Deseo hacer constar mi agradecimiento a las numerosasdigital.csic.es/bitstream/10261/4787/1/Tesis Victor Manuel Ladero Losada.pdf · Deseo hacer constar mi agradecimiento a las numerosas

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personas que han contribuido a la realización de esta Tesispersonas que han contribuido a la realización de esta Tesis

Doctoral.Doctoral.

En primer lugar a mis directores, por la confianzaEn primer lugar a mis directores, por la confianza

depositada en mi y su continuo apoyo. Al Dr. Juan Evaristodepositada en mi y su continuo apoyo. Al Dr. Juan Evaristo

Suárez por aceptarme en su grupo de investigación y por susSuárez por aceptarme en su grupo de investigación y por sus

provechosas enseñanzas y a la Dra. Pilar García por ser mas queprovechosas enseñanzas y a la Dra. Pilar García por ser mas que

una directora una compañera de trabajo.una directora una compañera de trabajo.

Al Ministerio de Educación y Cultura por haber financiadoAl Ministerio de Educación y Cultura por haber financiado

este trabajo y por concederme una beca de Formación de Personaleste trabajo y por concederme una beca de Formación de Personal

Investigador.Investigador.

A la Dra. Margarita Salas por la cesión de la A la Dra. Margarita Salas por la cesión de la σσAA–RNA–RNA

polimerasa de polimerasa de Bacillus subtilisBacillus subtilis..

Al Dr. Juan Carlos Alonso por permitirme realizar variasAl Dr. Juan Carlos Alonso por permitirme realizar varias

estancias cortas en su laboratorio y por sus valiosos comentariosestancias cortas en su laboratorio y por sus valiosos comentarios

durante todo el desarrollo del trabajo.durante todo el desarrollo del trabajo.

También me gustaría expresar mi agradecimiento a losTambién me gustaría expresar mi agradecimiento a los

que me habéis ayudado con vuestros conocimientos y trabajo. Aque me habéis ayudado con vuestros conocimientos y trabajo. A

Quirós por su ayuda filtrando en el FPLC, a Victoria por losQuirós por su ayuda filtrando en el FPLC, a Victoria por los

mutantes, a Silvia por el promotor, Oscar, mucho vicio con elmutantes, a Silvia por el promotor, Oscar, mucho vicio con el

pov..., al Dr. E. Méndez por el Malditof y los extremos amino,pov..., al Dr. E. Méndez por el Malditof y los extremos amino,

Gracias a todos.Gracias a todos.

A los compañeros del laboratorio A, a todos los que estáis yA los compañeros del laboratorio A, a todos los que estáis y

a los que nos habéis abandonado, (y en especial a Soniaa los que nos habéis abandonado, (y en especial a Sonia

compañera de fatigas desde hace muchos años), por todos loscompañera de fatigas desde hace muchos años), por todos los

buenos momentos que hemos pasado juntos, pipeta con pipeta, ybuenos momentos que hemos pasado juntos, pipeta con pipeta, y

por vuestro apoyo constante.por vuestro apoyo constante.

A la gente del CNB, por su buena acogida y ayuda en todoA la gente del CNB, por su buena acogida y ayuda en todo

momento, dentro y fuera del laboratorio y en especial a Silvia &momento, dentro y fuera del laboratorio y en especial a Silvia &

Silvia, Arantxa y Charo.Silvia, Arantxa y Charo.

A los compañeros del Area de Microbiología y del IPLA,A los compañeros del Area de Microbiología y del IPLA,

becarios y precarios, por estar dispuestos siempre a prestar vuestrabecarios y precarios, por estar dispuestos siempre a prestar vuestra

ayuda desinteresada para que todo avance, por esos buenosayuda desinteresada para que todo avance, por esos buenos

momentos de camaradería delante de un café o una birra (omomentos de camaradería delante de un café o una birra (o

mas), y por escucharme aunque yo a veces hiciera oídos sordos.mas), y por escucharme aunque yo a veces hiciera oídos sordos.

Gracias.Gracias.

Y por último, pero no menos importante a mis padres por suY por último, pero no menos importante a mis padres por su

apoyo y constante ánimo para superarme. Y a Eva, sufridora enapoyo y constante ánimo para superarme. Y a Eva, sufridora en

casa de esta Tesis, gracias por tu compresión y apoyo en loscasa de esta Tesis, gracias por tu compresión y apoyo en los

momentos difíciles.momentos difíciles.

A Eva y PaulaA Eva y Paula

Indice i

INDICE i

ABREVIATURAS v

I. INTRODUCCION 1

I.1. LAS BACTERIAS LACTICAS. 1

I.1.1. Características generales. 1

I.1.2. Importancia y aplicaciones a nivel industrial. 2

I.2. LOS BACTERIOFAGOS DE LAS BACTERIAS LACTICAS. 4

I.2.1. El problema del desarrollo viral en la industria láctea. 4

I.2.2. Características estructurales. 5

I.2.3. Desarrollo viral. 7

I.2.3.1. Ciclo lítico. 8

I.2.3.2. Ciclo lisogénico. 10

I.2.4. Regulación de la decisión lisis / lisogenia. 11

I.2.5. Aplicaciones biotecnológicas de los fagos de bacterias lácticas. 15

I.3. EL BACTERIOFAGO A2 16

I.4. OBJETIVOS. 17

II. MATERIALES Y METODOS. 19

II.1. MICROORGANISMOS Y PLASMIDOS. 19

II.2. CONDICIONES DE CULTIVO Y CONSERVACION. 20

II.2.1. Lactobacillus casei. 20

II.2.2. Escherichia coli. 21

II.2.3. Bacteriófago. 21

II.3. OBTENCION Y PURIFICACION DE LOS VIRIONES DE A2. 21

II.4. OBTENCION DE MUTANTES DE DELECION DE A2. 22

II.5. PROCEDIMIENTOS DE TRANSFORMACION GENICA. 22

II.6. MANIPULACION Y ANALISIS DEL DNA. 23

II.6.1. Aislamiento del DNA. 23

II.6.2. Visualización del DNA. 23

ii Indice

II.6.3. Tratamientos enzimáticos del DNA. 24

II.6.4. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). 24

II.6.5. Purificación de fragmentos de DNA. 25

II.6.6. Transferencia e hibridación del DNA. 25

II.6.7. Secuenciación del DNA. 25

II.6.8. Análisis de las secuencias de DNA. 26

II.7. MANIPULACION Y ANALISIS DEL RNA. 27

II.7.1. Obtención del RNA. 27

II.7.2. Visualización del RNA. 27

II.7.3. Transferencia e hibridación del RNA. 28

II.8. PURIFICACION Y ANALISIS DE PROTEINAS. 28

II.8.1. Electroforesis de proteínas. 28

II.8.2. Obtención de las proteínas estructurales del fago A2. 29

II.8.3. Purificación de CI. 29

II.8.4. Purificación de Cro. 31

II.9. ANALISIS DE LA INTERACCION DNA – PROTEINA. 32

II.9.1. Ensayos de retención en filtro. 32

II.9.2. Ensayos de retardo en gel. 33

II.9.3. Ensayos de protección frente a la digestión con DNasa I. 34

II.10. TRANSCRIPCION in vitro. 34

III RESULTADOS. 37

III.1. LOCALIZACION DEL GEN DEL REPRESOR. 37

III.2. ANALISIS DE LA SECUENCIA. 39

III.3. EL GEN cI CONFIERE INMUNIDAD A LA SUPERINFECCION. 43

III.4. CARACTERIZACION DE LOS PROMOTORES PL Y PR. 44

III.5. INTERACCION DE CI CON EL CONMUTADOR GENETICO DE A2.49

III.5.1. Purificación del represor. 49

III.5.2. CI se une de forma específica a la región intergénica cI – cro. 49

III.5.3. CI se une cooperativamente a la región intergénica cI – cro. 51

III.5.4. CI se une a los operadores del bacteriófago A2. 55

Indice iii

III.5.5. CI reprime la transcripción a partir de PR. 56

III.5.6. CI recoloca la RNA polimerasa en la región intergénica cI – cro. 57

III.6. INTERACCION DE CRO CON EL CONMUTADOR GENETICO DEL

CICLO. 63

III.6.1. Purificación de Cro. 63

III.6.2. Cro se une de forma específica a la región intergénica cI – cro. 66

III.6.3. Cro se une a los operadores del sistema. 71

III.6.4. Cro inhibe la transcripción a partir de PL. 72

III.6.5. Cro desplaza a la RNAP del promotor PL en la región intergénica

cI – cro. 74

III.7. IDENTIFICACION DEL OPERON DE LAS PROTEINAS

ESTRUCTURALES DEL FAGO A2. 78

III.7.1. Composición proteica de los viriones. 78

III.7.2. Localización de las proteínas mayoritarias de la cápsida. 80

III.7.3. Localización de los genes estructurales en el genoma del fago. 81

III.7.4. Análisis de la secuencia de nucleótidos. 84

III.7.5. Análisis de la secuencia de aminoácidos. 87

III.7.6. Expresión de los genes estructurales. 92

IV DISCUSION. 95

IV.1. EL CONMUTADOR DE CICLO DEL BACTERIOFAGO A2. 96

IV.2. CARACTERISTICAS Y FUNCION DE CI. 101

IV.3. CARACTERISTICAS Y FUNCION DE CRO. 104

IV.4. EL OPERON DE LAS PROTEINAS ESTRUCTURALES. 107

CONCLUSIONES. 117

BIBLIOGRAFIA. 119

Anexo I

Anexo II

Abreviaturas v

ABREVIATURAS

A Adenina o Adenosina.

aa Aminoácidos.

Ap Ampicilina.

ATCC American Type Culture

Collection.

BrEt Bromuro de etidio.

C Citosina o citidina.

CAPS Acido 3-(ciclohexilamino)-

1-propanosulfónico.

cDNA Acido desoxirribonucleico

complementario.

Ci Curios.

Cm Cloranfenicol.

Da Dalton(s).

dATP Desoxiadenina 5´-trifosfato.

dCTP Desoxicitosina 5´-trifosfato.

DEPC Dietilpirocarbonato.

dGTP Desoxiguanina 5´-trifosfato.

DNA Acido desoxirribonucleico.

DNasa Desoxiribonucleasa.

DO Densidad óptica.

dsDNA DNA en doble cadena.

DTT Ditiotreitol.

dTTP Desoxitimina 5´-trifosfato.

EDTA Acido etileno-

diaminotetraacético.

EMBL European Molecular

Biology Laboratory.

EMSA Ensayos de retardo en gel.

Ery Eritromicina.

FPLC Fast Performance Liquid

Chromatography.

G Guanina o guanosina.

I Inosina.

IPTG 1-isopropil-β-D-1-

tiogalactopiranósido.

Kapp Constante aparente de

equilibrio.

kb kilobase(s).

KD Constante de disociación.

mdi Multiplicidad de infección.

MOPS Acido 3-(N-morfolin)

propano sulfónico.

mRNA Acido ribonucleico

mensajero.

NIH National Institute of Health.

Orf Pauta abierta de lectura.p/v Relación peso / volumen.

PAGE Electroforesis en gel de

poliacrilamida.

pb Par(es) de base(s).

PCR Reacción en cadena de la

polimerasa.

PEG Polietilénglicol.

pI Punto isoeléctrico.

vi Abreviaturas

PIR Protein Identification

Resource.

R Base Púrica.

RBS Sitio de unión al ribosoma.

Rif Rifampicina.

RNA Acido ribonucleico.

RNAP σA-RNA polimerasa de

Bacillus subtilis.

RNasa Ribonucleasa.

rRNA Acido ribonucleico

ribosómico.

SD Desviación estandar.

SDS Sodio dodecilsulfato.

T Timina o timidina.

TA Temperatura de

anillamiento de los

oligonucleótidos.

TCA Acido Tricloroacético.

Tris 2-amino-2(hidroximetil)-

1,3-propanodiol.

tRNA Acido ribonucleico de

transferencia.

U Uracilo o uridina.

ufp Unidades formadoras de

placas.

UTP Uridina 5´-trifosfato.

UV Luz ultravioleta.v/v Relación volumen /

volumen.

Y Base pirimidínica.

Abreviaturas vii

ABREVIATURAS DE AMINOACIDOS

Ala Alanina A

Arg Arginina R

Asn Asparragina N

Asp Acido aspártico D

Cys Cisteína C

Gln Glutamina Q

Glu Acido glutámico E

Gly Glicina G

His Histidina H

Ile Isoleucina I

Leu Leucina L

Lys Lisina K

Met Metionina M

Phe Fenilalanina F

Pro Prolina P

Ser Serina S

Thr Treonina T

Trp Triptófano W

Tyr Tirosina Y

Val Valina V

Introducción 1

I.1. LAS BACTERIAS LACTICAS.

I.1.1. Características generales.

El término bacterias lácticas designa un grupo heterogéneo de bacterias

Gram positivas que presentan un metabolismo fermentativo de los azúcares, cuyo

principal producto final es el ácido láctico. Además comparten otros rasgos comunes

como ser microaerófilas, no forman esporas, no pigmentan y no reducen el nitrato

(Dellaglio y col., 1994).

El grupo se subdivide en bacterias homo y heterofermentativas. Las

primeras se caracterizan porque el único producto de la fermentación de los

carbohidratos es el ácido láctico, mientras que las heterofermentativas originan,

además, dióxido de carbono, etanol y/o ácido acético (Kandler, 1983). Dentro del

grupo se engloban los organismos pertenecientes a los géneros Lactococcus,

Vagococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Aerococcus, Alloiococcus,

Tetragenococcus, Streptococcus, Enterococcus, Lactobacillus, Carnobacterium,

Bifidobacterium y Propionibacterium. Todos ellos, excepto los correspondientes a

los dos últimos géneros pertenecen a la subdivisión Clostridium del grupo de

bacterias Gram positivas. Estos organismos presentan genomas con un contenido en

G + C inferior al 50% (Stackebrand y Teuber, 1988; Collins y col., 1991; Gasser y

col., 1994). Los géneros Bifidobacterium y Propionibacterium se adscriben a la

subdivisión Actinomyces, cuyos miembros se caracterizan por poseer genomas con

un contenido en G + C superior al 50%. Esta dicotomía se ha confirmado con los

datos de la comparación de la secuencia de los rRNA 16S (Schleifer y col., 1995).

Las bacterias lácticas son habitualmente saprofíticas, encontrándose en los

suelos fértiles y las partes aéreas de los vegetales. Adicionalmente algunas cepas,

sobre todo de especies pertenecientes al género Lactobacillus, son mutualistas,

encontrándose en los tractos digestivo y urogenital de los animales, incluido el

2 Introducción

hombre, donde protegen las mucosas de la colonización por microorganismos

indeseables. Por ello, es frecuente que contaminen los productos alimentarios

derivados de los vegetales y los animales, provocando en ellos la fermentación de

los azúcares, circunstancia que ha sido aprovechada como un método de

conservación, ya que la acidez resultante de la producción de ácido dificulta el

desarrollo de los microorganismos patógenos y de la microbiota causante de

alteraciones indeseables, fundamentalmente la putrefacción. Esta capacidad ha sido

explotada por la humanidad durante cientos de años como un método de

conservación de los alimentos, siendo las especies utilizadas de forma mas

generalizada las pertenecientes a los géneros Lactobacillus, Leuconostoc,

Lactococcus, Pediococcus, Streptococcus y Bifidobacterium, pudiendo encontrarse

en numerosos alimentos fermentados de consumo muy habitual como embutidos,

encurtidos, pan, conservas vegetales, derivados lácticos y bebidas (McKay y

Baldwing, 1990).

I.1.2. Importancia y aplicaciones a nivel industrial.

La gran variedad de productos fermentados que consumimos en la

actualidad ha originado un creciente interés por la investigación sobre las bacterias

lácticas. Los estudios sobre su fisiología y los procesos fermentativos en si mismos

han transformado algunas de las fermentaciones tradicionales, que se realizaban de

forma empírica, en procesos industriales cuidadosamente controlados, especialmente

en la industria láctea debido a la gran importancia económica de este sector. Hoy en

día se tiende a la sustitución de los cultivos iniciadores preexistentes en la materia

prima, generalmente constituidos por una mezcla compleja de microorganismos, por

otros diseñados en el laboratorio, que simplifiquen el control fisiológico del proceso,

aseguren la ausencia de microorganismos indeseables sin alterar las propiedades

finales del producto, y permitan su estandarización (Rose, 1982; McKay y Baldwin,

1990; Cuesta, 1996).

La tendencia actual en la investigación sobre las bacterias lácticas es la

identificación de los determinantes que dan lugar a las características típicas de los

alimentos fermentados. Así por ejemplo, en el caso de las leches fermentadas se ha

Introducción 3

comprobado que la textura viene determinada por la producción o no de cápsulas

exopolisacarídicas, y el aroma por compuestos como el diacetilo y el acetaldehido,

los cuales confieren el olor a mantequilla y yoghurt, respectivamente (Kandler,

1983; Cogan, 1995). Los avances en la biotecnología han permitido identificar y

caracterizar la base genética de estas propiedades en algunas cepas de los géneros

Lactococcus y Lactobacillus, además de estabilizar los genes responsables en cepas

de uso industrial (Smith y col., 1992). Esto ha conducido también a la manipulación

de las rutas de interés, con lo que se ha conseguido, por ejemplo, la sobreproducción

de enzimas exocelulares, de gran importancia en la maduración de alimentos

fermentados como el queso, la obtención de cepas de Lactococcus con alteraciones

en las rutas de degradación del piruvato, tendentes a dirigir el flujo metabólico hacia

la producción de diacetilo (Swindell y col., 1996) o el uso de bacterias lácticas con

capacidad de producción de compuestos antimicrobianos para una mejor

conservación de los alimentos (Piard y Desmazeaud, 1991 y 1992).

Adicionalmente, las bacterias lácticas están consideradas como organismos

GRAS (“General Regarded As Safe”) y ciertas cepas, generalmente pertenecientes

al género Lactobacillus, poseen la capacidad de regular la actividad de la microbiota

intestinal y vaginal, teniendo un papel activo en el desarrollo del sistema inmune, en

la cura de casos de diarrea, en la prevención de determinados tipos de cáncer y en la

reducción de los niveles de colesterol (González y col., 1990; Kaila y col., 1992;

Sanders, 1993; Salminen y col., 1996; Boris y col., 1998). Todo ello ha determinado

la aparición de diversos derivados lácteos como el Actimel® o el LC1®, que

promueven el uso probiótico de las bacterias lácticas. Por ultimo, se está ensayando

el uso de bacterias lácticas en la inmunización oral contra patógenos, mediante la

expresión directa de sus antígenos en las mucosas que colonizan (Bottazzi y

Mercenier, 1994; Medaglini y col., 1997; Maassen y col., 1999).

4 Introducción

I.2. LOS BACTERIOFAGOS DE LAS BACTERIAS LACTICAS.

I.2.1. El problema del desarrollo viral en la industria láctea.

El éxito de las fermentaciones alimentarias industriales depende de la

composición de la materia prima, del adecuado crecimiento de los cultivos

iniciadores y de la estabilidad genética de los caracteres que inducen la

transformación deseada en aquélla. Dichos procesos son realizados a gran escala,

por lo que un fallo en la fermentación tiene como consecuencia grandes pérdidas

económicas. Las infecciones por bacteriófagos, bien por contaminación de la

materia prima o por inducción de profagos presentes en el cultivo iniciador, son la

principal causa de fallos en las fermentaciones lácteas. Los fagos provocan la lisis de

las bacterias iniciadoras de forma que no se obtiene una acidificación adecuada y así

el producto no alcanza el pH final esperado y no adquiere las propiedades

sensoriales deseadas. Además, en estas condiciones pueden desarrollarse

microorganismos alterantes o patógenos (Klaenhammer y Fitzgerald, 1994).

El problema de la contaminación por fagos en la industria láctea se conoce

desde hace mucho tiempo (Whitehead y Cox, 1935) y se debe a que la materia prima

empleada, la leche, no se puede esterilizar ya que el calentamiento daña las micelas

de caseína, lo que afecta a la coagulación de la leche y a la textura y características

del producto final (Teuber, 1995). Por otro lado, la pasteurización no elimina la

totalidad de las bacterias ni, lo que es mas importante, los bacteriófagos presentes en

el material de partida (Chopin, 1980; Teuber, 1995). Para tratar de paliar o reducir la

incidencia de las infecciones fágicas, se han desarrollado diversas estrategias como

el crecimiento de los cultivos iniciadores en medios ricos en fosfato (que quela los

cationes divalentes) y pobres en calcio, o la obtención de mutantes resistentes a la

infección. Con estas estrategias no se ha tenido mucho éxito, debido a la alta tasa de

evolución de los bacteriófagos que hace que en poco tiempo aparezca una nueva

variante de los mismos capaz de infectar a la cepa que antes era resistente

(Klaenhammer, 1984; Sandine, 1989). Actualmente, la estrategia mas empleada en

las industrias es la rotación de los cultivos iniciadores. Sin embargo, esta estrategia

no siempre se puede realizar debido a la actual especialización de los mismos,

Introducción 5

muchos de ellos están constituidos por una o unas pocas cepas con características

diseñadas para conferir las propiedades específicas deseadas al producto fermentado

final. La poca variedad de cepas existentes en estos cultivos hace que si se produce

la infección fágica se elimine la mayor parte del cultivo iniciador, provocando daños

mayores que cuando se utilizaban iniciadores naturales con una composición

compleja y mas heterogénea (Sing y Klaenhammer, 1993). Un nuevo avance en la

estrategia de rotación se ha conseguido mediante la construcción de cepas

isogénicas, en las que se han introducido, mediante técnicas de ingeniería genética,

diferentes genes de resistencia a bacteriófagos (Moineau, 1999). Esta estrategia

parece prometedora y soluciona alguno de los problemas planteados por la rotación

clásica de cultivos. Sin embargo, al tratarse de bacterias modificadas genéticamente,

tiene limitaciones legales de uso en algunos países, además de un impacto negativo

en la aceptación por parte de los potenciales consumidores.

Dada la importancia del fenómeno y su alcance económico se han realizado

grandes esfuerzos para caracterizar los bacteriófagos que infectan bacterias lácticas,

para definir sus características genéticas y fisiológicas, y sobre todo los mecanismos

naturales mediante los cuales las bacterias se defienden de ellos.

I.2.2. Características estructurales.

La mayoría de los estudios se han realizado sobre bacteriófagos que

infectan a Lactococcus lactis, estando la investigación en el resto de géneros y

especies menos avanzada. Para el género Lactococcus se han aislado y descrito

cientos de bacteriófagos (Jarvis, 1989; Jarvis y col., 1991; Teuber, 1995). Dentro del

género Lactobacillus se han identificado bacteriófagos que infectan a especies

como: L. plantarum (Trevors y col., 1983; Caso y col., 1995), L. casei (Herrero y

col., 1994; Nakashima y col., 1994), L. gasseri (Fremaux y col., 1993) y L.

delbrueckii (Forsman y Alatossava, 1991; Dupont y col., 1995). En el resto de

géneros los estudios han sido mínimos (Klaenhammer y Fitzgerald, 1994),

identificándose diversos bacteriófagos que infectan a Streptococcus thermophilus

(Brüssow y col., 1998) o Leuconostoc oenos (Arendt y col., 1991). En todos los

casos se han descrito tanto bacteriófagos virulentos como temperados.

6 Introducción

Los fagos que infectan a Lactococcus lactis pueden presentar tanto cabezas

isométricas como alargadas, habiéndose clasificado por tanto dentro de las familias

Podoviridae y Siphoviridae respectivamente y, dentro de ésta ultima, en los

morfotipos B1 y B2 de Ackermann y Dubow (1987). Los bacteriófagos descritos

para el género Lactobacillus poseen en general cabezas isométricas, aunque la

morfología de la cola no es homogénea, se han descrito bacteriófagos tanto con

colas contráctiles como no contráctiles (Trevors y col., 1983; Caso y col., 1995),

siendo clasificados dentro del morfotipo B1 (Ackermann y Dubow, 1987).

Asimismo, se han observado diferencias en la longitud de la cola, así como en la

presencia de estructuras adicionales del tipo de placas basales, collares y fibras. Las

cápsidas virales están constituidas por una serie de proteínas, normalmente mas de

diez, de las que dos o tres son mayoritarias, por lo que se postula que serían los

componentes principales de cabezas y colas.

El genoma de los bacteriófagos de Lactobacillus, en los casos en que se

conoce, está constituido por una molécula lineal de dsDNA, oscilando su tamaño

entre 37 y 42 kb, aunque los fagos de L. plantarum B2 (Nes y col., 1988), LP1–A y

LP1–B (Caso y col., 1995) presentan tamaños mayores (73 – 80 kb). En el caso de

los fagos de Lactococcus el tamaño genómico oscila habitualmente entre 18 y 55 kb

(Jarvis y col., 1991), aunque pueden alcanzar las 130 kb (Prévots y col., 1990). La

mayoría de los genomas fágicos estudiados hasta ahora presentan extremos

cohesivos 3´ sobresalientes (Lillehaug y col., 1991; Lubbers y col., 1994; García y

col., 1997), aunque algunos poseen permutación circular con redundancias

terminales (Trautwetter y col., 1986; Arendt y col., 1994).

En la actualidad se conoce la secuencia completa de varios fagos de

Lactococcus: bIL67 (Schouler y col., 1994), bIL170 (Crutz – Le Coq y col., 1997),

c2 (Lubbers y col., 1995), r1t (van Sinderen y col., 1996), sk1 (Chandry y col.,

1997), Tuc2009 (van Sinderen, comunicación personal), de los fagos de

Streptococcus thermophilus φO1205 (Stanley y col., 1997), DT1 (Tremblay y

Moineau, 1999), φSfi19 (Desiere y col., 1998), φSfi11 (Lucchini y col., 1999a) y

φSfi21 (Lucchini y col., 1999b) y de los fagos de Lactobacillus: LL–H (Mikkonen y

col., 1996), φg1e (Kodaira y col., 1997) y φadh (Altermann y col., 1999). Todos

estos datos, además de las secuencias de diferentes porciones de otros genomas

Introducción 7

fágicos, han permitido realizar estudios comparativos entre regiones genómicas de

virus relacionados. Se ha visto que la organización de los genes es muy similar entre

todos los bacteriófagos analizados hasta ahora, independientemente de la especie

hospedadora (Lucchini y col., 1998). La comparación de estas secuencias con las

disponibles en las bases de datos, ha permitido la adscripción de funciones a alguno

de los genes encontrados. Además, se han realizado estudios funcionales que han

permitido corroborar alguna de estas funciones: se han identificado los genes que

codifican las proteínas estructurales (Mikkonen y Alatossava, 1994; Arendt y col.,

1994; Johnsen y col., 1996; van Sinderen y col., 1996), se han caracterizado diversas

integrasas (Fremaux y col., 1993; Kakikawa y col., 1997; Alvarez y col., 1998),

genes implicados en la replicación del DNA (van Sinderen y col., 1996; McGrath, y

col., 1999; Moscoso y Suárez, 2000), genes implicados en el empaquetamiento del

DNA en la partícula fágica (García y col., 1997) y genes implicados en la lisis del

hospedador, previa a la liberación de las partículas fágicas de nueva síntesis (Boizet

y col., 1990; Herrero, 1996; Oki y col., 1996).

Por otro lado, los datos disponibles han permitido estudiar las relaciones

filogenéticas, para tratar de entender la variabilidad natural de los bacteriófagos. Se

ha podido comprobar que la teoría de la evolución modular de los fagos postulada

por Botsein en 1980 para los fagos lambdoides, es válida para los bacteriófagos de

bacterias lácticas (Lucchini y col., 1999b). Sin embargo, se postula que para estos

bacteriófagos la unidad mínima considerada como módulo intercambiable es menor

de un gen, puesto que se han encontrado datos que avalan que se ha intercambiado

una porción monofuncional de genes que codifican proteínas multifuncionales

(Desiere y col., 1998). Siendo precisamente la recombinación entre módulos la

principal fuente de variabilidad que explica diferencias en ciclo de vida o rango de

hospedador (Lucchini y col., 1999a).

I.2.3. Desarrollo viral.

El rango de hospedador de los bacteriófagos que infectan a bacterias

lácticas es muy estrecho, en la mayoría de los casos sólo infectan a una especie o

8 Introducción

incluso a unas pocas cepas dentro de una especie (Relano y col., 1987; Caso y col.,

1995).

El primer paso en la infección se produce mediante la adsorción de la

partícula vírica a la pared de la célula huésped. Mediante estudios de microscopía

electrónica con fagos de lactococos se ha comprobado que éstos atacan a las células

en pequeños grupos y en puntos distribuidos simétricamente (Budde – Nieckel y

Teuber, 1987). La adsorción ha sido estudiada con mucho detalle para el

bacteriófago de Lactobacillus casei PL – 1. Esta se produce en dos etapas: la

primera es una unión reversible en la que parecen estar implicados residuos de

azúcares de la pared celular como ramnosa (Ishibasi y col., 1982). El segundo paso

es una unión irreversible al receptor de la membrana celular, denominado PIP

(“Phage Infection Protein”) que requiere la presencia de iones Ca2+. Posteriormente

se produce la penetración del DNA en el citoplasma, mediante un proceso que

requiere ATP y síntesis proteica (Watanabe y col., 1979 y 1991). Una vez que el

DNA fágico ha penetrado en el interior de la célula se produce el ciclo infectivo. En

el caso de los fagos temperados el desarrollo de este ciclo infectivo puede seguir dos

caminos alternativos, el ciclo lítico o el ciclo lisogénico, mientras que los fagos

virulentos solo realizan el ciclo lítico.

I.2.3.1. Ciclo lítico.

Se conoce poco sobre el desarrollo intracelular de los fagos en bacterias

lácticas, aunque se han caracterizado los ciclos líticos de algunos de ellos mediante

el análisis de las curvas de desarrollo en un paso. Los periodos de latencia varían

entre 40 y 150 minutos, siendo en general, mas largos para los bacteriófagos de

Lactobacillus que para los de Lactococcus (Klaenhammer y Fitzgerald, 1994;

Herrero y col., 1994). Los tamaños de explosión varían entre 10 y 400 partículas

fágicas liberadas por célula infectada. Mediante mapas de transcripción se ha visto

que existe una expresión secuencial y temporal de genes con funciones relacionadas

y que éstos están agrupados en operones (Beresford y col., 1993; Chandry y col.,

1994; Madsen y Hammer, 1998). Esta regulación es necesaria para asegurar que la

cantidad de DNA y del resto de componentes estructurales necesarios están

Introducción 9

presentes en el momento adecuado y, de esta forma, optimizar el número de fagos de

la progenie. En el fago φ31 de Lactococcus lactis, se detectó la presencia de DNA en

el citoplasma celular a los 5 min postinfección y la presencia de concatémeros entre

los 20 y 40 min (Hill y col., 1991).

Una vez que el DNA fágico se ha replicado comienza el proceso de síntesis

de las proteínas que constituirán la cápsida. La cápsida es una estructura compleja

formada por cientos de subunidades proteicas que protege el genoma del virus y que

tras encontrar un hospedador adecuado interaccionará con él inyectando el DNA en

su interior. Consta de dos estructuras diferenciadas: la cabeza, una estructura

icosaédrica que contiene el DNA del fago y la cola, que tiene forma de tubo y puede

presentar una diversidad de estructuras accesorias como fibras, collares, espinas, etc.

La cola puede ser mas o menos larga y en algunos bacteriófagos es contráctil. Al

final de la misma se encuentran las proteínas encargadas del reconocimiento del

hospedador.

El ensamblaje de la cápsida es un proceso secuencial que se caracteriza por

la interacción de las proteínas que la forman y factores de ensamblaje no

estructurales, como puedan ser proteasas encargadas de procesos de maduración

proteolítica (Ackermann, 1999). En general el proceso de morfogénesis consta de

varias etapas. En un primer momento la proteína portal o conectora forma un anillo

al que se unen la proteína de andamiaje y la proteína mayoritaria de la cápsida,

formando la procápsida. La proteína de andamiaje sale de esta estructura y por un

proceso de expansión y maduración proteolítica, simultaneo con la entrada del DNA

del bacteriófago en la misma, se forma la precabeza. De forma independiente se

fabrica la cola a partir de unas proteínas iniciadoras que constituirán la base de la

misma. Sobre esta base se agregan subunidades de la proteína mayoritaria,

formándose de esta manera la estructura tubular que posteriormente se unirá a la

cabeza a través de la proteína conectora.

Se conoce poco acerca del proceso de morfogénesis de los bacteriófagos de

bacterias lácticas, aunque se han caracterizado un buen número de genes que

codifican proteínas estructurales. Así, se conocen los correspondientes a los fagos

bIL67 (Schouler y col., 1994), c2 (Lubbers y col., 1995), F4–1 (Chung y col., 1991),

r1t (van Sinderen y col., 1996), sk1 (Chandry y col., 1997), TP901–1 (Johnsen y

10 Introducción

col., 1996) y Tuc2009 (Arendt y col., 1994) de Lactococcus. Dentro de los fagos que

infectan Streptococcus thermophilus se han descrito recientemente en DT1

(Tremblay y Moineau, 1999), φO1205 (Stanley y col., 1997), φSfi11 (Lucchini y

col., 1998) y φSfi21 (Desiere y col., 1999). Por último, dentro de los fagos de

Lactobacillus se han descrito los de φadh (Altermann y col., 1999), φgle (Kakikawa

y col., 1996), LL–H (Mikkonen y Alatossava, 1994) y mv4 (Vasala y col., 1993). En

general se ha visto que los genes que codifican las proteínas estructurales se

encuentran agrupados en el genoma y que existe una gran diversidad en cuanto al

número y tamaño de los genes, lo que concuerda con lo observado en el resto de

bacteriófagos (Casjens y Hendrix, 1988).

Tras la replicación del DNA y la síntesis de las proteínas estructurales, el

DNA se empaqueta en las cabezas de los viriones mediante dos mecanismos

posibles. El de los bacteriófagos tipo pac se produce mediante llenado de cabeza

dando lugar a genomas circularmente permutados (Trautwetter y col., 1986;

Alatossava y Klaenhammer, 1991; Arendt y col., 1994), aunque en la mayoría de los

casos ocurre por reconocimiento y corte de sitios cos (Lillehaug y col., 1991;

Lubbers y col., 1994; Boyce y col., 1995a). El enzima responsable, la terminasa, ha

sido caracterizado únicamente en el caso del fago A2 y genera extremos cohesivos

3´ sobresalientes (García y col., 1997).

Los viriones de la progenie se liberan al final del periodo de latencia

mediante la acción concertada de dos proteínas, la holina y la lisina. La primera se

inserta en la membrana plasmática generando poros, lo que permite el acceso a la

pared celular de la segunda proteína, que degrada la capa de peptidoglucano de la

célula hospedadora, provocando en último termino la lisis celular y la liberación al

medio de las nuevas partículas fágicas, las cuales podrán comenzar un nuevo ciclo

infectivo.

I.2.3.2. Ciclo lisogénico.

La lisogenia es un fenómeno muy frecuente en bacterias lácticas (Davidson

y col., 1990; Cuesta y col., 1995), apareciendo incluso cepas multilisogénicas

(Jarvis, 1992). Se han identificado lisógenos en Lactococcus (Relano y col., 1987),

Introducción 11

Lactobacillus (Caso y col., 1995), Streptococcus (Bruttin y col., 1997) y

Leuconostoc (Arendt y col., 1991). El interés del estudio de la lisogenia se debe, por

un lado, a la posibilidad del desarrollo de nuevas herramientas genéticas y por otro,

a que diversos autores postulan que las cepas lisogénicas podrían actuar como

reservorios de fagos líticos, derivados de los temperados, en las plantas procesadoras

(Shimizu–Kadota y col., 1983; Relano y col., 1987; Klaenhammer y Fitzgerald,

1994; Bruttin y Brüssow, 1996).

El ciclo lisogénico comienza tras la inyección del DNA fágico en el interior

de la célula hospedadora. A la penetración del DNA le sigue la expresión de los

genes tempranos, entre ellos los que codifican el represor del ciclo lítico y la

integrasa. Estos dos genes son necesarios para impedir la producción de nuevos

viriones y para que el DNA fágico se incorpore al genóforo de la célula hospedadora

mediante un mecanismo de recombinación sitio – específica. En este estado de

latencia, que se denomina profago, va a permanecer hasta que alguna señal

medioambiental dispare la expresión de los genes líticos. El profago se transmite de

forma pasiva a las células de la progenie conjuntamente con el genoma del

hospedador y les confiere resistencia a la infección por parte del mismo fago o de

fagos relacionados. Esta propiedad se denomina inmunidad a la superinfección y

está basada en la capacidad del represor del ciclo lítico, responsable del

mantenimiento del estado de profago, de actuar en trans sobre los genomas fágicos

entrantes en la célula.

1.2.4. Regulación de la decisión lisis / lisogenia.

La regulación, a nivel molecular, de la decisión de seguir uno u otro ciclo

de desarrollo está perfectamente caracterizada para el bacteriófago λ (revisado en

Ptashne, 1992). En este bacteriófago existen dos regiones tempranas (OR y OL) en

las que se localizan cuatro promotores (PL, PR, PRE y PRM) y seis repeticiones

invertidas de 16 a 18 pb denominadas operadores (OR1/L1 a OR3/L3) (Figura I.2). La

unión de las proteínas CI o Cro a estos operadores determina la decisión de seguir

uno u otro ciclo de desarrollo. Una vez que el DNA del fago ha penetrado en la

célula se produce la expresión de los genes inmediatos tempranos, N y cro, a partir

12 Introducción

de los promotores PR y PL que son reconocidos por la RNA polimerasa del

hospedador. El producto del gen N es un antiterminador de la transcripción, que

permite la expresión, entre otros genes tempranos, del gen cII a partir de PR y del

gen cIII a partir de PL. Los productos de estos dos genes son necesarios para la

expresión de cI, el gen responsable del mantenimiento de la lisogenia. CIII es una

proteína que protege a CII de la degradación por parte de una proteasa de

codificación celular. CII es necesaria para que la RNA polimerasa celular pueda

reconocer a los promotores PRE y PI. A partir de PRE, o promotor del establecimiento

de la lisogenia, se transcribe cI, mientras que el segundo gobierna la transcripción de

los genes necesarios para la integración del DNA viral en el genoma del hospedador

en forma de profago. El que el virus siga un ciclo u otro de desarrollo va a depender

de las concentraciones relativas de CI y Cro en la célula.

attP int xis cIII N cI cIIcro O P Q

PLOL PRM/R OR

OL1 OL2 OL3 OR3 OR2 OR1

PL PRMPR

PREPI

cIIcII

N N NcI cI cI

Figura 1: Esquema del interruptor genético del bacteriófago λ. El rectángulo blancorepresenta el DNA de lambda y las líneas onduladas los mRNA. Se indican los inicios detranscripción (flechas truncadas), los sitios de activación (flechas invertidas) y represión(flechas tachadas) de la transcripción y la proteína efectora en cada caso. Modificado deHendrix y col. (1983).

Introducción 13

Una vez que se ha expresado cI, y por lo tanto se ha establecido la

lisogenia, deja de transcribirse a partir de PRE y pasa a depender de PRM, o promotor

del mantenimiento de la lisogenia, y la regulación de la misma depende de las

concentraciones relativas de CI y Cro que haya en la célula, lo que a su vez

determina la ocupación de los tres operadores (OR1, OR2 y OR3) de la región OR.

Tanto CI como Cro tienen capacidad de unión a los tres, pero la afinidad por cada

uno de ellos es distinta, lo que permite de hecho la expresión diferencial de sus

respectivos genes. OR1 y OR3 solapan con las regiones –35 de PR y PRM

respectivamente, mientras que OR2 está situada entre ambos promotores. CI tiene

mayor afinidad por OR1 y menor afinidad por OR3, mientras que Cro tiene afinidades

inversas, siendo OR3 el operador por el que tiene una mayor afinidad. A baja

concentración de CI, éste se unirá a OR1 y a OL1, reprimiendo la transcripción a partir

de PR y PL, lo que detiene la síntesis de Cro y de N, respectivamente. Esto determina

la detención de la síntesis de CII y CIII. Si la concentración de CI es suficiente se

unirá a OR2, lo que provocará la interacción entre CI y la subunidad σ de la RNAP.

Esta interacción permite que la RNAP reconozca de forma eficiente el promotor PRM

y de esta forma se induce la transcripción de cI a partir de él. Al seguir aumentando

la concentración de CI, éste se unirá a OR3 reprimiendo su propia transcripción. Al

no haber síntesis de nuevas moléculas de CI su concentración en la célula bajará

hasta que quede libre OR3 y de nuevo se producirá la síntesis de la proteína. De esta

forma se consigue que haya una concentración constante de CI en el citoplasma. Así

pues, el represor del ciclo lítico, CI, es un regulador autónomo de su propia síntesis,

actuando como un activador a bajas concentraciones y como un represor a

concentraciones altas. Una vez que CI se ha unido a los operadores OL y OR todos

los promotores que transcriben genes implicados en el ciclo lítico quedan

inactivados y el estado de profago se mantiene de forma estable. Ahora bien, si se

produce una disminución de la concentración de CI por debajo de un valor crítico,

los promotores pueden reactivarse. Esto puede ocurrir por diversas causas, siendo la

mas estudiada la que corresponde a la respuesta SOS. Esta respuesta se induce al

producirse un daño en el DNA celular, lo que va a provocar, como un proceso

colateral, la degradación proteolítica de CI mediada por RecA. Esto dará lugar a la

activación de los genes líticos a partir de los promotores tempranos y el inicio del

14 Introducción

ciclo lítico. En esta situación, o bien si tras la penetración del DNA fágico en la

célula no se llega a expresar el gen cI, se produce la activación del ciclo lítico ya que

los niveles de Cro presentes en la célula serán suficientes para unirse a OR3, lo que

reprime la transcripción a partir de PRM, y en consecuencia la producción de CI. La

transcripción de cro continuará hasta que la concentración de Cro sea suficiente para

unirse a OR1, lo cual reprimirá su propia transcripción. Esto es necesario porque se

ha comprobado que una excesiva expresión de los productos de los genes tempranos

es tóxica para la célula e interfiere con el desarrollo del ciclo lítico (Friedman y

Gottesman, 1983). Mediante este interruptor genético se consigue una perfecta

regulación de los dos ciclos alternativos del desarrollo del bacteriófago λ.

Se conoce muy poco acerca de la regulación de la decisión de seguir el

ciclo lítico o el lisogénico para los fagos de bacterias del ácido láctico. El análisis de

las secuencias de los bacteriófagos de Lactococcus lactis r1t (Nauta y col., 1996),

BK5T (Boyce y col., 1995b) y Tuc2009 (van de Guchte y col., 1994) revela la

existencia de una región con dos genes divergentes que podrían ser los homólogos

funcionales de cI y cro de estos fagos. En el caso de r1t en esta región se localizan

dos posibles operadores de 21 pb con simetría invertida separados por 2 pb. Estos

operadores solapan con las regiones –35 de los dos presuntos promotores

divergentes, además de presentar un posible tercer operador O1 solapando con el

homólogo estructural de λ cro. Asimismo, se ha comprobado que el producto del

probable represor del ciclo lítico, Rro, tiene capacidad de unión a esta región

temprana (Nauta y col., 1996). En el caso de BK5T, en la probable región

reguladora se localizan tres secuencias con simetría invertida de 18 pb separadas

entre sí por 10 y 24 pb. Los posibles operadores O1 y O3 se encuentran solapando

con las regiones –35 de los promotores divergentes localizados en la región,

mientras que O2 se localiza en el espacio entre ambos (Boyce y col., 1995b).

