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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
Paula Roberta Caumo de Camargo
Desenvolvimento e validação de métodos analíticos empregando
HPLC e UHPSFC para doseamento simultâneo
dos fármacos cloridrato de adifenina, cloridrato de prometazina
e dipirona em associações medicamentosas na forma de
comprimido
CAMPINAS
2019
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Paula Roberta Caumo de Camargo
Desenvolvimento e validação de métodos analíticos empregando
UHPSFC E HPLC para doseamento simultâneo
dos fármacos cloridrato de adifenina, cloridrato de prometazina
e dipirona em associações medicamentosas na forma de
comprimido
Dissertação de mestrado apresentada ao Instituto de biologia da
Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos
exigidos para obtenção do título de Mestra em Ciências, na área de
Fármacos, Medicamentos e Insumos para Saúde.
Orientador: Prof. Dr. Paulo Cesar Pires Rosa
CAMPINAS
2019
ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO
DEFENDIDA PELA ALUNA PAULA ROBERTA CAUMO DE CAMARGO E ORIENTADA
PELO PROF. DR. PAULO CÉSAR PIRES ROSA.
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Campinas, 14 de novembro de 2019.
Comissão examinadora
Prof. Dr. Paulo Cesar Pires Rosa
Prof. Dr. Rodney Alexandre Ferreira Rodrigues
Prof(a). Dra Carla Beatriz Grespan Bottoli
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de
Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros
encontra-se no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na
Secretaria do Programa de Pós-Graduação em Biociências e Tecnologia
de Produtos Bioativos da Unidade Instituto de Biologia.
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Agradecimentos
A Deus pela saúde e pelo consolo em todos os momentos vividos
nessa caminhada.
Houveram muitas pedras no caminho, mas Ele as tirou e
possibilitou a concretização
desse trabalho.
Ao meu amado Rogério pelo incentivo a iniciar o mestrado e por
permanecer me
apoiando durante todo o decorrer desse estudo, me encorajando a
encontrar soluções
para os desafios que apareceram. Por todo seu conhecimento,
paciência e
compreensão.
Aos meus filhos, que mesmo sem saber, me impulsionaram a ampliar
meu horizonte
em busca de algo maior.
Aos meus familiares e amigos pelas conversas, paciência e apoio
nos momentos
difíceis.
Aos colegas de vida acadêmica pelos companheirismo, risadas,
desabafos e
aprendizado.
Ao meu orientador Dr. Paulo Rosa pela oportunidade, sabedoria,
tolerância e por
acreditar na importância desse trabalho.
Á professora Dra. Márcia Cristina Breitkreitz pelo conhecimento,
paciência, dedicação
e por acreditar na minha capacidade. O domínio e a experiência
profissional e
acadêmica da professora foram essenciais para o desenvolvimento
do método por
UHPSFC e todo conteúdo referente ao planejamento experimental,
assim como o
tratamento estatístico dos resultados.
À professora Dra. Isabel Jardim por conceder o uso do UPC2, pela
sabedoria e
gentileza.
À Lucília Melo, minha querida amiga, pelo ensinamento, motivação
e carinho.
O presente trabalho foi realizado com o apoio da Coordenação de
Aperfeiçoamento
de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) – Código
Financeiro 001.
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Epígrafe
”Por vezes sentimos que aquilo que fazemos não é senão uma gota
de água no mar. Mas o mar seria menor se lhe faltasse uma gota”
Madre Teresa de Calcutá
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Resumo
As técnicas cromatográficas são amplamente empregadas para
análises de
amostras complexas em diferentes áreas, principalmente a
farmacêutica, devido as
variadas características dos fármacos e às associações entre os
mesmos.
Recentemente uma nova técnica que associa a SFC (Supercritical
Fluid
Chromatography) e UHPLC (Ultra High Performance Liquid
Chromatography) está se
destacando no quesito de separações analíticas. Trata-se da
Cromatografia com
Fluído Supercrítico de Ultra Alta Eficiência (Ultra High
Performance Supercritical Fluid
Chromatography (UHPSFC), uma técnica capaz de unir as
características da
cromatografia líquida e da gasosa tornando-se muito versátil,
que emprega CO2 como
principal constituinte da fase móvel, reduzindo o consumo de
solventes tóxicos, sendo
considerada uma técnica verde. Esse trabalho propõe o
desenvolvimento e validação
de métodos cromatográficos por Cromatografia Liquida de Alta
Eficiência (High
Performance Liquid Chromatography, HPLC) e Cromatografia com
Fluído Supercrítico
de Ultra Alta Eficiência (Ultra High Performance Supercritical
Fluid Chromatography,
UHPSFC) para doseamento simultâneo da associação cloridrato de
adifenina,
cloridrato de prometazina e dipirona sódica em comprimido. Para
a técnica de HPLC,
realizou-se uma triagem para avaliar qual fase estacionária,
fase móvel, diluente e
concentração do trabalho fornecia melhor resultado em relação ao
formato de pico.
As condições definidas foram: coluna Phenyl Hexyl, diluente
metanol, vazão 1 mL min-
1, fase móvel tampão fosfato de potássio:metanol:acetonitrila,
modo de eluição
gradiente, volume de injeção 20 µL, coluna e amostras em
temperatura ambiente,
concentração dos ativos 0,5 mg mL-1 dipirona, 0,010 mg mL-1
cloridrato de adifenina
e 0,005 mg mL-1 de cloridrato de prometazina. O método foi
validado de acordo com
a resolução RE nº 899, de 29 de maio de 2003 da ANVISA e
considerado preciso,
exato, seletivo e linear para a faixa de trabalho empregada com
tempo de corrida de
20 minutos. Para a técnica de UHPSFC, algumas condições
cromatográficas foram
avaliadas, como modificador orgânico e aditivos na fase móvel.
