������D

� �9�; ��� ����J�������;���� ��9:������9���� ��; �� ���� G��"&"��21"(/��*� !��+('� !��2�24.�+/$�(%�+('�/!"�(+/.#"��*�$11.("�#"%2�(%"%�/�!"2+/$/$%�J,&$#.%�����&+))$("%�)+(�8"�1�'.�+/4"'� 80� )�'"�$&"#0� �*� &+#$�.%� )0/�=$("� -"("%�F,�11.(����B.>�����4���������D

� �9�; �� ���9���� ��9:��� �;��� ���� G��142#�&"1"(/��*�!"2+/$/$%�J,&$#.%�����&+))$("%�802�+%1$'%�)�"62#"%%$(-�!"2+/$/$%�J,%.#*+)"�+(/$-"(+('�$(/"#�".=$(4���F,�$#���;�>����4�?D�����?

������:�����J������:;�F������J������G��('.)/$�(��*�)04/�/�6$)� ,�012!�)0/"%�+('�+(/$/.1�#�$11.($/0<$/!����� &+))$("%� "62#"%%$(-� %$(-�"� ,)"��"2$/�2"%��F,�11.(����3B>�����4��?�������

����� ��������;��F�������������������� �� �������������� �������;��� �G��"/$(�$)�+)$'4$('.)"'/#+(%)#$2/$�(+��1�'.�+/$�(��*�/!"�!.1+(�$(/"#*"#4�(4-+11+�2#�1�/"#�� F,J$����!"1�-;�>���?D�4��?���������

����;�9G� #"+/1"(/��*�$(�2"#+8�"�1+�$-(+(/�/.1�#%�<$/!/!"�/�6$(%��*��#0%$2"�+%�+('�/!"�8+)$��.%��#�'$4-$�%.%���1�F,�"'��)$��.H>��D����D�>

����;�������J������������ ������������������4����� ���� J����9� ���� ������ � G�,)+#)$(�"18#0�($)� +(/$-"(� 2��0(.)�"�/$'"&+))$("� !+%� $(� &$&�� +(/$/.1�#� +)/$&$/0��"(" !"#�->���4��������

�������������F������������� � �� G�"("�&+))$(+/$�(<$/!�(+="'�2�+%1$'����G�1")!+($%1��*�� �2#$1$(-��F,�62��"'��H<>�����4����������

�������� � �� ���������������F�� �������J�������������������G���%/$1.�+/$�(�2#�&$'"'�80����$11.($Z+/$�(� "(!+()"%� +(/$/.1�#� $11.($/0�F,�11.(����3�>�>���4���>�����?

��9���;�F���J��� ��F��������������;������:��� �4:;��G��$**"#"(/$+��#"-.�+/$�(��*�/!"���4���2>�2#�1�/"#�+('��*�2>��%")#"/$�(�80��2�����+('�$2�2��0%+))!+#$'"��F,�11.(����B->��??�4�??������

��9���;�F���� ����F ��;���:��:������G�J+)/"#$+�����$('.)"%��:�)"��%�/��2#�'.)"����4-+11+�$(�&$&�+('�$()#"+%"%�/!"�/�6$)$/0��*��$2�2��0%+))!+#$'"%�F,�11.(����3B>�>�?�4>�?�������

�������� ��� ���������������:�;�� F�G� �(*�+11+/�#0)0/�=$("%�+('�/02"��,�]4'"$�'$(+%"�"62#"%%$�(�$(2!$��#+/��$&"#�)"��%�������"����('�)#$(����-�>����4��D�����?

������������������������������������������������

��������J���������������������������������� ������� ������ ����G���%$/$&"�+('�("-+/$&"�#"-.�+4/$�(��*�/!"�)�12�%$/"��)/+1"#�1�/$*��*�/!"�$(/"#4�".=$(���"(!+()"#�80���4����)/4���+('�#"/$(�$)+)$'�#")"2/�#��F,�62��"'��H.>��>D�4�>�?������>

���9���������; ��G� !"�#��"��*�/02"��,$(/"#*"#�(%�$(�/!"'$**"#"(/$+/$�(�+('�*.()/$�(��*� !��+('� !��)"��%��"1$(��()���-<>���4�>4���4�D�����?

����J�����J;����J���� ����J��������F��9��:�����G�('.)/$�(��*�)0/�/�6$)� ,�012!�)0/"%�80� $(/#+41.%).�+#�$11.($Z+/$�(�<$/!�2�+%1$'�����$%�*+4)$�$/+/"'�80�8�("�1+##�<4'"#$&"'�)"��%���#�)��+/��)+'��)$�,���,��>�D�?D4D�D�������

�������� ����� ���� G� !"�����7���7 ���4��)�142�"6��*�J,�012!�)0/"%G��$(=$(-�(+/.#+��/��+)I.$#"'$11.($/0���((.��"&��11.(�����>���?4�>�������

��� ^� ������ ����;����9�J� ��������J������ �G�$**"#"(/� ,!"�2"#�)"���/02"%�+('�+(/$8�'0�$%�/02"%-"("#+/"'�80�%+�$("�+('�-"("�-.(�����$11.($4Z+/$�(��F,�11.(����3H>���?D4��D>�����?

���� �����F���������� ����F��:�������� G��**")/$&"����&+))$(+/$�(� +-+$(%/� �$%/"#$�%$%� 80� 2#$1"78��%/�$(�).�+/$�(�<$/!�/!"�-"("�-.(��F,�11.(���B�>�>���4>��D������

����������������G��"('#$/$)�)"��%�$(�)+()"#�$11.4(�/!"#+20���((.��"&� �11.(����H>� �>�4�?������

�����������:������ �����:�9� ����G� !"�%"#.1�1+((�%"48$('$(-�2#�/"$(�+('�/!"�1+)#�2!+-"�1+((�%"�#"4)"2/�#�+#"�2+//"#(�#")�-($/$�(�1��").�"%�/!+/��$(=$((+/"�+('�+'+2/$&"�$11.($/0���"1$(��11.(����.>���4�?������D

������������ ����;������ ��� ����������;���:�����G�"/$(�$)�+)$'�2#�1�/"%�2#��$*"#+/$�(�+('�$('.)"%"62#"%%$�(��*� #"/$(�$)�+)$'� #")"2/�#4+�2!+�-"("$(�1.#$("� ,�012!�)0/"%���"����11.(����3->��>�4�>D�������

�� ��������������������������FJ������������4����;�FFG��('.)/$�(��*�� ��)�+%%��4#"%/#$)/"'�� �#"%2�(%"�80�����$11.($Z+/$�(�<$/!�.8$I.$/$(4$(*�."(Z+� &$#.%� (.)�"�2#�/"$(� *.%$�(� +(/$-"(%��+))$("��B>�2�?��4�?�?�����D

�� ��������FJ������������F�����:����������������9���������Q���������;�FF�������G��#$1$(-�*� )0/�/�6$)� ,�012!�)0/"%� 80�����&+))$("%G�"I.$#"1"(/�*�#�2#�*"%%$�(+��+(/$-"(�2#"%"(/$(-)"��%�+('�"&$'"()"�*�#�+(/$-"(�/#+(%*"#�*#�1�10�4)0/"%�������"'��>����4�?������?