En cuanto a los bacteriófagos de Lactobacillus, la región temprana sólo se

ha descrito con detalle para los fagos φg1e (Kodaira y col., 1997), φadh (Engel y

col., 1998) y A2 (presente memoria, García y col., 1999; Ladero y col., 1999). Este

último, es el único fago de bacterias lácticas para el que se ha caracterizado a nivel

molecular la región de decisión genética. En el caso del bacteriófago φg1e se han

identificado dos genes, cng y cpg, cuyos productos serían los homólogos funcionales

Introducción 15

de λ Cro y CI, respectivamente. Se ha visto que Cng tiene la capacidad de unirse a

esa región del DNA, en la cual se localizan dos presuntos promotores divergentes y

cinco repeticiones invertidas (Kakikawa y col., 1998). En el caso de φadh, se ha

identificado el represor, Rad, y se ha visto que es capaz de reprimir la transcripción

de dos promotores divergentes localizados en la posible región de decisión lisis –

lisogenia, donde además se localizan tres repeticiones invertidas, dos de ellas de 17

pb solapan con las regiones –35 de ambos promotores, mientras que la tercera de 77

pb se localiza entre ambas, estando separada por 14 y 43 pb de las otras dos (Engel y

col., 1998).

I.2.5. Aplicaciones biotecnológicas de los fagos de bacterias lácticas.

El estudio de los bacteriófagos de bacterias lácticas ha conducido al

desarrollo de diversas herramientas biotecnológicas de aplicación al estudio de las

bacterias lácticas empleadas como iniciadores industriales. Así, se han desarrollado

varios vectores de integración basados en la integrasa y el sitio attP de varios fagos

(Dupont y col., 1995; Auvray y col., 1997; Lillehaug y col., 1997; Alvarez y col.,

1997; Brønsdted y Hammer, 1999). Estos vectores permiten la estabilización en el

cromosoma bacteriano de genes de interés, que si fueran de codificación plasmídica

serían inestables. Mediante la utilización del origen de replicación y los extremos

cohesivos del bacteriófago φLC3 se ha logrado el desarrollo de un cósmido que

permite el empaquetamiento de grandes porciones de DNA que posteriormente se

pueden introducir en la célula (Birkeland y Holo, 1993).

Otro campo de interés es el de la expresión de genes de una forma

controlada, lo que se ha logrado mediante el desarrollo de sistemas de expresión

inducible basados en un mutante termosensible del represor del bacteriófago r1t

(Nauta y col., 1996 y 1997). Mediante éste, u otros sistemas de expresión similares,

se han conseguido realizar lisis controladas de los cultivos mediante la clonación de

lisinas y holinas fágicas. La expresión de ambos enzimas es capaz de provocar la

lisis celular del cultivo, lo que podría, por ejemplo, acelerar la maduración de

algunos quesos (Crow y col., 1995; Gasson, 1996; de Ruyter y col., 1997). Otras

aplicaciones derivadas del estudio de los bacteriófagos son los denominados

16 Introducción

sistemas PER (“Phage Encoded Resistance”), entre los que destaca la clonación, en

un vector de alto número de copias, del origen de replicación de un fago, lo que hace

a la célula portadora resistente a la infección (Hill y col., 1990; Moscoso y Suárez,

2000) o la inserción en el genoma bacteriano de forma estable del represor del ciclo

lítico (Ladero y col., 1998; Alvarez y col., 1999). Otro mecanismo de defensa frente

a la infección fágica, inducible por ésta, consiste en la clonación de genes que

provoquen la muerte celular bajo el control de promotores fágicos tardíos y por lo

tanto inducibles por la infección (O´Sullivan y col., 1996; Djordjevic y col., 1997).

I.3. El BACTERIOFAGO A2

El bacteriófago A2 se aisló a partir de muestras de suero de leche utilizada

en la fabricación de queso Gamonedo, un queso azul artesano de larga maduración

producido en Asturias (Herrero y col., 1994). Este fago infecta a cepas de

Lactobacillus casei y Lactobacillus paracasei, entre ellas a L. casei ATCC 393,

cepa de referencia y que se emplea en la maduración de quesos y en la elaboración

de leches fermentadas comerciales. Este bacteriófago es temperado, presenta

viriones desnudos compuestos de una cabeza isométrica y una cola larga, flexible,

no contráctil y que presenta en su extremo una placa basal (Figura 2A).

0 kb

coscos

44 kb

Lisis Módulo de replicación terter int

A)

B)

Figura 2: A) Micrografía electrónica del bacteriófago A2. B) Mapa del genoma delbacteriófago A2, las líneas verticales representan los sitios de restricción EcoRI, se indican

Introducción 17

los extremos cohesivos (cos), los genes de la terminasa (ter), la integrasa (int), los genesimplicados en la lisis y el módulo de replicación.

Pertenece por tanto a la familia Siphoviridae y se puede catalogar como

perteneciente al morfotipo B1 de la clasificación de Ackermann y Dubow (1987). Su

ciclo de desarrollo tiene periodos de eclipse y de latencia de 100 y 120 min,

respectivamente y su tamaño de explosión es de 180 ufp/célula. Su genoma esta

compuesto por una doble cadena de DNA de 44 kb que presenta extremos cohesivos

3´sobresalientes (Herrero y col., 1994; García y col., 1997). Se ha caracterizado la

integrasa y el sitio de integración attP y se ha visto que la integración se realiza por

recombinación sitio – específica en un gen que codifica el tRNALeu cuyo anticodón

es CAA (Alvarez y col., 1998). Así mismo, se han localizado y caracterizado otros

genes (Figura 2B), entre ellos la terminasa, que es el enzima encargado del corte de

los concatémeros de DNA y de su empaquetamiento dentro de la cápsida (García y

col., 1997). También se identificó el gen que codifica la proteína mayoritaria de la

cápsida (Herrero, 1996), la región de replicación (Moscoso y Suárez, 2000) y los

genes lisina y holina, cuyos productos están implicados en la lisis celular (Herrero,

1996).

I. 4. OBJETIVOS.

Diversos estudios (Núñez, 1978; González del Llano y col., 1992) han

demostrado que los lactobacilos mesófilos son las bacterias lácticas predominantes

en algunos quesos frescos y azules producidos de forma artesanal en Asturias. En la

actualidad existe una gran demanda de estos productos, por lo que existe un

creciente interés en las industrias lácteas por poner en marcha su producción a gran

escala, lo que conllevará una previsible estandarización de los cultivos iniciadores.

Por otra parte, determinadas cepas de lactobacilos se están utilizando como

iniciadores en la manufactura de embutidos y encurtidos y también en la fabricación

de leches fermentadas a las que se les atribuye un valor probiótico.

En nuestro laboratorio, entre otros temas, estamos interesados en el estudio

de los fagos que infectan a estas bacterias, especialmente a Lactobacillus plantarum

y Lactobacillus casei, como un paso previo al desarrollo de sistemas de resistencia a

la infección. El aislamiento y caracterización de bacteriófagos que infectan a

18 Introducción

lactobacilos mesófilos contribuirá, además, a lograr un mayor conocimiento de este

grupo de fagos poco estudiado. Al mismo tiempo, trataremos de desarrollar

herramientas genéticas aplicables en biotecnología.

En este trabajo nos hemos centrado en el bacteriófago A2, cuyas

características generales ya han sido descritas. Los objetivos concretos de esta Tesis

pueden resumirse en los tres siguientes:

1. Caracterización de la base estructural y funcional de la región genómica

que regula la decisión lisis – lisogenia.

2. Caracterización, a nivel funcional, de las proteínas implicadas en dicho

proceso de regulación.

3. Localización y caracterización de la región genómica que codifica las

proteínas estructurales que componen la cápsida viral.

Materiales y métodos 19

II.1. MICROORGANISMOS Y PLASMIDOS.

Para el desarrollo de este trabajo se utilizaron las cepas bacterianas y

bacteriófagos que se detallan en la Tabla 1.

Cepa / bacteriófago Genotipo / fenotipo relevante Referencia/Fuente

Lactobacillus casei

ATCC 393 Cepa hospedadora de A2 ATCC

393 Cepa curada de pLZ15 Dr. J. Kok. R U, Groningen

393-A2 Derivado lisogénico de A2 Herrero y col., 1994

Escherichia coli

XL-1 Blue F´ Tn10 pro A+B+ laqIq ∆(lacZ) M15/

recA1 endA1 gyrA96 (Nalr) thi hsdR17 (rk-

mk-) supE44 relA1 lac Bullock y col., 1987

DH10B F- mcrA ∆(mrr- hsd RMS- mcrBC) φ80d

lacZ ∆M15 ∆lacX74 endA1 recA1 deoR

∆(ara, leu)7697 araD139 galU galK nup6

rpsL λ- GIBCO BRL

BL21(DE3) F- hsdS (rB-mB

-) RNA polimerasa del fago

T7 bajo el control del promotor lac UV54 Studier y Moffatt, 1986

Bacteriófago

A2 Herrero y col., 1994

Tabla 1: Cepas bacterianas y bacteriófago.

En la Tabla 2 se detallan los vectores utilizados, sus características mas

relevantes, así como los plásmidos mas importantes construidos a partir de dichos

vectores durante el desarrollo del trabajo. La descripción de la construcción de estos

plásmidos, así como sus características mas importantes, se detalla en apartados

posteriores.

20 Materiales y métodos

Vector / plásmido Características relevantes Referencia/Fuente

Vectores

pEM40 EryR ApR Integrasa y attP del fago A2 Alvarez y col., 1998

pET11a ApR Vector de expresión inducible por

IPTG

Studier y col., 1990

pLys CmR Lisozima del fago T7 Studier, 1991

pUC18 ApR Selección por inactivación del gen

lacZ

Yanisch–Perron y col., 1985

Plásmidos

pEM40–cI Gen cI del fago A2 Apartado III.3

pET11a–cI Gen cI del fago A2 Apartado II.8.3

pET11a–cro Gen cro del fago A2 Apartado II.8.4

pUO183 pUC18 con la región intergénica entre

cI y cro del fago A2

Apartado II.9.1

Tabla 2: Vectores, y plásmidos generados a partir de estos, utilizados en el presente trabajo.

II.2. CONDICIONES DE CULTIVO Y CONSERVACION.

Las cepas bacterianas se conservaron congeladas a –70ºC o a –20ºC en medio

de cultivo al que se le añadió glicerol a una concentración final del 20% (v/v). En el

momento de sembrarlas se descongelaron, incubándose en los medios

correspondientes a la temperatura adecuada para cada cepa bacteriana. Los medios

sólidos y semisólidos son los que se describen a continuación añadiéndoles 1´5% y

0´5% (p/v) de agar – agar, respectivamente.

II.2.1. Lactobacillus casei.

L. casei se cultivó en medio MRS (Oxoid), a 30ºC en estático, tanto en medio

líquido como sólido. La concentración de eritromicina (ery) para la selección de las

cepas transformantes fue de 5 µg/ml.


II.2.2. Escherichia coli.

Las cepas de E. coli se incubaron a 37ºC en medio 2xTY (Sambrook y col.,

1989) con agitación forzada cuando el medio era líquido. La concentración de

antibiótico para la selección de las cepas transformantes fue de 150 µg/ml para ery,

100 µg/ml para ampicilina (ap) y 25 µg/ml para cloranfenicol (cm).

II.2.3. Bacteriófago.

Para la propagación del bacteriófago A2 se utilizó medio MCM (medio

MRS suplementado con MgSO4 10 mM y CaCl2 10 mM), tanto líquido como sólido.

En este último caso se empleó el método en doble capa de Adams (1959).

II.3. OBTENCION Y PURIFICACION DE LOS VIRIONES DE A2.

Para la obtención de suspensiones fágicas a pequeña escala se propagaron

los bacteriófagos en medio MCM sólido. La extracción de los viriones se llevó a

cabo según se ha descrito previamente (Suárez y Chater, 1981) mediante la

resuspensión de los fagos en tampón SM (Tris – HCl 20 mM, NaCl 100 mM,

Ca(NO3)2 10 mM y MgSO4 10 mM; pH 7´2) a partir de placas de Petri que

presentaban lisis semiconfluente. La suspensión se limpió por centrifugación a baja

velocidad seguida de una ultracentrifugación a 35.000 rpm en un rotor Beckman

42Ti durante 90 min a 4ºC. El precipitado se resuspendió en un pequeño volumen de

tampón SM. Estas suspensiones se esterilizaron por filtración a través de filtros de

nitrocelulosa de 0´45 µm ∅ de poro y se almacenaron a 4ºC.

Para la obtención de virus a gran escala la propagación se realizó en caldo

MCM inoculado con un cultivo de L. casei al 1%. El cultivo se incubó a 30ºC hasta

alcanzar una DO600 = 0´2. En este momento se infectó con el fago A2 a una

multiplicidad de infección (mdi) = 0´1 y la incubación se prolongó durante 12 horas.

Para la recuperación de los fagos se siguió el mismo protocolo descrito para la

obtención a pequeña escala.


La purificación de los viriones se realizó mediante gradiente de CsCl. A las

suspensiones obtenidas se les añadió CsCl a una concentración final de 750 mg/ml y

se ultracentrifugaron en un rotor Beckman 75Ti (40.000 rpm) durante 24 h a 20ºC.

Tras la obtención de la banda correspondiente al fago esta se dializó frente a tampón

SM.

La visualización de los viriones se realizó por microscopía electrónica a

partir de las suspensiones purificadas. Se empleó una tinción negativa con acetato de

uranilo según el método descrito por Suárez y col. (1984). Las suspensiones se

depositaron sobre rejillas de cobre de malla fina recubiertas de Formvar y se

visualizaron en un microscopio electrónico JEOL 2000 EXII.

II.4. OBTENCION DE MUTANTES DE DELECIÓN DE A2.

Para la obtención de mutantes de deleción del bacteriófago A2 se partió de

suspensiones fágicas con un título de 5 x 109 ufp/ml. Estas suspensiones fueron

tratadas en rondas sucesivas con una solución 10 mM de pirofosfato sódico, pH 7´4,

a 37ºC durante 30 min, transcurridos los cuales se plaquearon las diluciones

apropiadas en medio MCM. Los bacteriófagos supervivientes se recogieron de

placas que mostraron una lisis semiconfluente. Se centrifugaron durante 2 h a 35.000

rpm en un rotor Beckman 42Ti. El precipitado se resuspendió en tampón SM y los

fagos presentes se sometieron a una nueva ronda de tratamiento. En cada ronda de

selección se hicieron diluciones para obtener placas aisladas. Se seleccionaron los

fagos de 25 placas, los cuales se propagaron, purificaron y guardaron para análisis

posteriores.

II.5. PROCEDIMIENTOS DE TRANSFORMACION GENICA.

La introducción de plásmidos en el interior de las cepas bacterianas se

realizó mediante electroporación con un equipo “Gene pulser” de Bio-Rad.

Las condiciones de los diferentes parámetros para E. coli fueron las

descritas por Dower y col. (1988). L. casei se transformó por electroporación

utilizando el método descrito por Lockman y col. (1994) con modificaciones. Las


células de un cultivo de una noche en medio MRS con 1% de glicina se diluyeron

1:10 en el mismo medio y se incubaron a 37ºC durante una hora. Estas células se

recogieron por centrifugación, se lavaron tres veces con agua mili Q a 4ºC y se

resuspendieron en PEG 1500 al 30% (p/v) en 1/100 del volumen de cultivo. Después

se repartieron alícuotas de 50 µl en tubos eppendorf en hielo y etanol (-20ºC). A las

células se les añadió el DNA (0´05 – 4 µg) disuelto en 1 µl de agua mili Q. Las

condiciones para el pulso fueron: 25 µF, 2.500 V y 400 Ω. Las células se

resuspendieron en 600 µl de MRS y tras eliminar por centrifugación el PEG del

sobrenadante, se incubaron una hora a 30ºC y se sembraron en placas de MRS con el

antibiótico apropiado.

II.6. MANIPULACION Y ANALISIS DEL DNA.

II.6.1. Aislamiento del DNA.

La extracción de DNA plasmídico de E. coli se llevó a cabo mediante el

método del SDS alcalino (Birboim y Doly, 1979). En algunas ocasiones esta

extracción se realizó mediante el kit comercial “Plasmid MiniKit” de Quiagen. En el

caso de que el DNA plasmídico fuese posteriormente utilizado en secuenciación la

extracción se realizó mediante el kit “Wizard Plus SV Miniprep” de Promega. El

DNA empleado en los ensayos con proteínas se purificó por centrifugación en

gradiente de CsCl (Sambrook y col., 1989).

El DNA del bacteriófago A2 se extrajo según el método descrito por Suárez

y Chater (1981) siguiendo las modificaciones de Herrero y col. (1994).

II.6.2. Visualización del DNA.

Las moléculas de DNA se separaron en geles de agarosa siguiendo el

método de Meyers y col. (1976), utilizando tampón Tris-Borato (Tris 89 mM,

EDTA 2´5 mM y ácido bórico 8´9 mM; pH 8) como electrolito. Los geles se

prepararon con concentraciones variables de agarosa, en un rango entre 0´8% y

1´5% (p/v). Para la detección de fragmentos de DNA de pequeño tamaño se


realizaron electroforesis en geles de poliacrilamida al 7% (p/v). En ambos casos el

DNA presente en el gel se visualizó por exposición a luz UV tras realizarse una

tinción con una solución acuosa de BrEt a una concentración final de 0´5 µg/ml.

Como patrones de tamaño se utilizaron los fragmentos de DNA del fago λ

(Pharmacia Biotech) generados por digestión con las endonucleasas de restricción

HindIII o PstI.

II.6.3. Tratamientos enzimáticos del DNA.

Las diferentes endonucleasas de restricción usadas fueron suministradas por

las casas comerciales Amersham, Boehringer Mannheim y Gibco BRL. Las

ligaciones se realizaron mediante el Kit “T4 DNA ligase – Ready to go” de

Pharmacia. Los enzimas fosfatasa alcalina, polinucleótido quinasa del fago T4 y

RNasa fueron suministradas por Boehringer Mannheim. En todos los casos se

utilizaron según las recomendaciones indicadas por las casas suministradoras. Para

el marcaje radiactivo de los fragmentos de DNA, este se incubó durante 15 min a

temperatura ambiente con el fragmento Klenow de la DNA polimerasa I de E. coli

(Amersham) en presencia de dATP, dGTP, dTTP y [α32P]dCTP (3.000 Ci/mmol,

Amersham). Tras la inactivación del enzima, los nucleótidos no incorporados se

eliminaron mediante filtración en una columna de Sephadex G – 25 (Pharmacia).

II.6.4. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Las reacciones de PCR se realizaron utilizando las DNA polimerasas

termoestables de Boehringer Mannheim Taq y Pwo, esta última en el caso de querer

clonar los fragmentos generados. En el caso de que los fragmentos de DNA a

generar fuesen de gran tamaño se utilizó el sistema “Expand” (Boehringer

Mannheim). Las amplificaciones se realizaron en un termociclador “Minicycler”

(MJ Research) en un volumen final de 50 µl según las indicaciones del fabricante.

Las temperaturas de anillamiento de los oligonucleótidos fueron entre 5 y 10ºC

inferiores a la TA calculada para ellos.


II.6.5. Purificación de fragmentos de DNA.

La purificación de fragmentos de DNA procedentes de restricción con

endonucleasas o de amplificación por PCR se realizó por electroelución, tras

separación de los mismos en geles de agarosa o poliacrilamida (Sambrook y col.,

1989). Las tripas de diálisis utilizadas fueron suministradas por Sigma. En algunas

ocasiones los fragmentos de PCR se purificaron mediante el “PCR purification Kit”

de Quiagen siguiendo las instrucciones facilitadas por el fabricante, en este caso no

se procedió a la separación previa de los fragmentos por electroforesis.

II.6.6. Transferencia e hibridación del DNA.

La transferencia de fragmentos de DNA desde los geles de agarosa a

membranas de nylon “Hybond – N” (Amersham) se realizó según la técnica de

Southern (1975), siguiendo las indicaciones de Sambrook y col. (1989).

Posteriormente el DNA se fijó de forma irreversible a la membrana mediante

irradiación con luz UV durante 2 min.

Los oligonucleótidos usados como sondas se marcaron radiactivamente con

polinucleótido quinasa y [γ32P]dATP (3.000 Ci/mmol, Amersham). La sonda se

purificó mediante filtración en una columna de Sephadex G – 25 (Pharmacia). La

hibridación se realizó usando “Rapid Hybrid Buffer” (Amersham) siguiendo las

instrucciones del fabricante en cuanto a condiciones de prehibridación, hibridación y

lavados de la membrana. La detección de las bandas radiactivas se realizó por

exposición en películas “Hyperfilm MP” (Amersham).

II.6.7. Secuenciación del DNA.

La secuenciación del DNA se llevó a cabo por el método de los

dideoxinucleótidos (Sanger y col., 1977) de forma manual y automática. En el

primer caso se utilizó el kit de la “Sequenase 2.0” (Amersham) y [35S]dATP (1.200Ci/mmol; Amersham) para el marcaje. El DNA utilizado como molde fue el de los

distintos clones y subclones que se construyeron en el vector pUC18. Antes de


iniciar la reacción de marcaje, el DNA en doble cadena se desnaturalizó siguiendo el

método de Hattori y Sakaki (1986). Como cebadores se utilizaron los

oligonucleótidos directo y reverso de pUC18 y, cuando fue necesario, se diseñaron

oligonucleótidos específicos para completar la secuencia. Los productos de la

reacción se separaron en geles de poliacrilamida al 6% en condiciones

desnaturalizantes (Sambrook y col., 1989) y se visualizaron, tras su secado, por

exposición en una película “Hyperfilm MP” de Amersham. La secuenciación

automática se llevó a cabo en un equipo “ALFexpress” (Pharmacia) realizándose los

marcajes con los kits de Pharmacia “Autocycle sequencing kit” y “Thermo

sequenase fluorescent labelled primer cycle sequencing kit”, utilizando como

marcaje en los oligonucleótidos el fluoróforo Cy5 (Pharmacia). La separación de las

reacciones se realizó en geles desnaturalizantes de poliacrilamida al 6%

(“Rapidgel”, Amersham; “Ready Mix”, “High resolution Reprogel” y “Long Read

Reprogel” de Pharmacia). Los resultados se analizaron con el programa ALFwin v.

1.1.

La secuenciación de fragmentos de PCR se realizó por los mismos

métodos, excepto que el fragmento a secuenciar se purificó previamente (ver

apartado II.6.5). En el caso de secuenciación directa del DNA del fago se siguió el

método descrito por Studier (1989).

II.6.8. Análisis de las secuencias de DNA.

El estudio, análisis y comparación de las secuencias de nucleótidos y

aminoácidos se realizó con ayuda del conjunto de programas GCG de la Universidad

de Wisconsin (Devereux y col., 1984) y con la ampliación del EMBL EGCG (Rice y

col., 1995): GELASSEMBLE se utilizó para la composición de las secuencias

obtenidas, HTH para la identificación del motivo “Hélice α – giro – Hélice α”,

PILEUP para realizar alineamientos de secuencias, FASTA se utilizó para la

comparación de las proteínas, BLAST se usó para la comparación de nucleótidos y

proteínas, éste último se utilizó desde GCG y desde el servidor del NIH a través de

internet. Se utilizaron las bases de datos del EMBL, Genbank, PIR y Swissprot.


Las secuencias obtenidas se enviaron a la base de datos del EMBL y se les

asignó el número de acceso Y12813 y AJ251790.

II.7. MANIPULACION Y ANALISIS DEL RNA.

II.7.1. Obtención del RNA.

El RNA total de L. casei se obtuvo por el método de Chomczynski y Sacchi

(1987) con modificaciones. Los cultivos de L. casei se incubaron hasta alcanzar una

DO600 = 0´25, posteriormente se infectaron con el bacteriófago A2 a una mdi = 5 y

se tomaron muestras a distintos intervalos de tiempo. Las células se recogieron por

centrifugación, el sedimento se congeló rápidamente en un baño criogénico (hielo

seco y acetona) y se guardaron a –70ºC hasta su tratamiento. Las células se

rompieron por agitación en un vortex con bolas de vidrio de 106 µm ∅ (SIGMA) en

presencia de solución desnaturalizante (tiocianato de guanidina 4 M, citrato sódico

25 mM, 2β – mercaptoetanol 100 mM, sarcosil 0´5%). Tras centrifugar las muestras

(14.000 rpm, 2 min) se recogió el sobrenadante y se le añadió un volumen de AcNa

2 M, pH 4, se agitó en el vortex y se le añadió un volumen de fenol (saturado con

agua) y un volumen de cloroformo. Se dejó 15 min en hielo y se centrifugó durante

10 min a 4ºC, se recogió la fase acuosa y se precipitó con un volumen de

isopropanol a –70ºC. Para su utilización en experimentos posteriores se centrifugó

15 min a 4ºC, se lavó con etanol 70% (v/v) y se resuspendió en un volumen adecuado

de H2O – DEPC, tras lo que se trató con DNasa I (Boehringer). En el caso de las

cepas lisogénicas se realizó el mismo tratamiento omitiendo el paso de infección con

A2. Todo el material utilizado había sido previamente lavado con DEPC y

autoclavado. Todas las manipulaciones se realizaron en frío.

II.7.2. Visualización del RNA.

Tras el aislamiento, la visualización del RNA se realizó en geles de agarosa

1´5% (p/v) con formaldehído 2% (v/v) en tampón MOPS (MOPS 20 mM, acetato

sódico 5 mM y EDTA 1 mM; pH 7). Antes de cargar las muestras en el gel se


mezclaron en una proporción 3:1 (v/v) con tampón de carga [formamida desionizada

50% (v/v), tampón MOPS 1% (v/v), formaldehído 6% (v/v), glicerol 10% (v/v) y azul

de bromofenol 0´5% (p/v)], se calentaron a 85ºC durante 2 min y se les añadió 1/5 de

volumen de BrEt (1mgr/ml). La electroforesis se realizó utilizando tampón MOPS a

pH 7 como electrolito y en presencia de formaldehído al 0´3% (v/v). El RNA

presente en el gel se visualizó por exposición a luz UV. Como marcadores de

tamaño de RNA se utilizaron los suministrados por GIBCO BRL.

II.7.3. Transferencia e hibridación del RNA.

La transferencia e hibridación del RNA se realizó mediante la técnica de

“Northern”. Tras la electroforesis, el gel se lavó dos veces con 10xSSC (Sambrook

y col., 1989). El RNA se transfirió a membranas de nylon “Hybond – N”

(Amersham) por capilaridad y posteriormente se fijó de forma irreversible mediante

irradiación con luz UV durante 2 min. Los fragmentos de DNA usados como sondas

se marcaron radiactivamente mediante la técnica del anillamiento al azar utilizando

[α32P]dCTP (3.000 Ci/mmol) y el kit “Rediprime” (Amersham). La sonda se purificó

mediante filtración en una columna de Sephadex G – 25 (Pharmacia). La hibridación

se realizó durante la noche a 42ºC en tampón de hibridación (1xDenhardt, 5xSSC,

formamida 50% (v/v), tampón fosfato sódico 50 mM, DNA de esperma de salmón

(SIGMA) 250 µgr/ml, DTT 10 mM; pH 6´5). Los lavados de la membrana tras la

hibridación fueron los recomendados por el fabricante. La detección de las bandas

radiactivas se realizó por exposición en películas “Biomax MS” (Kodak) utilizando

pantallas amplificadoras “Biomax MS” (Kodak).

II.8. PURIFICACION Y ANALISIS DE PROTEINAS.

II.8.1. Electroforesis de proteínas.

Las electroforesis analíticas de proteínas se realizaron en condiciones

desnaturalizantes y según un procedimiento discontinuo, en geles SDS – PAGE

(Laemmli, 1970) salvo que las proteínas a visualizar fuesen de pequeño tamaño, en


cuyo caso se utilizaron geles de Tricina – SDS – PAGE (Schägger y Von Jagow,

1987). Las electroforesis se realizaron en un “Miniprotean II” (Bio-Rad). Las

proteínas se visualizaron por tinción con azul de Comassie R–250 (Swank y

Munkres, 1971) y/o por tinción con plata (Morrisey, 1981). Como marcadores de

peso molecular se emplearon los incluidos en “Low Molecular Weight Markers”

(Pharmacia) y “Kit for molecular weight 2.500 – 17.000” (Sigma).

II.8.2. Obtención de las proteínas estructurales del fago A2.

Para separar las cabezas de las colas los viriones purificados se calentaron a

70ºC durante 15 min. El DNA fágico se eliminó mediante la adición de DNasa I (1µg/ml) y MgSO4 (10 mM), incubándose la mezcla durante una hora a 37ºC.

Posteriormente la suspensión se sometió a un gradiente continuo de glicerol (5 –

30%) en tampón SM. Se centrifugó en un rotor Contron TST 41.14 (35.000 rpm, 90

min, 15ºC) y se recogieron fracciones de 600 µl del el fondo del tubo. Las fracciones

resultantes se analizaron por microscopía electrónica y electroforesis de proteínas.

La separación de las proteínas de la cápsida se realizó por electroforesis en

SDS – PAGE, tras someter suspensiones de viriones purificados a calentamiento y

eliminación del DNA.

Para la secuenciación del extremo aminoterminal de las proteínas

estructurales se siguió el método de degradación de Edman (Edman y Begg, 1967)

utilizando un secuenciador de fase gaseosa (Applied Biosystems, modelo 477A).

Para ello tras separar las proteínas por SDS – PAGE, se transfirieron por

electroforesis (80 V durante 2 h) a una membrana “Inmobilón P” (Millipore)

siguiendo la técnica de “Western” (Burnette, 1981), utilizando tampón CAPS

(metanol 10% (v/v), CAPS 10 mM; pH 11) como tampón de transferencia.

II.8.3. Purificación de CI.

Para conseguir la sobreexpresión de CI se construyó el plásmido pET11a–

cI y se introdujo en E. coli BL21(DE3)/pLys. La construcción de este plásmido se

describe a continuación:


Los oligonucleótidos 5'–GAGGTGAGACATATGAAAAC–3', que incluye

el inicio de la traducción de cI, y 5'–CAGCTTTTAACGTGGATCCGGG–3', que

corresponde a una secuencia localizada a continuación del codón de parada, se

utilizaron para amplificar por PCR el gen cI. Estos oligonucleótidos se diseñaron

para introducir sitios de restricción para las endonucleasas NdeI y BamHI

respectivamente (subrayados). El segmento de DNA amplificado se purificó, se

digirió con los enzimas de restricción indicados y se ligó al vector pET11a digerido

con los mismos enzimas. La mezcla de ligación se transfirió a E. coli

BL21(DE3)/pLys por electroporación.

La sobreexpresión de CI se consiguió mediante la adición de IPTG 1 mM

(Boehringer Mannheim) a cultivos de E. coli BL21(DE3)/pLys con el plásmido

pET11a–cI a una DO580 = 1. Al cabo de 30 min se añadió Rifampicina (Rif) a una

concentración final de 200 µg/ml y las células se incubaron durante otros 90 min. Las

células se recogieron por centrifugación, se resuspendieron en 25 ml de tampón A

(Tris-HCl 50 mM, MgCl210 mM, DTT 1 mM, Tween 20 0´1%; pH 7´5) conteniendo

1 M NaCl por litro de cultivo, y se lisaron con una prensa hidráulica (French–press).

Todos los pasos de purificación se realizaron a 4ºC. Los extractos crudos, con una

concentración total de proteína de aproximadamente 20 mg/ml, se centrifugaron

(12.000 x g, 30 min). En estas condiciones mas del 95% de CI se encontraba

formando cuerpos de inclusión. Se descartó el sobrenadante y el precipitado se lavó

dos veces con 25 ml de tampón A conteniendo 1 M de NaCl. El sedimento

resultante, que contiene mayoritariamente la proteína CI, se resuspendió en el

mismo tampón hasta conseguir su completa disolución y posteriormente se diluyó 4

veces en tampón A para obtener una concentración final de NaCl de 250 mM. Esta

muestra se cargó en una columna de “Q – Sepharose” (Pharmacia) equilibrada con

tampón A sin DTT. La columna se lavó con 10 volúmenes de columna del mismo

tampón y se eluyó con un gradiente lineal de NaCl (250 mM - 1 M) en tampón A.

Las fracciones se analizaron por SDS – PAGE y las que contenían CI pura se

guardaron a –20°C en glicerol a una concentración final del 50% (v/v). La cantidad

de proteína presente en la muestra se cuantificó utilizando el kit “Protein Assay”

(Bio – Rad). La proteína CI se analizó por espectrometría de masas (MALDI/TOF)

utilizando ácido dihidroxibenzoico como matriz en un espectómetro de masas HP


G2025A MALDI/TOF (Hewlett Packard). A las fracciones resultantes se les

secuenció el extremo amino terminal utilizando un secuenciador de péptidos HP

G1005A (Hewlett Packard).

II.8.4. Purificación de Cro

La sobreexpresión de Cro se realizó tras la introducción del plásmido

pET11a–cro en E. coli BL21(DE3)/pLys. Dicho plásmido se construyó como se

describe a continuación: los oligonucleótidos 5'-GGAGGCAATCATATGACAC-3',

que incluye el inicio de la traducción de cro, y 5'-

CATTGGATCCTTATCAACAACCAC-3', que corresponde a una secuencia

localizada detrás del codón de parada, se utilizaron para amplificar el gen cro. La

secuencia de estos oligonucleótidos fue diseñada para introducir sitios de

reconocimiento para las endonucleasas NdeI y BamHI respectivamente

(subrayados). El fragmento amplificado se purificó y se cortó con los enzimas de

restricción indicados. La mezcla de ligación se preparó con este fragmento y el

vector pET11a, cortado con los mismos enzimas, y posteriormente se transfirió a E.

coli BL21(DE3)/pLys.

La sobreexpresión de Cro se consiguió de modo similar a la descrita para

CI. Tras la inducción, las células se recogieron por centrifugación, se resuspendieron

en 25 ml de tampón B (Tris – HCl 50 mM, NaCl 50 mM, DTT 1 mM; pH 7´5) por

litro de cultivo y se rompieron con una prensa hidráulica (French – press). Los

extractos crudos, con una concentración de proteína total de aproximadamente 20mg/ml, se centrifugaron durante 30 min a 12.000 x g y el sobrenadante, conteniendo la

proteína Cro, se ultracentrifugó (100.000 x g, 1 h). El precipitado se desechó y el

sobrenadante se cargó en una columna de “Q – Sepharose” (Pharmacia) equilibrada

con tampón B. Cro eluyó de esta columna al lavarla con tampón B. La fracción

eluida en este lavado se trató con (NH4)2SO4 al 40% (concentración final), la mezcla

se agitó durante 1 h y se centrifugó a 12.000 x g durante 30 min. El sobrenadante se

sometió de nuevo a precipitación con (NH4)2SO4 al 80%. La muestra se centrifugó

(12.000 x g, 30 min), el precipitado se resuspendió en tampón C (tampón fosfato

sódico 50 mM; pH 7´5) y se cargó en una columna “Mono – S” (FPLC), equilibrada


con el mismo tampón. Después del lavado las proteínas se eluyeron con un gradiente

lineal de NaCl (0´25 – 0´5 M) en tampón C. Las proteínas Cro y Cro*, un mutante

de deleción producido durante la sobreexpresión de Cro, eluyeron a una

concentración aproximada de NaCl de 0´3 M. Las fracciones que contenían ambas

proteínas se mezclaron y se diluyeron a una concentración final 0´1 M de NaCl en

tampón C. Para separar Cro de Cro* se realizó una nueva cromatografía en la misma

columna con un gradiente tendido de NaCl (0´25 M a 0´35 M). Las fracciones se

analizaron en geles de Tricina – SDS – PAGE y aquellas que contenían Cro o Cro*

puras se guardaron a –20ºC en glicerol al 50% (v/v) para su posterior utilización.

Todos los pasos seguidos durante la purificación se llevaron a cabo a 4ºC. La

concentración de proteína presente en las muestras se cuantificó utilizando el kit

“Protein Assay” de Bio-Rad. Las proteínas Cro y Cro* se analizaron por

espectrometría de masas (MALDI/TOF) utilizando ácido dihidroxibenzoico como

matriz en un espectrómetro de masas HP G2025A MALDI/TOF (Hewlett Packard).

A las fracciones resultantes se les secuenció el extremo amino terminal utilizando un

secuenciador de péptidos HP G1005A (Hewlett Packard).

II.9. ANALISIS DE LA INTERACCION DNA – PROTEINA.

Para la realización de los ensayos de unión DNA – proteína se utilizaron los

siguientes tampones:

- Tampón I: Tris – HCl 50 mM, MgCl2 10 mM, Tween 20 0´1%, NaCl

100 mM; pH 7´5. Se utilizó en los ensayos en los que estaba presente

CI.

- Tampón II: Tris – HCl 50 mM, NaCl 100 mM, Tween 20 0´1%; pH

7´5, Se utilizó en las reacciones en las que estaba presente Cro o Cro*.

II.9.1. Ensayos de retención en filtro.

El grado de formación de los complejos DNA – proteína se midió

básicamente como se describe en García y col. (1997). El DNA utilizado en las

reacciones fue el fragmento de 183 pb BamHI – HindIII del plásmido pUO183


marcado con [α32P]dCTP (3.000 Ci/mmol). Este plásmido se obtuvo como sigue: la

región del bacteriófago A2 localizada entre los genes cI y cro se amplificó por PCR

utilizando los oligonucleótidos 5'–TGGATTGCCTCCTTTCGTTTC–3' y 5'–

ACCTCAAGAATGATTTTAACACCG–3'. El fragmento amplificado, de 153 pb,

se purificó y posteriormente se clonó en el sitio HincII de pUC18 para obtener

pUO183.

La reacción estándar se realizó a 30ºC durante 30 min y contenía 475 pgr

(81 pM) de DNA y 126 ngr (100 nM) de CI en un volumen de 50 µl de tampón I. La

reacción se paró al añadir 1 ml del mismo tampón. La mezcla de reacción se filtró

(Nitrocelulosa, 0´45µm ∅, Gelman Sciences) y se lavó varias veces con tampón I.

Los filtros se secaron y la radiactividad unida a ellos se cuantificó en un contador de

centelleo. La radiactividad específica del fragmento marcado se determinó como

DNA precipitable con TCA (15%). El DNA retenido en el filtro en presencia de

proteínas se corrigió con la cantidad de DNA retenido en ausencia de proteínas, lo

que representaba entre el 1 y el 3% de la radiactividad aplicada. Todas las muestras

se realizaron por duplicado.

II.9.2. Ensayos de retardo en gel.

El DNA utilizado en los ensayos de retardo en gel fue el mismo que el

empleado en los ensayos de retención en filtro.

El DNA (242 pgr, 81 pM) se incubó con concentraciones crecientes de

proteína (CI, Cro, Cro* y/o RNAP) en 25 µl del tampón correspondiente, I o II, a

30ºC durante 30 min, en presencia de poli (dI–dC) (Boehringer Mannheim) como

competidor inespecífico a una concentración final de 4 ngr/µl. Los productos de la

reacción se analizaron por electroforesis en gel no desnaturalizante de

poliacrilamida al 5% (p/v) (Sambrook y col., 1989), excepto si en la mezcla de

reacción estaba presente la RNAP, en cuyo caso el gel de poliacrilamida era del

4´5% (p/v). Los geles se corrieron en cubetas de electroforesis “Miniprotean II”

(Bio – Rad) a 100 V en tampón TAE (Tris – acetato 40 mM, EDTA 1 mM; pH 8) a

temperatura ambiente. Los geles se secaron al vacío y las bandas radiactivas se

visualizaron por autorradiografía en una película “Hyperfilm – MP” (Amersham).


La cuantificación de los complejos DNA – proteína separados en los geles se realizó

en un analizador β de imagen “Instant Imager” (Packard).

II.9.3. Ensayos de protección frente a la digestión con DNasa I.

Los fragmentos XbaI – PstI o SmaI – HindIII obtenidos a partir de pUO183

se marcaron en los extremos HindIII (cadena superior) o XbaI (cadena inferior) con

[α32P]dCTP (3.000 Ci/mmol, Amersham). El DNA (81 pM) marcado en uno de sus

extremos se incubó durante 30 min a 30ºC en ausencia o presencia de CI, Cro, Cro*y/o RNAP en 25 µl del tampón apropiado conteniendo poli (dI-dC) a una

concentración final de 4 ngr/µl. A continuación se añadió DNasa I (Boehringer

Mannheim), diluida inmediatamente antes, para obtener una concentración del

enzima que produjese, por término medio, un corte por molécula de DNA. La

mezcla se incubó durante 5 min a 30ºC y la reacción se detuvo con la adición de 1

µl de EDTA 0´5 M, pH 8. El DNA resultante se precipitó y se resuspendió en

tampón de carga desnaturalizante (Maxam y Gilbert, 1980). La muestra se sometió a

electroforesis en un gel desnaturalizante de poliacrilamida al 6%. Los geles se

secaron al vacío y se analizaron por exposición a una película “Hyperfilm – MP”

(Amersham). Como marcadores de tamaño se utilizaron reacciones de secuencia de

purinas (Maxam y Gilbert, 1980) generadas por el protocolo rápido de Belikov y

Wieslander (1995). Si las proteínas Cro o Cro* estaban presentes en la mezcla de

reacción la DNasa I se diluyó en presencia de MgCl2 (a una concentración final de

10 mM).

II.10. TRANSCRIPCIÓN in vitro.

Los experimentos de transcripción in vitro se realizaron básicamente como

se describe en Monsalve y col. (1997). En estos, se utilizó como molde el plásmido

pUO183 linearizado por corte con ScaI. La reacción de transcripción se realizó en

un volumen final de 25 µl y contenía DNA 3 nM, 0´2 mM de ATP, CTP, GTP y

UTP, Tris – HCl 25 mM, MgCl2 10 mM, sulfato amónico 90 mM, DTT 2 mM, 7´5

unidades de “RNasin” (Promega) y RNAP 30 nM; pH 7´5. Después de 30 min de


incubación a 30ºC, las reacciones se pararon mediante la adición de 1 µl de EDTA

0´5 M; pH 8. El RNA obtenido se precipitó a –20 ºC con etanol y se analizó por una

reacción de extensión del cebador (“primer extension”) como sigue: el precipitado

se resuspendió en 10 µl de una solución a pH 7´5, que contenía Tris – HCl 50 mM,

KCl 40 mM, acetato magnésico 7 mM, DTT 2 mM, 200 µM de dATP, dGTP y

dTTP, 25 nM [α32P]dCTP (3.000 Ci/mmol), 4 unidades de AMV transcriptasa reversa

(Promega), 10 unidades de “RNasin” (Promega) y 0´5 pmoles de los

oligonucleótidos 5'–CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGA–3' para el promotor PR y

5'–GCGGATAACAATTTCACACAGG–3' para el promotor PL. La mezcla de

reacción se incubó a 42ºC durante 60 min y se paró mediante la adición de 0´5 µl de

EDTA 0´5 M, pH 8 y 100 µl de tampón TE. Los nucleótidos no incorporados se

eliminaron mediante filtración en una columna de Sephadex G – 25 (Pharmacia).

Los cDNAs obtenidos se precipitaron para posteriormente resuspenderlos

en 6 µl de tampón TE y analizarlos mediante electroforesis en un gel de

poliacrilamida al 6% en condiciones desnaturalizantes. Las bandas resultantes se

visualizaron tras exposición del gel a una película “Hyperfilm – MP” (Amersham) y

pantallas amplificadoras “Hyperscreen – MP” (Amersham). Como marcadores de

tamaño se utilizaron reacciones de secuencia de purinas (Maxam y Gilbert, 1980)

generadas por el protocolo rápido de Belikov y Wieslander (1995).

Los experimentos de represión de la transcripción a partir del promotor PR

se realizaron del mismo modo, excepto que la mezcla de reacción se incubó 20 min

a 30ºC en presencia de cantidades crecientes de CI antes de la adición de la RNAP.