Definidas as
condições cromatográficas, realizou-se um planejamento do tipo
composto central
para avaliar como a temperatura da coluna, a concentração de
modificador e a
pressão influenciavam a retenção e a resolução dos ativos.
Verificou-se que os
mesmos afetam as respostas, sendo a concentração do modificador
o fator mais
impactante. Através dos resultados foi determinado o Design
Space, região
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considerada robusta, na qual alterações nas condições de análise
não afetam as
respostas de interesse. A partir desse espaço, foi definida a
condição empregada na
validação: coluna HSS C18, diluente etanol, vazão 1,5 mL min-1,
fase móvel CO2:
metanol com 0,2 % de trietilamina e 5 % de água purificada
(A:B), modo de eluição
isocrático 80:20 (A:B), volume de injeção: 0,5 µL, concentração
dos ativos: 5 mg mL-1
de dipirona, 0,10 mg mL-1 de cloridrato de adifenina e 0,05 mg
mL-1 de cloridrato de
prometazina, pressão 1500 psi e temperatura da coluna de 30 °C.
O método foi
validado e considerado preciso, exato, seletivo e linear para a
faixa de trabalho
empregada com tempo de corrida de 2 minutos. Ambos métodos foram
considerados
aptos para doseamento dos ativos.
Palavras chave: HPLC, UHPSFC, planejamento experimental,
cloridrato de
adifenina, cloridrato de prometazina, dipirona sódica,
analgésicos, cromatografia
líquida.
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Abstrat
Chromatographic techniques are widely used for analysis of
complex samples
in different areas, mainly pharmaceutical, due to the varied
characteristics of the drugs
and their associations. Recently a new technique that combines
SFC (Supercritical
Fluid Chromatography) and UHPLC (Ultra High Performance Liquid
Chromatography)
is emerging in the area of analytical separations. This is Ultra
High Performance
Supercritical Fluid Chromatography (UHPSFC), a very versatile
technique that
combines the characteristics of liquid and gaseous
chromatography with CO2 as the
main constituent of the phase. This technique proposes the
development and
validation of chromatographic methods by High Performance Liquid
Chromatography
(HPLC) and Ultra High Efficiency Supercritical Fluid
Chromatography (Ultra
Chromatography). High Performance Supercritical Fluid
Chromatography (UHPSFC)
for simultaneous dosing of the combination of adiphenine
hydrochloride, promethazine
hydrochloride and sodium dipyrone in tablet. work provided
better res compared to the
peak format. The defined conditions were: Phenyl Hexyl column,
methanol diluent, flow
rate 1 mL min-1, mobile phase potassium phosphate buffer:
methanol: acetonitrile,
gradient elution mode, injection volume 20 µL, column and
samples at room
temperature, concentration of active ingredients 0.5 mg mL-1
dipyrone, 0.010 mg mL-
1 adiphenine hydrochloride and 0.005 mg mL-1 promethazine
hydrochloride. The
method was validated in accordance with ANVISA Resolution No.
899 of May 29, 2003
and considered accurate, accurate, selective and linear for the
working range
employed with a running time of 20 minutes. For the UHPSFC
technique, some
chromatographic conditions were evaluated, such as organic
modifier and mobile
phase additives. Once the chromatographic conditions were
defined, a central
composite type planning was performed to evaluate how column
temperature, modifier
concentration, and pressure influenced the retention and
resolution of the assets. They
were found to affect responses, with modifier concentration
being the most impacting
factor. Through the results it was determined the Design Space,
a region considered
robust, in which changes in the analysis conditions do not
affect the responses of
interest. From this space, the validation condition was defined:
HSS C18 column,
ethanol diluent, flow rate 1.5 mL min-1, mobile phase CO2:
methanol with 0.2%
triethylamine and 5% purified water (A: B), 80:20 isocratic
elution mode (A: B), injection
volume: 0.5 µL, active concentration: 5 mg mL -1 dipyrone, 0.10
mg mL -1 adiphenine
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hydrochloride and 0 0.05 mg mL -1 promethazine hydrochloride,
pressure 1500 psi
and column temperature 30 ° C. The method was validated and
considered accurate,
accurate, selective and linear for the working range employed
with a 2-minute running
time. Both methods were considered fit for dosing the
assets.
Keywords: HPLC, UHPSFC, experimental design, adiphenine
hydrochloride,
promethazine hydrochloride, sodium dipyrone, analgesics, Liquid
Chromatography.
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Diagrama de fases do dióxido de carbono (adaptado
Nokáková
2014)............................................................................................................
34
Figura 2. Spider diagram - Natureza das colunas
cromatográficas
empregadas em UHPSFC (adaptado Lesselier e West,
2015)................... 39
Figura 3. Equipamento UPC2 da empresa
Waters...................................... 40
Figura 4. Fluxograma para desenvolvimento de métodos utilizando
os
conceitos de
A-QbD.....................................................................................
44
Figura 5. Fluxograma da parte experimental realizada na
técnica
HPLC/DAD...................................................................................................