Page 19: designing immune responses with genetic immunization and - SAV

�B���� ���������� �������������� ���� ��;������������9

�������������������� �:� ���:��9�����F�G��(!+()"41"(/��*�)"��.�+#�+('�!.1�#+��$11.("�#"%2�(%"%/��!"2+/$/$%��,&$#.%�)�#"�2#�/"$(�.%$(-����48+%"'&+))$("%� +.-1"(/"'�<$/!� )0/�=$("4"62#"%%$(-2�+%1$'%��F,�11.(����3H>�����4���?�����?

��:�����������������������������Q�������������:�94� �FJ������ �:;���G���'.�+/$�(��*�#"(+��'$%"+%"$(�+./�$11.("���J7��9�1$)"�80�$11.($Z+/$�(<$/!�8+)/"#$+�������F,�62��"'��H�>���D�4���?�����

��������������F������������������������������� ��� G� ���� $11.($Z+/$�(� )�(*"#%� 2#�/")/$�(+-+$(%/�1.#$("�)0/�1"-+��&$#.%�$(*")/$�(��F,�$#��;.>�?���4?��D������

�������������G��(*")/$�.%�'$%"+%"%�����$���./8#"+=�#+$%4"%�I."%/$�(%�+8�./�&+))$("���)$"()"�-�.>��D�?4�D���������

�����FG��"/$(�$'%�+('�&"#/"8#+/"�'"&"��21"(/��F,J$���!"1�-B�>������4��>��������>

��:��� ������ �:� ����� :�� ����� �;������ ����������9������ �� ���:����������J��9����� G�24���4%2")$*$)�+)/$&+/$�(��*�+(/$-"(42#"%"(/4$(-�)"��%�#"I.$#"%�%/#"%%�=$(+%"�+)/$&$/0�+('�$%�2#"4)"'"'�80�(�(4%2")$*$)�"('�)0/�%$%�+('�"('�%�14+��1+/.#+/$�(���18��F,�;>�����4��>������D

��:��� ����J�������� �:�� ����� �� ����:���:������9����� G��11.("��"����)/$&+/$�(�80�J+)/"4#$+���24����/!#�.-!��0"��$'��$**"#"(/$+/$�(�+#="#�DD�+('� .1�#��")#�%$%��+)/�#��")"2/�#4�%%�)$+/"'��+)/�#�3 ���5���F,�62��"'���->����4���������

��:�� ���� �������F����J�� ����� �������������� �4����G�����1.�/$4� ��"2$/�2"�&+))$("%�*�#� ��+('���+%1�'$.1�*+�)$2+#.1G�$11.(�-"($)$/0�$(1$)"���+))$("��B>�>��4>�������D

�� �����:������� �F��9��������J��� �� ������� J��:

����� ��J� ���������J������������������� ��4 �����FG��11.("�#"%2�(%"%�+*/"#�$11.($Z+/$�(<$/!�2�+%1$'�����"()�'$(-�J"/�&,���/!"�1+P�#+��"#-"(��*�8$#)!�2���"(��F,���"#-0���$(��11.(���.�>���?4���������

�� �����:������� �F��9��������J��� �� ������� J��:

����� ��J� ������������:���� ������������J������������������ �� �����FG��%�*�#1%��*�/!"�1+4P�#�+��"#-"(��*�8$#)!�2���"(�$('.)"�'$**"#"(/�$141.("�#"%2�(%"%�+*/"#�-"("/$)�$11.($Z+/$�(���(/�#)!����"#-0��11.(����-.>��?4��������

�� �������:������G��")!+($%1� +('� *.()/$�(� �*+,("<�0�$'"(/$*$"'��2�����1�/$*�$(�!.1+(�2#$41+#0�J,)"��%��F,�11.(����B<>��>>4���������

��9�Q����������������� ���J������ �� 9��J�����G .1+(�1+)#�2!+-"%�%")#"/"�+,/.1�#$)$'+��+)/$&4$/0�'$%/$()/�*#�1�/.1�.#�(")#�%$%�*+)/�#4+�2!+�+('

#"+)/$&"�($/#�-"(�$(/"#1"'$+/"%���"%��11.(����<�>D�4�>������

�� �9������J������G��0/�/�6$)� ,�012!�)0/"�+)/$&+4/$�(�80� )#�%%42#$1$(-���.##��2$(� �11.(�����>��>4��D������

����� �� �:�� �����:�9��� ��:��� �� ���� ��������F� ���� ��� ����� �� ����:��9����� �� �:�4���:���:�����G��, ���4�$="� #")"2/�#� #")�-($Z"%8+)/"#$+������@�(��#�)"%%��$/+/$�(A���+/.#"�<.H>?>�4?>�������

��������F ����������F��9������:�FJ����Q�F ��:������F���� �� ����������� ��������������:�G��.)�"$)� +)$'� &+))$("4$('.)"'� $11.("� #"4%2�(%"%�#"I.$#"����D�)�%/$1.�+/$�(�+('�+#"�#"-4.�+/"'�80�� ��>�� F,�11.(����B.>��?��4�?�>����D

��� ��� ��:;�� ���� ������;���9� ��� ���:�� ��� �: G��11.(�2#�2!0�+6$%��*�+��"#-"(4$('.)"'�$11.(�-��8.�$(��,%0(/!"%$%�+('�+$#<+0!02"##"%2�(%$&"("%%�$(�&$&��80�-"("/$)�$11.($4Z+/$�(�@%""�)�11"(/%A���+/��"'�->��>�4�>>������

�������J��������������������^J������� ���������� �9�����9G��#�/")/$&"�)0/�/�6$)� ,�012!�)0/"#"%2�(%"%� +-+$(%/� 2+#+106�&$#.%"%� $('.)"'�80"2$/�2"48+%"'�����&+))$("%G��(&��&"1"(/��*����-+11+���(/��11.(����.>��>>�4�>>?�����D

��� ��������� �� �:�������F�������F�������������������������� ������G���+%1$'�����"62#"%%4$(-�+,%")#"/"'��#�+,(�(%")#"/"'�*�#1��*�!"2+/$/$%�,&$#.%� (.)�"�)+2%$'G���12+#+/$&"� %/.'$"%� �*+(/$8�'0�+('� 4!"�2"#�#"%2�(%"%�*����<$(-�-"("/$)$11.($Z+/$�(�������"���J$����B>��D�4��������?