El análisis de represión del promotor PL, se llevó a cabo como se describe

para PR pero con ligeras modificaciones. Como molde se utilizó un fragmento de

390 pb obtenido a partir del plásmido pUO183 mediante amplificación por PCR

utilizando los oligonucleótidos mencionados en este mismo apartado. La reacción de

transcripción se realizó del mismo modo que para PR, pero en presencia de

[α32P]UTP (400 Ci/mmol). Después de 20 min de incubación a 30ºC en presencia de

Cro, se añadió la RNAP diluida en presencia de MgCl2 (concentración final de 10

mM). La reacción se detuvo mediante la adición de 0´5 µl de EDTA 0´5 M, pH 8 y

100 µl de tampón TE. Los nucleótidos no incorporados se eliminaron mediante

filtración en una columna de Sephadex G – 25 (Pharmacia). Los productos


obtenidos en la reacción se precipitaron para posteriormente separarlos mediante

electroforesis en un gel de poliacrilamida al 6% en condiciones desnaturalizantes. El

análisis de los geles se llevó a cabo como se ha indicado anteriormente.

Resultados 37

III.1. LOCALIZACION DEL GEN DEL REPRESOR.

En los bacteriófagos temperados los represores son esenciales para el

establecimiento y mantenimiento del ciclo lisogénico, pero no para el ciclo lítico.

Por lo tanto, para localizar el gen del represor viral nos propusimos obtener mutantes

de deleción incapaces de lisogenizar, los cuales se reconocerán por su fenotipo placa

clara. Estos mutantes se seleccionaron teniendo en cuenta que al ser su DNA de

menor tamaño que el del fago silvestre, ejercerá una menor presión sobre las paredes

de las cápsidas. Y por tanto, se verán favorecidos en un medio en el que se induzca

una disminución de la cohesión de los capsómeros.

A)λλ

Pst

I

λλ P

stI

A2

Eco

RI

A2

Eco

RI

A2

Eco

RI

I II III

IV V VI

VII

VII

I

IX X

11´5

54´84´5

2´82´5

2´11´9

1´7

8´98´17´5

5´4

4´13´4

2´7

1´5

B)

( )( ) coscos

0 kb 44 kb

I II

2,3 2,7 1,5 5,4 7,5 4,1 8,1 8,9

Figura 3: A) Electroforesis en gel de agarosa de los fragmentos de DNA obtenidos tras ladigestión con EcoRI de los diez tipos de mutantes de deleción del fago A2 encontrados. Comomarcador de tamaños se empleó el DNA de λ digerido con PstI. B) Mapa de restricciónEcoRI de A2, se indica el tamaño de los fragmentos obtenidos, así como las dos regionesdispensables para el desarrollo lítico (líneas entre paréntesis).

38 Resultados

Para llevar a cabo el experimento se trataron partículas víricas de A2

purificadas con pirofosfato sódico, un agente quelante de iones divalentes que

desestabiliza las cápsidas debido a que toma el Ca2+ y el Mg2+ que mantienen los

capsómeros unidos. Se determinó en primer lugar la concentración mínima del

agente que mostró una tasa de selección compatible con una buena tasa de

supervivencia (7 x 10-4 supervivientes por ml). En sucesivas rondas de selección se

observó un aumento de la resistencia al pirofosfato hasta alcanzar una supervivencia

del 10% de los fagos en la suspensión. De las placas de lisis obtenidas en las rondas

4ª, 5ª y 6ª de tratamiento, se tomaron muestras que se reaislaron para un posterior

análisis. Se obtuvo el DNA de cada uno de los posibles mutantes y se comparó su

patrón de restricción con el correspondiente al del tipo silvestre. Todos los fagos

aislados presentaron alteraciones en el patrón de restricción, correspondientes a

deleciones en el genoma, que permitieron su clasificación en 10 fenotipos (Figura

3a). Las deleciones oscilaban entre 0´5 y 2´5 kb y mapearon en tres fragmentos

EcoRI del genoma de A2. Se localizaron así, dos regiones que no eran necesarias

para la realización del ciclo lítico, y que comprendían aproximadamente 8 kb de

DNA (Figura 3b).

Los mutantes que presentaban deleciones en la región II (Clases I a VI),

localizada en el brazo derecho del mapa, proporcionaron fácilmente derivados

lisogénicos de Lactobacillus casei 393, incluso de aquellos mutantes con las

mayores deleciones (Clase V; 2´5 kb de deleción). Todos ellos mostraban inmunidad

a la superinfección con A2 y liberaban partículas del fago en una tasa similar a la del

tipo silvestre. Tras la inducción con mitomicina C de estos cultivos se observaba una

lisis de los mismos (Ladero y col., 1998). Por el contrario, no se pudieron obtener

derivados lisogénicos a partir de los mutantes cuyas deleciones mapeaban en el

centro del genoma, clases VII a X. Además, todos ellos presentaban un fenotipo de

placa clara, típico de los fagos que desarrollan únicamente el ciclo lítico. De estos

datos, y de los derivados de otros estudios sobre el bacteriófago realizados en

nuestro laboratorio (Alvarez y col., 1998) se dedujo que el gen del represor debería

estar localizado en el centro del mapa del genoma de A2.

Resultados 39

III.2. ANALISIS DE LA SECUENCIA.

Una vez localizada una región concreta dentro del genoma en la que podría

estar localizado el gen del represor viral, se procedió a su análisis mediante

clonación y secuenciación. La secuencia obtenida, de 2.760 pb (Anexo I), presentaba

un contenido en G + C del 43%, un valor ligeramente inferior al obtenido para el

resto del genoma fágico conocido (45%). Este valor disminuye hasta el 36% si

consideramos sólo la tercera base de los codones de las regiones codificantes,

llegando al 17% al considerar la tercera base de los codones correspondientes a los

10 primeros aminoácidos de cada una de las pautas encontradas, una peculiaridad de

algunos de los genes de Lactobacillus (Pouwels y Leer, 1993).

crocI ATGGTA

PL PR

O1O2O3

-10 -35 -35 -10

lisis/lisogenia

coscos

0 kb 44 kb

attPantcrocIorfXxisint

A)

B)

C)

Figura 4: Representación esquemática del genoma de A2 mostrando la localización yorganización de la región de decisión lisis / lisogenia. A) Mapa de restricción EcoRI delgenoma de A2. B) Esquema de las orfs encontradas en la región central. Se indican con lazoslos terminadores de la transcripción. attP: sitio de integración del fago, int: integrasa, xis:excisionasa, cI: represor, ant: antirrepresor. C) Esquema de la región intergénica cI – cro. Semuestran los inicios de traducción y de transcripción (flechas truncadas), los operadores(barras rellenas) y las cajas –10 y –35.

En el segmento secuenciado se identificaron cuatro pautas abiertas de

lectura con capacidad de codificar polipéptidos de mas de 50 aminoácidos. En base a

sus analogías estructurales las denominamos: orfX, cI, cro y ant (Figura 4). Dos de

40 Resultados

ellas, cro y ant, transcriben hacia el extremo derecho del mapa del genoma, mientras

que las otras dos, cI y orfX, transcriben en dirección opuesta. Todas ellas presentan

posibles sitios de unión al ribosoma que tienen secuencias complementarias a la

secuencia del extremo 3´del rRNA 16S de Lactobacillus casei (Nakagawa y col.,

1995).

En la región intergénica entre cI y cro se localizan dos posibles promotores,

PL y PR, con orientación divergente, que muestran homología con la secuencia

consenso de los promotores de Lactobacillus (Pouwels y Leer, 1993).

El producto de cro es un polipéptido pequeño de 81 aminoácidos (Anexo I),

con un peso molecular estimado de 9.180 Da y con un pI básico (10´8). Presenta

homología en su secuencia de aminoácidos con un represor de la transcripción de un

pseudobacteriófago de Pseudomonas aeruginosa (Lee y col., 1999) y con una Orf

localizada en una posición similar en los bacteriófagos φSfi21 y TP–J34 de

Streptococcus thermophilus (Bruttin y col., 1997; Neve y col., 1998). En la proteína

Cro de A2 no se detecta un claro motivo hélice alfa – giro – hélice alfa, aunque

presenta alguno de los residuos esenciales presentes en homólogos de Cro y un pI

básico.

La pauta denominada ant codifica un polipéptido de 160 aminoácidos con

un peso molecular estimado de 17.844 Da y un pI de 5´39. El codón de inicio de ant

solapa con el codón de parada de cro en la secuencia ATGA (Anexo I), lo que

sugiere una traducción acoplada. La proteína que se deduce a partir de la secuencia

muestra homología con Orfs de otros bacteriófagos que infectan a bacterias lácticas,

como Orf266 de BK5–T (Boyce y col., 1995a), Orf5 de r1t (Nauta y col., 1996) y

Orf287 de φSfi21 (Bruttin y Brüssow, 1996). En estos bacteriófagos dichas Orfs

están localizadas en posiciones similares dentro del genoma, pero no se ha podido

determinar cual es su función. En φSfi21 la proteína correspondiente, Orf287,

presenta homología con el antirrepresor del fago P1 (Bruttin y Brüssow, 1996). Este

último fago codifica un represor primario, C1, que reprime las funciones del ciclo

lítico y un represor secundario, C4, que es un RNA antisentido que inhibe la síntesis

de un antirrepresor, ant, el cual es capaz de inactivar al represor C1 (Riedel y col.,

1993). Se postula por tanto, que ant podría codificar un antirrepresor en A2.

Resultados 41

42 Resultados

El producto de la pauta que denominamos cI es un polipéptido de 224

aminoácidos (Anexo I), lo que corresponde a 25.277 Da y tiene un pI de 4´56. Su

secuencia de aminoácidos presenta homología con represores del ciclo lítico de otros

bacteriófagos como: CI de λ (Sauer y Andreg, 1978) y φ80 (Ogawa y col., 1988 a),

Rro del bacteriófago r1t de Lactococcus lactis (Nauta y col., 1996). También se

parece a los hipotéticos represores de BK5–T (Boyce y col., 1995b) y Tuc2009 (van

de Guchte y col., 1994), ambos fagos que infectan a Lactococcus lactis. Así mismo,

presenta homología con proteínas reguladoras implicadas en la respuesta SOS como

LexA (Horii y col., 1981) y DinR (Raymond – Denise y Guillen, 1991) de

Escherichia coli y Bacillus subtilis, respectivamente.

En la Figura 5 se muestra un alineamiento de CI con alguna de estas

proteínas. Cuando se analiza la secuencia de CI utilizando el programa “Helix – turn

– helix“ del paquete de programas para análisis de secuencias EGCG (Rice y col.,

1995) se obtiene un valor de 2.199 (+ 6´68 SD) para un grupo de 20 aminoácidos

situados en el extremo amino – terminal de la proteína (Figura 5). Esta región podría

estar implicada en la unión a secuencias específicas en el DNA (Anderson y col.,

1982; Sauer y col., 1982). En el extremo carboxi – terminal de CI se encuentra un

dominio de reconocimiento para la proteasa RecA, que comprende los residuos

conservados serina y lisina, y el motivo de corte alanina – glicina (marcados con

asteriscos en la Figura 5). En el represor de λ, el corte en este motivo AG es el

primer paso de la inducción del ciclo lítico del profago (Slilaty y Little, 1987).

Basándonos en las características descritas para CI y Cro postulamos que podrían ser

los homólogos funcionales de las proteínas homónimas de λ.

Inmediatamente detrás de cI existe una repetición invertida, que tiene un

∆G = –17 kcal/mol, (Tinoco y col., 1973), seguida de varias timinas que podría actuar

como un terminador de la transcripción independiente de rho (Anexo I y Figura 4).

Adyacente a ella se encuentra orfX, la cual codifica un polipéptido de

24.447 Da compuesto por 225 aminoácidos y con un pI de 4´4. La comparación de

la secuencia de aminoácidos deducida para OrfX con proteínas de las bases de datos,

sólo reveló una homología significativa (52% de identidad en 117 aminoácidos) con

dos proteínas (TXE3 y DTXA) de un operón policistrónico que codifica las

enterotoxinas A y B de Clostridium difficile (Dove y col., 1990). También se

Resultados 43

encontró homología con dos Orfs de función desconocida pero situadas en una

posición similar, a continuación del gen cI y antes de los genes de integración sitio –

específica, en dos bacteriófagos de bacterias lácticas: mv4 que infecta a

Lactobacillus delbrueckii (Dupont y col., 1995) y φLC3 de Lactococcus lactis

(Lillehaug y col., 1997).

III.3. EL GEN cI CONFIERE INMUNIDAD A LA SUPERINFECCION.

Una de las propiedades de los represores de los fagos temperados es la de

conferir a la cepa hospedadora inmunidad a la superinfección por parte del mismo

fago o de otros relacionados. Para verificar si el producto del gen cI confería esta

propiedad a las células de L. casei, optamos por introducirlo en copia única en el

genóforo de dicha cepa. Para ello amplificamos por PCR un fragmento de 0´8 kb,

que contenía el gen y el promotor PL, utilizando los oligonucleótidos: 5'–

CATCCGAATTCCCATGTGTC–3' y 5'–GTAGTTTCAGAATTCCCCTCC–3'. Estos

cebadores contienen sitios de restricción EcoRI (se muestran en cursiva) que se

utilizaron para la inserción del segmento amplificado en el vector pEM40 (Alvarez y

col., 1998). Este plásmido, diseñado en nuestro laboratorio, es un derivado de

pUC18 que contiene un gen de resistencia a eritromicina. Aunque no se replica en

bacterias gram positivas el gen eryr si se expresa, por lo que puede ser utilizado en la

selección de clones que contengan el plásmido. pEM40 porta el gen de la integrasa y

la secuencia attP del bacteriófago A2, las cuales median su inserción estable en el

genoma de L. casei, concretamente en el gen que codifica el tRNALeu (CAA). El

fragmento de DNA conteniendo cI se purificó, se digirió con EcoRI y se ligó a

pEM40 digerido con el mismo enzima para generar pEM40–cI (Figura 6).

Los transformantes de L. casei portadores de pEM40–cI resultaron ser

inmunes a la infección por el fago A2. En ningún caso se detectaron placas de lisis

tras la infección con una suspensión fágica que presentaba un título de 1010 ufp/ml.

Posteriormente se determinó que la inserción de pEM40–cI es estable y que confiere

resistencia a la infección durante la fermentación de leche por L. casei, lo que

confiere a estas cepas interés tecnológico (Alvarez y col., 1999). Este resultado es

consistente con la función de represor del ciclo lítico sugerida para el producto de cI.

44 Resultados

Figura 6: Esquema del plásmido pEM40-cI. Se indican los genes de resistencia a eritromicina(ery), ampicilina (bla), así como el sitio de recombinación del fago (attP) y los genes de laintegrasa (int) y el represor (cI) de A2.

III.4. CARACTERIZACION DE LOS PROMOTORES PL Y PR.

Mediante el análisis de la secuencia de la región intergénica cI – cro se

localizaron dos posibles promotores, que denominamos PL y PR tal y como se indica

en el apartado III.2 (Anexo I y Figura 4).

Los puntos de inicio de la transcripción de ambos promotores se

determinaron mediante transcripción in vitro utilizando la σA – RNA polimerasa de

Bacillus subtilis y el plásmido pUO183 como molde. Este plásmido contiene un

fragmento de 153 pb que comprende la región intergénica cI – cro (ver apartado

II.9.1). Sobre los productos obtenidos de la transcripción se realizó una reacción de

extensión del cebador a partir de la cual se obtuvieron dos bandas de cDNA de 84 y

100 nucleótidos (Figura 7), que corresponden a los transcritos de PL y PR,

respectivamente. La intensidad de estas bandas de cDNA parece indicar que la

transcripción a partir de PR sería unas diez veces mas abundante que a partir de PL.

En ambos promotores, la transcripción comienza en un residuo G, posiciones 12 y

130 de la Figura 8. En ambos casos, 7 pb por encima de los sitios de inicio de la

transcripción encontramos unas regiones –10 extendidas consenso, con el

dinucleótido TG en posición –16. Estas regiones están separadas por 14 pb de los

Resultados 45

hexámeros –35 consenso. En dirección 5´ de la región –35 de PR aparece un

elemento UP (Figura 8). Esta región, para la cual se ha definido recientemente la

secuencia consenso 5' – NNAAA (A/T) (A/T) T (A/T) TTTTNNAAAANNN – 3'

(Estrem y col., 1998), parece tener una gran importancia en la transcripción puesto

que el extremo carboxi – terminal de la subunidad α de la RNAP se une a ella

aumentando su afinidad por el promotor (Gross y col., 1992; Helmann, 1995). Los

promotores están separados por 81 pb, lo que implica que están situados en la misma

cara de la hélice del DNA (asumiendo 10 ± 1 pb por vuelta de hélice) y se

transcriben de forma divergente. La disposición divergente de ambos promotores y

su situación en la misma cara del DNA, permite que ambos puedan ser transcritos

simultáneamente tras la entrada del genoma fágico en la célula y por lo tanto ambos

reguladores estarían activos en la célula en el momento crítico de la decisión lisis /

lisogenia.

PL

PR

1 2 3 4

84

98

102

Figura 7: Localización de los inicios de transcripción mediante transcripción in vitro. Seindican las bandas correspondientes a los cDNAs específicos de cada promotor. Calle 1:marcador de tamaños.

46 Resultados

. . . . . . . . GTATCTCACCTCAAGAATGATTTTAACACCGTTCCCGATTGTGCACAATAGGGGCACTAAAAAGCAATATCTGAATATTT O3 cI CATAGAGTGGAGTTCTTACTAAAATTGTGGCAAGGGCTAACACGTGTTATCCCCGTGATTTTTCGTTATAGACTTATAAA * -10 -35

. -35 . . -10 * . . TTTTGAAATAATCGTTGACACATGGGAACACGGATGATATTCTTTAGATGTTCCCAAAAGGAAACGAAAGGAGGCAATCC cro O2 O1 AAAACTTTATTAGCAACTGTGTACCCTTGTGCCTACTATAAGAAATCTACAAGGGTTTTCCTTTGCTTTCCTCCGTTAGG

Figura 8: Secuencia de nucleótidos de la región intergénica cI – cro. Se indican los operadores(flechas enfrentadas), las regiones –10 y –35 (negrita), los inicios de transcripción (asteriscos)y el elemento UP (negrita y cursiva).

En esta misma región también se localizan tres repeticiones invertidas

imperfectas, de 20 pb (O1, O2 y O3) (Anexo I), que denominaremos operadores del

sistema por la similaridad de su disposición con la de los operadores del interruptor

genético del bacteriófago λ. O1 se localiza por debajo del promotor PR, mientras que

O2 y O3 solapan con las regiones –35 de, PR y PL, respectivamente (Figura 8). Entre

las secuencias de estas tres repeticiones se observan pequeñas diferencias pero, al

igual que sucede con el bacteriófago λ (Ptashne, 1992), se puede establecer un

alineamiento entre cada una de las mitades, obteniéndose la secuencia consenso

C4C5C5A3A4T4T3G6T5G2 (Figura 9).

O1

O2

O3

C4C5C5A3A4T4T3G6T5G2A1A1T1T2T2A1C2 G1T2T1 G1 G1A1 A1 C1

C C C G A T T G T GC C C T A T T G T G

A A T A A T C G T T C C C A T G T G T C

C C C A A A A G G A T C C T T T C G T T

Figura 9: Alineamiento de cada una de las mitades de las repeticiones invertidas encontradasen la región intergénica cI – cro y su secuencia consenso.

Resultados 47

Para profundizar en el conocimiento de ambos promotores y analizar la

expresión de los genes cI y cro, estudiamos el patrón de transcripción de los

mismos. Para ello se realizó una hibridación tipo “Northern”, a partir de RNA total

de L. casei 393 y de un derivado lisogénico. Para el análisis del promotor PL se

utilizó como sonda el gen cI, desde su ATG hasta el codón de parada, generada por

PCR y marcada radiactivamente.

7.45.32.81.9

11.6

7.45.32.81.9

11.6

A B

min

Figura 10: Análisis del patrón de transcripción del gen cI. A) RNA total de Lactobacilluscasei 393 sin infectar (calle 1) y de un derivado lisogénico de A2 (calle 2). B) RNA total deLactobacillus casei 393 extraído a distintos tiempos tras la infección con A2. En ambos“Northern” se indican la posición y tamaño (en kb) de los marcadores de peso molecular.

Como se observa en la Figura 10A, se detectaron dos transcritos de

aproximadamente 0´8 y 1´4 kb. El tamaño del menor de los transcritos corresponde

a la distancia entre el promotor PL y el probable terminador rho independiente

localizado al final del gen cI (Anexo I). El transcrito de mayor tamaño, 1´4 kb, podía

corresponder a la transcripción conjunta de los genes cI y orfX. Cuando esta

hibridación se realiza sobre RNA extraído de cultivos que han sido infectados con

A2 se observan estos mismos transcritos, pero sólo en las calles correspondientes a

los tiempos entre 15 y 25 minutos postinfección, desapareciendo posteriormente

(Figura 10B). Bajo las condiciones de propagación empleadas el periodo de eclipse

48 Resultados

del bacteriófago A2 es de 120 min (Herrero y col., 1994), por lo que los tiempos en

los que se detecta transcripción del gen cI se consideran tempranos.

Para estudiar la transcripción a partir del promotor PR, el RNA extraído de

cultivos de L. casei 393 infectados con A2 se hibridó con una sonda que comprendía

el gen cro desde el ATG hasta su codón de parada. En la Figura 11 se puede

observar la presencia de tres transcritos que aparecen a los 40 min postinfección y

que permanecen hasta el final del ciclo infectivo (120 min) creciendo en intensidad.

El menor de los transcritos, de 1´5 kb, podría comprender los genes cro y ant, que

como vimos anteriormente son solapantes. El transcrito de 2´5 kb correspondería al

anterior mas una zona adyacente donde se localizan dos pequeñas pautas con

función desconocida. El mRNA de mayor tamaño, 10 kb, comprendería además de

los genes anteriores la región del genoma de A2 implicada en replicación (Moscoso

y Suárez, 2000).

0 2010 40 60 75 120 min

0´2

1´3

2´4

4´4

7´59´5

105 140

Figura 11: Análisis del patrón de transcripción del gen cro durante el ciclo de infección de A2en Lactobacillus casei 393. Se indica la posición y tamaño (en kb) de los marcadores de pesomolecular.

Resultados 49

Con estos resultados se puede concluir que PR sería el responsable de la

transcripción del operón lítico temprano, incluyendo cro, ant y el bloque de

replicación, mientras que PL sería el responsable de la expresión del represor del

ciclo lítico, cI.

III.5. INTERACCION DE CI CON EL CONMUTADOR GENETICO DE A2

III.5.1. Purificación del represor.

La proteína CI se sobrexpresó en E. coli BL21/pLys después de insertar el

gen cI en el vector pET11a bajo la influencia del promotor P10 del bacteriófago T7

tal y como se describe en Materiales y Métodos. Bajo estas condiciones la mayor

parte de CI, que totalizaba un 2% de la proteína total de la célula, estaba en el

precipitado que se obtiene tras la centrifugación de los extractos crudos. Este hecho

permitió la eliminación de la mayoría de las proteínas coprecipitadas con CI

mediante el lavado de los agregados con tampón. La proteína se solubilizó en el

mismo tampón conteniendo 1 M de NaCl. Posteriormente, la muestra se diluyó y se

sometió a cromatografía de intercambio iónico (Q – Sepharosa). Las fracciones

resultantes del gradiente se analizaron por SDS – PAGE. Algunas contenían CI con

un nivel de pureza superior al 95% (Figura 12). CI pura migra, en condiciones

desnaturalizantes, como un polipéptido de aproximadamente 28.000 Da (recuérdese

que el peso deducido a partir de la secuencia de aminoácidos era de 25.277 Da). La

identidad de la proteína se comprobó mediante la determinación de la secuencia de

su extremo amino – terminal. La masa molecular en solución se obtuvo por un

análisis de espectrometría de masas MALDI/TOF y fue de 25.235 ± 13 Da. La

muestra analizada tenía una concentración nanomolar, lo que indica que CI es un

monómero en solución a la concentración utilizada.

III.5.2. CI se une de forma específica a la región intergénica cI – cro.

La organización genómica de la región temprana del bacteriófago A2 nos

permite postular que la decisión entre seguir el ciclo lítico o lisogénico dependerá de

50 Resultados

la capacidad de CI de actuar como represor del ciclo lítico del bacteriófago A2, es

decir de su capacidad de unirse a los posibles operadores localizados entre los

promotores PL y PR para bloquear la transcripción de los genes del ciclo lítico. Esta

hipótesis está basada en las similitudes encontradas entre CI y otros represores

(Ladero y col., 1998).

1 2 3 4 5 6

14

20

30

43

6794

Figura 12: Análisis por SDS – PAGE de los pasos de purificación de la proteína CI. Calle 2:extracto celular tras la sobrexpresión. Calle 3: fase insoluble. Calle 4: proteína solubilizada.Calle 5: proteína CI pura tras la elución de la matriz “Q – Sepharosa”. Calles 1 y 6 patronesde peso molecular (en kDa).

Para comprobarlo se realizaron ensayos de retención en filtro, inducida por

CI, de un fragmento de 183 pb que contiene la región intergénica cI – cro marcada

radioactivamente. Los complejos CI – DNA quedaron retenidos en los filtros de

nitrocelulosa, lo que se aprovechó para optimizar las condiciones de la reacción y

posteriormente cuantificar la afinidad entre sus componentes. La formación de los

complejos era dependiente de la presencia de Mg2+, con un óptimo a 10 mM del

catión (Figura 13A), mientras se ve reducida por concentraciones de NaCl

superiores a 150 mM (Figura 13B). La presencia de Tween 20 (0´1 – 1%) en la

reacción no tiene ningún efecto significativo (datos no mostrados). La unión de CI al

DNA es total al cabo de 20 min (al menos un 80% de la radiactividad quedaba

retenida en los filtros).

La especificidad de la unión entre CI y la región intergénica cI – cro se

determinó midiendo la capacidad de moléculas de DNA no marcadas

Resultados 51

radiactivamente de actuar como competidores. Cuando en la reacción estaba

presente DNA inespecífico, poli d(I-C), la unión sólo se inhibía parcialmente incluso

a concentraciones 400 veces superiores a la del fragmento cI – cro (Figura 13C). Sin

embargo, cuando el DNA que se añadía en la reacción era específico, es decir el

mismo fragmento de DNA sin marcaje radiactivo, se observaba un descenso

inmediato de la radiactividad retenida en los filtros que era directamente

proporcional a las cantidades relativas de moléculas marcadas y sin marcar presentes

en la reacción (Figura 13D).

0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100

[MgCl 2] mM

% D

NA

ret

enid

o en

el f

iltro

0

20

40

60

80

100

0 100 200 300 400 500

[NaCl] mM%

DN

A r

eten

ido

en e

l filt

ro

0

20

40

60

80

100

0.01 1 100

poli d(I-C) ng

% D

NA

ret

enid

o en

el f

iltro

0

20

40

60

80

100

0 4 8 12 16 20

DNA no marcado ng

% D

NA

ret

enid

o en

el f

iltro

.

A) B)

C) D)

Figura 13: Parámetros implicados en la formación de complejos CI – DNA detectados porretención en filtro. El parámetro analizado en cada caso se indica bajo la gráfica.

III.5.3. CI se une cooperativamente a la región intergénica cI – cro.

Para determinar la tasa de formación del complejo CI – DNA en función de

la concentración de la proteína se realizó un ensayo de retención en filtro (Figura

14A). La constante aparente de equilibrio (Kapp) del complejo CI – DNA se estimó

en 80 nM a pH = 7´5 y 30ºC, mientras que la Kapp para el DNA inespecífico tiene un

52 Resultados

valor aproximado de 100 µM en las mismas condiciones (datos no mostrados). La

gráfica de retención del DNA es una curva sigmoidal, lo que significaría que CI se

une de forma cooperativa a la región intergénica cI – cro.

0

20

40

60

80

100

-8 -7 -6

log [CI ] M

% D

NA

ret

enid

o en

el f

iltro

0

20

40

60

80

100

-9 -8 -7 -6

log [CI ] M

% D

NA

ret

ard

ado

en

el g

el

0

500

1000

1500

0 5 10 15

1 / [ DNA t ]

[ CI ]

/ [

DN

Au

]

CI

I

II

DNAlibre

A) B)

C) D)

Figura 14: Determinación de la afinidad entre la proteína CI y el segmento intergénico cI –cro. A) Cantidad de DNA retenida en el filtro en presencia de concentraciones crecientes deCI. B) Análisis EMSA de los complejos formados en presencia de concentraciones crecientesde CI (0, 1, 2, 4, 6, 8, 10 y 50 nM). Se indica el DNA libre y los complejos I y II. C) Fracciónde DNA unido en presencia de concentraciones crecientes de CI obtenida por cuantificaciónde los datos mostrados en B. D) Unión de CI (7 nM) en presencia de concentracionescrecientes de DNA. [CI] concentración total de proteína, [DNAu] concentración de DNAunido a CI, [DNAt] concentración total de DNA.

Para conocer el tipo de complejos formados se realizaron ensayos de

retardo en gel (EMSA). CI se une de forma específica al fragmento de DNA

generando dos bandas con movilidad electroforética retardada, complejos I y II en la

Figura 14B, lo que nos indica la existencia de al menos dos sitios de unión para el

represor en la región intergénica cI – cro. El complejo I se forma preferentemente a

Resultados 53

concentraciones bajas de proteína, mientras que a concentraciones altas solo se

detecta el complejo II. La Kapp de formación del complejo CI – DNA en función de

la concentración de CI fue de 7 nM a pH = 7´5 y 30ºC (Figura 14C). La forma

sigmoidal de la curva es similar a la observada cuando la constante se calculó

mediante el ensayo de retención en filtro (Figura 14A), indicando de nuevo que debe

existir una unión cooperativa de CI al DNA, aunque el valor de la Kapp es unas 10

veces mayor en los ensayos de retención en filtro que el obtenido en los de retardo

en gel.

Para obtener otra medida equivalente a la Kapp calculamos la tasa de

disociación (KD). Para ello se estudió la cinética de formación del complejo CI –

DNA en presencia de una concentración constante de proteína, 7 nM, y variando la

concentración de DNA. Como se muestra en la Figura 14D los datos se

representaron como la concentración de proteína dividida de la concentración de

DNA unido, frente al inverso de la concentración total de DNA. La pendiente de la

recta nos da el valor de la constante de disociación para la unión de CI (KD = 10

nM), asumiendo que cada monómero tiene un sitio de unión al DNA. Este valor es

muy similar al obtenido para la Kapp en EMSA al variar las concentraciones de CI.

Para determinar cuantitativamente el grado de cooperatividad de la unión

CI – DNA se calculó el factor de cooperatividad de la reacción, τ, de acuerdo a la

ecuación τ = 4 (F)(2R)/(1R)2 (Wilson y col., 1993). La ventaja de este método es

que los datos necesarios para calcular τ se pueden obtener para cada una de las

calles de los geles de retardo, y por tanto nos da una serie de valores que han de ser

semejantes. Los valores de la ecuación se obtienen cuantificando la cantidad de

DNA libre (F), unido a una molécula de CI (1R) y unido a dos o más moléculas de

CI (2R). El factor de cooperatividad se define como el grado en el que la formación

del complejo con dos moléculas unidas excede a la formación del complejo con una

molécula unida. Teóricamente, un valor de τ mayor o menor de 1 indicaría una

cooperatividad positiva o negativa respectivamente, mientras que un valor próximo

a uno indicaría que no existe cooperatividad en la unión. El valor obtenido a partir

de los datos estimados para la Figura 14 b es de τ = 9´97 ± 0´59, lo que ratifica que

probablemente CI es una proteína que se une de forma cooperativa a sus sitios diana

en el segmento intergénico cI – cro.

54 Resultados

A B

O1

O1

O2

O3

O2

O3

CI CI

Figura 15: Análisis mediante ensayos de protección a la digestión por DNasa I de loscomplejos CI – DNA. A) El fragmento SmaI – HindIII (cadena superior) se incubó enpresencia de concentraciones crecientes de CI (3´5, 7, 14 y 28 nM). B) El fragmento XbaI –PstI (cadena inferior) se incubó en presencia de 3´5, 7, 14, 28 y 56 nM de CI. En losextremos de cada autorradiografía se presentan los mismos fragmentos incubados en ausenciade proteína. Se indica mediante barras la posición de los operadores.

Resultados 55

. . . . . . . . GTATCTCACCTCAAGAATGATTTTAACACCGTTCCCGATTGTGCACAATAGGGGCACTAAAAAGCAATATCTGAATATTT O3 cI CATAGAGTGGAGTTCTTACTAAAATTGTGGCAAGGGCTAACACGTGTTATCCCCGTGATTTTTCGTTATAGACTTATAAA * -10 - 35

. - 35. . -10 * . . . TTTTGAAATAATCGTTGACACATGGGAACACGGATGATATTCTTTAGATGTTCCCAAAAGGAAACGAAAGGAGGCAATCC cro O2 O1 AAAACTTTATTAGCAACTGTGTACCCTTGTGCCTACTATAAGAAATCTACAAGGGTTTTCCTTTGCTTTCCTCCGTTAGG

Figura 16: Esquema de las regiones protegidas por CI (barras) en la región intergénica cI –cro basado en los datos obtenidos en la Figura 15. Se indican los operadores (flechasenfrentadas), las regiones –10 y –35 (negrita), los inicios de transcripción (asteriscos), elelemento UP (negrita y cursiva) y los sitios de hipersensibilidad (flechas).

III.5.4. CI se une a los operadores del bacteriófago A2.

De los datos obtenidos en los ensayos de retardo en gel se deduce la

existencia de al menos dos sitios de unión para CI en la región intergénica cI – cro.

Para una localización mas precisa de las secuencias reconocidas por el represor

analizamos los complejos CI – DNA mediante ensayos de protección frente a la

digestión con DNasa I.

La cadena superior presenta tres dominios de protección por CI de un

tamaño de 22, 26 y 24 pb que solapan con las secuencias invertidas localizadas en

esta región (O1, O2 y O3). Estos dominios están separados entre sí por intervalos de

12 y 38 pb (Figuras 15A y 16). En las regiones espaciadoras entre los dominios de

protección se observan varios sitios de hipersensibilidad a la digestión con DNasa I.

Entre O1 y O2 se localiza uno, mientras que entre O2 y O3 hay varios que están

separados entre sí por 10 ± 1 nucleótidos, lo que significa aproximadamente una

vuelta de hélice, asumiendo 10´5 pb por vuelta en DNA de doble cadena. Estas

56 Resultados

anomalías periódicas en el patrón de digestión de la DNasa I implican una

deformación del DNA producida por la unión de CI (revisado en Schleif, 1992).

En la cadena inferior de nuevo podemos observar tres dominios de

protección de CI solapantes con las repeticiones invertidas (Figuras 15B y 16).

Nuevamente, estas regiones de protección están separadas por espacios en los que se

localizan varios sitios de hipersensibilidad a la digestión por DNasa I.

La cantidad de CI requerida para proteger todos los operadores es al menos

tres veces inferior que la requerida en los ensayos EMSA (3´5 frente a 10 nM). En

estas condiciones hay aproximadamente 40 monómeros de CI por cada molécula de

DNA.

Los datos expuestos hasta aquí indican que la región intergénica entre cI y

cro es el interruptor genético del bacteriófago A2, y que las repeticiones invertidas

encontradas en ella son los operadores del sistema de acuerdo a la nomenclatura de

λ (revisado en Ptashne, 1992).

III.5.5. CI reprime la transcripción a partir de PR.

El represor CI de los fagos lambdoides es capaz de reprimir la transcripción

de los genes líticos tempranos y estimular su propia transcripción al unirse a los

operadores de la región de decisión del desarrollo de estos fagos (revisado en

Ptashne, 1992). Por lo tanto, se espera que el represor de A2 sea capaz de reprimir la

transcripción a partir del promotor PR. Para verificar esta hipótesis decidimos

estudiar la transcripción de PR en presencia de cantidades crecientes de CI. Para ello

realizamos ensayos de transcripción in vitro utilizando la σΑ − RNAP de B. subtilis y

el plásmido pUO183 como molde. Como podemos observar en la Figura 17, CI

reduce, en un proceso dependiente de concentración, la transcripción a partir de PR

hasta bloquearla por completo. Una concentración de 7´4 nM de CI es suficiente

para detectar una reducción en los niveles de transcripción, lo que corresponde a 2´5

monómeros de CI por molécula de DNA, mientras que para bloquear completamente

el promotor se necesita alcanzar una concentración de CI en la reacción de 177 nM,

aproximadamente 60 monómeros por molécula de DNA.

Resultados 57

PR

CI

Figura 17: Inhibición de la transcripción a partir de PR por la presencia de concentracionescrecientes de CI (0, 3´7, 7´4, 30, 60, 118, 177, 237 y 474 nM). En la primera calle se presentaun marcador de tamaños.

Para descartar la posibilidad de que el efecto pudiera deberse a una unión

inespecífica de la proteína con el DNA o a la presencia de RNasas contaminantes en

la preparación de la proteína se incubaron concentraciones superiores a las

necesarias para reprimir la transcripción de PR (hasta 480 nM de CI) en ensayos de

transcripción con un promotor no relacionado [Promotor P1 del plásmido

pSM19035 de Streptococcus pyogenes (Rojo y Alonso, 1995)], no observándose

ningún efecto sobre los niveles de expresión del mismo (datos no mostrados).

III.5.6. CI recoloca la RNA polimerasa en la región intergénica cI – cro.

Debido al hecho de que O2 solapa con la región –35 de PR y que O1 está

localizado inmediatamente después de su inicio de transcripción (Figura 4), CI

podría reprimir la transcripción de PR bien por exclusión de la RNAP, impedimento

58 Resultados

estérico, o bien bloqueando el desplazamiento de la polimerasa situada sobre el

promotor, de tal modo que ésta no pudiera iniciar la transcripción. Para analizar cual

de estas dos posibilidades es la real realizamos un análisis de competición mediante

EMSA. Para ello, primero analizamos las características de unión de la RNAP a la

región intergénica. En la Figura 18 se puede observar que al incubar el fragmento de

DNA en presencia de concentraciones crecientes de RNAP se forman dos complejos

con movilidad electroforética retardada, RPI y RPII, formándose el complejo RPII

de manera preferente a concentraciones altas de proteína (Figura 18, calles 3 a 8).

Este resultado es el esperado si tenemos en cuenta que los dos promotores no

solapan. La Kapp para los complejos RNAP – DNA es de aproximadamente 20 nM a

pH 7´5 y 30ºC; este valor es tres veces superior al de la Kapp obtenida para los

complejos CI – DNA.

CIσσA-RNAP 22 nM σA-RNAP

RPII

II

RPII

RPI

II

I

II*

CI-RP

DNA libre

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Figura 18: Análisis mediante EMSA de la unión de CI y RNAP a la región intergénica. Elfragmento de DNA (calle 1) se incubó en presencia de 6 nM de CI (calle 2), concentracionescrecientes de RNAP (13, 17´5, 22, 26´5, 34 y 44 nM) (calles 3 a 8). En las calles 9 a 12 laconcentración RNAP se mantuvo constante (22 nM) y se añadieron concentracionescrecientes de CI (2´7, 5´6, 11 y 22 nM). Se indica la posición del DNA libre, de los complejosCI – DNA (I y II), RNAP – DNA (RPI y RPII) y de los complejos ternarios CI – RNAP –DNA (II* y CI – RP).

Una vez establecido el patrón de unión de CI y la RNAP a la región

intergénica se procedió a realizar los experimentos de competición para verificar una

Resultados 59

de las dos hipótesis de partida. Incubando el DNA con una concentración constante

de RNAP (22 nM) y concentraciones crecientes de CI podemos observar como la

cinética de formación de los complejos DNA – proteína se ve aumentada al añadir

CI, compárense las calles 2, 5 y 9 en la Figura 18. Incluso a concentraciones

inferiores a 3 nM de CI observamos la aparición de los complejos II y RPII, así

como la aparición de un nuevo complejo denominado CI – RP, que postulamos

estaría formado por el DNA + CI + 2 RNAP. A concentraciones de CI próximas a su

KD (Figura 18, calle 11) observamos el complejo CI – RP y los complejos difusos II,

formados por el complejo II y el II* de nueva aparición, que interpretamos como

DNA + CI + RNAP. Estos resultados se obtienen independientemente del orden de

adición de las proteínas e implican que CI y RNAP coexisten en la región

intergénica cI – cro.

Para profundizar en el conocimiento de los complejos formados por CI y la

RNAP con la región intergénica cI – cro se procedió al análisis de los mismos

mediante ensayo de protección frente a la digestión con DNasa I. La unión de CI al

DNA da un patrón de protección característico (Figura 15). La RNAP muestra un

patrón de protección extendido sobre la región donde solapan PR y O2, así como en

la región del elemento UP, mientras que sobre PL la protección es menor y sólo se

detecta a mayores concentraciones de RNAP y sobre todo en la cadena en la que se

sitúa el promotor (Figuras 19 y 20). Al igual que se hizo en el caso del análisis por

EMSA se procedió a estudiar los complejos proteína – DNA cuando CI y RNAP se

incuban juntas con el segmento intergénico cI – cro (Figuras 21 y 22). En presencia

de una concentración constante de RNAP (31 nM) y concentraciones crecientes de

CI se observa un patrón de protección que difiere de los observados al incubar cada

una de las proteínas por separado con el DNA (Figura 21). La RNAP no altera el

patrón de protección de CI en la región correspondiente a O1 y O2, lo que indica que

es desplazada del promotor PR incluso a bajas concentraciones de represor (3´5 nM).

Sin embargo, la polimerasa compite con CI en la región correspondiente a O3 y a PL,

lo que se puede deducir por el cambio en el patrón de protección de CI en presencia

de RNAP. Para recuperar este patrón en O3 se requiere una concentración 8 veces

mayor (28 nM) que cuando la RNAP no está presente (Figuras 21 y 22).

60 Resultados

σσA-RNAP σσA-RNAP

PL

PR

UP

PL

UP

PR

A B

Figura 19: Análisis mediante ensayos de protección a la digestión por DNasa I de loscomplejos RNAP – DNA. A) El fragmento SmaI – HindIII (cadena superior) se incubó enpresencia de concentraciones crecientes de RNAP (3´9, 7´8, 15´5, 31 y 62 nM). B) Elfragmento XbaI – PstI (cadena inferior) se incubó en presencia de 31, 62, y 124 nM deRNAP. En los extremos de cada autorradiografía se presentan los mismos fragmentosincubados en ausencia de proteína. Se indica la posición de los promotores (flechas) y delelemento UP (barra).

Resultados 61

. . . . . . . . GTATCTCACCTCAAGAATGATTTTAACACCGTTCCCGATTGTGCACAATAGGGGCACTAAAAAGCAATATCTGAATATTT O3 cI CATAGAGTGGAGTTCTTACTAAAATTGTGGCAAGGGCTAACACGTGTTATCCCCGTGATTTTTCGTTATAGACTTATAAA * -1 0 - 35


Figura 20: Esquema de las regiones protegidas por la RNAP (barras) en la región intergénicacI – cro basado en los datos obtenidos en la Figura 19. Se indican los operadores (flechasenfrentadas), las regiones –10 y –35 (negrita), los inicios de transcripción (asteriscos), elelemento UP (cursiva) y los sitios de hipersensibilidad (flechas verticales).

La combinación de los datos obtenidos mediante EMSA y los ensayos de

protección frente a DNasa I parecen indicar que en ausencia de CI la RNAP

interaccionaría primero con PR para formar el complejo RPI, y al ir aumentando la

concentración de RNAP, ésta se uniría a los dos promotores formando RPII (Figura

18). Sin embargo, en presencia de bajas concentraciones de CI (2´7 nM), la RNAP

es desplazada de PR debido a la mayor afinidad del represor por O1 y O2. Como

consecuencia de este desplazamiento la transcripción a partir del promotor del ciclo

lítico, PR, desaparece. Sin embargo, la RNAP parece interaccionar con CI y

reposicionarse para interactuar con PL por un mecanismo no identificado, originando

el complejo CI – RP (Figura 18), lo que probablemente implicaría un aumento de la

transcripción a partir de PL, es decir del gen que codifica el represor. Finalmente, si

la concentración de CI sigue aumentando la proteína se uniría a O3 lo que implicaría

el desplazamiento de la RNAP de PL y por lo tanto un bloqueo de la transcripción a

partir de ambos promotores.