55
Figura 6. Fluxograma da parte experimental realizada na
técnica
UHPSFC/DAD..............................................................................................
61
Figura 7. Estrutura química das fases estacionárias utilizadas
na triagem
cromatográfica A: Phenyl hexyl e B: Zorbax eclipse
plus.............................. 69
Figura 8. Sobreposição dos cromatogramas da dipirona (A)
solubilizada
em metanol (preto) e em HCl (azul) e a formação do produto
de
degradação (B). Condições cromatográficas coluna Phenyl Hexyl,
diluente
metanol, vazão 1 mLmin-1, fase móvel tampão : metanol :
acetonitrila
(A:B:C -v/v/v), modo de eluição gradiente (conforme apresentado
na
Tabela 4), volume de injeção 20 µL, concentração dos ativos 0,5
mg mL-
dipirona, 0,010 mg mL-1 cloridrato de adifenina e 0,005 mg mL-1
de
cloridrato de prometazina comprimento de onda de 254
nm........................
74
Figura 9. Cromatograma obtido no comprimento de onda de 210 nm:
(A)
4MAA, (B) dipirona, (C) cloridrato de prometazina e (D)
cloridrato de
adifenina. Condições cromatográficas coluna Phenyl Hexyl,
diluente
metanol, vazão 1 mLmin-1, fase móvel tampão : metanol :
acetonitrila
(A:B:C -v/v/v), modo de eluição gradiente (conforme apresentado
na
Tabela 4), volume de injeção 20 µL, concentração dos ativos 0,5
mg mL-
dipirona, 0,010 mg mL-1 cloridrato de adifenina e 0,005 mg mL-1
de
cloridrato de
prometazina.............................................................................
75
Figura 10. Cromatograma obtido no comprimento de onda de 254 nm:
(A)
4MAA, (B) dipirona e (C) cloridrato de prometazina.
Condições
cromatográficas coluna Phenyl Hexyl, diluente metanol, vazão 1
mLmin-1,
fase móvel tampão : metanol : acetonitrila (A:B:C -v/v/v), modo
de eluição
gradiente (conforme apresentado na Tabela 4), volume de injeção
20 µL,
concentração dos ativos 0,5 mg mL- dipirona, 0,010 mg mL-1
cloridrato de
adifenina e 0,005 mg mL-1 de cloridrato de
prometazina...............................
75
Figura 11. Cromatograma ilustrando a seletividade para a
dipirona e o 4-
MAA. Condições cromatográficas coluna Phenyl Hexyl, diluente
metanol,
vazão 1 mL min-1, fase móvel tampão : metanol : acetonitrila
(A:B:C -v/v/v),
modo de eluição gradiente (conforme apresentado Tabela 4),
volume de
injeção 20 µL, concentração do ativo 0,5 mg mL- dipirona, 0,010
mg mL-1.. 76
-
Figura 12. Cromatograma ilustrando a seletividade para o
cloridrato de
prometazina. Condições cromatográficas coluna Phenyl Hexyl,
diluente
metanol, vazão 1 mLmin-1, fase móvel tampão : metanol :
acetonitrila
(A:B:C -v/v/v), modo de eluição gradiente (conforme apresentado
na
Tabela 4), volume de injeção 20 µL, concentração do ativo 0,005
mg mL-1
de cloridrato de
prometazina........................................................................
76
Figura 13. Cromatograma ilustrando a seletividade para o
cloridrato de
adifenina. Condições cromatográficas coluna Phenyl Hexyl,
diluente
metanol, vazão 1 mL min-1, fase móvel tampão : metanol :
acetonitrila
(A:B:C -v/v/v), modo de eluição gradiente (conforme apresentado
na
Tabela 4), volume de injeção 20 µL, concentração do ativo 0,010
mg mL-1
cloridrato de
adifenina..................................................................................
77
Figura 14. Cromatograma ilustrando a seletividade para a fase
móvel e o
placebo (excipientes). Condições cromatográficas coluna Phenyl
Hexyl,
diluente metanol, vazão 1 mL min-1, fase móvel tampão : metanol
:
acetonitrila (A:B:C -v/v/v), modo de eluição gradiente
(conforme
apresentado na Tabela 4), volume de injeção 20
µL..................................... 77
Figura 15. Curva analítica para cloridrato de
adifenina.............................. 78
Figura 16. Gráficos para análise de resíduos do cloridrato de
adifenina.... 78
Figura 17. Curva analítica para cloridrato de
prometazina........................... 79
Figura 18. Gráficos para análise de resíduos do cloridrato de
prometazina. 79
Figura 19. Curva analítica para dipirona
sódica.......................................... 80
Figura 20. Gráficos para análise de resíduos da dipirona
sódica...........................................................................................................
80
Figura 21. Estrutura química das fases estacionárias utilizadas
na triagem
cromatográfica.............................................................................................
86
Figura 22. Cromatograma obtido nas condições: coluna C18, fase
móvel
CO2:metanol (90:10), volume de injeção de 1 µL, pressão 1500
psi,
temperatura de 30 ºC, vazão 1,5 mL min-1, concentração dos
padrões de
0,5 mg mL-1. Compostos: A: cloridrato de adifenina, B:
cloridrato de
prometazina e C:
dipirona............................................................................
86
Figura 23. Comparação dos cromatogramas obtidos utilizando
metanol
em diferentes proporções com hidróxido de sódio. Compostos: A
–
cloridrato de adifenina, B – dipirona e C – cloridrato de
prometazina.