�������:�������FJ�������J���������� ������G��0/�=$(""(!+()"1"(/��*�����$11.($Z+/$�(��"+'%�/��"*4*")/$&"�/#"+/1"(/��*�"%/+8�$%!"'�2.�1�(+#0�1"4/+%/+%"%��F,�11.(����3B>���D4�>�������

�9���:�����J��J���J G��('.)/$�(�80�����$11.($Z+/$�(�*�+,2#�/")/$&"�+(/$/.1�#�)0/�/�6$)� ,�012!�)0/"#"%2�(%"�+-+$(%/�+,1$($1+�4"2$/�2"4�"62#"%%$(-/.1�#���+()"#��11.(����11.(�/!"#�<3>��?�4�?�����D

�9���:����� � ���� ����JF��� ����:��J����� �������J��J���J G��(!+()"'�� ��#"%2�(%"%�1"'$+/"'80�2�+%1$'�����$11.(�-"(%�"()�'$(-�)�%/$14.�+/�#0�1��").�"%�+('�)0/�=$("%��F,�11.(����3H>>���4>��������?

�9���:����� ����������� �� ��������J������ ���J��J��J G� !"�'�1$(+(/�#��"��*�8�("�1+##�<4'"#$&"')"��%�$(�� ��$('.)/$�(�*����<$(-�2�+%1$'����$11.($Z+/$�(�+/�'$**"#"(/�%$/"%��F,�11.(����3�>��4�>�����?

F�������9�����������J����:�� �������J������������� 4 ����9�����F�G��$#")/�-"("�/#+(%*"#�$(/��(�(!.4

Page 20: designing immune responses with genetic immunization and - SAV

�B- ��� ���������� �������������� ���� ��;������������9

1+(�2#$1+/"�10�*$8"#%�$(�&$&��� .1�"("� !"#�>���4���������

:��� �� �� ��:�� ��J������� ��J�� ���9FG���4$11.4($Z+/$�(�<$/!�����&+))$("%�"62#"%%$(-�-#+(.��4)0/"41+)#�2!+-"�)���(04%/$1.�+/$(-�*+)/�#�+('10)�8+)/"#$+��%")#"/"'�2#�/"$(%�"(!+()"%� 4)"��$11.($/0��8./�(�/�2#�/")/$&"�"**$)+)0�+-+$(%/��04)�8+)/"#$.1�/.8"#).��%$%���11.(���-0��B>����4���������

:� ���������������J����� ����9��;��� �������� �� G .1�#+�� +('� )"��.�+#� $11.($/0� /�� +(� "()�'"'2#�/"$(� $('.)"'�80�'$#")/�����$(P")/$�(�� .1"("� !"#�3>�����4����������>

:���FF���;;��������J������������� � �������������:��9���J��J�;���F���9�������JG��(�&$&�"(-$(""#$(-� �*� +,)"��.�+#� $11.("� #"%2�(%"� 80)�+'1$($%/#+/$�(��*���4���"62#"%%$�(�&")/�#�<$/!+,���� $11.(�-"(�� F,�11.(����3H>�D��4D������?

:���FF��J������������ ���������� �;��:��� �;��:�9������������������������� � �������������:���� ����������� �������������F��4;������J�;���F���9���J��9�������JG��(-$4(""#$(-��*�$(�&$&��$11.("�#"%2�(%"%�/������$141.($Z+/$�(�&$+�)�'"�$&"#0��*�)�%/$1.�+/�#0�1��4").�"�-"("%���+/�J$�/")!(����3>��>�4�>������?

:���FF���� �� ����:�� ������������F�������� ��� � F����� � ��� ���������: ��9;����������F��;���������:���9�������JG��(/$4-"(4%2")$*$)� !.1�#+�� +('� )"��.�+#� $11.("� #"4%2�(%"%� )+(� 8"�1�'.�+/"'� $(� #!"%.%�1+)+I."%/!#�.-!�/!"�.%"��*����4-+11+����4�����#���4�D-"("�+'P.&+(/%��F,�"'��#$1+/���-H>���>4���������

:���FF�� ��������� �� ����:������������������������ �F�������F������:����� � ��� ��� ������������F��;������9�������JG��(/#+)"��.�+#+'!"%$�(�1��").�"4��1�'.�+/"%�8"/+4)!"1�=$("%+('�'$#")/�0�)�%/$1.�+/"%� ,)"��%�$(�&$&���F,��$(�(&"%/��.�>�D��4D??������

:���FF��;���F��������F��9������������ �� ����:������������� �������� �F������:����� � ��� ����F��;���������� F���� ����������9�����

�JG��+)#�2!+-"�)���(04%/$1.�+/$(-�*+)/�#�)+(1�'.�+/"�$11.("�#"%2�(%"%�+('�+//#+)/�'"('#$/$))"��%�$(�&$&��@�(��#�)"%%��$/+/$�(A�� .1�"("� !"#��>����4���������

:�J�;�� �� �� ������������� ��4���������������G��#"42#$1$(-G�+,(�&"��+22#�+)!�/�����48+%"'�&+))$4(+/$�(�+('�$11.(�1�'.�+/$�(�@�(��#�)"%%��$/+4/$�(A���2#$(-"#��"1$(��11.(�2+/!���-->�D�4�������

:�J�;�� �� �� ���������� �:�J�;�� ��:���;������ ���������������������G��11.(�%/$1.�+/�#0

���� 2#"42#$1$(-G� +,(�&"�� +22#�+)!� *�#� 2#�4��(-"'� !�4�8$+%"'�$11.($/0���"����11.(�����H>��4?�������

:� ����FG� !0#�$'�!�#1�("�'"$�'$(+/$�(�$(�/+#-"/�/$%%."%d+�#"-.�+/�#0�#��"�*�#�/!"�/#+)"�"�"1"(/�%"�"($.1U�62���$(��('�)#$(����.->���4D������>

:� ����F���� ��J���������� ��������:� �����J����:G�+2$'�%/$1.�+/$�(��*� /02"� �,�]4'"$�'$(+%"� $(� #+/2$/.$/+#$"%�80����]��4�/#$$�'�4�4/!0#�($("�������"���('�)#$(����.H>��?4���������

:������G��$#")/�$11.(���-$)�+)/$&$/$"%��*��2����+('�$12�$)+/$�(%�*�#�-"("�/!"#+20��F,"("��"'��>��4��������

:��������9� ��9���� �������������������� �������;������;���:��� �� ���������� �G��"I."()"1�/$*%�$(�+'"(�&$#+������8��)=�$11.("�+)/$&+4/$�(�80�%/$1.�+/�#0��2�1�/$*%���#�)��+/���)+'�)$�����3>������4����������D

:��������;���:���� �������9����� ��� � F��J�� ����� �����������:��� �:;����:���������G�2�1�/$*%� $(�8+)/"#$+������/#$--"#�'$#")/�J4)"���+)/$&+/$�(���+/.#"��;<>��>�4�>�������

:��������������F���������:��J����J�������J G��(&��&"1"(/��*�+(�� �4'"2"('"(/�2"2/$'")!+2"#�("�$(�)#�%%4�2#"%"(/+/$�(�+*/"#�����$141.($Z+/$�(��F,�11.(����B3>�?��4?��������

��� ����������:��� ��� ��������� ������� �;������4� ������� ����F���:�������9����������������������F������:������� �J�� ����������F�� ���������G��+*"/0��/��"#+8$�$/0�+('�!.1�#+�$11.("�#"%2�(%"%�+*/"#�$(/#+1.%).�+#�+'1$($%4/#+/$�(��*�+,1+�+#$+�����&+))$("�/��!"+�/!0�+'.�/&��.(/""#%���+))$("��H>��D��4�����������

�����9��� ��F �����;�G��2/$1+��$('.)/$�(��*�!"2+/$4/$%��,&$#.%�"(&"��2"4%2")$*$)�$11.($/0�80�8$)$%4/#�($)�2�+%1$'�����$(�).�+/$�(�<$/!�/!"�-#+(.4��)0/"41+)#�2!+-"� )���(04%/$1.�+/$(-� *+)/�#-"("��F,�$#���;->�D>��4D>�������D

��� ����99G��0/!��1"(+)"��#�1"'$)+��8�"%%$(-UG� !")�$($)+��2�/"(/$+��+('�/!"�2#�8�"1%��*�-"("/$)�&+)4)$("%����J���"2�->���D4�?��������

��� ����99�����������J�����9������ ��F����� � ������ �� ;��F���;��� F�G� �11.("� #"%2�(%"%$('.)"'�80�$(/#+1.%).�+#��#�-"("�-.(�$(P")/$�(�*�2#�/")/$&"�'"�60#$8�(.)�"$)�+)$'�&+))$("%�/!+/"62#"%%�/!"�)$#).1%2�#�Z�$/"�2#�/"$(�*#�1���+%41�'$.1�8"#-!"$�1+�+#$+� 2+#+%$/"%�� F,�11.(���3�>�����4���������?

��������������� ��9�������FJ��� �����F���������;FG� �11.($Z+/$�(� �*� (�(4!.1+(� 2#$1+/"%�<$/!����&+))$("%���+))$("��3>����4���������?

��������������;��J������ �F ���9�� ���G�����&+))$4(+/$�(��*�1$)"�+-+$(%/�#+8$"%�&$#.%G�"**")/%��*�/!"

Page 21: designing immune responses with genetic immunization and - SAV

�B���� ���������� �������������� ���� ��;������������9

#�./"��*�&+))$(+/$�(�+('�/!"�+'P.&+(/�1�(�2!�%42!�#0�� �$2$'��,3���5���+))$("��H>�����4���������

�����F�����������J������������ ���F������J��� ��������� ������9��������J��� ���� :G����4�(�/��Q����$-+('%�$(!$8$/�)"���+)/$&+/$�(�+('�2#"4&"(/�+2�2/�%$%�$(�J4�012!�)0/"%��F,�"����!0%$���;3>��D4??������D

��9�����J�� �������������� ����F����������G� �<+#'%+,����&+))$("�+-+$(%/�/.8"#).��%$%���+))$("��->���?4��>������>

�����;������� ��Q���� ���;���������� �:;� ������4�������G���>�4$('"2"('"(/�2+/!<+0%��*� ,)"��!"�2� *�#� 2#$1$(-� �*� ��D3T5� )0/�/�6$) ,�012!�)0/"%��F,�62��"'����>��>�4���������

������������J�;���F������:������;�:�����:4���� �F�� J������������ � � ���������J�����;�� ����� F��������������J������;�������J�������9�������JG��$#%/�!.1+(�/#$+���*+,���48+%"'�&+))$("�*�#�/#"+/1"(/��*�!.1+($11.(�'"*$)$"()0�&$#.%�/02"���$(*")/$�(G�%+*"4/0�+('�!�%/�#"%2�(%"��F,�(*")/��$%��;H>���4��������D

����:��� ���� ��� ����:�;���� �����;��G��0/�4/�6$)� ,)"���#"%2�(%"%�/������&+))$(+/$�(G��"42"('"()"� �(� +(/$-"(� 2#"%"(/+/$�(� &$+� )�+%%� ��� ���F,�11.(����B�>�����4���������D

�����:������������F��;����9����9��������J G�"4("/$)�$11.($Z+/$�(�+-+$(%/�!"#2"%�%$12�"6�&$#.%��#�/")/$�(�$%�1"'$+/"'�80���>T� ,�012!�)0/"%�F,�11.(����33>����4���������

�� ����J������ ����F�����J����F�G����$%�(�/�%.**$)$"(//�� "62�+$(�1+6$1+�� )0/�/�6$)$/0��*� /.1�#$)$'+�1+)#�2!+-"%�+-+$(%/�+(���4%"(%$/$&"�)"��� �$("�F,�".=�)�J$���B.>��>�4���������

�� �������G� ��"#+()"��'+(-"#��+('�/!"�"6/"('"'�*+1$�0��((.��"&��11.(����->����4��>������>

����������J� F�����:������ ����FF���������:�G��"/4$(�$)� +)$'� .2#"-.�+/"%� !.1+(��+(-"#!+(%� )"��+(/$-"(� 2#"%"(/+/$�(� +('� %.#*+)"� "62#"%%$�(� �* ��4���+('�����)��+,8"/+���$(/"-#$(�)#$/$)+��0$(&��&"'�$(� 4)"���+)/$&+/$�(��F,�(&"%/��"#1+/���.�>�??�4??�������>

���� ������� � �:����������J�:������:��������J� ������� ��:������������������ ����������;4���� G��+="'�����+('�+'"(�&$#+��$11.($Z+4/$�(%� *�#� $11.(�/!"#+20� �*� 2#�%/+/"� )+()"#G+,2!+%"��7���)�$($)+��/#$+����.#�#����H>���D4��?������

������:������������ ��������� ��9������������ ���������� F��� ����������� � ���J�����G��12�"6$/0��*�/!"�)0/�=$("�+('�+(/$8�'0�#"%2�(%""�$)$/"'�80� $11.($Z$(-�1$)"�<$/!���+%1�'$.1

0�"�$$� )$#).1%2�#�Z�$/"� 2#�/"$(� 2�+%1$'�����F,�11.(����33>�����4��>�������

�������� �������������G� ��+('� ��)"��%G�'$**"#"(/2+//"#(%��*��012!�=$("�%")#"/$�(��"+'�/��'$**"#"(/*.()/$�(+��2#�2"#/$"%���((.��"&��11.(���;>��>�4�?�����D�

����������J��� ���� :G��"/$(�$)�+)$'�2#"&"(/%�2!�%2!�4#0�+/$�(��*�2�J�$(�(�#1+��!.1+(�J,�012!�)0/"%G#"-.�+/$�(��*�)0)�$(����)0)�$(����+('�2��3�$2�5�J���'��<>���>D4���D�������

��� �� ��� �F�������;�� �������:�9�� �������:����;G���'�(��2/$1$Z+/$�(�"**")/��(�/#+(%�+/$�(+��"*4*$)$"()0� �*�����&+))$("� $(�1+11+�$+(� )"��%G+(+�0%$%��*�2�+%1$'�����"()�'$(-�+,� ��"2$/�2"'"#$&"'�*#�1�1$)#��#-+($%1%��J$�)!"1�J$�2!0%�"%���11.(�-B�>�>>�4>��������

��� ����99�����9� �JF������������ �������FG���/"(4/$+������&+))$("� $(/"-#+/$�(� $(/��!�%/�)"���-"4(�1"���((��,;��)+'��)$�;;->���4���������

�� ������ ���J���� �� �������������������������� ����������� G� .1+(�2��3��>4�?�5� ��4��8$('$(-�2"2/$'"�$%�+(�$11.(�'�1$(+(/�"2$/�2"$(����4$11.($Z"'� ��4��� /#+(%-"($)�1$)"��+()"#��"//���;>��D�4���������

���� �:;��������� ��������G��(*�."()"��*�8+)=8�("�)!"14$%/#0��(�$11.("�+)/$&+/$�(�80�%0(/!"/$)���$-�(.4)�"�/$'"%��J$�)!"1��!+#1+)���3H>���D�4��DD�����

�� ��F������������������F�G� #+(%)#$2/$�(��*�#"/$(�$)�+)$'#")"2/�#�-"("%�$(�/#+(%-"($)�1$)"�$()#"+%"%���D 4)"���%.8%"/������J$����"2��;>����4�>��������

��� ���:���� ��Q������������������;�� ����������Q��J���9����������F������������������������������J���������������4��� �����������; ��J��J� ����JG��"*")/$&"�����%$-(+�$(-�$(��� 7 "F�+('���?J�7���)�#�1$)"G�1./+/$�(%�$(� �#>-"("���)$"()"�-H->���D�4��DD�����D

������������������:����9���:�����J��J���J ����� ����������������G��#"'�1$(+(/�#��"�*�#�'$#")/�0/#+(%*")/"'�'"('#$/$)�)"��%�$(�+(/$-"(�2#"%"(/+/$�(/����DT� ,)"��%� +*/"#� -"("� -.(� $11.($Z+/$�(�F,�62��"'��HH>�2��?�4��D������D

���;����:��������F�� �;����F�G��+($2.�+/$�(��*� ��4��-2���4%2")$*$)�$11.("�#"%2�(%"%�"�$)$/"'�&$+-"("�-.(48+%"'�����$11.($Z+/$�(���+))$("��3>��>�4���������?

����F�� ���������� ���������:���� ��:�������:�4�� ��;����� �F����������������� �J����������� � ��FG����>�$%�+,2+//"#(�#")�-($/$�(�#"4)"2/�#���11.($/0��>����4��������>

���:���:��J��� ������:�� ����J�� ��������������J��������������������������� ���G��"/$(�$'/#"+/1"(/��*�"62"#$1"(/+��+��"#-$)�"()"2!+��104

Page 22: designing immune responses with genetic immunization and - SAV

�B< ��� ���������� �������������� ���� ��;������������9

"�$/$%����4>�2#�'.)/$�(�)�##"�+/"%�<$/!�$12#�&"''$%"+%"�)�.#%"��F,�11.(����3<>�>��4>�D�������

���������������������:������������ J���J���������� 4����������:�9�:�� � �� ��� ���� ��9���;��:��:�������� ����G��(/#+'"#1+��-"("�$11.4($Z+/$�(G�/!"�2�%%$8�"�#��"��*�����.2/+="�$(�/!"$('.)/$�(��*�)"��.�+#� $11.($/0� /��&$#.%"%���#�)�+/���)+'��)$�,���,��>�����4���������>

������� � �� ���� ��;����������������F������������9��������������J��� ������������G��#"*"#4"(/$+��$('.)/$�(��*�+, !��$11.("�#"%2�(%"�+('$(!$8$/$�(��*�%2")$*$)��-��+(/$8�'0�*�#1+/$�(�802�+%1$'�����$11.($Z+/$�(���#�)��+/���)+'��)$,���,��>���>�4��>�������

�����F���������������� �������G��,)�('$/$�("'�'"('#$/4$)�)"���)+(�8"�+,/"12�#+��8#$'-"�8"/<""(�+,��>T 4�!"�2"#�+('�+, 4=$��"#�)"���@%""�)�11"(/%A���+4/.#"����>�>?>4>?D�����D

������������ ���F��9 � ���F�G�����$11.($Z+/$�(G.8$I.$/$(+/$�(��*�+,&$#+��2#�/"$(�"(!+()"%�)0/�4/�6$)� 4�012!�)0/"�$('.)/$�(�+('�+(/$&$#+��2#�4/")/$�(�8./�+8#�-+/"%�+(/$8�'0�$('.)/$�(��F,�$#��;�>�D>�?4D��������?