62 Resultados

A B C

CI

σA-RNAPCI31 nM σA-RNAP

Figura 21: Efecto de la presencia de CI sobre la unión de la RNAP a la región intergénica cI –cro analizado mediante el ensayo de protección a la digestión por DNasa I. El fragmento SmaI– HindIII (cadena superior) se incubó en presencia de 3´5, 7, 14 y 28 nM de CI (A), 3´9, 7´8,15´5, 31 y 62 nM de RNAP (B) y de 31 nM RNAP mas 3´5, 7, 14 y 28 nM de CI (C). En esteúltimo caso la RNAP y el DNA se incubaron durante 15 min tras los que se añadió CI.

Resultados 63

. . . . . . . . GTATCTCACCTCAAGAATGATTTTAACACCGTTCCCGATTGTGCACAATAGGGGCACTAAAAAGCAATATCTGAATATTT O3 cI CATAGAGTGGAGTTCTTACTAAAATTGTGGCAAGGGCTAACACGTGTTATCCCCGTGATTTTTCGTTATAGACTTATAAA * -1 0 - 35


Figura 22: Esquema de las regiones protegidas por CI (barras blancas) y RNAP (barrasralladas) en la región intergénica cI – cro basado en los datos obtenidos de las Figuras 15 y19. Se indican los operadores (flechas enfrentadas), las regiones –10 y –35 (negrita), losinicios de transcripción (asteriscos), el elemento UP (cursiva) y los sitios de hipersensibilidad(flechas verticales). La barra negra indica la región protegida por la RNAP en presencia debajas concentraciones de CI (obtenido de la Figura 21).

III.6. INTERACCIÓN DE CRO CON EL CONMUTADOR GENETICO DEL

CICLO

III.6.1. Purificación de Cro.

El interruptor genético del fago lambda consta de dos proteínas principales,

CI y Cro, siendo la unión de estas dos proteínas a los operadores del sistema lo que

permite la decisión de seguir el ciclo lisogénico o lítico (revisado en Ptashne, 1992).

En el bacteriófago A2 hemos visto la existencia de una disposición estructural

similar a la del fago λ, por lo que postulamos que funcionalmente la organización

también será similar. Para confirmarlo, nos decidimos a abordar el estudio de las

interacciones de la proteína Cro con el segmento cI – cro y determinar si también

64 Resultados

ella estaba implicada en la regulación de los ciclos de desarrollo fágico. El primer

paso en este estudio fue la purificación de la proteína.

a b c d e f

1714.410.68.1

Figura 23: Análisis por SDS – PAGE de los pasos de purificación de las proteínas Cro y Cro*.Calle a: sobrenadante tras la ultracentrifugación. Calle b: fracción eluída de la matriz “Q –Sepharosa”. Calle c: proteína tras la precipitación con sulfato amónico. Calle d: fraccióneluída de la columna “Mono – S”. Calle e: proteína Cro pura. Calle f: proteína Cro* pura. Seindica la posición y tamaño (en kDa) de los patrones de peso molecular.

El producto del gen cro se sobrexpresó en E. coli BL21/pLys después de

insertar el gen en el vector pET11a como se describe en Materiales y Métodos.

Sorprendentemente en los sobrenadantes de los extractos crudos de estos cultivos se

detectaron dos polipéptidos de tamaño aproximado al deducido de la secuencia de

Cro que en su conjunto constituían aproximadamente un 2% del contenido total de

proteína de la célula (Figura 23). Dichos sobrenadantes se pasaron por una columna

de intercambio iónico (“Q – Sepharosa”) con el fin de eliminar de la muestra las

proteínas con un pI ácido que quedarían retenidas en la misma, mientras que Cro

debería pasar libremente a través de la matriz debido a que tiene un pI de 10´8,

curiosamente ambos polipéptidos se comportaron del mismo modo. Las proteínas

que eluyeron de la columna se concentraron mediante precipitación fraccionada con

sulfato amónico. El precipitado resultante se resuspendió y se sometió a un paso de

cromatografía en FPLC a través de una columna “Mono – S”. Las dos proteínas

sobrexpresadas eluyeron prácticamente juntas a una concentración muy parecida de

Resultados 65

NaCl, por lo que se realizó un nuevo paso de cromatografía en la misma columna

pero con un gradiente escalonado muy tendido lo que permitió separarlas y

obtenerlas con una pureza de al menos el 95% (Figura 23).

Las proteínas purificadas migran en condiciones desnaturalizantes como

polipéptidos de 9.500 y 7.500 Da. Para determinar su identidad se analizó su

secuencia amino – terminal, comprobándose que en ambos casos coincidía con la

deducida a partir de la secuencia de nucleótidos del gen cro, por lo que las

denominamos Cro y Cro*. Mediante un análisis de espectrometría de masas

MALDI/TOF se obtuvo la masa molecular en solución de ambas proteínas. En el

caso de la mayor se obtuvieron dos picos que correspondían a masas moleculares de

9.180 (75%) y 9.048 (25%) Da; estos valores se corresponden con los esperados

para Cro con y sin la formil – metionina inicial. La muestra correspondiente a Cro*

presentó una mezcla de polipéptidos con masas moleculares de 7.887 (25%), 7.766

(35%) y 7.607 (40%). La secuenciación de dichos péptidos reveló que los sitios de

corte proteolítico que los generarían se localizan entre los residuos Asn – 70 y Asn –

71 (con pesos moleculares de 7.766 y 7.607 Da que corresponderían a polipéptidos

con y sin la metionina inicial, respectivamente) y entre los aminoácidos Asn – 71 y

Val – 72 (masas moleculares de 7.887 y 7.766 Da con y sin la metionina inicial,

respectivamente). Cro* resultó ser un derivado delecionado de la proteína Cro, al

que le faltan 11 o 12 residuos del extremo carboxi – terminal. En todos los casos las

muestras fueron analizadas a concentración nanomolar, lo que nos indica que, a esta

concentración, ambas proteínas son monómeros en solución. Mediante experimentos

de filtración en gel realizados a concentraciones proteicas mayores, rango

micromolar, pudimos comprobar que Cro* se encuentra en forma de monómeros,

mientras que Cro se encuentra en forma de dímeros y tetrámeros. Es decir, a baja

concentración de proteína Cro es monomérica, pero a medida que aumenta su

concentración en solución es capaz de formar dímeros y tetrámeros, mientras que

Cro* se encuentra en forma de monómero a cualquier concentración de proteína.

66 Resultados

III.6.2. Cro se une de forma específica a la región intergénica cI – cro.

Aunque la función de Cro sería la de unirse a los operadores y de esta

forma impedir que el ciclo lisogénico se lleve a cabo, el análisis de su secuencia de

aminoácidos no reveló un claro motivo de unión a DNA, aunque si presenta alguno

de los residuos esenciales y el polipéptido tiene pI básico.

0

20

40

60

80

100

0 100 200 300 400 500

[NaCl] mM

% D

NA

ret

arda

do e

n el

gel

0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100

[MgCl2 ] mM

% D

NA

ret

arda

do e

n el

gel

0

20

40

60

80

100

0 10 20 30 40 50

DNA no marcado ng

% D

NA

ret

arda

do e

n el

gel

0

20

40

60

80

100

1 100 10000poli d(I-C) ng%

DN

A r

etar

dad

o en

el g

el

A) B)

C) D)

Figura 24: Parámetros implicados en la formación de complejos Cro – DNA detectados porretardo en gel. El parámetro analizado en cada caso se indica bajo la gráfica.

Como un primer paso para profundizar en el análisis de la función de Cro

estudiamos su capacidad de unión al DNA. Para ello incubamos un fragmento de

DNA de 183 pb que contenía la región temprana de control del fago A2, con la

proteína Cro pura en diferentes condiciones experimentales, analizando

posteriormente la mezcla mediante EMSA, para optimizar la reacción, conocer el

tipo de complejos formados y cuantificar la afinidad entre los componentes. La

formación de los complejos se ve inhibida por la presencia de Mg2+ en

Resultados 67

concentraciones superiores a 1 mM (Figura 24A). De igual forma, la reacción se ve

parcialmente inhibida por concentraciones de NaCl superiores a 150 mM (Figura

24B). Por el contrario, la presencia de Tween 20 al 0´1% tiene un efecto positivo en

la formación de los complejos (datos no mostrados).

I

II

DNAlibre

0 5 10 30 60 min

0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100

tiempo (min)

% D

NA

ret

arda

do e

n e

l ge

l

A) B)

Figura 25: Estabilidad de los complejos Cro – DNA en el tiempo. El fragmento intergénico cI– cro (81 pM) se incubó en presencia de Cro (20 nM) durante 15 min (tiempo 0), tras los quese añadió el mismo DNA sin marcar (un exceso de 50 veces). A) Análisis EMSA de lasalícuotas tomadas a distintos tiempos. B) Gráfica de la estabilidad de los complejos en eltiempo.

La especificidad de la unión de Cro a la región intergénica cI – cro se

comprobó determinando la capacidad de moléculas de DNA no marcadas de actuar

como competidores. DNA inespecífico, poli d(I – C), sólo es capaz de inhibir

parcialmente la formación de complejos, incluso a concentraciones que exceden en

4.000 veces la del segmento intergénico (Figura 24C). Sin embargo, cuando el DNA

utilizado en la reacción de competición es específico, es decir, el fragmento de 183

pb sin marcaje radiactivo, se observa rápidamente una reducción de la formación de

los complejos Cro – DNA (Figura 24D). Una concentración 5 veces superior del

competidor específico inhibe totalmente la formación de los complejos. Para

determinar la estabilidad de los complejos Cro – DNA en el tiempo, se realizó una

reacción en condiciones estándar durante 15 min, transcurridos los cuales se añadió

a la mezcla de reacción un exceso de 50 veces de DNA específico no marcado,

incubando esta nueva mezcla durante diferentes tiempos y analizándola mediante

EMSA. La mayor parte de Cro permanece unida al DNA incluso transcurridos 70

68 Resultados

min desde de la adición del competidor no marcado. Sin embargo, existe

aproximadamente un 15% de los complejos inicialmente formados que son

inestables y tienen una vida media inferior a 5 min (Figura 25).

Cro

I

II

DNAlibre

A)

B)

0

20

40

60

80

100

-9 -8 -7 -6

log [Cro] M

% D

NA

ret

arda

do e

n el

gel

Figura 26: Determinación de la afinidad entre la proteína Cro y el segmento intergénico cI –cro. A) Análisis EMSA de los complejos formados en presencia de concentraciones crecientesde Cro (0, 1, 2, 4, 8, 10, 15, 20, 25 y 50 nM). Se indica el DNA libre y los complejos I y II. B)Fracción de DNA unido en presencia de concentraciones crecientes de Cro obtenida porcuantificación de los datos mostrados en A.

La unión de Cro a la región intergénica cI – cro origina dos complejos con

movilidad electroforética retardada (I y II en la Figura 26A). El complejo I se forma

a concentraciones bajas de Cro, mientras que el complejo II se forma

preferentemente a concentraciones mayores de la proteína. Para medir la afinidad de

Cro por sus sitios de unión en el DNA se determinó la tasa de formación del

complejo Cro – DNA en función de la concentración de Cro (Figura 26B). La

gráfica de formación de dichos complejos es lineal, lo que parece indicar que la

unión de Cro a la región intergénica cI – cro no es cooperativa. Para corroborar este

Resultados 69

hecho calculamos el factor de cooperatividad τ, de acuerdo con la ecuación de

Wilson y col. (1993). El valor estimado para la unión Cro – DNA a partir de los

datos de la Figura 26A es de τ = 0´8 ± 0´3, lo que confirma que Cro probablemente

se une al segmento de DNA de forma no cooperativa. De los datos obtenidos por

cuantificación del gel presentado en la Figura 26A se deduce una Kapp de 6 nM a pH

7´5 y 30ºC.

Cro*

I

DNAlibre

0

20

40

60

80

100

-8 -7 -6

log[Cro*] M

% D

NA

ret

arda

do e

n el

gel

A)

B)

Figura 27: Determinación de la afinidad entre la proteína Cro* y el segmento intergénico cI –cro. A) Análisis EMSA de los complejos formados en presencia de concentraciones crecientesde Cro* (0, 1, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 500 y 1000 nM). Se indica el DNA libre y el complejoI. B) Fracción de DNA unido en presencia de concentraciones crecientes de Cro* obtenida porcuantificación de los datos mostrados en A.

Al igual que para la proteína Cro, se determinó la afinidad de Cro* por el

segmento de DNA que contiene la región intergénica cI – cro en función de su

concentración. En este caso únicamente se observa la formación de un complejo

Cro* – DNA con movilidad electroforética retardada (I en la Figura 27A), incluso a

altas concentraciones de proteína (hasta 1 µM). De la gráfica obtenida se puede

deducir una Kapp de 25 nM a pH 7´5 y 30ºC (Figura 27B).

70 Resultados

O1

O2

O3

Cro

O3

O2

O1

Cro

A B

Figura 28: Análisis mediante ensayos de protección a la digestión por DNasa I de loscomplejos Cro – DNA. A) El fragmento SmaI – HindIII (cadena superior) se incubó enpresencia de concentraciones crecientes de Cro (50, 100, 150, 200, 250 y 300 nM). B) Elfragmento XbaI – PstI (cadena inferior) se incubó en presencia de 12´5, 25, 50, 100, 150, 200y 250 nM de Cro. En los extremos de cada autorradiografía se presentan los mismosfragmentos incubados en ausencia de proteína. Se indica mediante barras la posición de losoperadores.

Resultados 71



Figura 29: Esquema de las regiones protegidas por Cro (barras) en la región intergénica cI –cro basado en los datos obtenidos en la Figura 28. Se indican los operadores (flechasenfrentadas), las regiones –10 y –35 (negrita), los inicios de transcripción (asteriscos), elelemento UP (cursiva) y los sitios de hipersensibilidad (flechas verticales).

III.6.3. Cro se une a los operadores del sistema.

Para localizar de una forma precisa la secuencia de nucleótidos de la región

intergénica cI – cro a la que se une la proteína Cro, analizamos los complejos

proteína – DNA mediante un análisis de protección frente a la digestión con DNasa

I. En la cadena superior podemos observar diversas zonas de protección mediada por

Cro, pero básicamente se detectan tres dominios que coinciden con la secuencia de

los operadores O1, O2 y O3 (Figura 28A). En las regiones espaciadoras entre los

operadores se observan varios sitios de hipersensibilidad a la digestión con DNasa I,

especialmente entre O2 y O3, así como en el centro de los operadores. En la cadena

inferior también se observan diferentes zonas de protección que definen los tres

dominios que corresponden a los operadores, separados por sitios de

hipersensibilidad a la digestión con DNasa I (Figura 28B). Los sitios de

hipersensibilidad entre los operadores O2 y O3 están separados por unas 10 ± 1 pb, lo

que corresponde aproximadamente a una vuelta de hélice de DNA en doble cadena

72 Resultados

(Figura 29). Al igual que ocurría con CI, esto significa que el DNA está deformado

debido a la unión de Cro (revisado en Schleif, 1992).

La cantidad de Cro necesaria para la ocupación de los tres sitios de unión es

unas 3 veces mayor que la que se necesita cuando se realizan ensayos de retardo en

gel (150 versus 50 nM). Esto podría ser debido a que la estabilidad de los complejos

Cro – DNA se ve negativamente afectada por el Mg2+, que sin embargo es

absolutamente requerido como cofactor de la DNasa I. En ambas cadenas se observa

una afinidad creciente de Cro por cada uno de los operadores, así en O3 se observa

unión a una concentración de 50 nM, determinada por la aparición del sitio de

hipersensibilidad en el centro del operador, mientras que en O2 se observa este

patrón a 100 nM y en O1 a 150 nM de Cro.

También se analizaron los complejos formados por Cro* con el segmento

de DNA correspondiente a la región intergénica cI – cro, mediante el ensayo de

protección frente a la digestión con DNasa I. En ambas cadenas se observa el mismo

patrón que cuando la proteína presente es Cro, sin embargo la cantidad de Cro*

necesaria para proteger cada uno de los operadores es mayor, 75 nM para proteger

O3, 150 nM para O2 y 225 nM para O1 (datos no mostrados).

III.6.4. Cro inhibe la transcripción a partir de PL.

Como vimos en el apartado III.5.5 el represor CI era capaz de inhibir la

transcripción de cro, y por tanto de reprimir el ciclo lítico, mediante su unión al

operador O2, lo que resultaba en el desplazamiento de la RNAP de la región –35 del

promotor PR. El papel de Cro en los fagos lambdoides es el de reprimir la

transcripción del gen del represor uniéndose a los operadores del sistema. Por lo

tanto, si la proteína codificada por el gen cro del bacteriófago A2 fuese el

antagonista de CI, o lo que es lo mismo el represor del ciclo lisogénico, además de la

capacidad de unión a la región intergénica cI – cro tendría que ser capaz de reprimir

la transcripción de cI a partir del promotor PL mediante su unión a O3.

Para verificar esta hipótesis analizamos la expresión a partir de PL en

presencia de concentraciones crecientes de Cro. Para ello realizamos ensayos de

transcripción in vitro utilizando la σΑ − RNAP de B. subtilis y empleando como

Resultados 73

molde un fragmento de DNA de 390 pb que contiene la región intergénica cI – cro.

En la Figura 30 se puede observar como al aumentar la concentración de Cro

presente en la reacción se produce un descenso progresivo en la transcripción, hasta

que al llegar a una concentración de 2 µM se observa el bloqueo total de la misma.

Cro

PL

Figura 30: Inhibición de la transcripción a partir de PL en presencia de concentracionescrecientes de Cro (0, 250, 500, 1000, 1500 y 2000 nM).

Para descartar la posibilidad de que el efecto pudiera deberse a una unión

inespecífica de la proteína con el DNA o a la presencia de RNasas contaminantes en

la preparación de la proteína, se incubaron concentraciones superiores a las

necesarias para reprimir la transcripción de PL (hasta 4 µM de Cro) en ensayos de

transcripción con un promotor no relacionado [Promotor P1 del plásmido

pSM19035 de Streptococcus pyogenes (Rojo y Alonso, 1995)], no observándose

ningún efecto sobre los niveles de expresión del mismo (datos no mostrados).

74 Resultados

III.6.5. Cro desplaza a la RNAP del promotor PL en la región intergénica cI –

cro.

Puesto que Cro es capaz de reprimir la transcripción de PL mediante la

unión a los operadores de la región intergénica, y teniendo en cuenta que O3 solapa

con la región –35 de PL podría ser que Cro reprimiera la transcripción excluyendo a

la RNAP, mediante impedimento estérico, o bien bloqueando a la polimerasa situada

sobre el promotor de tal modo que ésta no pudiera iniciar la transcripción. Para

comprobar cual de estas dos hipótesis era cierta, realizamos ensayos de competición

entre Cro y la RNAP analizando los complejos resultantes mediante EMSA. Como

se vio en apartados anteriores, la RNAP forma dos complejos con movilidad

electroforética retardada, RPI y RPII (Figura 18).

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Cro31 nM σA-RNAP

RPII

RPI

DNAlibre

II

I

RPI*

I*

Figura 31: Análisis mediante EMSA de la unión de la RNAP a la región intergénica enpresencia de concentraciones crecientes de Cro. El fragmento (calle 1) se incubó en presenciade 31 nM de RNAP (calle 2), 20 nM de Cro (calle 3) y con una concentración de 31 nM deRNAP y concentraciones crecientes de Cro (30, 50, 75, 100, 125 y 150 nM) (calles 4 a 9). Seindica la posición del DNA libre y de los complejos Cro – DNA (I y II), RNAP – DNA (RPIy RPII) y de los posibles complejos ternarios Cro – RNAP – DNA (I* y RPI*).

El ensayo de competición se realizó manteniendo constante la

concentración de RNAP (31 nM) e incrementando la concentración de Cro. A una

concentración aproximada de 30 nM de Cro se observa que disminuye la intensidad

de la banda correspondiente al complejo RPII y se produce un aumento en la

Resultados 75

intensidad de la banda del complejo RPI. Este aumento de intensidad en presencia

de Cro presente en la reacción, podría deberse a la aparición de una nueva banda

(RPI*) correspondiente al complejo ternario DNA – Cro – RNAP que migraría a una

altura similar en el gel a la del complejo RPI. Al seguir aumentando la

concentración de Cro en la reacción se obtienen las bandas correspondientes a los

complejos I y II de Cro. Sin embargo el desplazamiento de la RNAP no es total, ya

que incluso a las mayores concentraciones de Cro empleadas se observa una banda

tenue que correspondería al complejo RPI o RPI*. Además se detecta la aparición de

un nuevo complejo difuso I* con movilidad electroforética intermedia entre los

complejos I y II formados por Cro. Estos resultados se obtienen independientemente

del orden de adición de las proteínas (Figura 31).

Para corroborar la hipótesis de que al aumentar la concentración de Cro en

la reacción se produce un desplazamiento de la RNAP de uno de los promotores,

con la consiguiente aparición del nuevo complejo RPI*, se realizaron nuevas

reacciones de competición las cuales, se analizaron mediante el ensayo de

protección frente a la digestión con DNasa I (Figura 32). El patrón de protección de

la RNAP y Cro se muestra en las Figuras 19 y 28, respectivamente. Al realizar el

ensayo en presencia de una concentración constante de RNAP (31 nM) y

concentraciones crecientes de Cro se observa un patrón de protección que difiere del

obtenido para cada una de las proteínas por separado. A bajas concentraciones de

Cro, la RNAP no altera su patrón de protección en la región en la que se localiza PR,

la cual solapa con el operador O2, sin embargo Cro compite con la RNAP en la

unión al operador O3, que solapa con PL, desplazándola de este promotor. Al

aumentar progresivamente la concentración de Cro presente en la reacción se

observa como la RNAP es desplazada incluso del promotor PR, lo que se pone de

manifiesto por la aparición del patrón característico de hipersensibilidades

originadas por la unión de Cro a los operadores y la desaparición del patrón de la

RNAP (Figura 32). Sin embargo, se aprecia la aparición de nuevas

hipersensibilidades a la digestión con DNasa I en la región espaciadora entre los

operadores, que implicarían que se está produciendo una distorsión en el DNA que

podría estar generada por un nuevo complejo Cro – RNAP – DNA (Figuras 32 y

33).

76 Resultados

Croç 31 nM σA-RNAPèA B C D

PL

UP

PR

O1

O2

O3

Figura 32: Efecto de la presencia de Cro sobre la unión de la RNAP a la región intergénica cI– cro analizado mediante el ensayo de protección a la digestión por DNasa I. El fragmentoXbaI – PstI (cadena inferior) se incubó en presencia de 31 nM RNAP y de concentracionescrecientes de Cro ( 50, 100, 150, 200, 250, 300 y 500 nM). En las calles A y D se presenta elpatrón de protección de RNAP (31 nM) y Cro (500 nM) respectivamente. Calles B y C: Elfragmento se incubó en ausencia de proteínas.

Resultados 77



Figura 33: Esquema de las regiones protegidas por Cro en la región intergénica cI – cro enausencia de RNAP (barras blancas). Con flechas rojas se indican los nuevos sitios dehipersensibilidad detectados en presencia de RNAP y altas concentraciones de Cro basado enlos datos obtenidos en la figura 32. Se indican los operadores (flechas enfrentadas), lasregiones –10 y –35 (negrita), los inicios de transcripción (asteriscos), el elemento UP(cursiva) y los sitios de hipersensibilidad (flechas verticales negras).

Los datos combinados del ensayo de retardo en gel y de protección a la

digestión con DNasa I sugieren que en ausencia de Cro la RNAP interacciona con el

DNA de la región intergénica cI – cro para dar los complejos RPI y RPII. A bajas

concentraciones interaccionaría con PR para dar el complejo RPI para

posteriormente, al ir aumentando la concentración de la proteína, interaccionar con

ambos promotores y formar RPII (Figuras 18 y 19). Sin embargo, en presencia de

bajas concentraciones de Cro la RNAP es desplazada de PL, debido a la mayor

afinidad de Cro por O3, lo que originaría una represión de la transcripción a partir de

este promotor. En esta situación se puede observar una coexistencia de ambas

proteínas en el DNA permaneciendo unido Cro al operador O3 y la RNAP al

promotor PR (Figura 32). Finalmente, si la concentración de Cro continúa

aumentando se produce la unión de la proteína a los otros dos operadores, O1 y O2,

lo que originaría un desplazamiento de la RNAP de PR y consecuentemente una

represión de la transcripción del mismo.

78 Resultados

III.7. IDENTIFICACION DEL OPERON DE LAS PROTEINAS

ESTRUCTURALES DEL FAGO A2.

III.7.1. Composición proteica de los viriones.

Por trabajos previos realizados en nuestro laboratorio (Herrero, 1996) se

determinó que la cápsida del bacteriófago A2 presenta 4 proteínas mayoritarias,

observables tras su separación en SDS – PAGE y posterior tinción con Azul de

Coomasie (Figura 34A), y al menos siete minoritarias que se pusieron de manifiesto

al teñir los geles con plata (Figura 34B). Los tamaños de estas proteínas oscilan

entre 18 y 93 kDa y se denominaron gpA – gpK (Tabla 3).

A B

14

20

30

43

6794

gpA

gpBgpCgpDgpEgpF

gpGgpHgpIgpJgpK

Figura 34: Composición proteica de los viriones del bacteriófago A2. A) Tinción con Azul deCoomasie. B) Tinción con plata. Los patrones de peso molecular se indican en kDa.

Resultados 79

De ellas gpD, gpE y gpF se presentaban en mayor proporción que el resto,

por lo que se postuló que serían las proteínas mayoritarias de la cabeza y la cola de

los viriones.

ProteínaPeso molecularestimado (kDa)

Secuencia amino terminal

gpA 18gpB 22gpC 25gpD 28 ADTAVTTNKKLAKFGASAFEYgpE 35 AVPTDASDAVNAGVKgpF 42 AVPTDASgpG 51 AVPTDASDAVNAGVKgpH 52 GLATEVDPHWADHLLgpI 80 ANLIFGGHKIGSSFLgpJ 90 MKPFYFVDRSLgpK 93

Tabla 3: Composición proteica de las partículas de A2.

Para localizar los genes responsables de la síntesis de estas proteínas se

decidió proceder a la secuenciación de sus extremos amino – terminales, como paso

previo a la generación de sondas específicas. Previamente se purificaron las

partículas virales en gradientes de ClCs y, después de dializar las suspensiones

fágicas, se sometieron a ruptura por un tratamiento de calor (70ºC, 15 min). La

expulsión del DNA de las cabezas provocó la gelificación de la suspensión, que se

licuó de nuevo mediante tratamiento con DNasa I. Las proteínas resultantes se

separaron por SDS – PAGE, se transfirieron a membranas “Inmobilón P”, que se

tiñeron con Azul de Coomasie y las bandas correspondientes a cada polipéptido se

recortaron y se enviaron para realizar la secuenciación de sus extremos amino –

terminales (Tabla 3). De las once proteínas detectadas se pudo obtener la secuencia

de siete. Sorprendentemente, se observó que tres de ellas, (gpE, gpF y gpG),

presentaban el mismo extremo, aunque tuvieran tamaños diferentes, indicando que

80 Resultados

probablemente existía un procesamiento diferencial en su extremo carboxi –

terminal antes o durante su integración en la cápsida o bien constituían formas

multiméricas de la proteína no disociables por el tratamiento con SDS en caliente

mas β – Mercaptoetanol previo a la electroforesis.

A B C

Figura 35: Micrografías electrónicas del bacteriófago A2. A) El bacteriófago A2 antes deltratamiento con calor y DNasa I. B) Fracción enriquecida en cabezas. C) Fracción enriquecidaen colas.

III.7.2. Localización de las proteínas mayoritarias de la cápsida.

La observación al microscopio electrónico de las suspensiones de fagos

tratadas con calor reveló que este tratamiento no destruye las cápsidas, sino que

separa cabezas y colas permitiendo la liberación al medio del DNA empaquetado en

las cabezas. Así pues, nos planteamos separar ambas estructuras y para ello

realizamos un gradiente continuo de glicerol que permitió la obtención de fracciones

relativamente puras de cabezas (Figura 35B), y fracciones conteniendo

mayoritariamente colas, aunque contaminadas con restos de cabezas (Figura 35C).

Resultados 81

El análisis mediante SDS – PAGE de estas fracciones reveló la presencia

mayoritaria de las proteínas gpE y gpF y la desaparición de gpD en las

preparaciones conteniendo cabezas, mientras que en las fracciones que contenían

mayoritariamente colas gpD aparecía en mayor proporción (Figura 36). Estos

resultados parecen indicar que gpD sería el componente principal de las colas

mientras que gpE y gpF serían las proteínas mayoritarias de la cabeza.

A B C D E F

gpDgpE

gpF

Figura 36: Análisis por SDS – PAGE de las fracciones, obtenidas por gradiente de glicerol,conteniendo mayoritariamente colas (calles A y B) y cabezas (calles C y D). Calle E: Patronesde peso molecular. Calle F: Patrón de proteínas de la cápsida de A2.

III.7.3. Localización de los genes estructurales en el genoma del fago.

A partir de los extremos amino – terminales de las proteínas de la cápsida,

se obtuvieron una serie de oligonucleótidos específicos correspondientes a las

diferentes posibilidades de codificación en el DNA para la secuencia de aminoácidos

conocida para la proteína gpH (5’ – GCIACIGARGTIGAYCCICA – 3’) y para las

proteínas gpE, gpF y gpG (5’ – GAYGCITCIGAYGCIGTIAAYGG – 3’). La

mezcla de oligonucleótidos sintética se marcó radiactivamente y se utilizó como

sonda para hibridar con el DNA del fago A2 digerido con diversos enzimas de

restricción. Este DNA digerido se separó en un gel de agarosa (Figura 37A) y se

transfirió a membranas de Nylon. De este modo se localizaron los segmentos

82 Resultados

codificantes para ellas, de tal forma que durante su secuenciación y la de las

regiones genómicas adyacentes pudieron detectarse los genes responsables de la

síntesis de las proteínas estructurales del fago.

Así por ejemplo, la proteína de 28 kDa, gpD, está codificada por un gen

localizado en un fragmento EcoRI de 5´4 kb (Herrero, 1996; Figura 38). Mientras

que la sonda correspondiente a la proteína gpH dio una señal que correspondió al

fragmento EcoRI de 2´7 kb (Figura 37B). Basándonos en estos resultados y en la

localización de otras proteínas en el genoma fágico decidimos secuenciar la región

comprendida entre el extremo izquierdo del genoma (fragmento EcoRI 2´7 kb) y el

centro del mismo (fragmento EcoRI 7´5 kb) y de esta forma completar las

secuencias parciales que ya conocíamos en esta región (García y col., 1997; Herrero,

1996; Figura 2).

A B

Bam

HI

Bgl

II

Xho

I

Eco

RV

Eco

RI

Bam

HI

Bgl

II

Xho

I

Eco

RV

Eco

RI

8´98´17´5

5´4

4´13´4

2´7

Figura 37: Localización del gen responsable de la síntesis de gpH. A) Gel de agarosa en elque se separaron los fragmentos correspondientes a la digestión del genoma de A2 con lasendonucleasas de restricción BamHI, BglII, XhoI, EcoRV y EcoRI. Junto a los fragmentosgenerados por esta última se indican sus tamaños (en kb). B) Resultado de la hibridación deloligonucleótido diseñado para gpH sobre los fragmentos de DNA transferidos desde el gelmostrado en A.

Resultados 83

84 Resultados

Para la obtención de la secuencia correspondiente a esta región se procedió

a la clonación y subclonación en pUC18 de fragmentos generados con diferentes

endonucleasas de restricción. En aquellos casos en los que fue necesario se

diseñaron oligonucleótidos específicos, se amplificaron fragmentos de DNA

mediante PCR que fueron secuenciados directamente, o se secuenció el DNA del

fago de forma directa, especialmente para confirmar la continuidad de la secuencia

en los casos de clones adyacentes no solapantes. El ensamblaje de las secuencias

obtenidas mediante el programa “Gelassamble” permitió obtener una secuencia

continua en ambas cadenas de 16.908 pb (Anexo 2), que abarca desde el sitio EcoRI

adyacente a los extremos cohesivos (fragmento EcoRI de 2´7 kb) hasta el sitio

EcoRI solapante con los genes del sistema lítico, localizados previamente en el

fragmento EcoRI de 7´5 kb (Herrero, 1996; Figura 38).

III.7.4. Análisis de la secuencia de nucleótidos.

El análisis de la secuencia mediante el programa “Frame” reveló la

presencia de 16 pautas abiertas de lectura, tomando como indicador de la presencia

de una pauta regiones que codificaran para polipéptidos de un tamaño mínimo de 50

aminoácidos, la existencia de un codón de inicio (ATG o GTG) y la presencia de

hipotéticos sitios de unión al ribosoma. Todas las orfs encontradas bajo estos

criterios se localizaban en la misma cadena. Las posibles pautas abiertas de lectura

se denominaron en función de que correspondiesen a una de las proteínas

estructurales a las que se había secuenciado el extremo amino – terminal, o en

función del número de aminoácidos que codificaban (Tabla 4).

El contenido total de G + C de la secuencia es de un 45´4%, lo que está de

acuerdo con el valor obtenido para el resto del genoma de A2 conocido (45%). Este

valor es ligeramente menor si consideramos la tercera posición de los codones en las

regiones codificantes (41´3%).

Las principales características de la secuencia se reflejan en la Tabla 4. En

todas las pautas abiertas de lectura el codón de inicio es un ATG, excepto en el caso

de orfI que es un GTG. Por delante de todos ellos se localiza una secuencia rica en

purinas, parcialmente complementaria al extremo 3´ – OH del rRNA 16S de

Resultados 85

86 Resultados

Lactobacillus casei (Nakagawa y col., 1995; Tabla 4) que podría actuar como un

posible sitio de unión al ribosoma, a una distancia de 6 ± 2 nucleótidos. El codón de

parada menos frecuente fue TAG (2 ocasiones), mientras que los codones TAA y

TGA se encontraron en 7 ocasiones cada uno de ellos. El 88% de la secuencia total

es codificante, encontrándose varias orfs que podrían tener un acoplamiento

traduccional al detectarse un solapamiento entre el codón de parada de una de ellas y

el codón de inicio o el RBS de la siguiente. De esta forma las pautas abiertas de

lectura orf146, orf128 y orf114 por un lado, y orf563, orf486, orfI y orf156 por otro,

se traducirían de forma coordinada. Existe además un caso, orfH y orf209, en el que

las pautas solapan en 15 aminoácidos (Figura 38, Tabla 4 y Anexo II).

III.7.5. Análisis de la secuencia de aminoácidos.

El análisis de las secuencias aminoacídicas deducidas a partir de la

secuencia de nucleótidos de las diferentes orfs permitió la localización de los

extremos amino – terminales obtenidos por secuenciación de las proteínas gpD, gpE,

gpF, gpG, gpH, gpI y gpJ. De esta forma, se pudo adscribir a estas pautas abiertas de

lectura la codificación de dichas proteínas estructurales. En los casos de gpD, gpI y

gpJ la metionina inicial se encuentra ausente, lo que indica que sufre un

procesamiento post – traduccional. Las proteínas gpE, gpF y gpG están codificadas

por el mismo gen, orfEFG, localizándose el extremo amino terminal de las mismas

en el codón 123 de dicho gen, lo que implica la existencia de un proceso proteolítico

de maduración. Este gen codificaría una proteína de 400 aminoácidos que se

procesaría para dar lugar a dos polipéptidos. El menor de ellos correspondería al

extremo amino de la misma, tendría un peso molecular estimado de 13´9 kDa y un

pI de 6´31, mientras que el extremo carboxi – terminal correspondería a un

polipéptido de 277 residuos con un peso molecular estimado de 29´7 kDa y un pI de

4´85. Este último polipéptido correspondería a la proteína mayoritaria de la cabeza.

La masa molecular estimada a partir de los geles de poliacrilamida para las proteínas

gpE, gpF y gpG (35, 42 y 51 kDa, respectivamente) indicaría que la primera

correspondería al monómero y que gpF y gpG serían multímeros de aquella. El

extremo amino terminal de la proteína gpH se localizó a cinco aminoácidos del

Resultados 87

inicio de traducción de orfH, lo que nuevamente indica la existencia de un

procesamiento proteolítico de maduración.

Se intentó adscribir una función a cada uno de los productos génicos

codificados por el resto de las orfs mediante el análisis de los posibles motivos

encontrados en las mismas, y la búsqueda de homologías con otras proteínas ya

caracterizadas y depositadas en las bases de datos utilizando los programas BLAST

y FASTA.

Los productos de las pautas orf146, orf128, orf73, orf156, orf107 y orf116 no

presentaron homología significativa con ninguna de las proteínas depositadas en las

bases de datos. El producto de orf114 presentó homología (49% similaridad) con la

Orf32, de función desconocida del bacteriófago φ105 de Bacillus subtilis

(Kobayashi y col., 1998). Las principales homologías encontradas para el resto de

las Orfs se describen a continuación:

- gpH: mostró homologías significativas con las proteínas portales o

conectoras de los bacteriófagos φPVL de Staphylococcus aureus (47% de

similaridad) (Kaneko y col., 1998), DT1 de Streptococcus thermophilus (42% de

similaridad) (Tremblay y Moineau, 1999), HK97 de E. coli (42% de similaridad)

(Duda y col., 1995a) y D3 de Pseudomonas aeruginosa (41% de similaridad)

(Gilakjan y Kropinski, 1999).

- Orf209: presentó homología con proteínas fágicas de función desconocida,

siendo la mas importante de éstas (48% de identidad) con la Orf26 del bacteriófago

φ105 de B. subtilis (Kobayashi y col., 1998). También presentó homología (32% de

identidad) con una posible proteasa del bacteriófago φC31 de Streptomyces (Smith y

col., 1999).

- OrfEFG: Como se ha indicado anteriormente el producto de orfEFG, se

procesa proteolíticamente para dar lugar a dos péptidos, el correspondiente al

extremo amino – terminal tiene un tamaño de 123 aminoácidos, mientras que el

correspondiente al extremo carboxi – terminal tiene un tamaño de 277 aminoácidos.

Este último polipéptido correspondería a la proteína mayoritaria de la cabeza. La

región amino – terminal, que se liberaría por el proceso de proteolisis, presenta una

estructura en forma de hélice alfa en la que se localiza un dominio de cremallera de

leucinas (“Leucine zipper”). Este extremo presenta una gran abundancia de residuos

88 Resultados

cargados (49 de 123) especialmente si consideramos la región de la molécula con

estructura de hélice alfa (35 de 75) y en ambos casos las cargas se reparten al 50%

entre positivas y negativas. Este polipéptido no presentó homología con ningún otro

presente en las bases de datos. Basándonos en sus propiedades estructurales, además

de en el orden funcional de los genes implicados en el ensamblaje de la cabeza,

donde la proteína de andamiaje precede a la mayoritaria de la cabeza en la mayoría

de los genomas de los fagos de dsDNA estudiados hasta ahora (Georgopoulos y col.,

1983; Eppler y col., 1991; Hatfull y Sarkis, 1993) o se origina, por un corte

proteolítico, a partir de la misma (Duda y col., 1995 a, b y c; Desiere y col., 1999),

postulamos que éste polipéptido podría constituir la proteína de andamiaje del

bacteriófago A2. La proteína mayoritaria de la cabeza mostró homologías con

proteínas estructurales fágicas, incluyendo la proteína mayoritaria de la cabeza de

los bacteriófagos DT1, 22% de identidad, (Tremblay y Moineau, 1999), y φSfi21,

22% de identidad, (Desiere y col., 1998) de Streptococcus thermophilus y el

bacteriófago φadh de Lactobacillus gasseri, 24% de identidad, (Altermann y col.,

1999). En estos dos últimos fagos la homología se obtiene con la proteína madura,

ya que en ambos la proteína mayoritaria de la cabeza sufre un proceso de

maduración por corte proteolítico en el que se libera el extremo amino – terminal.

- gpD: La secuencia de esta proteína ya se había obtenido anteriormente

(Herrero, 1996), comprobándose que correspondía a gpD y que la metionina inicial

es procesada para dar una proteína madura de 201 aminoácidos. Esta proteína resultó

ser la proteína mayoritaria de la cola y presentó homología en las bases de datos con

proteínas de función desconocida de los bacteriófagos φ105 y φPVL.

- Orf465: La proteína deducida a partir de la secuencia de esta orf presentó

homología con la proteína gpT, 23% de identidad, del bacteriófago P2 de E. coli.

Dicha proteína se encuentra en la cola del virión de P2 y está posiblemente

implicada en la determinación de la longitud de la misma (Christie y col., 1998).

Igualmente se parece a la proteína G, 22% de identidad, componente estructural de

la cola del bacteriófago φ186 de E. coli (Xue y Egan, 1995).

- Orf563: Su secuencia aminoacídica presentó homología con proteínas

minoritarias de la cápsida de distintos bacteriófagos y con la proteína H del

bacteriófago lambda, 21% identidad, que es un determinante de longitud de la cola,

Resultados 89

además de iniciar la polimerización de las mismas (Casjens y Hendrix, 1988). Por

otro lado, mostró homología con las cadenas pesadas de la miosina de diferentes

organismos.

- Orf486: Este polipéptido presentó homología, 26% de identidad, con un

componente estructural, Orf15, de la cola del bacteriófago DT1 de S. thermophilus

(Tremblay y Moineau, 1999).

- gpI: Presentó homología con proteínas estructurales minoritarias de la cola

de los bacteriófagos φSfi11 (26% de identidad en 100 aminoácidos) y DT1 (30% de

identidad en 85 aminoácidos) de S. thermophilus (Lucchini y col., 1998; Tremblay y

Moineau, 1999).

- gpJ: Presentó homología con proteínas estructurales de diversos

bacteriófagos, muchas de ellas identificadas como componentes de la cola,

incluyendo la Orf18 del bacteriófago DT1, 24% de identidad, posiblemente

implicada en la especificidad de huésped (Tremblay y Moineau, 1999) y un probable

anti – receptor del bacteriófago φSfi21, 30% de identidad en 689 aminoácidos

(Desiere y col., 1999). En la región central de esta proteína destaca la presencia de

13 repeticiones de un motivo similar al colágeno de la forma (Gly – X – Y)n

distribuidas en 3 segmentos. La presencia de este tipo de secuencias ha sido descrita

en los genes implicados en la especificidad de hospedador de varios bacteriófagos

(Smith y col., 1998) y aunque no está establecida su función se cree que podría jugar

un papel en la generación aleatoria de diversidad por recombinación (Lucchini y

col., 1999b).