Comprimento de onda de 210nm. Condições cromatográficas:
coluna
C18, pressão 1500 psi, temperatura da coluna de 30 ºC, vazão 1,5
mLmin-
1, concentração dos ativos cloridrato de adifenina 0,10 mg mL-1,
cloridrato
de prometazina 0,05 mg mL-1e dipirona 5 mg
mL-1.......................................
88
Figura 24. Cromatograma obtido nas condições de 20% de metanol
e
acetato de amônio 5 mmol/L, comprimento de onda de 254nm
Condições
cromatográficas: coluna C18, pressão 1500 psi, temperatura da
coluna de
30 ºC, vazão 1,5 mLmin-1, concentração dos ativos cloridrato de
adifenina
-
0,10 mg mL-1, cloridrato de prometazina 0,05 mg mL-1e dipirona 5
mg mL-
1....................................................................................................................
89
Figura 25. Cromatogramas obtidos nos comprimentos de onda de 210
nm
e 254 nm utilizando metanol a 10 % com trietilamina. Compostos:
A –
cloridrato de adifenina, B – dipirona e C – cloridrato de
prometazina254nm.
Condições cromatográficas: coluna C18, pressão 1500 psi,
temperatura
da coluna de 30 ºC, vazão 1,5 mLmin-1, concentração dos ativos
cloridrato
de adifenina 0,10 mg mL-1, cloridrato de prometazina 0,05 mg
mL-1e
dipirona 5 mg
mL-1........................................................................................
90
Figura 26. Comparação entre os cromatogramas extraídos a
254nm
variando a concentração de metanol de 15 % (1) para 20 % (2)
utilizando
trietilamina como aditivo. Composto: A - cloridrato de
prometazina e B-
dipirona. 254nm Condições cromatográficas: coluna C18, pressão
1500
psi, temperatura da coluna de 30 ºC, vazão 1,5 mLmin-1,
concentração dos
ativos cloridrato de adifenina 0,10 mg mL-1, cloridrato de
prometazina 0,05
mg mL-1e dipirona 5 mg
mL-1........................................................................
91
Figura 27. Comparação dos cromatogramas contendo mistura de
bases
com pKa baixo (azul), médio (verde) e alto (vermelho) obtidos
com
colunas Acquity UPC2 2-EP sem hidróxido de amônio (A) e com 20
mM
do aditivo (B). (Adaptado de Perrenoud e
colaboradores)..........................
92
Figura 28. Reação de equilíbrio que ocorre com as partículas de
sílica
na presença de metanol formando éter de silil e
água............................... 93
Figura 29. Sobreposição das Curvas de retenção dos ativos -
Tempo de
retenção vs % modificador orgânico. Condições cromatográficas:
coluna
C18, pressão 1500 psi, temperatura da coluna de 30 ºC, vazão 1,5
mLmin-
1, concentração dos ativos cloridrato de adifenina 0,10 mg mL-1,
cloridrato
de prometazina 0,05 mg mL-1e dipirona 5 mg
mL-1.......................................
94
Figura 30. Cromatogramas apresentando os perfis dos picos
obtidos no
planejamento conforme Tabela 9. Condições cromatográficas
mantidas
constantes: coluna HSS C18, diluente etanol, vazão 1,5 mLmin-1,
fase
móvel CO2: metanol com 0,2 % de trietilamina e 5 % de água
purificada
(A:B), volume de injeção: 0,5 µL, concentração dos ativos: 5mg
mL-1 de
dipirona, 0,10 mg mL-1 de cloridrato de adifenina e 0,05 mg mL-1
de
cloridrato de prometazina. Cromatogramas obtidos em 210 nm
evidenciando o ativo de interesse cloridrato de
adifenina.............................
99
Figura 31. Cromatogramas apresentando os perfis dos picos
obtidos no
planejamento conforme Tabela 9. Condições cromatográficas
mantidas
constantes: coluna HSS C18, diluente etanol, vazão 1,5 mLmin-1,
fase
móvel CO2: metanol com 0,2 % de trietilamina e 5 % de água
purificada
(A:B), volume de injeção: 0,5 µL, concentração dos ativos: 5mg
mL-1 de
dipirona, 0,10 mg mL-1 de cloridrato de adifenina e 0,05 mg mL-1
de
cloridrato de prometazina. Cromatogramas obtidos em 254 nm
evidenciando os ativos de interesse cloridrato de prometazina e
dipirona.
Destaque para os planejamentos 2 e
6.........................................................
99
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Figura 32. Superfície de resposta para o K em função da
temperatura vs
modificador a pressão de 1500 psi para cloridrato de
adifenina................. 101
Figura 33. Superfície de resposta para o K em função da
temperatura vs
modificador a pressão de 1900 psi para cloridrato de
adifenina.................... 101
Figura 34. Gráfico resultados previstos pelo modelo vs
resultados experimentais para cloridrato de
adifenina...................................................
102
Figura 35. Gráfico resultados dos resíduos vs resultados
previstos pelo modelo para cloridrato de
adifenina..............................................................
102
Figura 36. Superfície de resposta para o K em função da
temperatura vs
modificador a pressão de 1500 psi para
dipirona.......................................... 103
Figura 37. Superfície de resposta para o K em função da
temperatura vs
modificador a pressão de 1900 psi para
dipirona.......................................... 104
Figura 38. Gráfico resultados previstos pelo modelo vs
resultados
experimentais para
dipirona.........................................................................