����� ���Q�;��J�� �������J������ �G���'�"(!+()"41"(/��*�+(/$8�'$"%�/��!"1+--�./$($(�+))"�"#+/"%2#�/")/$�(�+-+$(%/�$(*�."(Z+�&$#.%�)!+��"(-"���+4/.#"��11.(����>���?4���������

��;��F��9�����J�����F��������F �� ���;���������4����������F��J�: ������F:���9����9�����Q������9�������������;����:������������4���������� �;����F��� �;���J���������G��(4'.)/$�(��*�+(/$-"(4%2")$*$)���DT� ,)"��%�� ,!"�2"#)"��%��+('�2#�/")/$&"��"&"�%��*�+(/$8�'0�$(�!.1+(%80�2+#/$)�"41"'$+/"'�+'1$($%/#+/$�(��*�+,!"2+/$/$%J,&$#.%�����&+))$("���+))$("���>�?�>4??D�������

�� ��;����������� � �� ������������������;����������������F���� ���������������������G��141.(�%/$1.�+/�#0�����%"I."()"%�(")"%%+#0�*�#"**")/$&"�$(/#+'"#1+��-"("�$11.($Z+/$�(���)$"()"-;�>����4��>������

�� ��J� ��������� ������9��������: ��������� JR�:����������:����� ����99�� �� �����F���;���F�G�"1�&+���*�/!"�)$#).1%2�#�Z�$/"�2#�/"$(�-�0)�42!�%2!+/$'0�$(�%$/���%$-(+��%"I."()"�*#�1�+,�������&+))$("�"(!+()"%�$('.)/$�(��*����4%2")$*4$)� !��/02"�$11.("�#"%2�(%"%�+('�$12#�&"%�2#�4/")/$�(�+-+$(%/�1+�+#$+�$(*")/$�(���.#�F,�11.(��7�(�2+�%%9������

�� 9��J������������ �������J����G��!+#+)/"#$Z+/$�(+('� 2+#/$+�� 2.#$*$)+/$�(� �*� +,!$-!�1��").�+#<"$-!/�/.1�#$)$'+��+)/$&$/0�%")#"/"'�80�1.#$("8�("�1+##�<�1+)#�2!+-"%���(/��11.(���<>����4��>������

�� 9����������������:�����9��� �� ���� �����:��4�� �����FG��"2/$'�-�0)+(4�+('��$2�/"$)!�$)�+)$'4$('.)"'�)"���+)/$&+/$�(�$%�1"'$+/"'�80�/���4�$="�#"4)"2/�#����F,J$����!"1�-;<>��?>��4�?>��������

����� ���� ��� ������� �J�� ���� ���������G��#�/")4/$�(�+-+$(%/�1+�+#$+�80�$11.($Z+/$�(�<$/!�2�+%41$'����� "()�'$(-� )$#).1%2�#�Z�$/"� 2#�/"$(��#�)��+/���)+'��)$�,���,��>��D��4�D?������>

�����J���:������������ ���� ���G��$)#�8$+��2#�'4.)/%�$('.)"�+./�$11.("�'$%"+%"�80�+(���4��4'"42"('"(/� 2+/!<+0�� F,�11.(����3H>���D?4��������?

� �����F9������;� �����������������������������G�0/�/�6$)� ,�012!�)0/"� +('� !"�2"#� ,)"��� #"4%2�(%"%�*����<$(-� ���2��0(.)�"�/$'"�&+))$(+4/$�(���((��,;��)+'��)$�;;->���D4��D������

����F���:���FF�����:���������������J�� ����� F��9���4����JG��(!+()"1"(/��*�2#�/")/$&"�!.1�#+��3 !�5+('� )"��41"'$+/"'� 3 !�5� $11.("� #"%2�(%"%+-+$(%/�!"#2"%�%$12�"6�&$#.%4��/!#�.-!�)�4'"�$&4"#0��*�-#+(.��)0/"41+)#�2!+-"�)���(04%/$1.�+/4$(-�*+)/�#�"62#"%%$�(�)+%%"//"%���.#�F,�11.(���-H>2����4��>������D

����9������ ��:�� �������J�������� ���:���������J�����9�� �F9��9����� G�J+)/"#$+������+('$11.(�%/$1.�+/�#0��2���$-�(.)�"�/$'"%�/#$--"#1+/.#+/$�(� +('� +)/$&+/$�(� �*�1.#$("� '"('#$/$))"��%���.#�F,�11.(���-H>���>�4���>�����D

����9������ ����� :�� ������������J���� �� �:�� ��:4��� �� ���:��9����� G�J+)/"#$+������)+.%4"%� %"2/$)� %!�)=� @�"//"#A���+/.#"��HB>����4��?����?+

����9������ ����� :�� ����������������������� ��:4��� �� ���:��9����� G��+)#�2!+-"%�%"(%"2+/!�-"(%�&$+�����1�/$*%G� $('.)/$�(��*�/.1�#(")#�%$%� *+)/�#4+�2!+41"'$+/"'� %!�)=�� �.#F,�11.(���-;>���?�4��?������?8

� ���;�:F���9�� ��F�� �����G��+)#�2!+-"%�$(-"%/�+('+#"�+)/$&+/"'�80�8+)/"#$+�������F,�11.(����3;>����4����������

� ������������������J������ ���:�����������J�����G��2�1�/$*%��*�����&+))$("%�$('.)"�/!"�"642#"%%$�(��*�)!"1�=$("%�+('�� ��)�+%%����1��"4).�"%��(�10�)0/"%���.#�F,�11.(�����>����4���������

� ���������G� !"�'"('#$/$)�)"���%0%/"1�+('�$/%�#��"�$($11.(�-"($)$/0���((.��"&��11.(����>��?�4��������

������� ���Q�� � ���������� �FG� 02"��,$(/"#*"#�(41"'$+/"'� %/$1.�+/$�(� �*� ,)"��%� 80��2�����F,�62��"'��HH>�����4��>������D

�9�� ��F��� ���;�:F��:�:����:�����:���� ���� ����G����4-+11+�2#$1"%�1+)#�2!+-"�#"%2�(%"%

Page 23: designing immune responses with genetic immunization and - SAV

�B3��� ���������� �������������� ���� ��;������������9

/��8+)/"#$+�������F,�(/"#*"#�(��0/�=$("��"%��H>���4�?������D

���J��������������������J���� �������G��"-.�+/�#02�/"(/$+���*�"/!+(���+('�#"/$(�$)�+)$'��(�!.1+(1�(�)0/"�*.()/$�(%����)�!�����$(��62��"%��H>�>D4��>������>

�����;����������� �����������������G����4/#+(%#"/$(�$)�+)$'�$(!$8$/$�(��*�+(/$4���4$('.)"'� ,)"��+2�2/�%$%�$(�!.1+(�$11.(�'"*$)$"()0�&$#.%�$(4*")/$�(�1�%/�0�)�()"#(%���>� ,�012!�)0/"%�+('$%�1"'$+/"'�&$+�#"-.�+/$�(��*�������$-+('�"62#"%4%$�(��F,�(*")/��$%��;H>���DD4���D������D

��:� �������;��F��9���������9����9���J�����������������G��!+%"���%+*"/0�+('�$11.("�#"%2�(%"%/.'$"%� �*� +,���� &+))$("� "()�'$(-� !"2+/$/$%J,%.#*+)"� +(/$-"(� '"�$&"#"'� 80� +,-"("� '"�$&"#0'"&$)"���+))$("��;>��D��4�D���������

����������� ����F� �� �����G�"("/$)�$11.($Z+/$�($%�+,%$12�"�1"/!�'�*�#�"�$)$/$(-�+(� $11.("�#"4%2�(%"���+/.#"��3B>����4��>������

�� �����������������J��� �J���� �����������J�� �� ;���:G� .8"#).��%$%�����&+))$("�"()�'4$(-��-D���$%�$11.(�-"($)�+('�2#�/")/$&"�<!"(+'1$($%/"#"'�80�$(/#+1.%).�+#�(""'�"�$(P")/$�(�8./(�/�80�"2$'"#1+��-"("�-.(�8�18+#'1"(/���(*")�11.($/0�BH>��D�>4�D��������

����������� ���� ������������:;�F������� ����������F�����������F��J��9������� �J�����G�"�$&"#0� �*� 1.�/$2�"� ��D� )0/�/�6$)� ,)"��"2$/�2"%�80�����&+))$(+/$�(�� F,�11.(����B.>�?�?4�?�������D

�:���� ��;����� �� ��� ����������J�� ���:��� ��F���9��;���� ����;��;�������:� ��:�� ����� ��� ����G��(/$/.1�#�+)/$&$/0��*�'"�60#$8�(.)�"$)+)$'�*#+)/$�(�*#�1��0)�8+)/"#$.1�8�&$%�J������%��+/$�(��2!0%$)�)!"1$)+��)!+#+)/"#$Z+/$�(��+('+(/$/.1�#�+)/$&$/0��F,�+/���+()"#��(%/�;->����4������D>

��� ����J� �������JJ��������� ��:��9F��������JG���4'"�$&"#0��*� ,!"�2"#��48$+%$(-�)0/�=$("-"("%�"(!+()"%�/!"�"**$)+)0��*�-"("�-.(�$11.($4Z+/$�(��*�1$)"G�%/.'$"%�<$/!�/!"�1�'"��/.1�#�+(4/$-"(�8"/+4-+�+)/�%$'+%"�+('� /!"�J��J7)��"/!�,2���/.1�#4%2")$*$)�+(/$-"(��"("� !"#�B>����4���������

� �F�������;�� ���������� �� ��:�����;G��2/$1$Z+4/$�(��*�)�'�(�.%+-"��*�2�+%1$'�����&+))$("�$%#"I.$#"'�*�#�/!"�"**")/$&"�� ��)�+%%��4#"%/#$)/"' ,)"���#"%2�(%"%�+-+$(%/�+(�$(/#+)"��.�+#�8+)/"#$4.1��F,�11.(����B�>�2���>4���������D

�����FJ�����:�������9� ��������� �;�F��������G"("#+/$�(��*�� ��)�+%%��4#"%/#$)/"'�)0/�/�6$) ,�012!�)0/"%�80�"62#"%%$�(��*�+,&$#+��2#�/"$(�$(

1.%)�"�)"��%G�+(/$-"(�2#"%"(/+/$�(�80�(�(41.%)�")"��%���11.(���-0�H�>���4�?������

�����FJ���������;�FF�����:�������� ����� �������������9��:���F�����:�9�:��� �����:�������49� ������������������ ����G� "/"#���-�.%�2#�4/")/$�(�+-+$(%/�$(*�."(Z+�80�$(P")/$�(��*�����"(4)�'$(-�+,&$#+��2#�/"$(� @%""�)�11"(/%A���)$"()"-3�>��?>�4�?>�������

���� �������������:;������� �:�����������G� ���4�$="� #")"2/�#4��1"'$+/"%�10)�8+)/"#$+4$('.)"'2#�$(*�+11+/�#0�%$-(+�$(-�$(�1+)#�2!+-"%���#�)�+/���)+'��)$�,���,�B>��>>��4�>>��������

�����4������� ������JJ��F�� ��� �������� ���;������� �� ����G��#�/")/$�(�+-+$(%/��0)�8+)/"#$4.1�+&$.1�80�����&+))$("%�"62#"%%$(-�10)�8+)4/"#$+��+(/$-"(%�+%�*.%$�(�2#�/"$(%�<$/!�-#""(�*�.�4#"%)"(/� 2#�/"$(�� �(*")/� �11.(�B;>�>�>�4>��������

����������� ���:��������������� ����������� �����G +#-"/$(-� �*� !"2+/$/$%��,&$#.%� )�#"� 2#�/"$(� *�#� ���,�#�� �����2#"%"(/+/$�(�'�"%�(�/�"(!+()"$('.)/$�(��*�$11.("�#"%2�(%"%�/������&+))$(+4/$�(�������"���J$����H>����4���������

������������������ ���J�;����:�����J� ������������������������G�"("�-.(�����&+))$(+/$�(�<$/!�"&4$('"2"('"(/�%0(/!"/$)� ��4��-2����"(&"��2"-"("�.%$(-�1+11+�$+(�)�'�(%���+))$("��;>�����4��?�������

9���J���������������:�����:���9��������9��9�������JG��11.($Z+/$�(�80�'$#")/�����$(�).4�+/$�(�$('.)"%�#"P")/$�(��*�/.1�#�)"���)!+��"(-"� .1�"("� !"#�B>�>�?4>�D������

9���J�����:������:�� ���������F��;���������:����������;���� ������J�;���F��9��������9��9�������JG�"("�$(�).�+/$�(�-"("#+/"%�$11.("#"%2�(%"%�+-+$(%/�!.1+(�$11.(�'"*$)$"()0�&$4#.%�/02"�����#�)��+/���)+'��)$�,���,�.>�>���4>���������

9� ���J������������:� ��:�� �� � �� ��J��������:����� F�����������G��('.)/$�(��*�+(/$8�'$"%�/�+,=+22+� �,#"-$�(� 80� -"("� $11.($Z+/$�(�F,�11.(����3�>��D?�4�D?�������

9�����������J����� F����� J��:������ ��J� ������� �� �����J��� ��J�� ����� �����������������������;�������9��J�� �� �����FG��12#�&"1"(/��*/!"�$11.("�#"%2�(%"�+-+$(%/�2�+%1$'�����"(4)�'$(-��%2���*�J�##"�$+�80�+(���4/+#-"/$(-��"+'"#%"I."()"���+))$("��H>�D��4D�>������

9����������� ����99���� ��J� ��������� ������J���4 �� ������� J��:���� �� �����F���;���F�G"("/$)�&+))$(+/$�(�+-+$(%/�1+�+#$+�$(*")/$�(�80$(/#+'"#1+��+('�"2$'"#1+��$(P")/$�(%��*�+,2�+%1$')�(/+$($(-� /!"� -"("� "()�'$(-� /!"� 2�+%1�'$.1

Page 24: designing immune responses with genetic immunization and - SAV

�BB ��� ���������� �������������� ���� ��;������������9

8"#-!"$�)$#).1%2�#�Z�$/"�2#�/"$(�@�(��#�)"%%��$4/+/$�(A���(*")/��11.(�BH>����>4����������

9����F����J;��F���� ���J��:������������FG��#$1$(-� �4�4#"%/#$)/"'� )0/�/�6$)� ,�012!�)0/"� #"4%2�(%"%�/��"6�-"(�.%�!"2+/$/$%�J,%.#*+)"�+(/$-"($%���>T� ,)"���'"2"('"(/��F,�11.(����B�>��DD�4�DD?������

9�����F����� :��FF�����������9�����������F�����G���(-4/"#1�2"#%$%/"()"��*�2�+%1$'�����+('�*�#"$-(�-"(""62#"%%$�(�$(�1�.%"�1.%)�"�� .1�����"("/��>���4���������

9�����F�����������9��9������������ ���9����������F������� ���������G��$#")/� -"("� /#+(%*"#� $(/�1�.%"�1.%)�"�$(�&$&����)$"()"�-<;>��>��4�>�D�����

9�������:�� �F������������ ����J�G��"/$(�$)�+)$'$(!$8$/%���>��T�$(/"#�".=$(4>41"'$+/"'��-��2#�4'.)/$�(�$(�&$/#���J���'��->��?��4�?��������D

9�;��:����� FG��"�60#$8�(.)�"$)�+)$'�&+))$("%�"()�'4$(-�+(/$-"(%�<$/!� #+2$'�2#�/"+%�1"4�'"2"('"(/'"-#+'+/$�(�+#"�!$-!�0�"**$)$"(/�$('.)"#%��*�)04/��0/$)� ,�012!�)0/"%�� F,�11.(����3�>����?4��>������?

Q�����^����� ����:���� �������9�����9 ��� ���F��� �� �G��+))$(+/$�(�<$/!�+,2�+%1$'�&")/�#�)+#4#0$(-�/!"�#+8$"%�&$#.%�-�0)�2#�/"$(�-"("�$('.)"%2#�/")/$&"�$11.($/0�+-+$(%/�#+8$"%�&$#.%���$#���4-0����>����4�>������>

Q�����^����� ����:������ ���F�����:����F��9�F��;:�J��� �� �G��11.("�#"%2�(%"%�/��(.)�"$)�+)$'�&+)4)$("%�/��#+8$"%�&$#.%���$#���-0�-.�>����4�?�������

Q�������9��;G��#�/")/$�(�+-+$(%/��"$%!1+($+%$%�80�$(P")/$�(�*�����"()�'$(-�+,1+P�#� %.#*+)"�-�0)�2#�/"$(�-2�����*����1+P�#���11.(���-0�H<>��?�4�?�������

Q�������� ������;��������:��������J��������� ��� ����J���FG��11.($Z+/$�(�*�#��8��+�&$#.%�$(4*")/$�(���+/��"'�<>�2�?4>������D

;����� �����:���� ������ ��������� �:���� G��(&$/#��+.-1"(/+/$�(��*�(+/.#+��=$��"#�)"���+)/$&$/0+('�2#�'.)/$�(��*�$(/"#*"#�(4+�2!+78"/+�+('�4-+141+�<$/!� '"�60#$8�(.)�"$)� +)$'� *#+)/$�(� *#�1�0)�8+)/"#$.1�8�&$%�J���F2(�F,�+()"#��"%�;�>D��4D?�����DD

;���;������������������F����� ��:���� 9����F�G� ,)"��+)/$&+/$�(� +('� $()#"+%"%� $(� 2#�/"$(� =$(+%"�,+)/$&$/0� "(!+()"� #"/$(�$)� +)$'4$('.)"'� -"("/#+(%)#$2/$�(������ �('�)#$(���H>���?�4��?������>

;��:��:������������9�F������:��������J������� ���� ���9��:���F�����:�9�:��� G���(-4/"#1�+(/$4(.)�"�2#�/"$(�)"��.�+#�+('�!.1�#+��$11.($/0�$%$('.)"'� 80� $(/#+1.%).�+#� $(P")/$�(� �*� 2�+%1$'����)�(/+$($(-����-"("�������"���J$����->�??�4??�������

;���:��:������G��2�����#"%)."�*#�1�+(/$4�-�4$(4'.)"'�9� �4����J,�012!�1+� +2�2/�%$%� &$+1�'.�+/$�(� �*� �,=+22+� J,+�2!+� +('� �,=+22+J,8"/+�+('�%.%/+$("'�+)/$&+/$�(��*�(.)�"+#�*+)4/�#4=+22+�J7)4�"���F,�11.(����B.>���>�4��>�����D

;���:��:������G��+2$'�$('.)/$�(��*�1$/�-"(4+)/$&+/"'2#�/"$(�=$(+%"%�80�$11.("�%/$1.�+/�#0��2�����F,�11.(����B�>�>>��4>>�?�����D

;�� ���������� �� ��� �F������� ��� �� ��:�����;G�'&+(/+-"��*�-"("�-.(41"'$+/"'��&"#�$(/#+1.%4).�+#�$(�).�+/$�(��*�2�+%1$'�����&+))$("�$(�#"42#�'.)$8�"�$('.)/$�(��*�%2")$*$)�$11.("�#"%2�(%4"%���+))$("��H>��?��4�?��������

;��;��:�����:���:����� ���������:�����������J G�#�/")/$�(� 80�1$($-"("%G� +,(�&"�� +22#�+)!� �*����&+))$("%���+))$("��B>�����4���?�����D

���������F��� �����������J���� ��������������������J;����� ������J���� ��9G��()#"+%"'�"642#"%%$�(�+('�$11.(�-"($)$/0��*�%"I."()"41�'$4*$"'�!.1+(�$11.(�'"*$)$"()0�&$#.%

�#++�%2#($�(6�/&�"#+,

�#�*��#�F� !+�!+1"#���!���($&"#%$/0��*��+�Z8.#-�(%/$/./"��*��!"1$%/#0�+('�J$�)!"1$%/#0�11.(���-0�#�.2 "��8#.(("#%/#���>��4������+�Z8.#-���.%/#$+ "��G�>������4D�>>4�?�?�3�?��5�+6�G�>������4D�>>4�?���1+$�G�F�%"*� !+�!+1"#Y%8-�+)�+/