La baja homología, a nivel de secuencia, detectada para la mayoría de los

productos codificados por genes fágicos ha hecho que diversos autores postulen la

realización de un análisis comparativo entre genomas fágicos basándose en la

posición, tamaño y punto isoeléctrico de dichos productos como una herramienta

eficaz a la hora de determinar la posible función de los diferentes genes identificados

(Chandry y col., 1997; Altermann y col., 1999), debido a que estas propiedades

suelen estar mejor conservadas que la secuencia de nucleótidos e incluso que la de

aminoácidos (Casjens y col., 1992). Para realizar este análisis comparativo de la

región génica que codifica las proteínas estructurales en el bacteriófago A2 se

90 Resultados

seleccionaron las regiones equivalentes de tres bacteriófagos (Figura 39). El

bacteriófago λ (Hendrix y col., 1983) se seleccionó debido a que es el sistema

biológico mejor estudiado. Dentro de los fagos de bacterias lácticas se seleccionaron

los fagos φSfi21 (Desiere y col., 1999) y φadh (Altermann y col., 1999) debido a que

sobre el primero se han realizado múltiples estudios comparativos de su genoma con

el de otros fagos relacionados y el segundo por ser uno de los pocos fagos, que

infectan a lactobacilos, que han sido secuenciados en su totalidad. Al analizar el

alineamiento de los genomas vemos que existe una gran similitud en la región

correspondiente a las proteínas de la cabeza y las implicadas en la unión cabeza cola

(Figura 39), tanto en número de genes como en el tamaño y punto isoeléctrico de los

localizados en posiciones similares. Sin embargo, esta correlación disminuye al

comparar la región correspondiente a las proteínas de la cola. De esta forma se

corrobora la posible función asignada por homología de secuencia para la proteína

portal (codificada por orfH), la proteasa (orf209) y la proteína mayoritaria de la

cabeza (orfEFG). Por otro lado, los productos correspondientes a orf146, orf128 y

orf114, que no habían mostrado homología con otras proteínas, serían los

responsables de la unión cabeza – cola en la partícula fágica madura. Dentro de las

proteínas de la cola parece corroborarse la implicación de gpJ en la especificidad del

hospedador, o al menos, en el reconocimiento de alguna estructura necesaria para el

inicio de la infección, puesto que si bien el tamaño es algo menor que el de las

proteínas correspondientes de los bacteriófagos λ y φSfi21, los puntos isoeléctricos y

la posición en los genomas son similares (Figura 39). Las dos orfs que mostraron

homología con determinantes de longitud de la cola de diferentes fagos se

encuentran en una posición equivalente y tienen unos valores parecidos de pI a los

de la proteína H del bacteriófago lambda, por lo podrían estar implicadas en dicho

proceso. Para el resto de las proteínas estructurales no se puede asignar una función

concreta, exceptuando claro está a la proteína mayoritaria de la cola gpD.

Resultados 91

92 Resultados

1209060300

11´61´92´8

5´37´4

min

Figura 40: Análisis mediante "Northern" del patrón de transcripción del gen orfEFG duranteel ciclo de infección de A2 en Lactobacillus casei 393. Se indica la posición y tamaño (en kb)de los marcadores de peso molecular.

III.7.6. Expresión de los genes estructurales.

Para profundizar en el conocimiento de los genes estructurales analizamos

su patrón de expresión dentro del ciclo de infección de A2. Para ello realizamos

diversas hibridaciones tipo “Northern” utilizando como sondas fragmentos de DNA

correspondientes a las pautas orfEFG, orfD, orf563 y orfJ. Todas ellas hibridaron

con un mRNA de un tamaño aproximado de 17 kb. Este transcrito se detecta a los 60

minutos post – infección y permanece hasta el final del ciclo lítico (Figura 40). El

extremo 5´ de este mRNA debería iniciarse por encima del gen que codifica para la

subunidad pequeña de la terminasa, orf3, ya que al utilizar este gen como sonda se

obtiene un transcrito de igual tamaño y que se expresa a los mismos tiempos (García

Resultados 93

y col., 1997). Estos resultados parecen indicar que los genes estructurales se

transcriben de forma conjunta como un único operón y que el mRNA resultante

atravesaría la región correspondiente a los extremos cohesivos, por lo que se debe

producir cuando el genoma fágico esté circularizado y/o formando concatémeros.

Discusión 95

IV. DISCUSION.

La contaminación por bacteriófagos representa el mayor problema con el

que se enfrentan las empresas que producen derivados lácteos para llevar a cabo

fermentaciones eficaces. Uno de los principales métodos que se utilizan para limitar

el desarrollo de los fagos en la fabricación comercial es la rotación de las cepas que

constituyen los cultivos iniciadores. Sin embargo, en la actualidad esta estrategia

presenta problemas debido a que las rotaciones prolongadas en las que participan

varias cepas incrementan el nivel y la diversidad de fagos contaminantes en la planta

procesadora y, por tanto, el potencial genético para que puedan emerger nuevos

fagos por recombinación. En los casos de cultivos monocepa se aumenta la

probabilidad de pérdida total de la producción en caso de infección fágica (Sing y

Klaenhammer, 1993). La aplicación de nuevos conocimientos sobre la genética y el

desarrollo de los bacteriófagos y de las cepas hospedadoras servirá para minimizar

las pérdidas de fabricación causadas por éstos. En el futuro, nuestra capacidad de

utilizar en la industria alimentaria cepas muy especializadas dependerá de la

disponibilidad de estrategias de defensa frente a los fagos, que puedan protegerlas de

forma continuada y a largo plazo. El estudio del ciclo de desarrollo de los

bacteriófagos desde un punto de vista molecular podría tener una repercusión

importante en la mejora de las fermentaciones industriales. La secuenciación de

diversos genomas pertenecientes a bacteriófagos que infectan bacterias del ácido

láctico, pertenecientes a géneros muy diferentes entre si, ha contribuido a un avance

en el conocimiento de su biología, así como a la comprensión de las relaciones

filogenéticas existentes entre ellos. El fago A2, aislado a partir de suero del queso

artesano Gamoneu, se eligió como objeto de estudio debido a que es temperado y

posee extremos cohesivos, propiedades interesantes para el posible desarrollo de

herramientas genéticas derivadas del mismo. Además, el fago infecta a

Lactobacillus casei ATCC 393, cepa de referencia en la industria por su capacidad

acidificante y por ser productora de diacetilo.

En esta Tesis se ha abordado el estudio de dos regiones del genoma del

fago A2, con la intención de diseñar estrategias futuras de defensa frente a la

96 Discusión

infección. Así, se han conseguido transformantes totalmente resistentes mediante la

expresión estable del represor del ciclo lítico en cepas previamente sensibles.

Ciertamente, las construcciones descritas en la presente memoria necesitaban un

cierto refinamiento, tendente a eliminar las secuencias procedentes de bacterias no

GRAS y los genes de resistencia a antibióticos de los vectores antes de poder ser

utilizadas como iniciadores en fermentaciones alimentarias. Los primeros pasos en

esta dirección ya han sido dados, mediante la introducción del sistema de la

resolvasa en los vectores integrativos que portan el gen cI y que tras su inserción en

el genoma del hospedador eliminan todas las secuencias que no pertenecen a A2

(Martín y col., 2000). Igualmente el estudio de la región correspondiente al operón

de las proteínas estructurales esperamos que nos permita localizar el promotor

responsable de la expresión tardía, como paso previo a la generación de sistemas

inducibles de suicidio celular.

IV.1 EL CONMUTADOR DE CICLO DEL BACTERIOFAGO A2.

Un bacteriófago temperado puede existir en uno de dos estados: como

parásito intracelular activo llevando a cabo el ciclo lítico o atenuado como profago,

en un ciclo lisogénico. En el caso de los colifagos del tipo lambda, la decisión de

seguir y/o permanecer en uno u otro ciclo depende de un conmutador transcripcional.

El paso a estado de profago, y su posterior estabilización, requieren que el

conmutador esté posicionado en el modo lisogénico, mediante la represión de los

genes líticos mediada por el represor CI. Contrariamente, la proteína Cro permite la

transcripción de los genes del ciclo lítico al reprimir la transcripción del represor a

partir del promotor PRM, posicionando de este modo el interruptor transcripcional en

modo lítico (Johnson y col., 1981).

Para determinar si en el fago A2 existía un mecanismo de regulación

semejante se intentó localizar el gen del represor del ciclo lítico basándonos en dos

propiedades generales de estas proteínas: no son necesarias para seguir el ciclo lítico

y son indispensables para el ciclo lisogénico. Así pues, los mutantes con este gen

delecionado podrán propagarse pero no lisogenizar a la cepa hospedadora. Estas dos

Discusión 97

características eran compartidas por los mutantes cuyas deleciones se localizaban en

la región central del genoma de A2 (Figura 3B).

La secuencia de dicha zona reveló que presentaba un porcentaje de G + C

del 43%, es decir está dentro del rango de los genes secuenciados en especies de

Lactobacillus, que va desde el 36% de Lactobacillus acidophilus hasta el 50% de

Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, situándose en un 46% para

Lactobacillus casei (Kandler y col., 1986). Este porcentaje se reduce al analizar el

contenido G + C en la tercera posición de los codones de las regiones codificantes

(36%), llegando a un 17% si consideramos la tercera posición de los 10 primeros

codones de cada orf. Este fenómeno es común a todas las especies de Lactobacillus y

podría interpretarse como un mecanismo para evitar la formación de estructuras

secundarias en las regiones 5´ de los mRNA, que podrían dificultar el inicio de la

traducción (Pouwels y Leer, 1993).

La organización estructural de la región presentaba similitudes evidentes

con la correspondiente al conmutador de ciclo del fago λ (Patshne, 1992). Así,

aparecían pautas de lectura con orientaciones divergentes de transcripción. Los

productos de los genes cI y cro mostraban homologías significativas con los

represores homónimos de otros fagos, así como un tamaño (224 y 81 aminoácidos,

respectivamente) semejante al de aquellos. Adicionalmente, los promotores de la

región intergénica presentaban tres repeticiones invertidas semejantes (de 20 pb cada

una) en un segmento de DNA relativamente corto (161 pb), lo que recuerda a los

operadores descritos para el conmutador de lambda. Aparte de los genes anteriores,

se encontraron dos nuevas pautas de lectura, orfX y ant, localizadas inmediatamente

detrás de los genes cI y cro, respectivamente, que se transcribían en conjunción con

ellos y además en el caso de ant solapaba con el final de cro. Aunque no se ha hecho

ningún estudio sobre la función de los hipotéticos productos de estos dos genes, las

características indicadas, la semejanza de su localización respecto a los genes

auxiliares de otros bacteriófagos, como BK5–T o φSfi21 (Boyce y col., 1995a;

Bruttin y Brüssow, 1996), y la homología entre Ant y el antirrepresor del

bacteriófago P1 (Riedel y col., 1993) podrían indicar que juegan algún papel en la

decisión lisis / lisogenia del bacteriófago A2.

98 Discusión

Los dos promotores divergentes de la región intergénica que denominamos

PL y PR son funcionales simultáneamente como se pudo comprobar mediante

experimentos de transcripción “in vitro”. Al contrario de lo observado en el fago

lambda (Ptashne, 1992), el promotor localizado por delante del gen cI, PL, no

necesita la presencia de la proteína CI para transcribirse, sino que es constitutivo,

aunque presenta una transcripción que es al menos 10 veces menor que la observada

en las mismas condiciones para el promotor del ciclo lítico PR. La localización de los

puntos de inicio de la transcripción, el análisis de la secuencia de estas regiones

promotoras y los estudios de protección de la digestión con DNasa I por la σA –

RNA polimerasa de Bacillus subtilis nos ha permitido identificar las regiones

consenso típicas de los promotores vegetativos procariotas en cada uno de ellos,

ambos tienen unas regiones –10 y –35 canónicas separadas por una región

espaciadora de 17 pb. En esta región se detectó la presencia del dinucleótido TG

separada por una base del elemento –10. Este motivo, región –16, está presente en

algunos promotores de E. coli, formando los denominados promotores –10

extendidos, que se caracterizan porque carecen de una región –35 consenso. En estos

promotores es suficiente la presencia de este dinucleótido para permitir la

transcripción (Belyaeva y col., 1993; Voskuil y col., 1995). En bacterias gram

positivas, a diferencia de lo observado en E. coli, además del motivo TG aparece la

región –35 consenso, y en este grupo de bacterias parece tener importancia en la

determinación de los niveles de transcripción (Jensen y Hammer, 1988; Voskuil y

Chambliss, 1998). Esta región –16 se ha detectado en aproximadamente el 45% de

los promotores de B. subtilis, y sería importante para modular la actividad

transcripcional e indispensable para asegurar la correcta expresión de estos genes

(Helmann, 1995; Voskuil y Chambliss, 1998). En el promotor PR está presente,

además, el denominado elemento UP. Este elemento, al cual se une la subunidad α

de la RNAP, se ha localizado en promotores con altos niveles de transcripción,

como son los correspondientes a los genes que codifican los RNA ribosomales,

habiéndose demostrado que es precisamente este elemento el que confiere la

capacidad de transcribir a altas tasas (Ross y col., 1993; Busby y Ebright, 1994;

Fredrick y col., 1995; Ross y col., 1998). Recientemente se ha descrito una

secuencia consenso para este elemento UP (Estrem y col., 1998), la cual se

Discusión 99

encuentra en el promotor PR. Esta podría ser la explicación a la diferencia observada

en los niveles de expresión entre los promotores PR y PL, ya que para el resto de las

regiones importantes en la modulación de la transcripción (regiones –10, –16,

espaciadora y –35) los dos se ajustan bien a las secuencias consenso descritas y no

existen grandes diferencias entre ellos.

Mediante análisis “Northern” pudimos comprobar que PL es el promotor

del ciclo lisogénico al ser responsable de la transcripción del gen del represor, cI, y

de orfX, mientras que PR sería el promotor temprano del ciclo lítico al transcribir los

genes cro, ant y el módulo de replicación del fago. Estos datos se complementan con

los que indican que CI reprime la transcripción de PR, mientras Cro hace lo mismo

con PL. Al analizar la presencia de transcritos específicos en función de los datos

obtenidos de la curva de desarrollo en un paso del fago, eclipse 100 min y latencia

120 min (Herrero y col., 1994), vemos que cro y el resto de los genes

correspondientes al operón comienzan a expresarse a tiempos tempranos, y que, el

mRNA resultante del mismo permanece en la célula hasta el final del ciclo infectivo.

Este resultado sorprende un poco, puesto que está descrito que los productos de los

genes tempranos interfieren en el desarrollo de las fases tardías del ciclo infectivo,

por lo que suele existir un mecanismo de represión de dichos promotores tempranos

(Friedman y Gottesman, 1983), que se activa coincidiendo con el cambio de fase en

el ciclo lítico y que se une a une vida media corta de los mRNA tempranos

(Rodríguez y col., 1988; Suárez y col., 1992). En el caso del bacteriófago A2 este

mecanismo no parece existir, ya que los genes de replicación se expresan a lo largo

de todo el ciclo lítico. Sin embargo, este fenómeno no es un hecho aislado, puesto

que se ha detectado en el bacteriófago r1t que infecta a Lactococcus lactis (Franke –

Fayard y col., 1999).

Ambos promotores dan lugar a varios transcritos, entre los genes cI y orfX

se encontró un posible terminador de la transcripción, lo que podría explicar la

generación de los dos transcritos a partir de PL e implica que dicho terminador no es

lo bastante eficiente como para detener la transcripción completamente. La

existencia de terminadores ineficientes permite una mayor versatilidad de expresión

y regulación génica, especialmente en los bacteriófagos, ya que a partir de un único

promotor se pueden transcribir varias proteínas de forma coordinada, pero variando

100 Discusión

las proporciones de cada una de ellas. En este caso vemos como tanto a partir de PL

como de PR se produce este hecho obteniéndose mas cantidad de mRNA susceptible

de ser traducido de los genes reguladores tempranos, cI y cro, que del resto de genes

transcritos (por ejemplo las proteínas de replicación).

El concepto de interruptor transcripcional se emplea en situaciones en las

que dos o mas promotores comparten una región reguladora de forma que la

expresión de uno de ellos reprime la actividad de los otros o viceversa (Pérez –

Martín y col., 1994). Los promotores implicados en el interruptor pueden estar

organizados de forma divergente o en tandem. La disposición divergente de los

promotores es una estrategia muy común de regulación de la transcripción tanto en

bacterias como en sus bacteriófagos (revisado en Beck y Warren, 1988), ya que

permite una regulación diferencial de los niveles de expresión, especialmente en el

caso de que las proteínas que se originen a partir de la traducción de los genes

correspondientes actúen como moduladores de su expresión, convirtiéndose

entonces en un interruptor genético altamente sensible. El caso mas conocido de esta

organización es el conmutador de ciclo del bacteriófago lambda (Johnson y col.,

1981; Ptashne, 1992).

En todos los sistemas de este tipo descritos en procariotas los promotores se

localizan en caras diferentes del DNA o bien tienen un cierto grado de solapamiento

(Reznikoff y col., 1987). En general, la curvatura inducida por una proteína

represora en su sitio diana tiene un sentido opuesto al que necesitaría la RNAP unida

al promotor para formar un complejo activo transcripcionalmente (Zwieb y col.,

1989). Así pues, la disposición estructural hace que la curvatura inducida por el

represor le ayude a bloquear la transcripción a partir del promotor antagonista. Sin

embargo, en el caso del bacteriófago A2 no puede existir un mecanismo que

implique una curvatura en el DNA para ayudar a la represión de uno de los dos

promotores, puesto que ambos se localizan en la misma cara del DNA, y la

curvatura inducida será por tanto en la misma dirección que necesitaría la RNAP

para transcribir. Por otro lado, hay que recordar que los promotores no son

solapantes. Estos dos hechos hacen peculiar al conmutador genético del bacteriófago

A2 y por tanto lo dotan de un gran interés biológico.

Discusión 101

Las tres repeticiones invertidas espaciadas entre los promotores PR y PL se

corresponden con los operadores del conmutador genético y los denominamos O1,

O2 y O3 por su analogía con los operadores del bacteriófago lambda. La secuencia de

cada uno de ellos, de 20 pb con un eje central de simetría, difiere ligeramente de la

del resto (Figura 9). Este hecho es importante, ya que nuevamente por analogía con

el bacteriófago lambda, estas diferencias podrían explicar los distintos grados de

afinidad de CI y Cro por cada operador, constituyendo así un elemento básico para

el correcto funcionamiento del conmutador de ciclo (Ptashne, 1992).

De todo lo anterior se deduce que la organización general del conmutador

genético del bacteriófago A2 es muy similar, a pesar de las diferencias a nivel de

transcripción, a la encontrada en bacteriófagos bien estudiados como lambda o P22

(Jonhnson y col., 1981; Poteete y Ptashne, 1982), aunque en estos fagos en

particular los operadores están distribuidos de forma uniforme. Sin embargo, se han

caracterizado sistemas similares en otros bacteriófagos en los que, al igual que en

A2, los operadores se encuentran espaciados de forma asimétrica como ocurre con

HK022 o φ80 (Carlson y Little, 1993; Ogawa y col., 1988 b). Otra peculiaridad del

conmutador genético de A2 es que las distancias relativas entre los diferentes

elementos que lo componen son mucho mayores que en los fagos lambdoides

caracterizados, así la región intergénica cI – cro tiene 161 pb, mientras que en

lambda es de 100 pb (Figura 41). El tamaño de la región intergénica es posible que

sea aun mayor en otros bacteriófagos de bacterias lácticas, como BK5–T o φadh

(véase capítulo I.2.3.2 de la Introducción) en los que es de 257 y 436 pb

respectivamente (Boyce y col., 1995 b; Engel y col., 1998) aunque en estos

bacteriófagos no se ha caracterizado la funcionalidad del conmutador genético y su

naturaleza es solo hipotética.

IV.2. CARACTERISTICAS Y FUNCION DE CI.

La proteína codificada por el gen cI presentó las características

estructurales y funcionales típicas de los represores de bacteriófagos, es decir

homología de secuencia con represores de otros bacteriófagos, un motivo hélice α –

giro – hélice α de unión a DNA en su extremo amino – terminal, un motivo de corte

102 Discusión

para la proteasa RecA, en su extremo carboxi – terminal y su patrón de

transcripción. El gen cI se transcribe durante el periodo temprano del ciclo lítico y

en derivados lisogénicos. Ahora bien, la prueba definitiva de que CI es el represor

del ciclo lítico del fago A2, vino dada por su capacidad de conferir resistencia a la

superinfección por A2 a clones de Lactobacillus casei en los que se introdujo el gen

cI. Dichos clones constituyen una primera generación de cepas que han mostrado su

aptitud tecnológica. Así, son capaces de coagular la leche en presencia del

bacteriófago A2 dando lugar a una cuajada con las mismas características de

elasticidad y capacidad de desuerado que la que produce la cepa parental o la que

contiene únicamente el vector integrativo pEM40 en ausencia de fago (Alvarez y

col., 1999).

croPR

cIPRM

-3 5 -3 5-10 -10

OR3 OR1OR2

17 17 17

24 25

42

6 7

OR3 OR1OR2

PRM PR

-10 -10

O3 O1O2

cI

cro-35 -35

PL

PR

33 25

20 2020

53.5 46.5O3 O2 O1

76PL PR

Figura 41. Esquema de los conmutadores de ciclo de los bacteriófagos λ (arriba) y A2 (abajo).Se indican las distancias relativas entre los distintos elementos, la posición de las cajas –10 y–35, los operadores (cajas grises), así como los inicios de transcripción (flechas truncadas).

La proteína CI se une específica y cooperativamente a los operadores del

conmutador de ciclo aunque con mayor afinidad por O1 y O2 que por O3. La

organización simétrica de los operadores sugiere que CI, que es un monómero en

solución, podría dimerizar al unirse a cada uno de los brazos de las repeticiones. A

bajas concentraciones CI forma dos complejos con movilidad electroforética

Discusión 103

retardada, mientras que a altas concentraciones sólo se observa un complejo DNA –

proteína. El análisis de esta unión mediante la técnica de protección a la digestión

por DNasa I permitió determinar que la unión de CI a los operadores provoca una

curvatura en el DNA que se manifiesta por la gran cantidad de sitios de

hipersensibilidad a la DNasa I detectados entre los operadores. La distancia entre los

centros de simetría de los operadores O1 y O2 es de 46´5 pb (Figura 41), es decir

están separados por 4´5 vueltas de hélice. Por lo tanto, hay que asumir que la hélice

del DNA debe sufrir un giro para permitir la unión cooperativa de CI a ambos.

Actualmente, desconocemos el coste energético que tendría un giro de estas

características. Por otro lado, O2 y O3 están situados en la misma cara del DNA, la

distancia entre sus centros de simetría es de 53´5 pb lo que constituye

aproximadamente 5 vueltas de hélice (Figura 41). Esto favorecería la curvatura en el

DNA tras la unión de CI, como se deduce de los sitios de hipersensibilidad

detectados entre estos operadores que se presentan aproximadamente cada 10 pb, es

decir una vuelta de hélice. (Figuras 15 y 16).

La organización de los operadores y los promotores detectados en el

conmutador genético de A2 sugerían la posibilidad de que, al igual que sucede en el

fago lambda, CI regulara la transcripción del promotor lítico PR. Lo que se observó

fue que CI desplazaba a la RNAP del promotor PR, cuya región –35 solapa con O2,

por el cual CI presenta una gran afinidad. Esto resultaba en la represión de la

transcripción de los genes que conducen al bacteriófago hacia el ciclo lítico.

Asimismo, se observó que la RNAP resultaba desplazada de su posición normal

hacia el promotor PL a bajas concentraciones de CI. Este desplazamiento podría

significar que CI sería capaz de promover su propia transcripción al igual que sucede

con el represor del bacteriófago lambda. Igualmente, si se sigue aumentando la

concentración de CI se observa que la RNAP resulta desplazada completamente de

ambos promotores, lo que resultará en una represión de la transcripción de ambos

genes tempranos. CI por tanto se comportaría como un regulador autógeno de su

propia transcripción siendo capaz de estimularla cuando se encuentra en

concentraciones bajas y de inhibirla si la concentración de la proteína aumenta por

encima de un determinado nivel. Sin embargo, aunque los efectos finales de la

interacción CI – Interruptor son semejantes en λ y A2, los mecanismos por los que

104 Discusión

esto se consigue han de ser forzosamente distintos. En el caso del bacteriófago λ CI

estimula su propia transcripción debido a la interacción física entre el represor y la

subunidad σ de la RNAP. Esta interacción es posible por la proximidad que existe

entre el operador OR2 y el promotor PRM (Patshne, 1992; Kundell y Hochschild,

1994; Li y col., 1994). Recientemente se ha demostrado, usando construcciones

artificiales, que CI unido al operador OR2 alejado 20 pb del promotor PRM, es incapaz

de estimular la transcripción a partir del mismo debido a que es incapaz de contactar

con la subunidad σ de la RNAP (Dove y col., 1997). En el caso de lambda OR2

solapa parcialmente con el promotor PRM, mientras que en A2 la distancia entre O2 y

la región –35 de PL es de unos 40 pb (Figura 41), por lo que no es posible una

interacción directa del represor y la subunidad σ de la RNAP. Por lo tanto, la posible

activación de la transcripción a partir de PL mediada por CI en el bacteriófago A2

debe de estar causada por una interacción entre esta proteína y la subunidad α de la

RNAP. Resultados preliminares realizados en nuestro laboratorio sugieren que éste

es el mecanismo por el que el represor actúa.

IV.3. CARACTERISTICAS Y FUNCION DE CRO.

En el fago lambda la proteína Cro es la encargada de mantener activo el

ciclo lítico a través del bloqueo de la transcripción del gen del represor, cI, a partir

del promotor PRM (Johnson y col., 1981). La disposición del gen cro del bacteriófago

A2 respecto del gen cI, las características estructurales de la proteína y las

homologías de secuencia encontradas, parecían indicar que se trataba del homólogo

funcional de lambda cro. La confirmación de su papel se obtuvo determinando que

la proteína Cro se unía específicamente a la región intergénica cI – cro y que era

capaz de reprimir la transcripción a partir del promotor PL. La casualidad de que al

sobrexpresar Cro apareciera además una forma truncada de la proteína, Cro*, a la

que le faltaban los últimos 11 aminoácidos, nos permitió definir los dominios

funcionales de la misma. Así, ambas proteínas presentaban un mismo patrón de

protección de los operadores, lo que indica que el dominio de unión a DNA está

situado en la porción amino – terminal de la molécula. Por otro lado, las diferencias

observadas en la formación de los complejos con el DNA entre ambas proteínas nos

Discusión 105

permite concluir que el extremo carboxi – terminal de Cro estaría implicado en la

estabilidad del complejo DNA – proteína, en la formación de los dímeros de Cro al

unirse al DNA y en el tipo de complejos formados, puesto que la Kapp de Cro* es al

menos 4 veces mayor que la estimada para Cro y en los ensayos de retardo en gel

Cro* solo forma un complejo con movilidad electroforética retardada, mientras Cro

da lugar a dos.

Estos datos se ven corroborados por los experimentos de filtración en gel,

los cuales muestran que Cro*, al contrario que Cro, es incapaz de dimerizar, al

menos en el rango de concentraciones empleadas. Estos datos sugieren que la

estructura de Cro es similar a la de su homologo en el bacteriófago lambda. En el

extremo carboxi – terminal de esta última proteína se localiza un lazo antiparalelo

(residuos 54 – 56 y 54´ – 56´) que forma parte de la región implicada en la

dimerización y que está cercano a la región de interacción con el DNA (Anderson y

col., 1981; Albright y Matthews, 1998). Este extremo carboxi – terminal permite una

conexión flexible entre los monómeros y es un factor crítico en la afinidad de la

proteína por el DNA (Hubbard y col., 1990).

Integrando todos estos datos postulamos que el complejo I detectado en

EMSA se formaría por la unión de la proteína al DNA, mientras que la formación

del complejo II vendría mediada por un cambio en la forma del DNA. Este complejo

se estabilizaría mediante las interacciones entre los extremos carboxi – terminales de

Cro al dimerizar sobre el DNA. Si esta hipótesis fuera cierta, el complejo II no se

detectaría en los ensayos EMSA en los que estuviera presente Cro* ya que este no

dimeriza y además los complejos serían menos estables. Por otro lado, también

explicaría que no se detectaran diferencias en los ensayos de protección a la

digestión con DNasa I entre ambas proteínas, ya que al realizarse estos en presencia

de Mg2+, necesario para la actuación de la DNasa I, se desestabilizarían las

interacciones entre los dímeros de Cro y por tanto los cambios conformacionales en

el DNA, obteniéndose una imagen semejante a la que da Cro*.

Al igual que para CI la unión de Cro a los operadores provoca una

curvatura en el DNA a juzgar por la aparición de múltiples sitios de

hipersensibilidad al corte por DNasa I localizados entre los operadores y en el centro

de los mismos. Ahora bien, esta unión no es cooperativa. La afinidad de Cro por la

106 Discusión

región de DNA en la que se localiza el conmutador genético es similar a la de CI

(Kapp = 6 nM frente a Kapp = 7 nM). Sin embargo, difieren en la afinidad relativa por

cada operador, siendo ésta mayor para O3 en el caso de Cro y mayor por O1 y O2

para CI. Estos datos unidos al hecho de que el operador O3 solapa con la región – 35

del promotor PL sugiere que Cro podría actuar como un represor del ciclo lisogénico

y los resultados obtenidos mediante ensayos de transcripción in vitro confirman este

hecho.

Igualmente, los datos obtenidos in vitro predicen que la acumulación de

Cro conllevaría una represión del promotor PR al solapar el operador O2 con la

región – 35 del mismo y situarse O1 por delante del inicio de transcripción, lo que

podría bloquear el avance de la RNAP. Sin embargo, los estudios de transcripción

realizados in vivo parecen indicar que la represión de PR no tiene lugar ya que, en los

experimentos “Northern”, el mRNA correspondiente se mantiene durante todo el

ciclo lítico. Esto podría explicarse porque los transcritos resultantes de la expresión

tuviesen una vida media excepcionalmente larga, lo que corroboraría la primera

hipótesis o bien que en la célula nunca se alcanzaran los niveles de Cro necesarios

para que se una a los operadores O2 y O1. Alternativamente, Cro unido a O3 podría

estabilizar la RNAP sobre el promotor PR, lo que impediría la unión de Cro a los

operadores O1 y O2. A este respecto, al aumentar la concentración de Cro en los

ensayos de competición entre Cro y la RNAP de B. subtilis analizados mediante

EMSA (Figura 31) se observa la aparición de un nuevo complejo DNA – proteína, al

que denominamos I*. De igual modo, en los mismos experimentos de competición,

analizados mediante ensayos de protección frente a la DNasa I (Figura 32) al

aumentar la concentración de Cro se produce un desalojo de la RNAP de los

promotores y la recuperación del patrón de protección de Cro. Pero, al mismo

tiempo, se observa la aparición de nuevas bandas de hipersensibilidad indicando,

posiblemente, que la RNAP no se desplaza completamente del DNA, si bien este

extremo no a podido ser comprobado y requiere posteriores estudios.

Los datos obtenidos del estudio de las proteínas CI y Cro, y de los

elementos que constituyen el conmutador de ciclo del bacteriófago A2 sugieren que

inmediatamente después de la entrada de una molécula del genoma de A2 en la

célula hospedadora se producirá una transcripción temprana a partir de los

Discusión 107

promotores PR y PL. Este hecho conllevaría la síntesis de moléculas de Cro y de CI

que se unirían a los operadores O3 y O2 – O1 respectivamente. La unión de Cro a O3

induciría la represión del promotor lisogénico PL y llevaría el desarrollo del fago

hacia el ciclo lítico. En cambio, la unión de CI a los operadores O1 y O2 provocaría

la represión del promotor lítico PR y, en un primer momento una mayor

transcripción de su propio gen, cI, lo que conduciría al bacteriófago infectante hacia

un ciclo lisogénico y a permanecer en el estado de profago. El que el fago siga una

vía de desarrollo u otra sería una cuestión de azar, probablemente influida por las

condiciones del ambiente celular que podrían modular la expresión relativa de un

promotor respecto al otro.

Los resultados obtenidos nos muestran que en general la regulación de la

decisión de seguir el ciclo lítico o lisogénico en el bacteriófago A2 se rige por

principios similares a los descritos para los fagos lambdoides, aunque con claras

diferencias. Por un lado las distancias relativas entre los distintos elementos del

sistema de decisión, son mayores en el caso de A2, además de la especial

disposición estructural de ambos promotores situados sobre la misma cara del DNA,

implican que algunos de los mecanismos empleados por las proteínas para llevar a

cabo su función sean diferentes. El patrón de transcripción de los promotores

también es diferente, ya que PL puede transcribirse de forma constitutiva sin

necesidad de un activador y PR probablemente no ve detenida su expresión en el

periodo tardío del desarrollo lítico, sino que continúa transcribiéndose hasta el final

del ciclo. A pesar de estas diferencias parece claro que el sistema del conmutador de

ciclo se encuentra tanto en los colifagos como en los virus que infectan a las

bacterias gram positivas, lo que indica que es tan eficiente que se ha distribuido por

todo el reino Bacteria, a pesar de los diferentes hábitats de los hospedadores y por

tanto de la diferente presión selectiva a la que han estado sometidos.

IV.4. EL OPERON DE LAS PROTEINAS ESTRUCTURALES.

El ensamblaje de las cápsidas de los bacteriófagos de dsDNA es un proceso

complejo que implica la unión de cientos de subunidades de diferentes proteínas

estructurales de una forma ordenada para generar en un primer momento la cabeza

108 Discusión

de la partícula vírica. En la estructura icosaédrica debe introducirse de forma

compacta una molécula de DNA genómico, generalmente a través del poro formado

por una estructura proteica denominada portal o conectora. La entrada del DNA en

el interior de la cabeza viene acompañada de un proceso de expansión de la misma.

El proceso de formación de la cola también es secuencial, a una serie de proteínas

iniciadoras se une la proteína mayoritaria de la cola, que forma una estructura

tubular básica. Una vez formadas la cabeza y la cola se produce la unión de ambas, a

través del conector, para generar la partícula vírica madura. Esta estructura protege

al DNA genómico del virus de las agresiones del medio ambiente y está preparada

para liberarlo al encontrar un hospedador adecuado.

Los genes que codifican las proteínas estructurales del bacteriófago A2 se

encuentran agrupados en el brazo izquierdo del mapa genómico, en una región de

aproximadamente 16 kb localizada entre los genes de la terminasa y los del sistema

lítico. Este dato concuerda con los obtenidos para la mayoría de los fagos

estudiados, donde los genes de las proteínas morfogenéticas se localizan muy cerca

unos de otros y se expresan de forma coordinada (Casjens y Hendrix, 1988).

El contenido en G + C del segmento morfogenético es de un 45,4%, una

proporción semejante a la del resto del genoma de A2, 45%, y de Lactobacillus

casei, 46%, (Kandler y col., 1986). Curiosamente no se observa una reducción

sustancial en el % de G + C, típico de la mayoría de los genes de Lactobacillus,

cuando se analiza únicamente el tercer nucleótido de cada codón. Se ha sugerido

(Pouwels y Leer, 1993; Pouwels y Leunissen, 1994) que este mantenimiento del %

G + C en la tercera posición es peculiar de los genes que presentan una expresión

muy activa, como puedan ser los genes que codifican las proteínas de la capa S, los

cuales constituyen entre un 5 y un 10% del contenido de proteína total en la célula

(Vidgrén y col., 1992). En este sentido los genes de las proteínas estructurales de los

bacteriófagos, también tienen una expresión muy activa, puesto que se necesita un

número suficiente de copias de sus productos para asegurar un correcto desarrollo de

las cápsidas y obtener la producción de una progenie lo mas numerosa posible.

La región morfogenética presenta una alta densidad génica, mas del 80% de

la misma es codificante, detectándose solapamientos entre los codones de inicio y

parada de algunas orfs e incluso un solapamiento parcial entre dos de ellas. Estos

Discusión 109

solapamientos indican que puede haber acoplamiento traduccional y sugiere que la

región se expresa como un único operón. De hecho, los resultados obtenidos en los

estudios de transcripción indican que todos los genes estructurales se transcriben a

partir de un único promotor que genera un mRNA de mas de 17 kb, cuyo final se

encuentra inmediatamente antes del operón lítico del fago, lo que implica que dicho

promotor se localizaría en el brazo derecho del genoma del fago, concretamente en

la porción proximal del segmento EcoRI de 8´9 kb (Figura 2). Así pues, dicho RNA

incluiría los genes correspondientes a la terminasa, cuyos dos componentes se

encuentran a ambos lados de los extremos cohesivos (García y col., 1997), mas

todos los genes estructurales. La transcripción del operón se produce a partir del

minuto 60 post – infección y se mantiene hasta la lisis celular. Parece por tanto que

la expresión es inducible y probablemente lo sea por factores virales que se

sintetizan durante el periodo temprano del ciclo lítico, lo cual está de acuerdo con lo

descrito para la mayoría de los fagos estudiados, donde las proteínas estructurales se

sintetizan de forma coordinada en la etapa tardía de la infección (Casjens y Hendrix,

1988).

En el caso de las bacterias lácticas, en aquellos fagos que se ha investigado,

se ha encontrado una situación similar. Así por ejemplo, en el caso del bacteriófago

TP901–1 se ha visto que las proteínas estructurales se traducen desde un único

mRNA que se sintetiza a partir de un promotor tardío (Plate) que necesita la presencia

de un activador transcripcional (Orf27), codificado por el mismo fago, para ser

activo (Brønsted y Hammer, 1998; Madsen y Hammer, 1998). Alternativamente, en

el bacteriófago λ las proteínas estructurales se sintetizan a partir de un único

promotor PR´ que genera un mRNA de al menos 21 kb que atraviesa los extremos

cohesivos y que incluye además de los genes de la cápsida los genes necesarios para

la lisis celular. El promotor PR´ es constitutivo, aunque genera un mRNA muy corto

debido a la presencia de un terminador a 0´5 kb. La síntesis del mRNA tardío

necesita la acción previa del antiterminador Q (Friedman y Gottesman, 1983).

La función de las diferentes proteínas codificadas en la región

morfogenética se dedujo bien experimentalmente, caso de las mayoritarias de la

cabeza (gpE, gpF y gpG) y de la cola (gpD) o bien por analogía con otras,

depositadas en las bases de datos, con las que presentaban homología de secuencia.

110 Discusión

Así, gpH presentó homología con proteínas del conector, mientras que Orf209

podría ser la proteasa responsable del procesamiento post – traduccional de la

proteína mayoritaria de la cabeza y/o de gpH. El resto de las proteínas que

presentaron homologías significativas, lo hicieron con componentes minoritarios de

la cola. Así Orf465 y Orf563 podrían ser determinantes de la longitud de la misma

por su parecido con gpT del bacteriófago P2 (Christie y col., 1998) y con la proteína

H del fago lambda (Casjens y Hendrix, 1988), respectivamente. Es interesante

indicar que Orf563 presentó homología con las cadenas pesadas de la miosina.

Aunque en principio este parecido podría resultar sorprendente, en realidad

respondería a una función común que es la de mediar en la autopolimerización de

estructuras tubulares como puedan ser las moléculas de miosina del músculo y las

colas de los bacteriófagos.

La proteína gpJ presentó homología en las bases de datos con la proteína

Orf1276 del bacteriófago φSfi21de Streptococcus thermophilus y la proteína J del

fago λ (Desiere y col., 1998; Hendrix y col., 1983) que podrían estar implicadas en

el reconocimiento del hospedador, encontrándose en una posición equivalente en el

genoma al de ellas y presentando además un tamaño y pI similares (Figura 39).

Al comparar la secuencia aminoacídica del extremo amino – terminal de

aquellas proteínas estructurales en las que fue posible obtenerla, con la secuencia

deducida a partir de las orfs correspondientes se puede observar que en tres de ellas

falta la formilmetionina inicial. Para las proteínas gpD y gpI, los resultados están de

acuerdo con la regla general de que la metionina inicial se procesa cuando el

segundo aminoácido es alanina (Ben–Bassat y Bauer, 1987). También se ha descrito

que la probabilidad del procesamiento aumenta cuanto menor es el tamaño del

segundo aminoácido (Hirel y col., 1989) como sucede en el caso de gpJ.

Resulta llamativa la diferencia observada entre las masas moleculares de las

proteínas estructurales calculadas a partir de las correspondientes orfs y los

estimados a partir de los geles SDS – PAGE. Sin embargo, esta diferencia se ha

descrito en otros bacteriófagos, como puede ser el caso de F4–1 de Lactococcus

lactis (Kim y Batt, 1991). Esta discrepancia podría ser una peculiaridad de las

proteínas acídicas en los geles SDS – PAGE (See y Jackowski, 1989). Este podría

ser el caso de las proteínas estructurales gpD, gpH y gpI de A2 ya que todas ellas

Discusión 111

tienen un peso estimado en gel mayor que el calculado a partir de sus

correspondientes orfs, y todas presentan un pI menor de 5 (Tabla 4).

Asimismo, también se observó que dos de los genes, orfEFG y orfH, daban

lugar a proteínas que sufrían un proceso de maduración por corte proteolítico. En el

primer caso (proteína mayoritaria de la cabeza) se produce la liberación de un

péptido de 123 aminoácidos, mientras que en el segundo (proteína portal) se liberan

los 5 aa amino – terminales, un proceso que se ha observado también en las

proteínas portales de λ y φC31 (Catalano y col., 1995; Smith y col., 1999) aunque en

estos casos se liberan 22 aa.

El procesamiento proteolítico de las proteínas que participan en la

morfogénesis viral es un fenómeno generalizado que tiene lugar en muchos virus

animales y bacterianos (Dougherty y Semler, 1993). En el caso de los bacteriófagos

se ha descrito con detalle el procesamiento de las proteínas de los bacteriófagos T4,

lambda y P22 (Casjens y Hendrix, 1988). Mas recientemente, se ha publicado para

los bacteriófagos HK97 (Duda y col., 1995 b y c) y PR4 (Myung y col., 1994),

aunque hay evidencias de procesamiento en otros muchos fagos que infectan

hospedadores muy heterogéneos como c2 que infecta a Lactococcus lactis (Lubbers

y col., 1995), LL–H que se propaga sobre Lactobacillus delbrueckii (Mikkonen y

Alatossava, 1994), φg1e que ataca a Lactobacillus casei (Kakikawa y col., 1996),

φadh que se desarrolla sobre Lactobacillus gasseri (Altermann y col., 1999), φC31

que infecta a Streptomyces (Suárez y col., 1984), φSfi21 que afecta a Streptococcus

thermophilus (Desiere y col., 1999) o Cp–1 que se propaga sobre Streptococcus

pneumoniae (Martin y col., 1998).

Se ha sugerido que el procesamiento provoca la irreversibilidad del proceso

de ensamblaje y que su importancia en dicho proceso se debe a que provoca los

cambios conformacionales necesarios para un correcto desarrollo del mismo. En

muchos casos esta actividad proteolítica está codificada por el propio fago pudiendo

ser incluso un proceso autocatalítico (Casjens y Hendrix, 1988).

El gen orfEFG da lugar a tres proteína estructurales gpE, gpF y gpG, como

se deduce de su extremo amino – terminal común. Dichas proteínas corresponderían

al monómero en el primer caso (orfEFG tiene capacidad para codificar un

polipéptido de 29 kDa y gpE migra en geles de SDS – PAGE como una proteína de

112 Discusión

35 kDa) y a multímeros en los otros dos. Este dato implica que las uniones entre los

monómeros en gpF y gpG deben ser resistentes al tratamiento con SDS en caliente y

en presencia de β – Mercaptoetanol. El fenómeno de una unión covalente entre las

subunidades de la proteína mayoritaria de la cabeza para formar una cabeza madura

fue descrito por primera vez por Poppa y colaboradores (1991) para el bacteriófago

HK97. Sin embargo, en la actualidad se conocen otros fagos en los que se da este

proceso como son L5, que infecta a Mycobacterium spp. (Hatfull y Sarkis, 1993), y

c2 y r1t de Lactococcus lactis (Lubbers y col., 1995; van Sideren y col., 1996), por

lo que parece que la formación de enlaces cruzados entre las distintas subunidades

de la cabeza es un fenómeno ampliamente distribuido entre grupos muy diversos de

bacteriófagos. Recientemente Duda (1998) ha propuesto un modelo de organización

de las proteínas de la cabeza del fago HK97 basado en una estructura de cota de

malla. Los monómeros de la proteína mayoritaria de la cápsida que forman la cabeza

se unen entre si para formar hexámeros y pentámeros mediante enlaces amida entre

los residuos lisina – 169 y asparragina – 356 (Duda y col., 1995c) y a su vez, estas

subunidades quedarían unidas formando anillos en una estructura semejante a las

cotas de malla de los caballeros medievales para formar la cabeza icosaédrica de la

partícula viral (Duda, 1998). En el caso de la proteína mayoritaria de la cabeza de

A2 se localiza un residuo lisina en la posición 165 y uno de asparragina en la

posición 357 (Anexo II), teniendo en cuenta además la similitud de tamaños entre

ambas proteínas, 400 aa la de A2 frente a 385 aa la de HK97, estos residuos podrían

estar implicados en la formación de enlaces amida que resultarían en la aparición de

multímeros, aunque esta implicación deberá ser corroborada de forma experimental.