104
Figura 39. Gráfico resultados dos resíduos vs resultados
previstos pelo
modelo para
dipirona....................................................................................
105
Figura 40. Superfície de resposta para o K em função da
temperatura vs modificador a pressão de 1500 psi para cloridrato de
prometazina............
106
Figura 41. Superfície de resposta para o K em função da
temperatura vs
modificador a pressão de 1900 psi para cloridrato de
prometazina.............. 106
Figura 42. Gráfico resultados previstos pelo modelo vs
resultados
experimentais para cloridrato de
prometazina.............................................. 107
Figura 43. Gráfico resultados dos resíduos vs resultados
previstos pelo
modelo para cloridrato de
prometazina........................................................
108
Figura 44. Superfície de resposta para o par crítico cloridrato
de prometazina e dipirona em função da temperatura vs modificador a
1500
psi................................................................................................................
109
Figura 45. Superfície de resposta para o par crítico cloridrato
de
prometazina e dipirona em função da temperatura vs modificador a
1900
psi................................................................................................................
109
Figura 46: Gráfico resultados previstos pelo modelo vs
resultados experimentais para a resolução do par crítico cloridrato
de prometazina e
dipirona........................................................................................................
110
Figura 47. Gráfico resultados dos resíduos vs resultados
previstos pelo
modelo para a resolução do par crítico cloridrato de prometazina
e
dipirona........................................................................................................
110
Figura 48. Cromatograma ilustrando a seletividade para o
cloridrato de
adifenina. Condições cromatográficas: coluna C18, diluente
etanol, vazão
1,5 mL min-1, fase móvel CO2:Metanol 80:20 com 5 % água e 0,2
%
trietilamina, modo de eluição isocrático, volume de injeção 0,5
µL,
concentração do ativo 0,10 mg mL-1 cloridrato de adifenina,
temperatura
de 30 % e pressão de 1500
psi...................................................................
112
Figura 49. Cromatograma ilustrando a seletividade para o
cloridrato de
prometazina. Condições cromatográficas: coluna C18, diluente
etanol,
vazão 1,5 mL min-1, fase móvel CO2:Metanol 80:20 com 5 % água e
0,2 %
-
trietilamina, modo de eluição isocrático, volume de injeção 0,5
µL,
concentração do ativo 0,05 mg mL-1 de cloridrato de
prometazina,
temperatura de 30 % e pressão de 1500
psi...............................................
112
Figura 50. Cromatograma ilustrando a seletividade para a
dipirona.
Condições cromatográficas: coluna C18, diluente etanol, vazão
1,5 mL
min-1, fase móvel CO2:Metanol 80:20 com 5 % água e 0,2 %
trietilamina,
modo de eluição isocrático, volume de injeção 0,5 µL,
concentração do
ativo 5 mg mL-1 dipirona, temperatura de 30 % e pressão de 1500
psi........ 113
Figura 51. Cromatograma ilustrando a seletividade para a fase
móvel e o
placebo (excipientes). Condições cromatográficas: coluna C18,
diluente
etanol, vazão 1,5 mLmin-1, fase móvel CO2:Metanol 80:20 com 5 %
água
e 0,2 % trietilamina, modo de eluição isocrático, volume de
injeção 0,5 µL,
temperatura de 30 % e pressão de 1500
psi.................................................
113
Figura 52. Curva analítica para o cloridrato de
adifenina........................... 114
Figura 53. Gráficos para análise dos resíduos do cloridrato de
adifenina.... 115
Figura 54. Curva analítica para o cloridrato de
prometazina........................ 115
Figura 55. Gráficos para análise dos resíduos do cloridrato
de
prometazina.................................................................................................
116
Figura 56. Curva analítica para a dipirona sódica.
....................................... 116
Figura 57. Gráficos para análise dos resíduos da dipirona
sódica............... 117
Figura 58. Sobreposição dos mapas de contorno da K e RS a
pressão de
1500 psi.
......................................................................................................
121
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Propriedades dos IFAs: ação farmacológica, massa
molar, pka,
log P e estrutura
química..............................................................................
27
Tabela 2. Propriedades físico-químicas de alguns compostos que
podem
ser utilizados em cromatografia com fluído
supercrítico...............................
34
Tabela 3: Valores de DPR de acordo com a concentração do analito
na amostra para fins de avaliação da precisão do
método................................
48
Tabela 4. Gradiente empregado para validação do método por
HPLC/DAD...................................................................................................
57
Tabela 5. Concentração teórica dos fármacos para construção da
curva
analítica na técnica de
HPLC/DAD..............................................................
58
Tabela 6. Aditivos avaliados e respectivas
concentrações......................... 62
Tabela 7. Concentração dos padrões de acordo com a proporção
no
produto
acabado..........................................................................................
63
Tabela 8. Limites dos fatores para o planejamento composto
central........ 64
Tabela 9. Condições dos experimentos realizados de acordo com
o
Planejamento Composto
Central.................................................................
65
Tabela 10. Concentração teórica dos padrões para construção da
curva
analítica na técnica de
UHPSFC/DAD.........................................................
66
Tabela 11. Influência do pH da fase móvel no tempo de retenção
dos
cloridratos de adifenina e
prometazina........................................................
73
Tabela 12. Equação da reta das curvas analíticas, faixa linear,
coeficiente
de correlação para os ativos usando a técnica de HPLC/DAD e os
valores
informativos do limite de detecção (LD) e limite de
quantificação
(LQ)..............................................................................................................
81
Tabela 13. Resultados obtidos experimentalmente para
precisão
(repetibilidade) na técnica de
HPLC/DAD....................................................
82
Tabela 14. Resultados obtidos experimentalmente para
precisão
intermediária na técnica de
HPLC/DAD.......................................................
82
Tabela 15. Resultados da exatidão para o cloridrato de adifenina
na
técnica de
HPLC/DAD.................................................................................
83
Tabela 16. Resultados da exatidão para o cloridrato de
prometazina na
técnica de
HPLC/DAD.................................................................................
83
Tabela 17. Resultados da exatidão para dipirona na técnica
de
HPLC/DAD...................................................................................................
84
Tabela 18. Resultados da robustez para cloridrato de adifenina
na técnica
de
HPLC/DAD..............................................................................................
84
Tabela 19. Resultados da robustez para cloridrato de prometazina
na
técnica de
HPLC/DAD.................................................................................
84
Tabela 20. Resultados da robustez para dipirona sódica na
técnica de
HPLC/DAD...................................................................................................
85
Tabela 21. Ilustração do formato dos picos dos ativos em relação
ao tipo
de
diluente....................................................................................................
96
-
Tabela 22. Formato do pico cromatográfico para cloridrato de
adifenina
em função dos diferentes volumes de
injeção.............................................
97
Tabela 23. Equação da reta das curvas analíticas, faixa linear,
coeficiente
de correlação para os ativos estudados usando UHPSFC/DAD e
os
valores informativos do limite de detecção (LD) e limite de
quantificação
(LQ)..............................................................................................................
117
Tabela 24. Resultados obtidos experimentalmente para
precisão
(repetibilidade) na técnica de
UHPSFC/DAD..............................................
118
Tabela 25. Resultados obtidos experimentalmente para
precisão
intermediária na técnica de
UHPSFC/DAD.................................................
118
Tabela 26. Resultados da exatidão para o cloridrato de adifenina
na
técnica de
UHPSFC/DAD............................................................................
119
Tabela 27. Resultados da exatidão para o cloridrato de
prometazina na
técnica de
UHPSFC/DAD............................................................................
119
Tabela 28. Resultados da exatidão para o cloridrato de dipirona
na técnica
de UHPSFC/DAD.
..........................................................................
120
Tabela 29. Apresentação das condições cromatográficas dos
métodos
desenvolvidos e validados pelas técnicas de HPLC e
UHPSFC...................
122
-
LISTA DE EQUAÇÕES
Equação 1. Curva de van
Deemter.............................................................
29
Equação 2. Cálculo para
precisão..............................................................
47
Equação 3. Equação de
Horwitz.................................................................
47
Equação 4. Cálculo para limite de
detecção............................................... 48
Equação 5. Cálculo para limite de
quantificação........................................ 49
Equação 6. Cálculo para exatidão utilizando a
concentração.................... 50
Equação 7. Cálculo para exatidão utilizando a
recuperação...................... 50
Equação 8. Cálculo para fator de
retenção................................................. 64
Equação 9. Cálculo para
resolução............................................................
64
-
Lista de abreviaturas
AINES – Anti-inflamatórios Não Esteroidais
A-QbD - Analytical Quality by Design
ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária
ABPR – Automated Backpressure Regulator
CMD – Concentração Média Determinada
CO2 – Dióxido de Carbono
COX – Ciclooxigenase
CQA – Critical Quality Atribute
DAD – Detector por Arranjo de Diodos
DoE – Design of Experiments
DP – Desvio Padrão
dp – diâmetro de partícula
DPa – Desvio Padrão Estipulado
DPR – Desvio Padrão Relativo
DS – Design Space
ELSD – Detector Evaporativo por Espalhamento de Luz
FE – Fase Estacionária
FID – Detector por Ionização em Chama
FM – Fase Móvel
GC - Gas Chromatography
HPLC - High Performance Liquid Chromatography
Ic – Inclinação da curva de inclinação
ICH – International Conference on Harmonisation
IFA – Insumo Farmacêutico Ativo
K – Fator de retenção
LC – Liquid Chromatography
LD – Limite de Detecção
LQ – Limite de Quantificação
MIP – Medicamento Isento de Prescrição
MODR - Method Operable Design Region
MS – Mass Spectrometer
-
QbD – Quality by Design
r – Coeficiente de correlação
Rs – Resolução
SEF – Silyl Ether Formation
SFC - Supercritical Fluid Chromatography
UHPLC - Ultra High Performance Liquid Chromatography
UHPSFC - Ultra High Performance Supercritical Fluid
Chromatography
UPC2 - Ultra Performance Convergence Chromatography
UV – Ultravioleta
-
Sumário
1.
Introdução...............................................................................................
23 1.1. Dor e
Analgésicos..................................................................................
23 1.1.1. Dipirona
sódica...................................................................................
23 1.1.2. Cloridrato de
adifenina.......................................................................
23 1.1.3. Cloridrato de
prometazina..................................................................
26 1.1.4 Métodos analíticos farmacopéicos empregados em análises de
dipirona sódica, cloridrato de adifenina e cloridrato de
prometazina...........
27
1.2. Evolução das técnicas
cromatográficas................................................ 28
1.3. Cromatografia líquida de alta eficiência –
HPLC.................................. 31 1.4. Cromatografia com
fluído supercrítico de ultra alta eficiência -
UHPSFC.......................................................................................................