Ninguna de las Orfs encontradas en A2 presentó homología con proteínas

de andamiaje de otros bacteriófagos, sin embargo, esto no es un hecho extraño,

puesto que habitualmente estas proteínas solo presentan homología a nivel de

estructura secundaria (Casjens y Hendrix, 1988). En general todas ellas presentan un

extremo amino – terminal rico en estructura hélice alfa y una gran abundancia de

residuos cargados; en el caso del bacteriófago φ29 un 46% de los residuos están

cargados y en los fagos T4 y T7 un 30% (Eppler y col., 1991). Ambas características

tienen una gran importancia en la funcionalidad de la proteína, como ha quedado

Discusión 113

demostrado en el caso de la proteína de andamiaje del bacteriófago P22. Esta

proteína presenta una estructura en hélice alfa en su extremo amino – terminal que

forma una estructura de hélice superenrollada, “Coiled coil”, que le permite la

dimerización y de esta forma interactuar con las subunidades de la proteína

mayoritaria de la cabeza estabilizando, mediante interacciones electrostáticas entre

residuos cargados, las uniones entre los pentámeros y hexámeros para formar las

procabezas antes de la entrada del DNA en las mismas (Parker y Prevelige, 1998).

En el caso del bacteriófago HK97 no existe ningún gen que codifique para la

proteína de andamiaje, sino que se cree que funcionaría como tal el extremo amino –

terminal de la proteína mayoritaria de la cabeza una vez liberado tras un corte

proteolítico (Duda y col., 1995b). Esta suposición se basa en las características

estructurales de dicho péptido, ya que presenta un dominio en su región amino –

terminal con una alta probabilidad de formar una estructura de hélice superenrollada.

Al igual que para este bacteriófago se ha descrito una situación similar para el

bacteriófago φSfi21 (Desiere y col., 1999). En el bacteriófago A2 el extremo amino

– terminal de la proteína mayoritaria de la cabeza, liberado por proteolisis como un

péptido de 123 aa, presenta características estructurales similares a las de las

proteínas de andamiaje, como son una gran cantidad de residuos cargados (40%) y

una región amino – terminal rica en estructura hélice alfa y con un dominio de

cremallera de leucinas que mediaría su dimerización en forma de hélice

superenrollada. Así pues, al igual que ocurre en el caso de HK97 y φSfi21

proponemos que el gen orfEFG codifica un polipéptido que por un proceso

proteolítico de maduración generaría dos proteínas que funcionarían como proteína

de andamiaje y mayoritaria de la cabeza. El hecho de que un polipéptido, codificado

por un gen, pueda generar por procesamiento proteolítico dos o mas proteínas con

función diferente no es un hecho aislado y es probablemente una estrategia viral para

condensar su información genética, como es el caso del bacteriófago PR4, que

infecta a E. coli y Salmonella, donde el polipéptido precursor de la proteína

mayoritaria de la cabeza se procesa para dar lugar a ésta y otras dos proteínas de la

cápsida, con lo que a partir de un único gen se originan tres proteínas diferentes

(Myung y col., 1994).

114 Discusión

Recientemente Ackermann y col. (1995) han sugerido un origen común

para los fagos con cola, en base a una serie de características comunes como son la

estructura de la cabeza y de la cola, el genoma en forma de dsDNA, la presencia de

grupos de genes con función relacionada y la maduración de las cabezas por

proteolisis. Esta hipótesis se ve reforzada por la conservación de la disposición

estructural de los genes en módulos como puede ser el de las proteínas estructurales

(Botsein, 1980). Mas aun, también se observa que los genes que codifican las

proteínas de empaquetamiento de DNA, estructurales de la cabeza, de ensamblaje y

de la cola forman subgrupos adyacentes conservando ese orden preciso (Figura 39).

En el caso del bacteriófago A2 esta organización modular se conserva, y con la

particularidad de que atraviesa los extremos cohesivos del fago, es decir, únicamente

aparece una vez la molécula de DNA infectante se ha circularizado. Esta es una

prueba mas de la conveniencia biológica de presentar los genes implicados en la

morfogénesis en una disposición determinada. Aún podemos descender el último

peldaño en el nivel de organización común, que es el de las proteínas individuales

dentro de cada subgrupo. Así por ejemplo, las proteínas implicadas en el

empaquetamiento del DNA, la proteína portal, la proteasa responsable del

procesamiento de la proteína mayoritaria de la cabeza, la proteína de andamiaje y la

de la cabeza se presentan en este orden. Nuevamente resulta llamativo que esta

organización sea común a bacteriófagos que infectan hospedadores muy

heterogéneos, como puedan ser bacterias gram negativas y gram positivas y, dentro

de éstas, con contenidos G + C tan dispares como Streptomyces y Lactobacillus

(Figura 42).

En general, esta conservación del orden de los genes de los fagos con

dsDNA no se mantiene a nivel de su secuencia o la de sus productos, aunque si a

nivel de estructura tridimensional y funcionalidad de los mismos (Ackermann,

1999). Las razones que se aducen para la conservación de los agrupamientos de

genes son de dos tipos: por un lado resulta conveniente que genes con funciones

relacionadas o que deban interactuar entre si estén regulados conjuntamente. Por

otro lado, la organización modular favorece la generación de diversidad fágica, ya

que aumenta la probabilidad de que al producirse una recombinación entre dos fagos

individuales que infecten a un mismo hospedador, ésta resulte en la generación de

Discusión 115

dos individuos recombinantes que conserven todas las funciones necesarias para un

correcto desarrollo de su ciclo infectivo (Casjens y col., 1992).

A2

PortalTerminasa Proteasa CabezaAnd

amiaj

e

φC31

PortalTerminasa Proteasa CabezaAnd

amiaj

e

HK97

PortalTerminasa Proteasa CabezaAndam

iaje

φPVL

PortalTerminasa Proteasa Cabeza

Lambda

PortalTerminasa Cabeza

Andamiaje

Cabeza

Figura 42: Esquema de la organización de los genes implicados en la morfogénesis de lacabeza de diversos bacteriófagos.

Por otro lado, se ha observado que en ocasiones se presenta homología de

secuencia entre genes de bacteriófagos que infectan a hospedadores poco

relacionados filogenéticamente, lo cual apunta a la existencia de una transferencia

horizontal de la información genética que también se beneficiaría de la distribución

estructural común (Hendrix y col., 1999). Por tanto, podría pensarse que existe un

fondo genético común accesible a las diversas entidades que conocemos como fagos

116 Discusión

dsDNA, que constituiría un mecanismo evolutivo formidable en estos seres que

carecen de la versatilidad mutacional de los virus con RNA y de los procesos

sexuales y parasexuales de los organismos celulares.

Conclusiones 117

1ª) Se localizó la región genómica implicada en el control de la decisión

lisis/lisogenia. En ella se encontraron cuatro pautas abiertas de lectura orfX, cI,

cro y ant, estando las dos primeras situadas en dirección opuesta al resto. En el

espacio intergénico se sitúan tres repeticiones invertidas imperfectas, O1, O2 y

O3, que constituyen los operadores del sistema e interespaciados con éstas dos

promotores divergentes, PL y PR.

2ª) El gen cI se expresa a partir del promotor PL en tiempos tempranos

postinfeción y en lisógenos de Lactobacillus casei. La inserción de forma

estable del gen cI en el genoma de Lactobacillus casei 393, le confiere

resistencia a la superinfección por el bacteriófago A2. Este gen codifica una

proteína, CI, de 25 kDa que se une cooperativa y específicamente a los

operadores del sistema y que fue identificada como el represor del ciclo lítico.

3ª) La proteína CI reprime específicamente al promotor del ciclo lítico PR al

desplazar a la RNA polimerasa vegetativa de Bacillus subtilis de dicho

promotor recolocándola sobre el promotor PL en un proceso dependiente de

concentración.

4ª) El operón lítico temprano, que se expresa a partir del promotor PR durante todo

el ciclo infectivo esta constituido por los genes cro, ant y los correspondientes

al módulo de replicación.

5ª) El gen cro codifica una proteína de 9 kDa, Cro, que se une de forma específica

a los operadores del sistema. Mediante el estudio de un mutante de deleción se

determinó que la proteína Cro consta de dos dominios funcionales, una región

amino – terminal de unión a DNA y un extremo carboxi – terminal implicado

en la dimerización de la proteína.

6ª) La proteína Cro es capaz de reprimir al promotor lisogénico temprano PL al

desplazar, en un proceso dependiente de concentración, a la RNA polimerasa

vegetativa de Bacillus subtilis de dicho promotor.

118 Conclusiones

7ª) Se localizó la región genómica del bacteriófago A2 responsable de la

morfogénesis. En ella se localizaron dieciséis pautas abiertas de lectura, cinco

de las cuales codificaban para alguna de las proteínas estructurales

identificadas en geles SDS – PAGE, incluyendo las correspondientes a la

proteína mayoritaria de la cola y de la cabeza. Esta última proteína sufre un

proceso de maduración por corte proteolítico y se encuentra en forma de

multímeros.

8ª) Los genes que codifican las proteínas estructurales del bacteriófago A2 están

agrupados en su genoma, formando módulos funcionales con la ordenación:

empaquetamiento, morfogénesis de la cabeza y de la cola.

9ª) El operon de las proteínas estructurales se expresa como un único mRNA

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Anexo I

. . . . . . TCACTTTGGTCGGTGGGGTAGGCGCTTTTTATTTTGTATCCAGCCCCACTCTCCGGCTTG 1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60 AGTGAAACCAGCCACCCCATCCGCGAAAAATAAAACATAGGTCGGGGTGAGAGGCCGAAC

. . . . . . CACGGGGACGCCGCTTGCGTGGGGGAAGGAACTAGTCACCATAGTCGTCGGGAGCAGTTC 61 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 120 GTGCCCCTGCGGCGAACGCACCCCCTTCCTTGATCAGTGGTATCAGCAGCCCTCGTCAAG * D G Y D D P A T

. . . . . . CGGCGTCATCAATCTTCTTGGCCAAAGCCAATGGAACTGTGATTTTGCCACCCATAGTTG 121 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 180 GCCGCAGTAGTTAGAAGAACCGGTTTCGGTTACCTTGACACTAAAACGGTGGGTATCAAC G A D D I K K A L A L P V T I K G G M T

. . . . . . ACTTGTAAGTGGTGGTACCCAAGCTTTCAGCATAGAAGGTGATCTTGTCATTTTCTAGAA 181 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 240 TGAACATTCACCACCATGGGTTCGAAAGTCGTATCTTCCACTAGAACAGTAAAAGATCTT S K Y T T T G L S E A Y F T I K D N E L

. . . . . . TTCGAGAGCCGTTCATAATATCTGGATCATAACCGACCATAACTATATTGTCATAGTTGC 241 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 300 AAGCTCTCGGCAAGTATTATAGACCTAGTATTGGCTGGTATTGATATAACAGTATCAACG I R S G N M I D P D Y G V M V I N D Y N

. . . . . . CGTCGACAGCAACACGCAAATCATTTTCATCGTCACCCTCAACGACTTGAATAACTTTGC 301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 360 GCAGCTGTCGTTGTGCGTTTAGTAAAAGTAGCAGTGGGAGTTGCTGAACTTATTGAAACG G D V A V R L D N E D D G E V V Q I V K

. . . . . . CCGTTAGAGTAATGTTCTTGCCTTTGTAGTCGTCTGGAGTCCGTGCCAACTGTTCATAAG 361 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 420 GGCAATCTCATTACAAGAACGGAAACATCAGCAGACCTCAGGCACGGTTGACAAGTATTC G T L T I N K G K Y D D P T R A L Q E Y

. . . . . . TGATGCCAGTGTTGTAGTCAGCTGCGTTGAATGCTTCAGTGCTCGATGATTCCTCACTAT 421 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 480 ACTACGGTCACAACATCAGTCGACGCAACTTACGAAGTCACGAGCTACTAAGGAGTGATA T I G T N Y D A A N F A E T S S S E E S

. . . . . . CTGAATCGTCACTATCAGATTCTCCATAACTGTCATCATCTTCTTGCGACGATTTTGACC 481 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 540 GACTTAGCAGTGATAGTCTAAGAGGTATTGACAGTAGTAGAAGAACGCTGCTAAAACTGG D S D D S D S E G Y S D D D E Q S S K S

. . . . . . TTTGACGATTCAGCTTTGAAGACGAACTAGACGCAGCTGACCTGTTGCTTTCTCCCGAGT 541 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 600 AAACTGCTAAGTCGAAACTTCTGCTTGATCTGCGTCGACTGGACAACGAAAGAGGGCTCA R Q R N L K S S S S S A A S R N S E G S

Anexo I

. . . . . . AGGTGCCAATCCAAAAAAAGATTGCAATAAATGCTACCGCCGACAATGCGGTAATAATAA 601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 660 TCCACGGTTAGGTTTTTTTCTAACGTTATTTACGATGGCGGCTGTTACGCCATTATTATT Y T G I W F F I A I F A V A S L A T I I

. . . . . . GGTTCCGCTTTAGTTTTCTCGGATCCTTTCTTTGAACTATAGACAATGTGCCAAATATTG 661 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 720 CCAAGGCGAAATCAAAAGAGCCTAGGAAAGAAACTTGATATCTGTTACACGGTTTATAAC L N R K L K R P D K R Q V I S L T G F I

. . . . . . CAGCCAATAGGAGCGATCCTAAAAAGGCAATTAAGATAAGTAGTTTCATTATTCCCCTCC 721 ---------+---------+---------+---------+---------+------RBS+ 780 GTCGGTTATCCTCGCTAGGATTTTTCCGTTAATTCTATTCATCAAAGTAATAAGGGGAGG A A L L L S G L F A I L I L K M çç orfX

. . . . . . AAAAAAATCCAGCTTTTAACGTCGATCAGGGTTTGGACGTATTATTTTTATAAAACTACC 781 ---- ----+---------+---------+ 840 TTTTTTTAGGTCGAAAATTGCAGCTAGTCCCAAACCTGCATAATAAAAATATTTTGATGG * L V V

. . . . . . GTGTATACGACAACCCTGCCAATGATCTTGATGTTCTCTTCTTCAAGGTCTTCGTAGGTG 841 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 900 CACATATGCTGTTGGGACGGTTACTAGAACTACAAGAGAAGAAGTTCCAGAAGCATCCAC T Y V V V R G I I K I N E E E L D E Y T

. . . . . . TACATGATGGGACTAAATCTTTTGTCAGTTGAATCTGGAATGAAGGTAACAATCTGCTTT 901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 960 ATGTACTACCCTGATTTAGAAAACAGTCAACTTAGACCTTACTTCCATTGTTAGACGAAA Y M I P S F R K D T S D P I F T V I Q K

. . . . . . TGACGATCATTATAGAAATATTTGACTGCGTAGTCACCATCATCTGCAAAGACAACTATG 961 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1020 ACTGCTAGTAATATCTTTATAAACTGACGCATCAGTGGTAGTAGACGTTTCTGTTGATAC Q R D N Y F Y K V A Y D G D D A F V V I

. . . . . . TCACCGTCTTTAAGGTCTTGAATGTCGTTGTACTGTTTGACTGCTATTAAAGAGCCATCA1021 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1080 AGTGGCAGAAATTCCAGAACTTACAGCAACATGACAAACTGACGATAATTTCTCGGTAGT D G D K L D Q I D N Y Q K V A I L S G D

. . . . . . GGAATTGTTTGGTTCATTGATTCGCCGTTTATATGCATCATCAATATGCTGCTGTCTCCA1081 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1140 CCTTAACAAACCAAGTAACTAAGCGGCAAATATACGTAGTAGTTATACGACGACAGAGGT P I T Q N M S E G N I H M M L I S S D G

. . . . . . GCATATCTTCCCATAACGCTATCTGGTAGTTGAATCGTTTCAACGTCATCTGAAGTTAGC1141 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1200 CGTATAGAAGGGTATTGCGATAGACCATCAACTTAGCAAAGTTGCAGTAGACTTCAATCG A Y R G M V S D P L Q I T E V D D S T L

Anexo I

. . . . . . GGATCGACATTGCACAGGATTCCAGCCGATATCTCAGCGGGAATGTATGGATAAGAGTGA1201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1260 CCTAGCTGTAACGTGTCCTAAGGTCGGCTATAGAGTCGCCCTTACATACCTATTCTCACT P D V N C L I G A S I E A P I Y P Y S H

. . . . . . ACATTTAGTTTTTTGACTTTAAAAGGATCTACAGGAGAAACTCCTATTAGGCTTTCCGGA1261 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1320 TGTAAATCAAAAAACTGAAATTTTCCTAGATGTCCTCTTTGAGGATAATCCGAAAGGCCT V N L K K V K F P D V P S V G I L S E P

. . . . . . GTTGTGTGTAAAGCACTTGCAAATTTATCAACATAGTTTAATGGAAACTCACGTGTTCCA1321 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1380 CAACACACATTTCGTGAACGTTTAAATAGTTGTATCAAATTACCTTTGAGTGCACAAGGT T T H L A S A F K D V Y N L P F E R T G

. . . . . . TTGAAATAGCGAGACACAGACGATTTTGCCATGTCAACACGGCGTGCTAGTTCACTGATT1381 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1440 AACTTTATCGCTCTGTGTCTGCTAAAACGGTACAGTTGTGCCGCACGATCAAGTGACTAA N F Y R S V S S K A M D V R R A L E S I

. . . . . . GAAATCCCTTCACGGTTGCGAAGATCATTTAAAGTCTTGATTATTTCATCATTTGTTTTC1441 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1500 CTTTAGGGAAGTGCCAACGCTTCTAGTAAATTTCAGAACTAATAAAGTAGTAAACAAAAG S I G E R N R L D N L T K I I E D N T K

. . . . . . ATGTATCTCACCTCAAGAATGATTTTAACACCGTTCCCGATTGTGCACAATAGGGGCACT1501 --------- RBS ----+---------+- O3 ----+ 1560 TACATAGAGTGGAGTTCTTACTAAAATTGTGGCAAGGGCTAACACGTGTTATCCCCGTGA M ç cI * -10 -35

. Elemento UP . -35 . . AAAAAGCAATATCTGAATATTTTTTTGAAATAATCGTTGACACATGGGAACACGGATGAT1561 ---------+---------+---- O2 +---------+ 1620 TTTTTCGTTATAGACTTATAAAAAAACTTTATTAGCAACTGTGTACCCTTGTGCCTACTA

-10 . * . RBS . . . ATTCTTTAGATGTTCCCAAAAGGAAACGAAAGGAGGCAATCCAATGACACTAAATTTAAA1621 ---------+- O1 ---+---------+---------+ 1680 TAAGAAATCTACAAGGGTTTTCCTTTGCTTTCCTCCGTTAGGTTACTGTGATTTAAATTT cro èè M T L N L K

. . . . . . ACGTCTTCGCGCTGAACGTATCGCAAAAGGAATGAACCAAGATGAAATGGCGAAAGCTAT1681 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1740 TGCAGAAGCGCGACTTGCATAGCGTTTTCCTTACTTGGTTCTACTTTACCGCTTTCGATA R L R A E R I A K G M N Q D E M A K A M

. . . . . . GGGATGGCATACCCGCTCTTCGTATGCTAAGCGTGAGAATGGTATTACAACAATCAGCGC1741 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1800 CCCTACCGTATGGGCGAGAAGCATACGATTCGCACTCTTACCATAATGTTGTTAGTCGCG G W H T R S S Y A K R E N G I T T I S A

Anexo I

. . . . . . TACCGAATTAGTAAAAATGGCCAGCATTTTGGGGTATGGCACCAATCAACTTGACCTTTT1801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1860 ATGGCTTAATCATTTTTACCGGTCGTAAAACCCCATACCGTGGTTAGTTGAACTGGAAAA T E L V K M A S I L G Y G T N Q L D L F

. . . RBS . . . TTTTACAAATAACGTTCCCGATAGAGAACGAAAGGGGATGACGGTATGAACGAATTACAG1861 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1920 AAAATGTTTATTGCAAGGGCTATCTCTTGCTTTCCCCTACTGCCATACTTGCTTAATGTC F T N N V P D R E R K G M T V * ant è M N E L Q

. . . . . . CATTTTGATTTTAAAGGTCGGCAAGTAAGAACTGTGGTTGTTGATAATGAACCAATGTTT1921 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1980 GTAAAACTAAAATTTCCAGCCGTTCATTCTTGACACCAACAACTATTACTTGGTTACAAA H F D F K G R Q V R T V V V D N E P M F

. . . . . . GTCGGTAAGGACATTGCAGAAGTGCTGGGATATAGTAAGCCAGCTAACGCAGTAAACAAA1981 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2040 CAGCCATTCCTGTAACGTCTTCACGACCCTATATCATTCGGTCGATTGCGTCATTTGTTT V G K D I A E V L G Y S K P A N A V N K

. . . . . . TATGTACCCGATAAATTCAAAGGGGTCACCAAATTGATGACCCCCGGTGGAAAACAGGAT2041 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2100 ATACATGGGCTATTTAAGTTTCCCCAGTGGTTTAACTACTGGGGGCCACCTTTTGTCCTA Y V P D K F K G V T K L M T P G G K Q D

. . . . . . TTCGTTGTTATTGCCGAACCCGGGCTTTATAAATTAGTTTTCAAATCTGATATGCCAAAC2101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2160 AAGCAACAATAACGGCTTGGGCCCGAAATATTTAATCAAAAGTTTAGACTATACGGTTTG F V V I A E P G L Y K L V F K S D M P N

. . . . . . GCAGATGAATTTACAGATTGGGTAGCAGAGAAAGTTCTCCCATCAATCCGCAAGCATGGT2161 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2220 CGTCTACTTAAATGTCTAACCCATCGTCTCTTTCAAGAGGGTAGTTAGGCGTTCGTACCA A D E F T D W V A E K V L P S I R K H G

. . . . . . GCCTACATGACGCCTGAAACGATTGAGAAGGCCATCTATAATCCAGACTTCATTATCAAT2221 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2280 CGGATGTACTGCGGACTTTGCTAACTCTTCCGGTAGATATTAGGTCTGAAGTAATAGTTA A Y M T P E T I E K A I Y N P D F I I N

. . . . . . CTGGCAACGCAGCTAAAGGACGAACAAGCAAAAACAGCGGAACTTACGGCTGATAACGAA2281 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2340 GACCGTTGCGTCGATTTCCTGCTTGTTCGTTTTTGTCGCCTTGAATGCCGACTATTGCTT L A T Q L K D E Q A K T A E L T A D N E

. . . . . . ACAATGAAGCCTAAAGCGTTGTTTGCAGACGCGGTAGCCACAAGTTAAACAACCATCTTG2341 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2400 TGTTACTTCGGATTTCGCAACAAACGTCTGCGCCATCGGTGTTCAATTTGTTGGTAGAAC T M K P K A L F A D A V A T S *

Anexo I

. . . . . . GTCGGTGATCTTGCCAAGGTGATCAAACAGAACGGCGTTGACATTGGTGCCAAGCGGTTG2401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2460 CAGCCACTAGAACGGTTCCACTAGTTTGTCTTGCCGCAACTGTAACCACGGTTCGCCAAC

. . . . . . TTCGCCTGGCTACGTGAGCAAGGCTATTTGATCAAACGGATTGGTGCCGACTATAACTCG2461 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2520 AAGCGGACCGATGCACTCGTTCCGATAAACTAGTTTGCCTAACCACGGCTGATATTGAGC

. . . . . . CCGACACAACGCGCGATGGAGCTAGGCTTGTTCGAGGTCAAGGAAACGGCGATCAGTCAC2521 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2580 GGCTGTGTTGCGCGCTACCTCGATCCGAACAAGCTCCAGTTCCTTTGCCGCTAGTCAGTG

. . . . . . TCGGACGGCCATGTAACAGTTCAGAAGACCCCAAAGGTGACCGGCAAAGGCCAGCAGTAT2581 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2640 AGCCTGCCGGTACATTGTCAAGTCTTCTGGGGTTTCCACTGGCCGTTTCCGGTCGTCATA

. . . . . . TTTATCAACAAGTTTCTACAAAAGGAGGCTGTCTAAATGAACGGACGCACACAGGAAAAA2641 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2700 AAATAGTTGTTCAAAGATGTTTTCCTCCGACAGATTTACTTGCCTGCGTGTGTCCTTTTT

. . . . . . CTAGAAAATGCCGTTGCAGAATTTGTTGTTGCTCAACTGAAGAACAAAGGAAAAAGCCCC2701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2760 GATCTTTTACGGCAACGTCTTAAACAACAACGAGTTGACTTCTTGTTTCCTTTTTCGGGG

Anexo I: Secuencia de nucleótidos de la región de decisión lisis / lisogenia del bacteriófagoA2. Bajo la secuencia de nucleótidos de cada gen se representa la correspondiente traduccióna aminoácidos. Se señalan las regiones promotoras (n), el elemento UP (n), los inicios detranscripción (*), el terminador (–¡–), los sitios de unión al ribosoma (RBS) y los operadores(èç). Esta secuencia se encuentra depositada en la base de datos del EMBL con losnúmeros de acceso Y12813 y AJ251789.

Anexo II

EcoRI . . . . . . GAATTCTTGGCGCAAATATGGCTGGAATTGCCACTGTTTTAGGCTTCATTTTAGCTGGAT 1---------+---------+---------+---------+---------+---------+60 CTTAAGAACCGCGTTTATACCGACCTTAACGGTGACAAAATCCGAAGTAAAATCGACCTA

. . . . . . ATGGGGCTTTTTTGATCAATAGGCCTACTGGATTCATGGTTTGCGGCGGCTTGTTGTTTG 61---------+---------+---------+---------+---------+---------+120 TACCCCGAAAAAACTAGTTATCCGGATGACCTAAGTACCAAACGCCGCCGAACAACAAAC

. . . RBS . . TTCTCGCCTTTATTCTGCTGCTTCCTGATAACGAAGGGAGGTGAGATTAATGAAGCTATT 121---------+---------+---------+---------+---------+---------+180 AAGAGCGGAAATAAGACGACGAAGGACTATTGCTTCCCTCCACTCTAATTACTTCGATAA orfH è M K L F

. . . . . . TCGAGGATTGGCAACCGAAGTGGACCCTCACTGGGCAGATCATTTGCTTGATTCTGGGGT 181---------+---------+---------+---------+---------+---------+240 AGCTCCTAACCGTTGGCTTCACCTGGGAGTGACCCGTCTAGTAAACGAACTAAGACCCCA R G L A T E V D P H W A D H L L D S G V gpH . . . . . . AATCCCATCATTTCGAGGCGGGTATCTTGGCATTTCTGCCCTACGGAACTCTGACGTGCT 241---------+---------+---------+---------+---------+---------+300 TTAGGGTAGTAAAGCTCCGCCCATAGAACCGTAAAGACGGGATGCCTTGAGACTGCACGA I P S F R G G Y L G I S A L R N S D V L

. . . . . . TACGGCTGTATCGATTGTTTCGGGTGATGTTAGTCGGTTTCCGCTAGTAATCACGGACAG 301---------+---------+---------+---------+---------+---------+360 ATGCCGACATAGCTAACAAAGCCCACTACAATCAGCCAAAGGCGATCATTAGTGCCTGTC T A V S I V S G D V S R F P L V I T D S

. . . . . . CTCAACCGATGAAGTTATTGACTTAGCCAATATTGAATACTTGATGAATACAAAGGTAAA 361---------+---------+---------+---------+---------+---------+420 GAGTTGGCTACTTCAATAACTGAATCGGTTATAACTTATGAACTACTTATGTTTCCATTT S T D E V I D L A N I E Y L M N T K V N

. . . . . . CAAGCGGCTGTCGGCTTATCAGTGGAAATTTCCCATGATGGTCAATGCAATTTTGACTGG 421---------+---------+---------+---------+---------+---------+480 GTTCGCCGACAGCCGAATAGTCACCTTTAAAGGGTACTACCAGTTACGTTAAAACTGACC K R L S A Y Q W K F P M M V N A I L T G

. . . . . . CAACGCTTATTCGCGTATTGTGCGCGATCCGATAACCAACGAACCAGCTATGTTTGAGTT 481---------+---------+---------+---------+---------+---------+540 GTTGCGAATAAGCGCATAACACGCGCTAGGCTATTGGTTGCTTGGTCGATACAAACTCAA N A Y S R I V R D P I T N E P A M F E F

. . . . . . CTATGCCCCATCACAGACGCAGGTGGACACAAGCGACCCCGATAACATCATCTACCGTTT 541---------+---------+---------+---------+---------+---------+600 GATACGGGGTAGTGTCTGCGTCCACCTGTGTTCGCTGGGGCTATTGTAGTAGATGGCAAA Y A P S Q T Q V D T S D P D N I I Y R F

Anexo II

. . . . . . CACGCCTTACAACTCTAGCATGCAAAAAGTATGTGGATTTGAGGACGTCATTCACTGGAA 601---------+---------+---------+---------+---------+---------+660 GTGCGGAATGTTGAGATCGTACGTTTTTCATACACCTAAACTCCTGCAGTAAGTGACCTT T P Y N S S M Q K V C G F E D V I H W K

. . . . . . GTTTTTCTCATACGACACAATCATGGGGCGCTCACCGCTTTTGTCGCTTGGTGATGAGAT 661---------+---------+---------+---------+---------+---------+720 CAAAAAGAGTATGCTGTGTTAGTACCCCGCGAGTGGCGAAAACAGCGAACCACTACTCTA F F S Y D T I M G R S P L L S L G D E I

. . . . . . TGGACTGCAGGAGTCAGGTGTTTCAACGTTGCAGAAGTTCTTCAAGAGCGGCTTGAAAGG 721---------+---------+---------+---------+---------+---------+780 ACCTGACGTCCTCAGTCCACAAAGTTGCAACGTCTTCAAGAAGTTCTCGCCGAACTTTCC G L Q E S G V S T L Q K F F K S G L K G

. . . . . . CTCAATTATCAAAGCAAAGGAGAGTCGCCTGTCCGCCGAAGCACGCCAGAAGATTCGTGA 781---------+---------+---------+---------+---------+---------+840 GAGTTAATAGTTTCGTTTCCTCTCAGCGGACAGGCGGCTTCGTGCGGTCTTCTAAGCACT S I I K A K E S R L S A E A R Q K I R E

. . . . . . AGATTTTGAAAGGGCACAGGCAGGTGCTGATGCTGGATCGCCAATTATAGTTGACGCAAC 841---------+---------+---------+---------+---------+---------+900 TCTAAAACTTTCCCGTGTCCGTCCACGACTACGACCTAGCGGTTAATATCAACTGCGTTG D F E R A Q A G A D A G S P I I V D A T

. . . . . . GATGGATTATCAGCCGTTGGAAGTTGATACCAATGTTCTTAATCTGATTAACAGCAATAA 901---------+---------+---------+---------+---------+---------+960 CTACCTAATAGTCGGCAACCTTCAACTATGGTTACAAGAATTAGACTAATTGTCGTTATT M D Y Q P L E V D T N V L N L I N S N N

. . . . . . CTATTCAACAGCGCAGATTGCTAAGGCTTTGCGGGTGCCAGCGTATCGATTAGCCCAAAA 961---------+---------+---------+---------+---------+---------+1020 GATAAGTTGTCGCGTCTAACGATTCCGAAACGCCCACGGTCGCATAGCTAATCGGGTTTT Y S T A Q I A K A L R V P A Y R L A Q N

. . . . . . TAGTCCTAACCAGTCTGTTAAACAGCTTGCTGATGACTATATTCGCAATGATCTTCCATT 1021---------+---------+---------+---------+---------+---------+1080 ATCAGGATTGGTCAGACAATTTGTCGAACGACTACTGATATAAGCGTTACTAGAAGGTAA S P N Q S V K Q L A D D Y I R N D L P F

. . . . . . TTACTTTGAACCGATTACAAGTGAGTTTGAACTAAAGCTGCTTGATGACGCGCAACGGCA 1081---------+---------+---------+---------+---------+---------+1140 AATGAAACTTGGCTAATGTTCACTCAAACTTGATTTCGACGAACTACTGCGCGTTGCCGT Y F E P I T S E F E L K L L D D A Q R H

. . . . . . CCAATATTGCATAGGATTCGACACAAAATCAGTAAACGGATTGCCGATTGCTGACGTAAA 1141---------+---------+---------+---------+---------+---------+1200 GGTTATAACGTATCCTAAGCTGTGTTTTAGTCATTTGCCTAACGGCTAACGACTGCATTT Q Y C I G F D T K S V N G L P I A D V N

Anexo II

. . . . . . TACAGCAGTCAATGGCGGACTGTGGACTGGAAACGAGGGACGTGCGGAGCTTGGAAAGAA 1201---------+---------+---------+---------+---------+---------+1260 ATGTCGTCAGTTACCGCCTGACACCTGACCTTTGCTCCCTGCACGCCTCGAACCTTTCTT T A V N G G L W T G N E G R A E L G K K

. . . . . . ACCGTTAAAAGACCCGAACATGGATCGTATTCAGTCGACACTTAACACAGTATTTCTTGA 1261---------+---------+---------+---------+---------+---------+1320 TGGCAATTTTCTGGGCTTGTACCTAGCATAAGTCAGCTGTGAATTGTGTCATAAAGAACT P L K D P N M D R I Q S T L N T V F L D

. . . . RBS . . TCAAAAGGAAGCTTATCAAGCTGAGCATGCAGCAGAATTGAAGGGAGGTGATACTAATGC 1321---------+---------+---------+---------+---------+---------+1380 AGTTTTCCTTCGAATAGTTCGACTCGTACGTCGTCTTAACTTCCCTCCACTATGATTACG Q K E A Y Q A E H A A E L K G G D T N A orf209 è M P . . . . . . CAAAGGAAATCAGAATGGCAGCGGCACCAATGCAAATTCGTGATGGTGATGATGATCATC 1381---------+---------+---------+---------+---------+---------+1440 GTTTCCTTTAGTCTTACCGTCGCCGTGGTTACGTTTAAGCACTACCACTACTACTAGTAG K G N Q N G S G T N A N S * K E I R M A A A P M Q I R D G D D D H P

. . . . . . CTGCCGTTATTGAGGGCTATGCCCTTAAGTTCGACAGGCAATCCGAGATTATGGGCAGTG 1441---------+---------+---------+---------+---------+---------+1500 GACGGCAATAACTCCCGATACGGGAATTCAAGCTGTCCGTTAGGCTCTAATACCCGTCAC A V I E G Y A L K F D R Q S E I M G S G

. . . . . . GTGAGCTGAGTTTCCGCGAACACATTGACCCACACGCACTGGACAATGCGGACATGAGTA 1501---------+---------+---------+---------+---------+---------+1560 CACTCGACTCAAAGGCGCTTGTGTAACTGGGTGTGCGTGACCTGTTACGCCTGTACTCAT E L S F R E H I D P H A L D N A D M S N

. . . . . . ACGTTGTTGCGCTATTTAATCATGACCAGAACCAAGTGTTAGGCCGCACGGGAGTCAATT 1561---------+---------+---------+---------+---------+---------+1620 TGCAACAACGCGATAAATTAGTACTGGTCTTGGTTCACAATCCGGCGTGCCCTCAGTTAA V V A L F N H D Q N Q V L G R T G V N L

. . . . . . TAGAGCTGACGGTTGATGAAACGGGGCTCAAATATACGTTGACACCTCCAGATACACAGC 1621---------+---------+---------+---------+---------+---------+1680 ATCTCGACTGCCAACTACTTTGCCCCGAGTTTATATGCAACTGTGGAGGTCTATGTGTCG E L T V D E T G L K Y T L T P P D T Q L

. . . . . . TTGGGCGTGATTTGTTAGAAAACGTTCGTCGGGGAATTATCAGCCAATCAAGTTTTGCAT 1681---------+---------+---------+---------+---------+---------+1740 AACCCGCACTAAACAATCTTTTGCAAGCAGCCCCTTAATAGTCGGTTAGTTCAAAACGTA G R D L L E N V R R G I I S Q S S F A F

. . . . . . TCACGATTGCACCAGACAAAGATGCACAGAAGTGGCAAAAATCTAATGAACGTGGTGTGA 1741---------+---------+---------+---------+---------+---------+1800 AGTGCTAACGTGGTCTGTTTCTACGTGTCTTCACCGTTTTTAGATTACTTGCACCACACT T I A P D K D A Q K W Q K S N E R G V K

Anexo II

. . . . . . AGTATGACCGCACTATCAACAATATTGATCATTTGTTTGATGTCTCTCCAGTAACCACGC 1801---------+---------+---------+---------+---------+---------+1860 TCATACTGGCGTGATAGTTGTTATAACTAGTAAACAAACTACAGAGAGGTCATTGGTGCG Y D R T I N N I D H L F D V S P V T T P

. . . . . . CAGCATATCCGGATACTGAGGTAAAGGTCGGAGCACGATCGTTGGAACAGATAAAAGCGC 1861---------+---------+---------+---------+---------+---------+1920 GTCGTATAGGCCTATGACTCCATTTCCAGCCTCGTGCTAGCAACCTTGTCTATTTTCGCG A Y P D T E V K V G A R S L E Q I K A L

. . . . . . TAGATCAGCCGCCAGAATGGGAACTTAAGCGGTGTAAGATGCTTTATCAATTGAATAAAG 1921---------+---------+---------+---------+---------+---------+1980 ATCTAGTCGGCGGTCTTACCCTTGAATTCGCCACATTCTACGAAATAGTTAACTTATTTC D Q P P E W E L K R C K M L Y Q L N K E

. . . . . RBS . AGGACTTGCTCAAAGACATCGAATAATCGGTGCCTATTTTTATACAAAAAATAAGGAGGG 1981---------+---------+---------+---------+---------+---------+2040 TCCTGAACGAGTTTCTGTAGCTTATTAGCCACGGATAAAAATATGTTTTTTATTCCTCCC D L L K D I E *

. . . . . . TCACTAGATGACTTTAGATGAAAAATTAGCTGCTGTTAAAAAGCAACTTGATGAAAAGCG 2041---------+---------+---------+---------+---------+---------+2100 AGTGATCTACTGAAATCTACTTTTTAATCGACGACAATTTTTCGTTGAACTACTTTTCGCorfEFG è M T L D E K L A A V K K Q L D E K R Cremallera de leucinas . . . . . . TTCAGCGTTGCCAGCTATGAAGACAGAACTTCGTTCTTTACTTGAAGGTGAAGATTCCGA 2101---------+---------+---------+---------+---------+---------+2160 AAGTCGCAACGGTCGATACTTCTGTCTTGAAGCAAGAAATGAACTTCCACTTCTAAGGCT S A L P A M K T E L R S L L E G E D S E

. . . . . . GGAAAACCTGAAGAAGGCAGAAGGCGTTCGTGCCAAGTATGATAAAGCTGGCAAAGAGAT 2161---------+---------+---------+---------+---------+---------+2220 CCTTTTGGACTTCTTCCGTCTTCCGCAAGCACGGTTCATACTATTTCGACCGTTTCTCTA E N L K K A E G V R A K Y D K A G K E I

. . . . . . CAAAGATCTTGAAGAAAAACGTGACTTATACGAGGCTGCGTTGAAAGGCAATGAACAGTC 2221---------+---------+---------+---------+---------+---------+2280 GTTTCTAGAACTTCTTTTTGCACTGAATATGCTCCGACGCAACTTTCCGTTACTTGTCAG K D L E E K R D L Y E A A L K G N E Q S

. . . . . . GAGTGGGAAGAAGCCCGATCATCCGGAAGAGCATAGCTATCGCGATGCACTGAATGCTTA 2281---------+---------+---------+---------+---------+---------+2340 CTCACCCTTCTTCGGGCTAGTAGGCCTTCTCGTATCGATAGCGCTACGTGACTTACGAAT S G K K P D H P E E H S Y R D A L N A Y

. . . . . . TTTGCATACTCGTGGTCGTAATACTGATGGCGTCAATTTTGAAAAGACTGATGTTGGCAC 2341---------+---------+---------+---------+---------+---------+2400 AAACGTATGAGCACCAGCATTATGACTACCGCAGTTAAAACTTTTCTGACTACAACCGTG L H T R G R N T D G V N F E K T D V G T

Anexo II

. . . . . . ATTTGCAGTTTTACGAGCTGTTCCTACTGATGCCAGTGATGCGGTAAATGCCGGTGTCAA 2401---------+---------+---------+---------+---------+---------+2460 TAAACGTCAAAATGCTCGACAAGGATGACTACGGTCACTACGCCATTTACGGCCACAGTT F A V L R A V P T D A S D A V N A G V K gpE gpF gpG . . . . . . GGCTGCAGACGCGGCCTCGACCATTCCAGAAACTATTAGCAATACACCACAGCGTGAATT 2461---------+---------+---------+---------+---------+---------+2520 CCGACGTCTGCGCCGGAGCTGGTAAGGTCTTTGATAATCGTTATGTGGTGTCGCACTTAA A A D A A S T I P E T I S N T P Q R E L

. . . . . . GCAGACTGTTGTTGATCTGAAACCTTTCACGAACGTATTCCAAGCCTCTACACAAAAGGG 2521---------+---------+---------+---------+---------+---------+2580 CGTCTGACAACAACTAGACTTTGGAAAGTGCTTGCATAAGGTTCGGAGATGTGTTTTCCC Q T V V D L K P F T N V F Q A S T Q K G é . . . . . . TACTTACCCAACAGTTGCAAATGCCACAACCAAGATGGTCACTGTCGCCGAGTTGGAAAA 2581---------+---------+---------+---------+---------+---------+2640 ATGAATGGGTTGTCAACGTTTACGGTGTTGGTTCTACCAGTGACAGCGGCTCAACCTTTT T Y P T V A N A T T K M V T V A E L E K

. . EcoRI . . . . GAACCCAGCAATGGCAAAACCAGAATTCAAGCCGGTCAACTGGTCTGTTGAAACGTATCG 2641---------+---------+---------+---------+---------+---------+2700 CTTGGGTCGTTACCGTTTTGGTCTTAAGTTCGGCCAGTTGACCAGACAACTTTGCATAGC N P A M A K P E F K P V N W S V E T Y R

. . . . . . TCAGGCGTTACCAGTATCGCAGGAGTCAATTGACGACTCTGCGATTGATTTGGTTGGCCT 2701---------+---------+---------+---------+---------+---------+2760 AGTCCGCAATGGTCATAGCGTCCTCAGTTAACTGCTGAGACGCTAACTAAACCAACCGGA Q A L P V S Q E S I D D S A I D L V G L

. . . . . . GATTGCCCAGAACGGACAACAGATTAAGGTCAATACGACTAACGGTGCTGTTGCAACTCT 2761---------+---------+---------+---------+---------+---------+2820 CTAACGGGTCTTGCCTGTTGTCTAATTCCAGTTATGCTGATTGCCACGACAACGTTGAGA I A Q N G Q Q I K V N T T N G A V A T L

. . . . . . GCTGAAAGGCTTCACTGCCAAGACAATCTCTAGCGTTGATGATTTGAAGCATATCAATAA 2821---------+---------+---------+---------+---------+---------+2880 CGACTTTCCGAAGTGACGGTTCTGTTAGAGATCGCAACTACTAAACTTCGTATAGTTATT L K G F T A K T I S S V D D L K H I N N

. . . . . . CGTTGATTTAGATCCTGCATATTCTCGTGTAATTATTGCTTCACAGAGTTTCTACAATTT 2881---------+---------+---------+---------+---------+---------+2940 GCAACTAAATCTAGGACGTATAAGAGCACATTAATAACGAAGTGTCTCAAAGATGTTAAA V D L D P A Y S R V I I A S Q S F Y N F

. . . . . . CTTGGACACAGTTAAAGATGGCAATGGTCGCTACTTGCTACAAGATAGCATCTTGACCCC 2941---------+---------+---------+---------+---------+---------+3000 GAACCTGTGTCAATTTCTACCGTTACCAGCGATGAACGATGTTCTATCGTAGAACTGGGG L D T V K D G N G R Y L L Q D S I L T P