33
1.5. Quality by Design (QbD) no desenvolvimento de
métodos................... 42 1.6.
Validação...............................................................................................
45 1.6.1.
Seletividade........................................................................................
45 1.6.2.
Linearidade.........................................................................................
46 1.6.3. Faixa de
trabalho................................................................................
46 1.6.4.
Precisão..............................................................................................
47 1.6.5. Limite de
detacção..............................................................................
48 1.6.6. Limite de
quantificação.......................................................................
49 1.6.7.
Exatidão..............................................................................................
49 1.6.8.
Robustez............................................................................................
50 2. Objetivos.
..............................................................................................
51 2.1.
Principal................................................................................................
51 2.2.
Específicos............................................................................................
51 3.
Justificativa.............................................................................................
52 4. Materiais e
Métodos................................................................................
53 4.1.
Materiais...............................................................................................
53 4.1.1. Reagentes e
solventes.......................................................................
53 4.1.2. Padrões analíticos e
amostras............................................................
53 4.1.3.
Equipamentos.....................................................................................
53 4.1.4. Cromatógrafos, colunas cromatográficas e
softwares........................ 53
4.1.4.1.HPLC................................................................................................
53 4.1.4.1.1 Colunas
cromatográficas...............................................................
54 4.1.4.1.2.
Software.......................................................................................
54 4.1.4.2.
UHPSFC..........................................................................................
54 4.1.4.2.1. Colunas
cromatográficas..............................................................
54 4.1.4.2.2.
Software.......................................................................................
54 4.2. Métodos
...............................................................................................
54 4.2.1.
HPLC..................................................................................................
54 4.2.1.1.Preparo dos padrões e
amostras...................................................... 55
4.2.1.2. Triagem
cromatográfica...................................................................
56 4.2.1.2.1.Seleção das fases
estacionárias................................................... 56
4.2.1.2.2. Seleção da fase
móvel..................................................................
56 4.2.1.2.3. Seleção do diluente, concentração de trabalho, volume
de injeção e comprimento de
onda....................................................................
56
4.2.1.3.
Validação.........................................................................................
57 4.2.2.
UHPSFC.............................................................................................
60 4.2.2.1. Preparo dos padrões e
amostras.....................................................
61
-
4.2.2.2. Triagem
cromatográfica...................................................................
61 4.2.2.2.1. Seleção das fases
estacionárias.................................................. 61
4.2.2.2.2. Seleção da fase
móvel..................................................................
62 4.2.2.2.3. Seleção do diluente, concentração de trabalho, volume
de injeção e comprimento de onda.
..................................................................
62
4.2.2.2.4. Planejamento
experimental..........................................................
63 4.2.2.2.5. Validação do
método....................................................................
66 5. Resultados e
Discussão.........................................................................
68 5.1.
HPLC.....................................................................................................
68 5.1.1. Seleção da fase
estacionária.............................................................
68 5.1.2. Seleção da fase
móvel.......................................................................
69 5.1.3. Seleção do diluente, concentração de trabalho e volume de
injeção 73 5.1.4. Validação
..........................................................................................
75 5.1.4.1.
Seletividade.....................................................................................
76 5.1.4.2.
Linearidade......................................................................................
77 5.1.4.3.
Precisão...........................................................................................
81 5.1.4.4.
Exatidão..........................................................................................
82 5.1.4.5.
Robustez.........................................................................................
84 5.2.
UHPSFC...............................................................................................
85 5.2.1. Seleção da fase
estacionária..............................................................
85 5.2.2. Seleção da fase
móvel........................................................................
86 5.2.3. Seleção do diluente, concentração de trabalho e volume de
injeção 95 5.2.4. Planejamento
experimental................................................................
97 5.2.4.1. Resultado para o fator de
retenção................................................. 100
5.2.4.2. Resultado para a resolução entre o par crítico cloridrato
de prometazina e
dipirona................................................................................
108
5.2.5
Validação............................................................................................
111 5.2.5.1.
Seletividade....................................................................................
111 5.2.5.2.
Linearidade....................................................................................
113 5.2.5.3.
Precisão.........................................................................................
118 5.2.5.4.
Exatidão.........................................................................................
119 5.2.5.5.
Robustez.........................................................................................
120 6.
Conclusão...............................................................................................
123 7. Referências
bibliográficas....................................................................
125 8.
Anexos.....................................................................................................
8.1. Declaração de bioética e
biossegurança................................................ 8.2.
Declaração de direitos
autorais.............................................................
134 135 136
-
23
1. Introdução
1.1 Dor e Analgésicos
A dor tem importância clínica fundamental, sendo uma das queixas
mais
comuns dos pacientes que procuram atendimento médico. A sensação
de dor é um
sintoma subjetivo, que varia de indivíduo para indivíduo em
função de vários fatores
pessoais como: idade, raça, sexo, privação de sono, estresse,
entre outros (SOUZA,
2005).