Anexo II

. . . . . . GTCTGGCAAGAGCGTTCTTGGTATGCCGATTGCTGTTGTATCTGATGATACTTTGGGTGC 3001---------+---------+---------+---------+---------+---------+3060 CAGACCGTTCTCGCAAGAACCATACGGCTAACGACAACATAGACTACTATGAAACCCACG S G K S V L G M P I A V V S D D T L G A

. . . . . . AGCAGGCGAAGCACACGCCTTTTTGGGTGACATCAAGCGGGCAATTCTGTTTGCTAACCG 3061---------+---------+---------+---------+---------+---------+3120 TCGTCCGCTTCGTGTGCGGAAAAACCCACTGTAGTTCGCCCGTTAAGACAAACGATTGGC A G E A H A F L G D I K R A I L F A N R é . . . . . . CGCAGACTTCATGGTTCGCTGGGTTGATGATCAGATTTACGGCCAATTCTTGCAAGCAGG 3121---------+---------+---------+---------+---------+---------+3180 GCGTCTGAAGTACCAAGCGACCCAACTACTAGTCTAAATGCCGGTTAAGAACGTTCGTCC A D F M V R W V D D Q I Y G Q F L Q A G

. . . . . . AATGCGCTTTGGTGTATCTGTTGCTGACGAAAAGGCTGGCTACTTCCTCACATACACCCC 3181---------+---------+---------+---------+---------+---------+3240 TTACGCGAAACCACATAGACAACGACTGCTTTTCCGACCGATGAAGGAGTGTATGTGGGG M R F G V S V A D E K A G Y F L T Y T P

. . . . . . AAAAGCGTAACGCCTGACGGAGTGACTTTGAGCCAGAAAACGCTCACGGGTGCTGTCGGT 3241---------+---------+---------+---------+---------+---------+3300 TTTTCGCATTGCGGACTGCCTCACTGAAACTCGGTCTTTTGCGAGTGCCCACGACAGCCA K A *

. . . . . . TCCACAAAAGACATCACGGTGACAGTCACTCCTGATGGCGCTCCTCAAGCAGTCGAAGCT 3301---------+---------+---------+---------+---------+---------+3360 AGGTGTTTTCTGTAGTGCCACTGTCAGTGAGGACTACCGCGAGGAGTTCGTCAGCTTCGA

. . . . . . GTGTCGAGCGATGAAAGTGTCGCTACGGTTGTTAAGAAGTCCGATGGTGTTTACACCATT 3361---------+---------+---------+---------+---------+---------+3420 CACAGCTCGCTACTTTCACAGCGATGCCAACAATTCTTCAGGCTACCACAAATGTGGTAA

. . . . . . ACCAATCTGGCAGCGGGTGCAGCGACAATCACATTTAGCACTAATGGCATCAGATCAACA 3421---------+---------+---------+---------+---------+---------+3480 TGGTTAGACCGTCGCCCACGTCGCTGTTAGTGTAAATCGTGATTACCGTAGTCTAGTTGT

. . . . . . CTTGCCGTTACTGTTAACGCCGGGTAGGTGATTACTCTTGGCAGATACTACGCTTGACAA 3481---------+---------+---------+---------+---------+---------+3540 GAACGGCAATGACAATTGCGGCCCATCCACTAATGAGAACCGTCTATGATGCGAACTGTT

. . . . . . AAGCCCACTGACTGATGAACAGTTTCAGGTTCTGAAAATGTACTTGAAAGTTGATCAGAC 3541---------+---------+---------+---------+---------+---------+3600 TTCGGGTGACTGACTACTTGTCAAAGTCCAAGACTTTTACATGAACTTTCAACTAGTCTG

. . . . . . AATCGAAGACCCAATGATTATGCAACTGGTGAATGACGCTTGTGGTGAAATCAGTTCGGC 3601---------+---------+---------+---------+---------+---------+3660 TTAGCTTCTGGGTTACTAATACGTTGACCACTTACTGCGAACACCACTTTAGTCAAGCCG

Anexo II

. . . . . . TATTAGTTTTGGATCAAATCCGGAACAATTTCTAAGCAATCCAGAAACTCGGGATCGTTT 3661---------+---------+---------+---------+---------+---------+3720 ATAATCAAAACCTAGTTTAGGCCTTGTTAAAGATTCGTTAGGTCTTTGAGCCCTAGCAAA

. . RBS . . . . CTTCACAGCGCTCATGAAGCAAGTGAAGGAAGACTATGACTACCGAGGTATGGGTGCTGA 3721---------+---------+---------+---------+---------+---------+3780 GAAGTGTCGCGAGTACTTCGTTCACTTCCTTCTGATACTGATGGCTCCATACCCACGACT orf146 è M T T E V W V L K

. . . . . . AGTCATGCGCTTTCCGTTGCAAACATCAACCACAAATATTATCAATCAGCTTCGCTCAGA 3781---------+---------+---------+---------+---------+---------+3840 TCAGTACGCGAAAGGCAACGTTTGTAGTTGGTGTTTATAATAGTTAGTCGAAGCGAGTCT S C A F R C K H Q P Q I L S I S F A Q N

. . . . . . ATTGCCGGAAGAGGATGGTGATTCTGATGCGAATTAATCGAATGACTGAGAGAATTGCGT 3841---------+---------+---------+---------+---------+---------+3900 TAACGGCCTTCTCCTACCACTAAGACTACGCTTAATTAGCTTACTGACTCTCTTAACGCA C R K R M V I L M R I N R M T E R I A F

. . . . . . TCGTCAGCTATGAGTCAAAAAAGGTTAACGGAGTTCCGGTTGATGGTGTGATCGTTAAGC 3901---------+---------+---------+---------+---------+---------+3960 AGCAGTCGATACTCAGTTTTTTCCAATTGCCTCAAGGCCAACTACCACACTAGCAATTCG V S Y E S K K V N G V P V D G V I V K H

. . . . . . ATATGACGGTTTGGGCGGAAGTTCCTAAGGTACCAATCAGAGAAGCAAATGATCCACAGA 3961---------+---------+---------+---------+---------+---------+4020 TATACTGCCAAACCCGCCTTCAAGGATTCCATGGTTAGTCTCTTCGTTTACTAGGTGTCT M T V W A E V P K V P I R E A N D P Q T

. . . . . . CGAAGTTGGGCACTCGCAAAGACAGCCCGACTTTTTTAGTGCGATTTTTGACCGCAGAGG 4021---------+---------+---------+---------+---------+---------+4080 GCTTCAACCCGTGAGCGTTTCTGTCGGGCTGAAAAAATCACGCTAAAAACTGGCGTCTCC K L G T R K D S P T F L V R F L T A E E

. EcoRI . . . . AAATCCAACCAACTTGGAGAATTCAATGGCGTGGTAATGAATATCAAATCACGGGTCTTG 4081---------+---------+---------+---------+---------+---------+4140 TTTAGGTTGGTTGAACCTCTTAAGTTACCGCACCATTACTTATAGTTTAGTGCCCAGAAC I Q P T W R I Q W R G N E Y Q I T G L D

. . . . RBS . . ATCCCGATTACGAGAGGCGCGATCTGACAACGATTACGGCAAAGGCGGTGAGCTGATGGG 4141---------+---------+---------+---------+---------+---------+4200 TAGGGCTAATGCTCTCCGCGCTAGACTGTTGCTAATGCCGTTTCCGCCACTCGACTACCC P D Y E R R D L T T I T A K A V S * orf128 è M G

. . . . . . CGTAAAAGTCACAGGGGATGCTGAACTGCTCGCTAATCTTAACAAACTTCAATTTGGGGT 4201---------+---------+---------+---------+---------+---------+4260 GCATTTTCAGTGTCCCCTACGACTTGACGAGCGATTAGAATTGTTTGAAGTTAAACCCCA V K V T G D A E L L A N L N K L Q F G V

Anexo II

. . . . . . TGCAAAAGAAGCTCGAGCGGCTGTCCGAGATGGTGCACAGAAGTTTGCCGACAAACTGAA 4261---------+---------+---------+---------+---------+---------+4320 ACGTTTTCTTCGAGCTCGCCGACAGGCTCTACCACGTGTCTTCAAACGGCTGTTTGACTT A K E A R A A V R D G A Q K F A D K L K

. . . . . . AAGCAATACGCCTGAGTGGGACGGCGAGACTGATATGAGCGGACATCTGAGAGATGACAT 4321---------+---------+---------+---------+---------+---------+4380 TTCGTTATGCGGACTCACCCTGCCGCTCTGACTATACTCGCCTGTAGACTCTCTACTGTA S N T P E W D G E T D M S G H L R D D I

. . . . . . CAAGCTTTCAAGTGTCCGTGAAACGAGCGGATTAACAGAAGTAGACGTTGGATATGGTAA 4381---------+---------+---------+---------+---------+---------+4440 GTTCGAAAGTTCACAGGCACTTTGCTCGCCTAATTGTCTTCATCTGCAACCTATACCATT K L S S V R E T S G L T E V D V G Y G K

. . . . . . AGATACCGGATGGCGAGCCCACTTTCCAAACTCGGGCACTTCAATGCAGGACCCGCAACA 4441---------+---------+---------+---------+---------+---------+4500 TCTATGGCCTACCGCTCGGGTGAAAGGTTTGAGCCCGTGAAGTTACGTCCTGGGCGTTGT D T G W R A H F P N S G T S M Q D P Q H

. . . . . . TTTCATTGAAGAAACCCAAGAAATCATGCGGCCAGTTGTTATCGCTGCTTTCCTAAGCCA 4501---------+---------+---------+---------+---------+---------+4560 AAAGTAACTTCTTTGGGTTCTTTAGTACGCCGGTCAACAATAGCGACGAAAGGATTCGGT F I E E T Q E I M R P V V I A A F L S H

RBS . . . . . CTTGAAGGAAGGCGGGATGTAATGGCGCCTGAAAAACGTGTTTATGACATCCTGTCAGCC 4561---------+---------+---------+---------+---------+---------+4620 GAACTTCCTTCCGCCCTACATTACCGCGGACTTTTTGCACAAATACTGTAGGACAGTCGG L K E G G M * orf114 è M A P E K R V Y D I L S A

. . . . . . AATTTGGATATTGCTGACAAGGTGTATATAGGTACCCCGAACTTCAATAACCAGACTAGC 4621---------+---------+---------+---------+---------+---------+4680 TTAAACCTATAACGACTGTTCCACATATATCCATGGGGCTTGAAGTTATTGGTCTGATCG N L D I A D K V Y I G T P N F N N Q T S

. . . . . . GCAACTCCCGAGAGTCTAGCTCCATGGGTGAGAATCACTTATTTGCCCGGTGATGCTGCT 4681---------+---------+---------+---------+---------+---------+4740 CGTTGAGGGCTCTCAGATCGAGGTACCCACTCTTAGTGAATAAACGGGCCACTACGACGA A T P E S L A P W V R I T Y L P G D A A

. . . . . . GACTATGCTGACGATTCTAGGATTCTAGAGTATCCGAAAGTACAAGTAGATTTTTGGGTG 4741---------+---------+---------+---------+---------+---------+4800 CTGATACGACTGCTAAGATCCTAAGATCTCATAGGCTTTCATGTTCATCTAAAAACCCAC D Y A D D S R I L E Y P K V Q V D F W V

. . . . . . GGTATAACGGACTGGGATCAACAAGAAAAGATAGAAACACAGATATATCAAGCACTACAC 4801---------+---------+---------+---------+---------+---------+4860 CCATATTGCCTGACCCTAGTTGTTCTTTTCTATCTTTGTGTCTATATAGTTCGTGATGTG G I T D W D Q Q E K I E T Q I Y Q A L H

Anexo II

. . . . . . GCGGCTGACTGGGAAAGGTATTATCGCAACTCCTACGTTGATGGGATACCCCAGCCCTTC 4861---------+---------+---------+---------+---------+---------+4920 CGCCGACTGACCCTTTCCATAATAGCGTTGAGGATGCAACTACCCTATGGGGTCGGGAAG A A D W E R Y Y R N S Y V D G I P Q P F

. . . . . . GCATGACAACAGGATACTTTCAGTTTCAAGGACTGCCGATTGGCTAGTCCTTTTTAATTT 4921---------+---------+---------+---------+---------+---------+4980 CGTACTGTTGTCCTATGAAAGTCAAAGTTCCTGACGGCTAACCGATCAGGAAAAATTAAA A *

RBS . . . . . CCTAAAGGAGGATTTTTAATATGGCAGATACTGCTGTAACAACTAATAAGAAGTTAGCAA 4981---------+---------+---------+---------+---------+---------+5040 GGATTTCCTCCTAAAAATTATACCGTCTATGACGACATTGTTGATTATTCTTCAATCGTT orfD è M A D T A V T T N K K L A K gpD . . . . . . AATTTGGGGCTTCGGCCTTTGAATACGGGTTGGTCGGTGATGACGACTTTGGTCTAAGCA 5041---------+---------+---------+---------+---------+---------+5100 TTAAACCCCGAAGCCGGAAACTTATGCCCAACCAGCCACTACTGCTGAAACCAGATTCGT F G A S A F E Y G L V G D D D F G L S T

. . . . . . CACGAAAGATGCAAGGCTTATCTAGTGTGAAATTGGATATTAAAACAGAGCAAAAGACCC 5101---------+---------+---------+---------+---------+---------+5160 GTGCTTTCTACGTTCCGAATAGATCACACTTTAACCTATAATTTTGTCTCGTTTTCTGGG R K M Q G L S S V K L D I K T E Q K T L

. . . . . . TGTCCGCTGATGATGGCCCGTACTTGATTCTTTCTGGTGGTATCACAGAAGCAACCGAAA 5161---------+---------+---------+---------+---------+---------+5220 ACAGGCGACTACTACCGGGCATGAACTAAGAAAGACCACCATAGTGTCTTCGTTGGCTTT S A D D G P Y L I L S G G I T E A T E T

. . . . . . CAATCGAAATGTACGATGTTGATTCCGTTATGAAGTCTGATTTATTTGGCATTAAGGTTG 5221---------+---------+---------+---------+---------+---------+5280 GTTAGCTTTACATGCTACAACTAAGGCAATACTTCAGACTAAATAAACCGTAATTCCAAC I E M Y D V D S V M K S D L F G I K V V

. . . . . . TTAATGGGGTTGAAGTATATCCAAAGAACCTTAGCCCTAATTACGCCGCAACTTTGTTCC 5281---------+---------+---------+---------+---------+---------+5340 AATTACCCCAACTTCATATAGGTTTCTTGGAATCGGGATTAATGCGGCGTTGAAACAAGG N G V E V Y P K N L S P N Y A A T L F R

. . . . . . GCACGAAGCTTTCAAATGGCAAGTACGTTTGGGTTGGTATGCTCAAGGGAATGTTCTCAC 5341---------+---------+---------+---------+---------+---------+5400 CGTGCTTCGAAAGTTTACCGTTCATGCAAACCCAACCATACGAGTTCCCTTACAAGAGTG T K L S N G K Y V W V G M L K G M F S L

. . . . . . TTCCGGGCGTTGATACCAAGACTGTTGACGGCACACCAGATCCAAGTGCTGACAGTATCG 5401---------+---------+---------+---------+---------+---------+5460 AAGGCCCGCAACTATGGTTCTGACAACTGCCGTGTGGTCTAGGTTCACGACTGTCATAGC P G V D T K T V D G T P D P S A D S I E

Anexo II

. . . . . . AAGGCTCATTTATTCCTCGAGGTGACCAAGACACTGGCAATGTTGTGTTGATTGGTCGTG 5461---------+---------+---------+---------+---------+---------+5520 TTCCGAGTAAATAAGGAGCTCCACTGGTTCTGTGACCGTTACAACACAACTAACCAGCAC G S F I P R G D Q D T G N V V L I G R E

. . . . . . AAGACAACGATGGATTCGATTTTGATAAGTTCCACGGATATGTATTCCCTAAGACTGCTG 5521---------+---------+---------+---------+---------+---------+5580 TTCTGTTGCTACCTAAGCTAAAACTATTCAAGGTGCCTATACATAAGGGATTCTGACGAC D N D G F D F D K F H G Y V F P K T A E

. . . . . . AAGACGCGACTATTGCCCCAAAAGCGTAGTCGGTGTCAGCTTTGAGAACAGCTCGATTAA 5581---------+---------+---------+---------+---------+---------+5640 TTCTGCGCTGATAACGGGGTTTTCGCATCAGCCACAGTCGAAACTCTTGTCGAGCTAATT D A T I A P K A *

. . . . . . CCTTGCGGTTGGCGCATCTACAGTGCTAAAAGTGCAAATTAATCCGGCTGATGCCGCAAA 5641---------+---------+---------+---------+---------+---------+5700 GGAACGCCAACCGCGTAGATGTCACGATTTTCACGTTTAATTAGGCCGACTACGGCGTTT

. . . . . . TAAACAAGTTGCTTTCAAAACGTCAGATCCTACCGTTGCCACCGTTTCCAGTGATGGAAC 5701---------+---------+---------+---------+---------+---------+5760 ATTTGTTCAACGAAAGTTTTGCAGTCTAGGATGGCAACGGTGGCAAAGGTCACTACCTTG

. . . . . . TGTGGCTGGTGTAAAGGCAGGGTCTGCAACTGTAACAGTCACAACTGACGATGGTGGTAA 5761---------+---------+---------+---------+---------+---------+5820 ACACCGACCACATTTCCGTCCCAGACGTTGACATTGTCAGTGTTGACTGCTACCACCATT

. . . . . . AACTGCCACCGCAACTGTAACTGTGGCTTAGCAATGAACTCCGTCGCCTTGTAAATGCAC 5821---------+---------+---------+---------+---------+---------+5880 TTGACGGTGGCGTTGACATTGACACCGAATCGTTACTTGAGGCAGCGGAACATTTACGTG

. . RBS . . . AATACGCGAACAGCGGGCGGCTTATACCTAAGGAGATTAAGCATGGCATATCAAATTAAA 5881---------+---------+---------+---------+---------+---------+5940 TTATGCGCTTGTCGCCCGCCGAATATGGATTCCTCTAATTCGTACCGTATAGTTTAATTT orf73 è M A Y Q I K

. . . . . . CTAAATATCAAAGGCGAAACGTGTGTGTTCACACGAAATGGAGAGCCAACATTACGTGAT 5941---------+---------+---------+---------+---------+---------+6000 GATTTATAGTTTCCGCTTTGCACACACAAGTGTGCTTTACCTCTCGGTTGTAATGCACTA L N I K G E T C V F T R N G E P T L R D

. . . . . . ACCACGAATGCCTTGAAAGTGCAGCAACAACAGCTGCGCATGCTAAACCGAAAAGATGGC 6001---------+---------+---------+---------+---------+---------+6060 TGGTGCTTACGGAACTTTCACGTCGTTGTTGTCGACGCGTACGATTTGGCTTTTCTACCG T T N A L K V Q Q Q Q L R M L N R K D G

. . . . . . CCTTCAAACGATGATTACGATGATAACGAGAAAAACTTAGCCAAATTTTCGGTTGATTTC 6061---------+---------+---------+---------+---------+---------+6120 GGAAGTTTGCTACTAATGCTACTATTGCTCTTTTTGAATCGGTTTAAAAGCCAACTAAAG P S N D D Y D D N E K N L A K F S V D F

Anexo II

. . . . . . TGGAAAAACCAGTTTACCCGATGATGTTTAATTGATGGCTCATCTATTTCTTTGAAATCG 6121---------+---------+---------+---------+---------+---------+6180 ACCTTTTTGGTCAAATGGGCTACTACAAATTAACTACCGAGTAGATAAAGAAACTTTAGC W K N Q F T R *

. . . . . . CTGGATTCAATCAATGATGCCATTGCGATTCTCTAAGCGATGCGAAGAGGATAAGAAGGA 6181---------+---------+---------+---------+---------+---------+6240 GACCTAAGTTAGTTACTACGGTAACGCTAAGAGATTCGCTACGCTTCTCCTATTCTTCCT

. . . . . . CACAGCAAAAAAATCACCGAAGCGGACGTCAAAGAAGCCATTAGCAACCTTGACGACTTC 6241---------+---------+---------+---------+---------+---------+6300 GTGTCGTTTTTTTAGTGGCTTCGCCTGCAGTTTCTTCGGTAATCGTTGGAACTGCTGAAG

. . . . . . TACAAAGCAAGGCTCTCTGAAGGCTACCGATTAGCTGACGTTGATGCTATGACGCTCCGC 6301---------+---------+---------+---------+---------+---------+6360 ATGTTTCGTTCCGAGAGACTTCCGATGGCTAATCGACTGCAACTACGATACTGCGAGGCG

. . . . . . GATATTGAAAAACTTAACCAGATTTACGAGGAACGGGAGACCACGATCGACAAGGCCTTT 6361---------+---------+---------+---------+---------+---------+6420 CTATAACTTTTTGAATTGGTCTAAATGCTCCTTGCCCTCTGGTGCTAGCTGTTCCGGAAA

. . RBS . . . CCGTTCCTTTTCTAGTTCTATGAAAGGAGGTAAAACATGTTAGGAAATCTCGGACAAATT 6421---------+---------+---------+---------+---------+---------+6480 GGCAAGGAAAAGATCAAGATACTTTCCTCCATTTTGTACAATCCTTTAGAGCCTGTTTAA orf465 è M L G N L G Q I

. . . . . . GCGGCTACCGTAAGCTTGAACATTGATCCGTTTCAAGTAAGCCAGCGAGTTTTGAACTCT 6481---------+---------+---------+---------+---------+---------+6540 CGCCGATGGCATTCGAACTTGTAACTAGGCAAAGTTCATTCGGTCGCTCAAAACTTGAGA A A T V S L N I D P F Q V S Q R V L N S

. . . . . . TCAATTAAAGCAACTGCCGCTGAGTTGCGGGCTCAAGATGCTGCGTTTAAGGGCTCTGAA 6541---------+---------+---------+---------+---------+---------+6600 AGTTAATTTCGTTGACGGCGACTCAACGCCCGAGTTCTACGACGCAAATTCCCGAGACTT S I K A T A A E L R A Q D A A F K G S E

. . . . . . AAGTCTATCAACAACATGCGTTCAACCTATGACACATTGAGCCGCCAGTCAAAGAACTAC 6601---------+---------+---------+---------+---------+---------+6660 TTCAGATAGTTGTTGTACGCAAGTTGGATACTGTGTAACTCGGCGGTCAGTTTCTTGATG K S I N N M R S T Y D T L S R Q S K N Y

. . . . . . CAAGCTCAGCTTCAGAAACAGCGAGAACAGTATGATGAAAATTCGAAAGCGGTTGAAAAA 6661---------+---------+---------+---------+---------+---------+6720 GTTCGAGTCGAAGTCTTTGTCGCTCTTGTCATACTACTTTTAAGCTTTCGCCAACTTTTT Q A Q L Q K Q R E Q Y D E N S K A V E K

. . . . . . CTTAATAAAAGTGAGACTGCATCGCAGGAAGAAATTAATCGTGCGACAAAACTGCAAGCT 6721---------+---------+---------+---------+---------+---------+6780 GAATTATTTTCACTCTGACGTAGCGTCCTTCTTTAATTAGCACGCTGTTTTGACGTTCGA L N K S E T A S D Q Q I N R A T K L Q A

Anexo II

. . . . . . AATGCTGCATCACAGTATAATCGGACTGCTGCCGCTGCTGCTCAAAATGAAAATCGAATG 6781---------+---------+---------+---------+---------+---------+6840 TTACGACGTAGTGTCATATTAGCCTGACGACGGCGACGACGAGTTTTACTTTTAGCTTAC N A A S Q Y N R T A A A A A Q N E N R M

. . . . . . GCGGCCTTACGCAAAGAGATTGCGCTGCAAAGTGACGGCTGGACTAAAGTATCAAACGGT 6841---------+---------+---------+---------+---------+---------+6900 CGCCGGAATGCGTTTCTCTAACGCGACGTTTCACTGCCGACCTGATTTCATAGTTTGCCA A A L R K E I A L Q S D G W T K V S N G

. . . . . . GCATCAAAGTTTGCATCTGTTACCGAAAAGACAAGCTCTAAGCTAACCAGTTTCGGATCA 6901---------+---------+---------+---------+---------+---------+6960 CGTAGTTTCAAACGTAGACAATGGCTTTTCTGTTCGAGATTCGATTGGTCAAAGCCTAGT A S K F A S V T E K T S S K L T S F G S

. . . . . . ACGATGACAAGGGCGGTAACTGCTCCAATTGCCATTGGATTTGTAGCAGCCGCTAAATCT 6961---------+---------+---------+---------+---------+---------+7020 TGCTACTGTTCCCGCCATTGACGAGGTTAACGGTAACCTAAACATCGTCGGCGATTTAGA T M T R A V T A P I A I G F V A A A K S

. . . . . . GCCATTGATTTCAACAGCCAGATTCAAGCAATGGGACCTTTGCTAACAAATGGGGGTGCG 7021---------+---------+---------+---------+---------+---------+7080 CGGTAACTAAAGTTGTCGGTCTAAGTTCGTTACCCTGGAAACGATTGTTTACCCCCACGC A I D F N S Q I Q A M G P L L T N G G A

. . . . . . ATTACTGCCAAGTATCGTGCGCAACTTGATCAACTAGCATCAGCATCTAAAAAGTGGTCG 7081---------+---------+---------+---------+---------+---------+7140 TAATGACGGTTCATAGCACGCGTTGAACTAGTTGATCGTAGTCGTAGATTTTTCACCAGC I T A K Y R A Q L D Q L A S A S K K W S

. . . . . . GTTGAATATGGCGTTTCCACGGCTGCAATTAACGACGGCATGTCAGAAATGATCAAACGT 7141---------+---------+---------+---------+---------+---------+7200 CAACTTATACCGCAAAGGTGCCGACGTTAATTGCTGCCGTACAGTCTTTACTAGTTTGCA V E Y G V S T A A I N D G M S E M I K R

. . . . . . GGCTATACCGCTGCGCAAACATTAGGCGCAATGCCTGCAGTTCTCAATGCGGCAAAAGCG 7201---------+---------+---------+---------+---------+---------+7260 CCGATATGGCGACGCGTTTGTAATCCGCGTTACGGACGTCAAGAGTTACGCCGTTTTCGC G Y T A A Q T L G A M P A V L N A A K A

. . . . . . TCTGGCGATGACTTCAACGATGTTATGCATGTTTCTACATCCGTTTTGGAGCAATTTGGT 7261---------+---------+---------+---------+---------+---------+7320 AGACCGCTACTGAAGTTGCTACAATACGTACAAAGATGTAGGCAAAACCTCGTTAAACCA S G D D F N D V M H V S T S V L E Q F G

. . . . . . CTAAAGACAGAATCAACAACGGGCATGCTTAAAAACACGTCTCGCGTTACAGATACTCTT 7321---------+---------+---------+---------+---------+---------+7380 GATTTCTGTCTTAGTTGTTGCCCGTACGAATTTTTGTGCAGAGCGCAATGTCTATGAGAA L K T E S T T G M L K N T S R V T D T L

Anexo II

. . . . . . ACCTATATTGCGAACGCTACTGCAGCAGGGTTCCAAGATATGGGCGAGGCAATGACGTAT 7381---------+---------+---------+---------+---------+---------+7440 TGGATATAACGCTTGCGATGACGTCGTCCCAAGGTTCTATACCCGCTCCGTTACTGCATA T Y I A N A T A A G F Q D M G E A M T Y

. . . . . . GTCGGACCTTCTGCTCATGCTGCTGGTATTTCACTCGAAGAAACAGCGGCTGCTATTGGC 7441---------+---------+---------+---------+---------+---------+7500 CAGCCTGGAAGACGAGTACGACGACCATAAAGTGAGCTTCTTTGTCGCCGACGATAACCG V G P S A H A A G I S L E E T A A A I G

. . . . . . ATTATGAGCAACAAAGGGATTGAAGGATCAGTTGCTGGCACAGCGTTACGTGGTGCTTTA 7501---------+---------+---------+---------+---------+---------+7560 TAATACTCGTTGTTTCCCTAACTTCCTAGTCAACGACCGTGTCGCAATGCACCACGAAAT I M S N K G I E G S V A G T A L R G A L

. . . . . . ACAAGACTGTTGAAGCCTTCTAAGCAAAATCTTCAAGGATTTAATGAATTAGGCATATCT 7561---------+---------+---------+---------+---------+---------+7620 TGTTCTGACAACTTCGGAAGATTCGTTTTAGAAGTTCCTAAATTACTTAATCCGTATAGA T R L L K P S K Q N L Q G F N E L G I S

. . . . . . GTTGCTGATTTTAAAAAAGGAACTCTAACTCTTCCAGAGATTCTTGACAAAATCAAGAAT 7621---------+---------+---------+---------+---------+---------+7680 CAACGACTAAAATTTTTTCCTTGAGATTGAGAAGGTCTCTAAGAACTGTTTTAGTTCTTA V A D F K K G T L T L P E I L D K I K N

. . . . . . AACACTAAGGGGTGGACAGATCAGCAACGTGCTTCTGCAGTAGCGTTGGCTTTTGGCACT 7681---------+---------+---------+---------+---------+---------+7740 TTGTGATTCCCCACCTGTCTAGTCGTTGCACGAAGACGTCATCGCAACCGAAAACCGTGA N T K G W T D Q Q R A S A V A L A F G T

. . . . . . GAAGCGCAATCCGGCATGAATGCCTTAATTAGTGCAGGTGGCGGTGAGCTACCAAATATA 7741---------+---------+---------+---------+---------+---------+7800 CTTCGCGTTAGGCCGTACTTACGGAATTAATCACGTCCACCGCCACTCGATGGTTTATAT E A Q S G M N A L I S A G G G E L P N I . . . . . . CCAGTGAAGCTGAGCATGCTAGCGGAACAACTGCCAAAATTGCTAACCAGTTAAACAATA 7801---------+---------+---------+---------+---------+---------+7860 GGTCACTTCGACTCGTACGATCGCCTTGTTGACGGTTTTAACGATTGGTCAATTTGTTAT P V K L S M L A E Q L P K L L T S *

. . . . . . CGGATGCCGCCAAATTGAAGAGATTTCAAGAGTCGATTCATGTTTTAGGAATTGAAGTAG 7861---------+---------+---------+---------+---------+---------+7920 GCCTACGGCGGTTTAACTTCTCTAAAGTTCTCAGCTAAGTACAAAATCCTTAACTTCATC

. . . . . . GTCCACAAAGCTTCTACCGACGCTGACTCCTCTTATCAAAACAGCAACCGATGTTGTCAA 7921---------+---------+---------+---------+---------+---------+7980 CAGGTGTTTCGAAGATGGCTGCGACTGAGGAGAATAGTTTTGTCGTTGGCTACAACAGTT

. . . . . . TGCCTTTACAAAAATGGACAGTGGTACGCAACAAACCATTATTAAATTTGCAGCGTTTGC 7981---------+---------+---------+---------+---------+---------+8040 ACGGAAATGTTTTTACCTGTCACCATGCGTTGTTTGGTAATAATTTAAACGTCGCAAACG

Anexo II

. . . . . . GGCAGTTGTAGGGCCAGTGAGTTCTCTTATCGGTGGAGCTCTTAAGCCTGTTACTGCTTT 8041---------+---------+---------+---------+---------+---------+8100 CCGTCAACATCCCGGTCACTCAAGAGAATAGCCACCTCGAGAATTCGGACAATGACGAAA

. . . . . . GAGCAAAGGAATATCTGGAATTGCGGGAGTCATTGGGCGAGCATCTGCAGCTGCAAAGCT 8101---------+---------+---------+---------+---------+---------+8160 CTCGTTTCCTTATAGACCTTAACGCCCTCAGTAACCCGCTCGTAGACGTCGACGTTTCGA

RBS . . . . . . CGGCGGAACTGCAATGGATGTGCTCAAGTCTGGCTTTAGTAAGACAGCCTTTGAAGCATT 8161---------+---------+---------+---------+---------+---------+8220 GCCGCCTTGACGTTACCTACACGAGTTCAGACCGAAATCATTCTGTCGGAAACTTCGTAA orf563 è M D V L K S G F S K T A F E A L

. . . . . . GAAGGTTGCACCAGCCGCAGCAGCGGCGGCAGAAGGCACTTCTGGAATGGGAGCAGCATG 8221---------+---------+---------+---------+---------+---------+8280 CTTCCAACGTGGTCGGCGTCGTCGCCGCCGTCTTCCGTGAAGACCTTACCCTCGTCGTAC K V A P A A A A A A E G T S G M G A A W

. . . . . . GGCGGACGCAGCGAGCGGAACAGGATTACTAGCGGCATTGGGGCCAATCGTCCCAGTTGT 8281---------+---------+---------+---------+---------+---------+8340 CCGCCTGCGTCGCTCGCCTTGTCCTAATGATCGCCGTAACCCCGGTTAGCAGGGTCAACA A D A A S G T G L L A A L G P I V P V V

. . . . . . TTTAGGTGTAACAGCAGTCGTCGGTGGTGCCGGTGTAGCCATCTGGGAATTGTGGGGCAA 8341---------+---------+---------+---------+---------+---------+8400 AAATCCACATTGTCGTCAGCAGCCACCACGGCCACATCGGTAGACCCTTAACACCCCGTT L G V T A V V G G A G V A I W E L W G K

. . . . . . AAAGGCTCTTGAGTCTGCCGACAGAACTTCACGATGGGGTACTGATATTGGTGCCGATGC 8401---------+---------+---------+---------+---------+---------+8460 TTTCCGAGAACTCAGACGGCTGTCTTGAAGTGCTACCCCATGACTATAACCACGGCTACG K A L E S A D R T S R W G T D I G A D A

. . . . . . CGACCGATCTGCTTCCAAAATGAAAGATGCCTCTGGGGCAATTTCTGGTGCTTTTGATGA 8461---------+---------+---------+---------+---------+---------+8520 GCTGGCTAGACGAAGGTTTTACTTTCTACGGAGACCCCGTTAAAGACCACGAAAACTACT D R S A S K M K D A S G A I S G A F D D

. . . . . . TACAAACCACACAGTCGAGCAAAATAGCAAAACCATCAAAAAAGGCTTTGATGATATTAC 8521---------+---------+---------+---------+---------+---------+8580 ATGTTTGGTGTGTCAGCTCGTTTTATCGTTTTGGTAGTTTTTTCCGAAACTACTATAATG T N H T V E Q N S K T I K K G F D D I T

. . . . . . GAAGGCCGCTAAAGAATCGTCCAAAAATACCCAAACCGCACTCGACAAGTTGGCGAAGCA 8581---------+---------+---------+---------+---------+---------+8640 CTTCCGGCGATTTCTTAGCAGGTTTTTATGGGTTTGGCGTGAGCTGTTCAACCGCTTCGT K A A K E S S K N T Q T A L D K L A K Q

Anexo II

. . . . . . AGTCGGTGGATCGACTGCTGATCAGATTCATAAAGACGCAGCAGAAATGAAGAAGGCCGA 8641---------+---------+---------+---------+---------+---------+8700 TCAGCCACCTAGCTGACGACTAGTCTAAGTATTTCTGCGTCGTCTTTACTTCTTCCGGCT V G G S T A D Q I H K D A A E M K K A D

. . . . . . CGATGCACGCATCAAGCAAATTGAGGCTAATGCCAAACAAGCTAAGTCAATTACTGAATC 8701---------+---------+---------+---------+---------+---------+8760 GCTACGTGCGTAGTTCGTTTAACTCCGATTACGGTTTGTTCGATTCAGTTAATGACTTAG D A R I K Q I E A N A K Q A K S I T E S

. . . . . . TGCCAGCAAAGAACATGCCGAATTTACTCGAGATCAAATTCAGATTCTGGATAATTTGCG 8761---------+---------+---------+---------+---------+---------+8820 ACGGTCGTTTCTTGTACGGCTTAAATGAGCTCTAGTTTAAGTCTAAGACCTATTAAACGC A S K E H A E F T R D Q I Q I L D N L R

. . . . . . CAAGAGCAGTGCAGCCGAGGCCGTTAAGACACTTAGAATTTCCGGTACCCAACAAGCGAA 8821---------+---------+---------+---------+---------+---------+8880 GTTCTCGTCACGTCGGCTCCGGCAATTCTGTGAATCTTAAAGGCCATGGGTTGTTCGCTT K S S A A E A V K T L R I S G T Q Q A N

. . . . . . TGTCTTAAAAGCTATTAATGGCGAAAAGATTCGGATGAGTCAAGCAGCGGCTAAGGAACA 8881---------+---------+---------+---------+---------+---------+8940 ACAGAATTTTCGATAATTACCGCTTTTCTAAGCCTACTCAGTTCGTCGCCGATTCCTTGT V L K A I N G E K I R M S Q A A A K E Q

. . . . . . GTACAGCCAGATGCAACAGACATTTGCTGACGAAACTGATACTTATGGCAAACATTATGC 8941---------+---------+---------+---------+---------+---------+9000 CATGTCGGTCTACGTTGTCTGTAAACGACTGCTTTGACTATGAATACCGTTTGTAATACG Y S Q M Q Q T F A D E T D T Y G K H Y A

. . . . . . TGCCATTAAAAACTCTGCTGAGTTGAGTACGGCTCAAAAGAATAAAGATCTTGAAAAGCT 9001---------+---------+---------+---------+---------+---------+9060 ACGGTAATTTTTGAGACGACTCAACTCATGCCGAGTTTTCTTATTTCTAGAACTTTTCGA A I K N S A E L S T A Q K N K D L E K L

. . . . . . GGAAAAAGATCATCAAAGCAACATGAGCGTGATTTATGCGGGTGCGATCCAAGCAATGAA 9061---------+---------+---------+---------+---------+---------+9120 CCTTTTTCTAGTAGTTTCGTTGTACTCGCACTAAATACGCCCACGCTAGGTTCGTTACTT E K D H Q S N M S V I Y A G A I Q A M K

. . . . . . AGCGCAAGGACTATCCAACAAGACGATTCAAGAACAACTTCAAACAGAGTTTGGTGCGAC 9121---------+---------+---------+---------+---------+---------+9180 TCGCGTTCCTGATAGGTTGTTCTGCTAAGTTCTTGTTGAAGTTTGTCTCAAACCACGCTG A Q G L S N K T I Q E Q L Q T E F G A T

. . . . . . GGCGTCTCAAGCTAAAAAAGCAATGAGCGCTTATTCAGAGGCGATGAGCAAGGGGGTTAA 9181---------+---------+---------+---------+---------+---------+9240 CCGCAGAGTTCGATTTTTTCGTTACTCGCGAATAAGTCTCCGCTACTCGTTCCCCCAATT A S Q A K K A M S A Y S E A M S K G V K

Anexo II

. . . . . . GGACACAAAGCAGTTTGCCGCCGCTGTATCAGATGGAATGAGCAAGAACGTCAAGAAAGC 9241---------+---------+---------+---------+---------+---------+9300 CCTGTGTTTCGTCAAACGGCGGCGACATAGTCTACCTTACTCGTTCTTGCAGTTCTTTCG D T K Q F A A A V S D G M S K N V K K A

. . . . . . TGGCAACGATTGGAACAAGCTAGTTCTTGATCCAAAAACAGGCAAAGTTATCACGAATCT 9301---------+---------+---------+---------+---------+---------+9360 ACCGTTGCTAACCTTGTTCGATCAAGAACTAGGTTTTTGTCCGTTTCAATAGTGCTTAGA G N D W N K L V L D P K T G K V I T N L

. . . . . . TCCGGAGGTGTTGCACGATACAGCTAATACCAAAGAAGGGTGGAAGCGTCTAACCTTTGA 9361---------+---------+---------+---------+---------+---------+9420 AGGCCTCCACAACGTGCTATGTCGATTATGGTTTCTTCCCACCTTCGCAGATTGGAAACT P E V L H D T A N T K E G W K R L T F D

. . . . . . CTTAAAAAATGCAAAGATTAGCACTAATGCAAAAGAAACAATTGCCATAGCACTGGCATC 9421---------+---------+---------+---------+---------+---------+9480 GAATTTTTTACGTTTCTAATCGTGATTACGTTTTCTTTGTTAACGGTATCGTGACCGTAG L K N A K I S T N A K E T I A I A L A S

. EcoRI . . . . . AACTGATAAGTGGAATTCGCTTAGCGTCGATGAGAAGAACGCAATCATCAAAGAGACTGG 9481---------+---------+---------+---------+---------+---------+9540 TTGACTATTCACCTTAAGCGAATCGCAGCTACTCTTCTTGCGTTAGTAGTTTCTCTGACC T D K W N S L S V D E K N A I I K E T G

. . . . . . CCGAAAAGATTTGGCTGATCTTATGAAGCGCATGGTTTCTTGGAATGATTTAACGCTTGA 9541---------+---------+---------+---------+---------+---------+9600 GGCTTTTCTAAACCGACTAGAATACTTCGCGTACCAAAGAACCTTACTAAATTGCGAACT R K D L A D L M K R M V S W N D L T L E

. . . . . . ACAGCAGCAGGCGGTTGTCAAAGGAGACTATGCACCGCTGATTGACGCGATTATTCAAGC 9601---------+---------+---------+---------+---------+---------+9660 TGTCGTCGTCCGCCAACAGTTTCCTCTGATACGTGGCGACTAACTGCGCTAATAAGTTCG Q Q Q A V V K G D Y A P L I D A I I Q A

. . . . . . TGGTACATGGAATCAACTAGATGTGGAAGACAAGCAAGTCTTGGTAAAAGACAAGGCTAA 9661---------+---------+---------+---------+---------+---------+9720 ACCATGTACCTTAGTTGATCTACACCTTCTGTTCGTTCAGAACCATTTTCTGTTCCGATT G T W N Q L D V E D K Q V L V K D K A N

. . . . . . CATTCCGTTGGTTGATGCACTCGTTAATTCTGGTCGGTGGAACAAGCTTGACCTCAAGAC 9721---------+---------+---------+---------+---------+---------+9780 GTAAGGCAACCAACTACGTGAGCAATTAAGACCAGCCACCTTGTTCGAACTGGAGTTCTG I P L V D A L V N S G R W N K L D L K T

. . . . . . TCAAAATGCGCTTCTACAAGCAAAGGGCAAAAAAGATTTAGAGATGTTTTGTTCAATATG 9781---------+---------+---------+---------+---------+---------+9840 AGTTTTACGCGAAGATGTTCGTTTCCCGTTTTTTCTAAATCTCTACAAAACAAGTTATAC Q N A L L Q A K G K K D L E M F C S I W

Anexo II

RBS . . . . . GGGCTTTGGAACAGCCTCGACATGAATGAGAAATATGCCCAACTAAAGGCAATAGGTAAA 9841---------+---------+---------+---------+---------+---------+9900 CCCGAAACCTTGTCGGAGCTGTACTTACTCTTTATACGGGTTGATTTCCGTTATCCATTT G F G T A S T * orf486 è M N E K Y A Q L K A I G K

. . . . . . ACGGATTTAGCTGACATGATTGATCAGCTAGGACTGTGGGACACTATCACTCCTAAGCAA 9901---------+---------+---------+---------+---------+---------+9960 TGCCTAAATCGACTGTACTAACTAGTCGATCCTGACACCCTGTGATAGTGAGGATTCGTT T D L A D M I D Q L G L W D T I T P K Q

. . . . . . ATGGAGGCTGCAGTTAAAGGGGACTACAGTCAACTAACGGCGGCAATTGATCAGGTTCAT 9961---------+---------+---------+---------+---------+---------+10020 TACCTCCGACGTCAATTTCCCCTGATGTCAGTTGATTGCCGCCGTTAACTAGTCCAAGTA M E A A V K G D Y S Q L T A A I D Q V H

. . . . . . GGCTGGAATCAACTTGATACAAAGCAATTAGAGGCAATAGTTCAGGATAAAGCAACTGTT10021---------+---------+---------+---------+---------+---------+10080 CCGACCTTAGTTGAACTATGTTTCGTTAATCTCCGTTATCAAGTCCTATTTCGTTGACAA G W N Q L D T K Q L E A I V Q D K A T V

. . . . . . CCGCTGATTCAGGCAATGATTCAAAATCAAAAGTGGAATGGCCTTTCGGTTGAAGAAAAG10081---------+---------+---------+---------+---------+---------+10140 GGCGACTAAGTCCGTTACTAAGTTTTAGTTTTCACCTTACCGGAAAGCCAACTTCTTTTC P L I Q A M I Q N Q K W N G L S V E E K

. . . . . . AATGCAATTCTGAAAACTAAAGGCATGCCAGAATTAGCTGACATGGTTGTCAAATATGGC10141---------+---------+---------+---------+---------+---------+10200 TTACGTTAAGACTTTTGATTTCCGTACGGTCTTAATCGACTGTACCAACAGTTTATACCG N A I L K T K G M P E L A D M V V K Y G

. . . . . . TCATTTGATAGTTTACCGGATTCGACAAAACGATTGTTGATAAATGATGACGATGCCAGG10201---------+---------+---------+---------+---------+---------+10260 AGTAAACTATCAAATGGCCTAAGCTGTTTTGCTAACAACTATTTACTACTGCTACGGTCC S F D S L P D S T K R L L I N D D D A R

. . . . . . CAAAAGCTGATTGCTGCTGGAGTCAACATGGATAAATATAATGTCGATGTTAATCCCGAT10261---------+---------+---------+---------+---------+---------+10320 GTTTTCGACTAACGACGACCTCAGTTGTACCTATTTATATTACAGCTACAATTAGGGCTA Q K L I A A G V N M D K Y N V D V N P D

. . . . . . GCCAAAATTTTAAAGGGAGATAGCAGTCCACTATTAGCCGAAACAATTAAAGCCAAAGAA10321---------+---------+---------+---------+---------+---------+10380 CGGTTTTAAAATTTCCCTCTATCGTCAGGTGATAATCGGCTTTGTTAATTTCGGTTTCTT A K I L K G D S S P L L A E T I K A K E

. . . . . . GTAATCGCTGACTATGCAACCGTGTTACCTGATAAAAAGCAGTTCGGCGGAAACTCTAGC10381---------+---------+---------+---------+---------+---------+10440 CATTAGCGACTGATACGTTGGCACAATGGACTATTTTTCGTCAAGCCGCCTTTGAGATCG V I A D Y A T V L P D K K Q F G G N S S

Anexo II

. . . . . . GGCGTTACCAATGCAGCCAAATCTGGCGAAGGAAGCATCGGGCATTACGATACAGTTCTT10441---------+---------+---------+---------+---------+---------+10500 CCGCAATGGTTACGTCGGTTTAGACCGCTTCCTTCGTAGCCCGTAATGCTATGTCAAGAA G V T N A A K S G E G S I G H Y D T V L

. . . . . . CCGGGACTTAAGCTGTTTATCGGTGATTCAAGCAGCGTGACAAATCATGCTGAAAAAGGT10501---------+---------+---------+---------+---------+---------+10560 GGCCCTGAATTCGACAAATAGCCACTAAGTTCGTCGCACTGTTTAGTACGACTTTTTCCA P G L K L F I G D S S S V T N H A E K G

. . . . . . AAGGGCGAAGTCAACAGTTTCAATGGAACTAACCCATCAATGCGTTACTTCATGGGTAAT10561---------+---------+---------+---------+---------+---------+10620 TTCCCGCTTCAGTTGTCAAAGTTACCTTGATTGGGTAGTTACGCAATGAAGTACCCATTA K G E V N S F N G T N P S M R Y F M G N

. . . . . . GCTTCAAGCGTTGTGGGGGCTTCCGGATCTGGTAAAAACAGTATCGGAAGTTTTAATGGA10621---------+---------+---------+---------+---------+---------+10680 CGAAGTTCGCAACACCCCCGAAGGCCTAGACCATTTTTGTCATAGCCTTCAAAATTACCT A S S V V G A S G S G K N S I G S F N G

. . . . . . ACAAATCCGGGAGATAAATATTTCAAAGGCCATGATAATACGACAGGACCCGCAAGTGCT10681---------+---------+---------+---------+---------+---------+10740 TGTTTAGGCCCTCTATTTATAAAGTTTCCGGTACTATTATGCTGTCCTGGGCGTTCACGA T N P G D K Y F K G H D N T T G P A S A

. . . . . . GCCAAACGTGCAGTTAGCGCATTTGGTGGGAATGAAGTCATCACGAAGACTTTCAATTTT10741---------+---------+---------+---------+---------+---------+10800 CGGTTTGCACGTCAATCGCGTAAACCACCCTTACTTCAGTAGTGCTTCTGAAAGTTAAAA A K R A V S A F G G N E V I T K T F N F

. . . . . . GTGGCTAATATTTCGGACAGTATTCGGAAGCTTCTTCACTTGCAGCACGGAACTAATGAT10801---------+---------+---------+---------+---------+---------+10860 CACCGATTATAAAGCCTGTCATAAGCCTTCGAAGAAGTGAACGTCGTGCCTTGATTACTA V A N I S D S I R K L L H L Q H G T N D

. . . . . . CTCCGAACGAGTTCACTGGCGATGGTTAATGATGCCTCCGGATCTAACTATCAAGAGCCT10861---------+---------+---------+---------+---------+---------+10920 GAGGCTTGCTCAAGTGACCGCTACCAATTACTACGGAGGCCTAGATTGATAGTTCTCGGA L R T S S L A M V N D A S G S N Y Q E P

. . . . . . ATTATCACTCCTAATGGCAACATGTTTATGTTCAAAGAACGAAATGTGGTTTTTCCGCTT10921---------+---------+---------+---------+---------+---------+10980 TAATAGTGAGGATTACCGTTGTACAAATACAAGTTTCTTGCTTTACACCAAAAAGGCGAA I I T P N G N M F M F K E R N V V F P L

. . . . . . GCTCGTCACTCAATGGTTATTCCTGCTGATAAGGCTCGTCGAATGAACATTCCACGTTTT10981---------+---------+---------+---------+---------+---------+11040 CGAGCAGTGAGTTACCAATAAGGACGACTATTCCGAGCAGCTTACTTGTAAGGTGCAAAA A R H S M V I P A D K A R R M N I P R F

Anexo II

. . . . . . GCTGGTGGCACCACAGACTTCGGAGGCGCTGCTAATAGAATAAACCAATTGAATCCGCAA11041---------+---------+---------+---------+---------+---------+11100 CGACCACCGTGGTGTCTGAAGCCTCCGCGACGATTATCTTATTTGGTTAACTTAGGCGTT A G G T T D F G G A A N R I N Q L N P Q

. . . . . . ACCTTTGTTACCAGCATTTCTAGTGGTAGCAATAGTCGTGTTGAGGATTTGCTAGCAAGA11101---------+---------+---------+---------+---------+---------+11160 TGGAAACAATGGTCGTAAAGATCACCATCGTTATCAGCACAACTCCTAAACGATCGTTCT T F V T S I S S G S N S R V E D L L A R

. . . . . . CTGATCGAATTAACAACTTATAAGATTAGTAACCCGTCTGTTCCTGAAGGCAAGGTTGTT11161---------+---------+---------+---------+---------+---------+11220 GACTAGCTTAATTGTTGAATATTCTAATCATTGGGCAGACAAGGACTTCCGTTCCAACAA L I E L T T Y K I S N P S V P E G K V V

. . . . . . CTCGACAATGGGCGTGAAGTAGGACGGTGGCTGTATCCAACAATAAATAAATTGAAAAAC11221---------+---------+---------+---------+---------+---------+11280 GAGCTGTTACCCGCACTTCATCCTGCCACCGACATAGGTTGTTATTTATTTAACTTTTTG L D N G R E V G R W L Y P T I N K L K N

. . RBS . . . AGGGACATCATTATGAGTAATAGAAGAAGGGGGATTTTCTAAGTGGCAAATTTAATATTT11281---------+---------+---------+---------+---------+---------+11340 TCCCTGTAGTAATACTCATTATCTTCTTCCCCCTAAAAGATTCACCGTTTAAATTATAAA R D I I M S N R R R G I F * orfI è M A N L I F gpI . . . . . . GGAGGTCATAAGATTGGCAGTTCCTCTCTTCAATTCAGTGCAGCCCGCGGCGTTTTTTCT11341---------+---------+---------+---------+---------+---------+11400 CCTCCAGTATTCTAACCGTCAAGGAGAGAAGTTAAGTCACGTCGGGCGCCGCAAAAAAGA G G H K I G S S S L Q F S A A R G V F S

. . . . . . GAAGTTGAGAATACAACCCAGCCTGTCGGTGCCGGAGACGGAGAAATGCTGGTTCGAAGC11401---------+---------+---------+---------+---------+---------+11460 CTTCAACTCTTATGTTGGGTCGGACAGCCACGGCCTCTGCCTCTTTACGACCAAGCTTCG E V E N T T Q P V G A G D G E M L V R S

. . . . . . CACCTTAAGTCTAGAATCATTCCAGTGACTTATGATTTTGTGGCGCTATCTCGTCGTGAA11461---------+---------+---------+---------+---------+---------+11520 GTGGAATTCAGATCTTAGTAAGGTCACTGAATACTAAAACACCGCGATAGAGCAGCACTT H L K S R I I P V T Y D F V A L S R R E

. . . . . . TTTGAACGACAGTTAGCGCCATTGCTTTATAGCTCGGATGTTCAGAAACTAATCATTGAT11521---------+---------+---------+---------+---------+---------+11580 AAACTTGCTGTCAATCGCGGTAACGAAATATCGAGCCTACAAGTCTTTGATTAGTAACTA F E R Q L A P L L Y S S D V Q K L I I D

. . . . . . GATCGTCCTGATGAGTTTTGGTATGCAAAAGTTGACGGTAAGATTGATATGGACCGGGCT11581---------+---------+---------+---------+---------+---------+11640 CTAGCAGGACTACTCAAAACCATACGTTTTCAACTGCCATTCTAACTATACCTGGCCCGA D R P D E F W Y A K V D G K I D M D R A

Anexo II

. . . . . . TATTTTCTTGGCACTGGCACTATTAATTTTCTTGTCCCCGATGGCATCGCGCACTCGGTA11641---------+---------+---------+---------+---------+---------+11700 ATAAAAGAACCGTGACCGTGATAATTAAAAGAACAGGGGCTACCGTAGCGCGTGAGCCAT Y F L G T G T I N F L V P D G I A H S V

. . . . . . GCCACGCAGACGGCTGACAACATGCCATATAAGGACGTTCCTGTTAATCTACTTAAGGGA11701---------+---------+---------+---------+---------+---------+11760 CGGTGCGTCTGCCGACTGTTGTACGGTATATTCCTGCAAGGACAATTAGATGAATTCCCT A T Q T A D N M P Y K D V P V N L L K G

. . . . . . AGCGGCGAACCGCAAACAGTTGCGGCCCAGGTGTGGGGAGACGATCCACATTTATCTTTA11761---------+---------+---------+---------+---------+---------+11820 TCGCCGCTTGGCGTTTGTCAACGCCGGGTCCACACCCCTCTGCTAGGTGTAAATAGAAAT S G E P Q T V A A Q V W G D D P H L S L

. . . . . . GACACAAGCAGCCTAAAAATAGGCGATACTGTTTCTTTTCAAGTCAAAGTCGATGGGGTT11821---------+---------+---------+---------+---------+---------+11880 CTGTGTTCGTCGGATTTTTATCCGCTATGACAAAGAAAAGTTCAGTTTCAGCTACCCCAA D T S S L K I G D T V S F Q V K V D G V

. . . . . . AAAGATACCAATGTTTTTGTTGGTCTTAACAGCCAAAAAATATCTCCCTTATTTTCAAAT11881---------+---------+---------+---------+---------+---------+11940 TTTCTATGGTTACAAAAACAACCAGAATTGTCGGTTTTTTATAGAGGGAATAAAAGTTTA K D T N V F V G L N S Q K I S P L F S N

. . . . . . GGAATGGAGACTTTTGCAATCACATGGACAAAAGACTTGTCCGAGTTGCCTTTGCCAATT11941---------+---------+---------+---------+---------+---------+12000 CCTTACCTCTGAAAACGTTAGTGTACCTGTTTTCTGAACAGGCTCAACGGAAACGGTTAA G M E T F A I T W T K D L S E L P L P I

. . . . . . AAATTTTCAGTTAAGCCATCAGCGCTAACAGATGAATACACTTGGAGTCAGGCTAAAGCA12001---------+---------+---------+---------+---------+---------+12060 TTTAAAAGTCAATTCGGTAGTCGCGATTGTCTACTTATGTGAACCTCAGTCCGATTTCGT K F S V K P S A L T D E Y T W S Q A K A

. . . . . . GAGATTGGCACCACCGCTTCTCCATGGTCGCCTAACCCAGCTGATCCTGAATATTATACC12061---------+---------+---------+---------+---------+---------+12120 CTCTAACCGTGGTGGCGAAGAGGTACCAGCGGATTGGGTCGACTAGGACTTATAATATGG E I G T T A S P W S P N P A D P E Y Y T

. . . . . . GACACCATCACAGTGCCGAATGCTGGGACGTATCCATCTGAACCAGTTATCACGGCTACT12121---------+---------+---------+---------+---------+---------+12180 CTGTGGTAGTGTCACGGCTTACGACCCTGCATAGGTAGACTTGGTCAATAGTGCCGATGA D T I T V P N A G T Y P S E P V I T A T

. . . . . . ATCAACGGTGATAACGGCGTACTAACTGCCATTAATGATCAGGGCAGTGTACTACAGTTT12181---------+---------+---------+---------+---------+---------+12240 TAGTTGCCACTATTGCCGCATGATTGACGGTAATTACTAGTCCCGTCACATGATGTCAAA I N G D N G V L T A I N D Q G S V L Q F

Anexo II

. . . . . . GGCTCTCCCGATGAGACTGATGGCTTTGTGAAACAAAAGTCTGAACGCGTTTATCATCTC12241---------+---------+---------+---------+---------+---------+12300 CCGAGAGGGCTACTCTGACTACCGAAACACTTTGTTTTCAGACTTGCGCAAATAGTAGAG G S P D E T D G F V K Q K S E R V Y H L

. . . . . . GATTTCAATCAGACGCCGACAGGGTCACGCTCAATAATGGGGTTACGGATTTTCCTTACT12301---------+---------+---------+---------+---------+---------+12360 CTAAAGTTAGTCTGCGGCTGTCCCAGTGCGAGTTATTACCCCAATGCCTAAAAGGAATGA D F N Q T P T G S R S I M G L R I F L T

. . . . . . ATGAGCATGGCAATGATGCCAACGTACAGTCGGGACCGTTTGGCTATAAAGATGGTATTG12361---------+---------+---------+---------+---------+---------+12420 TACTCGTACCGTTACTACGGTTGCATGTCAGCCCTGGCAAACCGATATTTCTACCATAAC M S M A M M P T Y S R D R L A I K M V L

. . . RBS . . CCTACCCGTCCACTGAACGAACTGCTGCCAATCACTGGAATGGGCCTTCAATGAGCGGCA12421---------+---------+---------+---------+---------+---------+12480 GGATGGGCAGGTGACTTGCTTGACGACGGTTAGTGACCTTACCCGGAAGTTACTCGCCGT P T R P L N E L L P I T G M G L Q * orf156 è M S G T

. . . . . . CCATTCCGAAAAATTCGAATGGATCTAACACGGCTAATTTTCAGTTTGTCAATCGTATCA12481---------+---------+---------+---------+---------+---------+12540 GGTAAGGCTTTTTAAGCTTACCTAGATTGTGCCGATTAAAAGTCAAACAGTTAGCATAGT I P K N S N G S N T A N F Q F V N R I N

. . . . . . ATGTTGGAACGAATGCCGCAGAAGTAGGCCGTTTCGAGTTCAATTTGACGTATCAAGGCA12541---------+---------+---------+---------+---------+---------+12600 TACAACCTTGCTTACGGCGTCTTCATCCGGCAAAGCTCAAGTTAAACTGCATAGTTCCGT V G T N A A E V G R F E F N L T Y Q G K

. . . . . . AGATTGTCGCTTCTCTTGCGCTGTTTGATGATAGTGCTTCAAACGACCAGTGGGTTTTTT12601---------+---------+---------+---------+---------+---------+12660 TCTAACAGCGAAGAGAACGCGACAAACTACTATCACGAAGTTTGCTGGTCACCCAAAAAA I V A S L A L F D D S A S N D Q W V F S

. . . . . . CAGGCACAGTCTATGATGGCCGCCAAGCACAGATGATATTTTGGGACTTACTGCCACGCA12661---------+---------+---------+---------+---------+---------+12720 GTCCGTGTCAGATACTACCGGCGGTTCGTGTCTACTATAAAACCCTGAATGACGGTGCGT G T V Y D G R Q A Q M I F W D L L P R N

. . . . . . ATTACTATCGTGACGGCAACTACAATGCTGTTATCACAAAAATGGGTGATCAGTTAACCT12721---------+---------+---------+---------+---------+---------+12780 TAATGATAGCACTGCCGTTGATGTTACGACAATAGTGTTTTTACCCACTAGTCAATTGGA Y Y R D G N Y N A V I T K M G D Q L T F

. . . . . . TCCGTTTGGATCGTCTTGATTTAGGCGATGGTGGTATTGAGACACGGACAATATCAGGCT12781---------+---------+---------+---------+---------+---------+12840 AGGCAAACCTAGCAGAACTAAATCCGCTACCACCATAACTCTGTGCCTGTTATAGTCCGA R L D R L D L G D G G I E T R T I S G F

Anexo II

. . . . . . TCTCTAGTGTGCCAATTGATGGCTGGACAGCTTGGTCCCCGGATTCTCCGATCAACGTGG12841---------+---------+---------+---------+---------+---------+12900 AGAGATCACACGGTTAACTACCGACCTGTCGAACCAGGGGCCTAAGAGGCTAGTTGCACC S S V P I D G W T A W S P D S P I N V V

. . . . . . TTGGTCAATTAACTGGCAAGATAGCTACTTTGAGTGGATAAACGTTGATTACTGGGACGA12901---------+---------+---------+---------+---------+---------+12960 AACCAGTTAATTGACCGTTCTATCGATGAAACTCACCTATTTGCAACTAATGACCCTGCT G Q L T G K I A T L S G *

. . . . . . TATTCCTAACCGGTTTAAAGACGGTGACGTTGTGAAAATTGATGTTGCTAATCGGCGTGT12961---------+---------+---------+---------+---------+---------+13020 ATAAGGATTGGCCAAATTTCTGCCACTGCAACACTTTTAACTACAACGATTAGCCGCACA

. . . . . . CCTTGTTAACGGCTTTGAAGATCGAACACTGCAAACAATCGGCAATGATTGGGGTGGCTT13021---------+---------+---------+---------+---------+---------+13080 GGAACAATTGCCGAAACTTCTAGCTTGTGACGTTTGTTAGCCGTTACTAACCCCACCGAA

. . . . . . CAAGATACATCCCAGGTAATAACACTATTCGCTTGCTCACATCACATTGGGCAAAGCAGT13081---------+---------+---------+---------+---------+---------+13140 GTTCTATGTAGGGTCCATTATTGTGATAAGCGAACGAGTGTAGTGTAACCCGTTTCGTCA

. . RBS . . . . GTAAGGCTGAAGTATCTTGGCAGGAGGCATGGCTATGAAAGATTTTTATTTTGTGGATAG13141---------+---------+---------+---------+---------+---------+13200 CATTCCGACTTCATAGAACCGTCCTCCGTACCGATACTTTCTAAAAATAAAACACCTATC orfJ è M K D F Y F V D R gpJ . . . . . . ATCATGGCATCTGCTCGGTATTGCAACTGCTGGAGGTGGTGGGAAAATCCACATTGTCGA13201---------+---------+---------+---------+---------+---------+13260 TAGTACCGTAGACGAGCCATAACGTTGACGACCTCCACCACCCTTTTAGGTGTAACAGCT S W H L L G I A T A G G G G K I H I V D

. . . . . . TGATACTGATGATCAGCTTATCTCAGCAGGTGCTCGCACCTATTCAGGAACCATTCTGTT13261---------+---------+---------+---------+---------+---------+13320 ACTATGACTACTAGTCGAATAGAGTCGTCCACGAGCGTGGATAAGTCCTTGGTAAGACAA D T D D Q L I S A G A R T Y S G T I L F

. . . . . . CACCCCCGAACTGTCTTCTAAGGTTCAAACGATGGCAGCACGTGGCAATTACATTTTGTA13321---------+---------+---------+---------+---------+---------+13380 GTGGGGGCTTGACAGAAGATTCCAAGTTTGCTACCGTCGTGCACCGTTAATGTAAAACAT T P E L S S K V Q T M A A R G N Y I L Y

. . . . . . TATGGATGAGCGAAATAAGGCAGTCTTTATGACAATTATGGAATCAAGTCATGATCCACT13381---------+---------+---------+---------+---------+---------+13440 ATACCTACTCGCTTTATTCCGTCAGAAATACTGTTAATACCTTAGTTCAGTACTAGGTGA M D E R N K A V F M T I M E S S H D P L

Anexo II

. . . . . . TGCTGGTGAGGAGACATTCACTGCTGAAGATGCTGGTATTGATTTGATTAACGAAACCGT13441---------+---------+---------+---------+---------+---------+13500 ACGACCACTCCTCTGTAAGTGACGACTTCTACGACCATAACTAAACTAATTGCTTTGGCA A G E E T F T A E D A G I D L I N E T V

. . . . . . TGGCCCCTATAAAGCTCCACAAGCAATGAGCATCGCCGATTATATTAGCCTATTCACGAA13501---------+---------+---------+---------+---------+---------+13560 ACCGGGGATATTTCGAGGTGTTCGTTACTCGTAGCGGCTAATATAATCGGATAAGTGCTT G P Y K A P Q A M S I A D Y I S L F T N

. . . . . . TGACTCAGGTTTTGAAATCGGTCTTAACGAGATCCCTGATTTGAAGCGAACGCTTGAATG13561---------+---------+---------+---------+---------+---------+13620 ACTGAGTCCAAAACTTTAGCCAGAATTGCTCTAGGGACTAAACTTCGCTTGCGAACTTAC D S G F E I G L N E I P D L K R T L E W

. . . . . . GACTGGCGAGTCTGACACCACTTTAAATCGTATTCTATCTGTTGCGACTCAGTTTGATAA13621---------+---------+---------+---------+---------+---------+13680 CTGACCGCTCAGACTGTGGTGAAATTTAGCATAAGATAGACAACGCTGAGTCAAACTATT T G E S D T T L N R I L S V A T Q F D N

. . . . . . TGCTGAACTGGACTTTAGCTTCGATGTGTCAGGGACAACGGTTGTGCGCCGCTTAATCAA13681---------+---------+---------+---------+---------+---------+13740 ACGACTTGACCTGAAATCGAAGCTACACAGTCCCTGTTGCCAACACGCGGCGAATTAGTT A E L D F S F D V S G T T V V R R L I N

. . . . . . CATTCATAAGCGCATCGGTGCTGATAGGAATATCACGCTGTATGTGGATAAAGACATCAA13741---------+---------+---------+---------+---------+---------+13800 GTAAGTATTCGCGTAGCCACGACTATCCTTATAGTGCGACATACACCTATTTCTGTAGTT I H K R I G A D R N I T L Y V D K D I N

. . . . . . TAAGATTGTGACGTCCGACAGTATTTATGATCTTTATACTGCCGTTACACCGACAGGTGG13801---------+---------+---------+---------+---------+---------+13860 ATTCTAACACTGCAGGCTGTCATAAATACTAGAAATATGACGGCAATGTGGCTGTCCACC K I V T S D S I Y D L Y T A V T P T G G

. . . . . . CACACCTGAAAGCAAAGATGGCGAGACCGTTGATCAGCAGCCAATCACACTTGAAGGTTA13861---------+---------+---------+---------+---------+---------+13920 GTGTGGACTTTCGTTTCTACCGCTCTGGCAACTAGTCGTCGGTTAGTGTGAACTTCCAAT T P E S K D G E T V D Q Q P I T L E G Y

. . . . . . TCAGTGGACAGATCCCGATGGTCGTTACGTGTTAACGAAAGAGGGTGTTTTGCTTGACCC13921---------+---------+---------+---------+---------+---------+13980 AGTCACCTGTCTAGGGCTACCAGCAATGCACAATTGCTTTCTCCCACAAAACGAACTGGG Q W T D P D G R Y V L T K E G V L L D P

. . . . . . AGTTGCCAACCAAACATGGAGCAGACTTTTGGCTAAGGGTGGTGCACCGAGTGTCAATGC13981---------+---------+---------+---------+---------+---------+14040 TCAACGGTTGGTTTGTACCTCGTCTGAAAACCGATTCCCACCACGTGGCTCACAGTTACG V A N Q T W S R L L A K G G A P S V N A

Anexo II

. . . . . . AGCGTATATCAATCGTGTTGTCACTTATACGGCTACTTCGCAAGCAACCTTGCTTCAATC14041---------+---------+---------+---------+---------+---------+14100 TCGCATATAGTTAGCACAACAGTGAATATGCCGATGAAGCGTTCGTTGGAACGAAGTTAG A Y I N R V V T Y T A T S Q A T L L Q S

. . . . . . TGCGCTCTCTGACCTAAAGACGCACAACCATGAAGCTGTCAATTATGAGACTGACATTGC14101---------+---------+---------+---------+---------+---------+14160 ACGCGAGAGACTGGATTTCTGCGTGTTGGTACTTCGACAGTTAATACTCTGACTGTAACG A L S D L K T H N H E A V N Y E T D I A

. . . . . . TGTGCTGCCACAAAATATCAACATTGGTGACACAATTCATTTAGCTGACGAGGATGAACA14161---------+---------+---------+---------+---------+---------+14220 ACACGACGGTGTTTTATAGTTGTAACCACTGTGTTAAGTAAATCGACTGCTCCTACTTGT V L P Q N I N I G D T I H L A D E D E H

. . . . . . CTTGTATCTGTCGGCTCGCTTGCTCGAGCTCAAATCAAGCTATTCGATGGATACACACAC14221---------+---------+---------+---------+---------+---------+14280 GAACATAGACAGCCGAGCGAACGAGCTCGAGTTTAGTTCGATAAGCTACCTATGTGTGTG L Y L S A R L L E L K S S Y S M D T H T

. . . . . . AGCAACTTTGGGAGACTACCTTATTGAACATGATCAGGTAGCAGCCCAATATCGGCAACT14281---------+---------+---------+---------+---------+---------+14340 TCGTTGAAACCCTCTGATGGAATAACTTGTACTAGTCCATCGTCGGGTTATAGCCGTTGA A T L G D Y L I E H D Q V A A Q Y R Q L

. . . . . . TGCTGAACAAATTAAGAACATCCCCAAAACAATCCAATACTACCCATGGCTTCGCTATGC14341---------+---------+---------+---------+---------+---------+14400 ACGACTTGTTTAATTCTTGTAGGGGTTTTGTTAGGTTATGATGGGTACCGAAGCGATACG A E Q I K N I P K T I Q Y Y P W L R Y A

. . . . . . CGATGATGACAAGGGCACCAACATGAGTGCTTTGCCAGCTGGCAAGAAGTATATGGCGGT14401---------+---------+---------+---------+---------+---------+14460 GCTACTACTGTTCCCGTGGTTGTACTCACGAAACGGTCGACCGTTCTTCATATACCGCCA D D D K G T N M S A L P A G K K Y M A V

. . . . . . TGTATACAGCAACAAGTCATCCGTGCCAAGTGACAATCCGGCTGATTACGCCGGCAAGTG14461---------+---------+---------+---------+---------+---------+14520 ACATATGTCGTTGTTCAGTAGGCACGGTTCACTGTTAGGCCGACTAATGCGGCCGTTCAC V Y S N K S S V P S D N P A D Y A G K W

. . . . . . GGCATTGATTCAGGGACCAAAAGGTGACAACGGTGTGGGTGTGCCGGGCCCTAAGGGAGC14521---------+---------+---------+---------+---------+---------+14580 CCGTAACTAAGTCCCTGGTTTTCCACTGTTGCCACACCCACACGGCCCGGGATTCCCTCG A L I Q G P K G D N G V G V P G P K G A

. . . . . . TGATGGCAAAACTAGCTACTTTCATACAGCCTATGCTAACAGCATTGATGGGAAACAAGG14581---------+---------+---------+---------+---------+---------+14640 ACTACCGTTTTGATCGATGAAAGTATGTCGGATACGATTGTCGTAACTACCCTTTGTTCC D G K T S Y F H T A Y A N S I D G K Q G

Anexo II

. . . . . . ATTTTCAACCACAAATGGCAATGGTAAGTCTTATTTCGGCCAATATGTTGACCAGACCAA14641---------+---------+---------+---------+---------+---------+14700 TAAAAGTTGGTGTTTACCGTTACCATTCAGAATAAAGCCGGTTATACAACTGGTCTGGTT F S T T N G N G K S Y F G Q Y V D Q T K

. . . . . . AGCGGATAGTACCGATCCCACAAAATACTCATGGGCATTGTTCAAAGGTACTGATGGTCG14701---------+---------+---------+---------+---------+---------+14760 TCGCCTATCATGGCTAGGGTGTTTTATGAGTACCCGTAACAAGTTTCCATGACTACCAGC A D S T D P T K Y S W A L F K G T D G R

. . . . . . TGACGGCAAAGATGGTAGCGATAATGTGCCAGTCATTACTGTTGGTGCAGCGTATCCATC14761---------+---------+---------+---------+---------+---------+14820 ACTGCCGTTTCTACCATCGCTATTACACGGTCAGTAATGACAACCACGTCGCATAGGTAG D G K D G S D N V P V I T V G A A Y P S

. . . . . . AGGCCCCAAAAAGGGGGATATGCATTGGCTGACTGATAGCAGCGGTGTTGTAACGGGATA14821---------+---------+---------+---------+---------+---------+14880 TCCGGGGTTTTTCCCCCTATACGTAACCGACTGACTATCGTCGCCACAACATTGCCCTAT G P K K G D M H W L T D S S G V V T G Y

. . . . . . TTATACCTATGATGGGACTAAATGGAACCCTTATAAAATCGACGCTAAGATTCTTTCGGC14881---------+---------+---------+---------+---------+---------+14940 AATATGGATACTACCCTGATTTACCTTGGGAATATTTTAGCTGCGATTCTAAGAAAGCCG Y T Y D G T K W N P Y K I D A K I L S A

. . . . . . AGAAACATTTAACGGCATGACCTTCAACGGGGTTACATTTACCGGGTCTAAGTTCATTTC14941---------+---------+---------+---------+---------+---------+15000 TCTTTGTAAATTGCCGTACTGGAAGTTGCCCCAATGTAAATGGCCCAGATTCAAGTAAAG E T F N G M T F N G V T F T G S K F I S

. . . . . . TTCATTTAAAGGTGTCAAACCCGATGGCGTTGCTGACTATACCGTCCACGGGACAACCAC15001---------+---------+---------+---------+---------+---------+15060 AAGTAAATTTCCACAGTTTGGGCTACCGCAACGACTGATATGGCAGGTGCCCTGTTGGTG S F K G V K P D G V A D Y T V H G T T T

. . . . . . AATGGCCGATGGCAAGATCGTCACAGATACGTATTCGGATACTGACAACAGTCAGGTGAC15061---------+---------+---------+---------+---------+---------+15120 TTACCGGCTACCGTTCTAGCAGTGTCTATGCATAAGCCTATGACTGTTGTCAGTCCACTG M A D G K I V T D T Y S D T D N S Q V T

. . . . . . GCATACCGAACTCAGCCAATTTGGCTTGCTAAGTCAAATTTATAACAAAGGCACGCTGAT15121---------+---------+---------+---------+---------+---------+15180 CGTATGGCTTGAGTCGGTTAAACCGAACGATTCAGTTTAAATATTGTTTCCGTGCGACTA H T E L S Q F G L L S Q I Y N K G T L M

. . . . . . GGATAGTGCGCAACTATCGTTAGGTATGTTAACGCTAAGCGGCAACTATCAAACTGCCAG15181---------+---------+---------+---------+---------+---------+15240 CCTATCACGCGTTGATAGCAATCCATACAATTGCGATTCGCCGTTGATAGTTTGACGGTC D S A Q L S L G M L T L S G N Y Q T A S

Anexo II

. . . . . . TAACAAGCCGTTGGAGTGGATCACCAGCAGCTTAGATGCTTTAAGAGTCTTGCAATTAAC15241---------+---------+---------+---------+---------+---------+15300 ATTGTTCGGCAACCTCACCTAGTGGTCGTCGAATCTACGAAATTCTCAGAACGTTAATTG N K P L E W I T S S L D A L R V L Q L T

. . . . . . AAATAATAACTTGCTTGTTTGGCATGGCGCTTTCTATCCGCAATCTGGAGATACTGCAAC15301---------+---------+---------+---------+---------+---------+15360 TTTATTATTGAACGAACAAACCGTACCGCGAAAGATAGGCGTTAGACCTCTATGACGTTG N N N L L V W H G A F Y P Q S G D T A T

. . . . . . AATATCGACGCCACTTTCAAAGACTTTATCTGGATGGTTAATTGCATGGAGCTATTATCA15361---------+---------+---------+---------+---------+---------+15420 TTATAGCTGCGGTGAAAGTTTCTGAAATAGACCTACCAATTAACGTACCTCGATAATAGT I S T P L S K T L S G W L I A W S Y Y Q

. . . . . . AAACGGATCACCAACGTATAACAACTATGCGTTCACGCTGTTACCAAAGGCCGCTTTGAT15421---------+---------+---------+---------+---------+---------+15480 TTTGCCTAGTGGTTGCATATTGTTGATACGCAAGTGCGACAATGGTTTCCGGCGAAACTA N G S P T Y N N Y A F T L L P K A A L I

. . . . . . TTATAACACGACTGGTGCTAACTATTTAAGAGTGACCTTCACAATGAAGGATGTTGGAAC15481---------+---------+---------+---------+---------+---------+15540 AATATTGTGCTGACCACGATTGATAAATTCTCACTGGAAGTGTTACTTCCTACAACCTTG Y N T T G A N Y L R V T F T M K D V G T

. . . . . . CATCTTCAAAGTTCTGTGGTATGACGACACACATATTGTTGGCACGGCTGAGAACAATAC15541---------+---------+---------+---------+---------+---------+15600 GTAGAAGTTTCAAGACACCATACTGCTGTGTGTATAACAACCGTGCCGACTCTTGTTATG I F K V L W Y D D T H I V G T A E N N T

. . . . RBS . GGGCTCGTTATCAAAGGCGGTTATGACTGAGGTATACGCAGTTTAGGAGGCTGTTATGGA15601---------+---------+---------+---------+---------+---------+15660 CCCGAGCAATAGTTTCCGCCAATACTGACTCCATATGCGTCAAATCCTCCGACAATACCT G S L S K A V M T E V Y A V * orf107 è M E

. . . . . . AGCTGACAAAGTAAAAGCAATTTTTAACACTGATGAAGATGGCTATATCACTGGCTACCA15661---------+---------+---------+---------+---------+---------+15720 TCGACTGTTTCATTTTCGTTAAAAATTGTGACTACTTCTACCGATATAGTGACCGATGGT A D K V K A I F N T D E D G Y I T G Y Q

. . . . . . GCAGGAGTTTTGGGACGGCAGTCAGTGGCAAACGCCATTCGATGATGAGAAAGCCATTCT15721---------+---------+---------+---------+---------+---------+15780 CGTCCTCAAAACCCTGCCGTCAGTCACCGTTTGCGGTAAGCTACTACTCTTTCGGTAAGA Q E F W D G S Q W Q T P F D D E K A I L

. . . . . . GATTGCACCGGAAGAACTGAAAAAGATTGCCATTGGCGCCTCAAAGCTGGCTGATGACGG15781---------+---------+---------+---------+---------+---------+15840 CTAACGTGGCCTTCTTGACTTTTTCTAACGGTAACCGCGGAGTTTCGACCGACTACTGCC I A P E E L K K I A I G A S K L A D D G

Anexo II

. . . . . . TACTGTTGTAATAGATACCGATAAGCAAGCAGCGCTAGAAAAAGCGGCTAATCAAGTGAA15841---------+---------+---------+---------+---------+---------+15900 ATGACAACATTATCTATGGCTATTCGTTCGTCGCGATCTTTTTCGCCGATTAGTTCACTT T V V I D T D K Q A A L E K A A N Q V K

. . . . . . ACCGACCGGAGAACAGATGCTACTCGCAAATTTAACTCTCGAAGTAGCACAGCTGAAGGC15901---------+---------+---------+---------+---------+---------+15960 TGGCTGGCCTCTTGTCTACGATGAGCGTTTAAATTGAGAGCTTCATCGTGTCGACTTCCG P T G E Q M L L A N L T L E V A Q L K A

. . . . . . GGCGAAATCAAGTGACTAATTATGATCAGTGTGCACTACTTTACAGTTGGGGGATTGATT15961---------+---------+---------+---------+---------+---------+16020 CCGCTTTAGTTCACTGATTAATACTAGTCACACGTGATGAAATGTCAACCCCCTAACTAA A K S S D *

. . . . . RBS . TAACACCTTATGTACCGGTAATGATCACTCCAGATCAATACAAGCAAATTACAGGCAGTG16021---------+---------+---------+---------+---------+---------+16080 ATTGTGGAATACATGGCCATTACTAGTGAGGTCTAGTTATGTTCGTTTAATGTCCGTCAC

. . . . . . ACTATGTCGCCAGCAAAAGCTAGCGGCTATTTTTATGGAAGGAAGTATAAAGATGTGGAT16081---------+---------+---------+---------+---------+---------+16140 TGATACAGCGGTCGTTTTCGATCGCCGATAAAAATACCTTCCTTCATATTTCTACACCTA

orf116 è M S P A K A S G Y F Y G R K Y K D V D

. . . . . . TTCAAGAGTTGGATAGATATGTTTGTGGAGTTGGGTGGTGGAGCTTTGTTTGGTTGGTTT16141---------+---------+---------+---------+---------+---------+16200 AAGTTCTCAACCTATCTATACAAACACCTCAACCCACCACCTCGAAACAAACCAACCAAA F K S W I D M F V E L G G G A L F G W F

. . . . . . GCAAGCCAATGGCGCATGCATCGAAAGCATGGAAAGGCAATTGATTCAGGCCTTGTCGGT16201---------+---------+---------+---------+---------+---------+16260 CGTTCGGTTACCGCGTACGTAGCTTTCGTACCTTTCCGTTAACTAAGTCCGGAACAGCCA A S Q W R M H R K H G K A I D S G L V G

. . . . . . TTGCTTCATCATGAGGTTTACATGCTGTGTAACCATCATATCGAGGTGGGGTATATCAGC16261---------+---------+---------+---------+---------+---------+16320 AACGAAGTAGTACTCCAAATGTACGACACATTGGTAGTATAGCTCCACCCCATATAGTCG L L H H E V Y M L C N H H I E V G Y I S

. . . . . . ACGGACGACTTGGACGATCTTAATTACCTTTTCCGCAGCTACAAAGCACTGGGCGGTAAC16321---------+---------+---------+---------+---------+---------+16380 TGCCTGCTGAACCTGCTAGAATTAATGGAAAAGGCGTCGATGTTTCGTGACCCGCCATTG T D D L D D L N Y L F R S Y K A L G G N

. . . . . . GGAACGGGCGAAGCGCTATATAACAAAGTTTTGCAACTTCGGATTAAAAACTGAAAGGAA16381---------+---------+---------+---------+---------+---------+16440 CCTTGCCCGCTTCGCGATATATTGTTTCAAAACGTTGAAGCCTAATTTTTGACTTTCCTT G T G E A L Y N K V L Q L R I K N *

Anexo II

. . . . . . TGTTCAGTATGAAGATTAATTGGAAAGTACGAGTATTAAGCGTCAAATTCTGGCTGGCAT16441---------+---------+---------+---------+---------+---------+16500 ACAAGTCATACTTCTAATTAACCTTTCATGCTCATAATTCGCAGTTTAAGACCGACCGTA holina è M K I N W K V R V L S V K F W L A L

. . . . . . TAGTGCCGGCAGCTTTGTTGGTTGTACAAACAGCGGCAGCGGTTTTCGGTTACAACTGGG16501---------+---------+---------+---------+---------+---------+16560 ATCACGGCCGTCGAAACAACCAACATGTTTGTCGCCGTCGCCAAAAGCCAATGTTGACCC V P A A L L V V Q T A A A V F G Y N W D

. . . . . . ATTTTGCCAACTTGGGCAAGGAGCTCACCGCAGTGATCAATGCAGTATTTGCACTGTTGA16561---------+---------+---------+---------+---------+---------+16620 TAAAACGGTTGAACCCGTTCCTCGAGTGGCGTCACTAGTTACGTCATAAACGTGACAACT F A N L G K E L T A V I N A V F A L L T

. . . . . . CCATTGTGGGGGTTGCCGTTGACCCAACCACAGAGGGCGTCAGCGACAGCCAACAGGCGT16621---------+---------+---------+---------+---------+---------+16680 GGTAACACCCCCAACGGCAACTGGGTTGGTGTCTCCCGCAGTCGCTGTCGGTTGTCCGCA I V G V A V D P T T E G V S D S Q Q A L

. . . . . . TAGCTTACCCGGCACTCATTACCACCAAGGCAGCTAAGATCAAGTCCTTAGAGGACCAGA16681---------+---------+---------+---------+---------+---------+16740 ATCGAATGGGCCGTGAGTAATGGTGGTTCCGTCGATTCTAGTTCAGGAATCTCCTGGTCT A Y P A L I T T K A A K I K S L E D Q I

. . . . . . TTAAGGCACTGCAAGCAGATAAAGCGGCTGATCAGGCAACTTCTGCTGCTAGTGAAGTGG16741---------+---------+---------+---------+---------+---------+16800 AATTCCGTGACGTTCGTCTATTTCGCCGACTAGTCCGTTGAAGACGACGATCACTTCACC K A L Q A D K A A D Q A T S A A S E V V

. . . . . . TTCCAGAGACGTCTTCTGCAGCACCGGCGGAGTCAGCTCCGGAATCTGTTGCTCCAGTAG16801---------+---------+---------+---------+---------+---------+16860 AAGGTCTCTGCAGAAGACGTCGTGGCCGCCTCAGTCGAGGCCTTAGACAACGAGGTCATC P E T S S A A P A E S A P E S V A P V A

. . . . EcoRI CTAGTGAGGAGGTAAAATAGTATGAGTTATACCATCAACAAAGAATTC16861---------+---------+---------+---------+--------16908 GATCACTCCTCCATTTTATCATACTCAATATGGTAGTTGTTTCTTAAG S E E V K * lisina è M S Y T I N K E F

Anexo II: Secuencia de nucleótidos de la región de morfogénesis del bacteriófago A2. Bajo lasecuencia de nucleótidos de cada gen se presenta la correspondiente traducción aaminoácidos. Se señalan los sitios de unión al ribosoma (RBS), el extremo amino – terminalen aquellas proteínas de las que fue posible obtenerlo (n), el motivo de cremallera de leucinas(n), las repeticiones (Gly – X – Y)n, y la posición de la lisina y asparragina que podrían estarimplicados en la formación de enlaces amida (é). Esta secuencia se encuentra depositada enla base de datos del EMBL con los números de acceso Y09454 y AJ251790.

Deseo hacer constar mi agradecimiento a las numerosasdigital.csic.es/bitstream/10261/4787/1/Tesis Victor Manuel Ladero Losada.pdf · Deseo hacer constar mi agradecimiento a las numerosas

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