De acordo com a international association for the study of pain
(IASP), a
dor é uma sensação ou experiência emocional desagradável,
associada com dano
tecidual real ou potencial, sendo aguda com duração inferior a
30 dias, ou crônica com
duração superior a 30 dias. É classificada segundo seu mecanismo
fisiopatológico em
dor de predomínio nociceptivo, dor de predomínio neuropático e
dor mista. A dor de
predomínio nociceptivo, ou simplesmente dor nociceptiva, ocorre
por ativação
fisiológica de receptores de dor e está relacionada à lesão de
tecidos ósseos,
musculares ou ligamentares (osteoartrose, artrite reumatoide,
fratura e rigidez
muscular na dor lombar inespecífica) e geralmente responde bem
ao tratamento
sintomático com analgésicos ou anti-inflamatórios não esteroides
(AINES). A dor
neuropática é definida como dor iniciada por lesão ou disfunção
do sistema nervoso
periférico ou central, com a presença de descritores verbais
característicos
(queimação, agulhadas, dormências) e responde pobremente aos
analgésicos usuais
(paracetamol, dipirona, aines, opioides fracos). O tipo de dor
mais frequente na prática
clínica é o misto, indicando lesão simultânea de nervos e
tecidos adjacentes. Um
exemplo de dor mista é a radiculopatia ou a dor devida ao câncer
(“oncológica”), casos
em que não há somente compressão de nervos e raízes (dor
neuropática), mas
também de ossos, facetas, articulações e ligamentos (dor
nociceptiva) (BRASIL,
2012).
Há uma classe de medicamentos denominada analgésicos,
responsável
por amenizar ou interromper as vias de transmissão nervosa sendo
administrados
para alívio de dores de diversas intensidades. Os analgésicos
possuem mecanismos
e propriedades distintas, sendo divididos em algumas subclasses,
sendo as principais:
os opióides e os anti-inflamatórios não esterioidais (AINES)
(SILVA, 2006). Os
opióides possuem ação central, propriedades analgésicas
potentes, efeito
tranquilizante e sedativo, com tendência a produzir tolerância,
dependência psíquica
-
24
e física quando usados cronicamente. Os AINES possuem ação
central e periférica,
propriedades analgésica, antipirética e anti-inflamatória e
atuam inibindo a ciclo-
oxigenase (COX), enzima que catalisa a conversão do ácido
aracdônico em
prostaglandinas e prostaciclinas envolvidas no processo
inflamatório e na sensibili-
zação das unidades neuronais centrais e periféricas (MOTTA et
al, 2010).
Normalmente são vendidos sem necessidade de prescrição médica
facilitando a
automedicação e o consumo abusivo dos mesmos. Entre os AINES
mais
comercializados estão os medicamentos contendo dipirona sódica,
que pode estar na
forma de monodroga ou associada a outros insumos farmacêuticos
ativos (IFA). A
associação dipirona, cloridrato de adifenina e cloridrato de
prometazina é classificada
como AINE e indicada para alívio de manifestações dolorosas em
geral,
principalmente dores pós-operatórias e cefaleias (SILVA e MOARES
2010) por
promover ação analgésica, antiespasmódica e antipirética
referente à dipirona, ação
relaxante da musculatura lisa proveniente da adifenina, que
também reforça a ação
antiespasmódica da dipirona, e as ações sedativa, colinérgica,
antiemética e anti-
histamínica da prometazina. Esta associação de drogas permite
uma potencialização
dos efeitos, observando-se uma rápida resposta terapêutica.
Um estudo foi realizado com a associação dipirona, cloridrato de
adifenina
e cloridrato de prometazina em pacientes com dor oncológica com
objetivo de avaliar
se a administração por via oral da associação seria capaz de
proporcionar uma melhor
qualidade da analgesia e a redução da dose empregada de opióide.
A morfina é a
droga de escolha para pacientes com dor crônica de origem
oncológica, porém o seu
uso crônico e doses crescentes estão relacionados com o
surgimento de efeitos
colaterais. O estudo envolveu 20 pacientes com média de uso da
morfina de 73,5
mg/dia. Foi administrada a associação de 6 em 6 h durante uma
semana. Para avaliar
a intensidade da dor foi utilizada a escala visual analógica
(EVA) que varia de 0 (menor
intensidade) a 10 (maior intensidade) no início e no final do
tratamento. Após o período
de estudo foi constatado a redução da dose da morfina em 13
pacientes (média de
50,5 mg/dia) e redução no EVA em 18 pacientes. Os resultados
evidenciaram a
melhora da eficácia analgésica, com possibilidade de redução da
dose de opióide
(LISASOR).
-
25
1.1.1 Dipirona
A dipirona ou metamizol ou ácido
1-fenil-2,3-dimetil-5-pirazolona-4-
metilaminometanossulfônico (Tabela 1), é um fármaco muito
utilizado pela população
brasileira em diversas apresentações farmacêuticas (solução
oral, injetável,
comprimidos e supositórios), sendo comercializado principalmente
como
medicamento isento de prescrição (MIP) (CAETANO, 2005). A
dipirona sódica
monoidratada é encontrada principalmente como um pó cristalino,
quase branco e
inodoro. É solúvel em água e em metanol, pouco solúvel em etanol
e praticamente
insolúvel em éter etílico, acetona, benzeno e clorofórmio
(BRASIL, 2010). Após
administração oral, a dipirona ao entrar em contato com o suco
gástrico é rapidamente
hidrolisada originando o metabólito ativo
4-N-metil-aminoantipirina (MAA), que é
prontamente absorvido pelo organismo sofrendo biotransformação
hepática. O MAA
é em seguida metabolizado no fígado por desmetilação formando o
4-amino-antipirina
(AA), e por oxidação, originando o 4- formil-amido-antipirina
(FAA). O AA sofre
acetilação originando o composto inativo 4-acetilaminoantipirina
(AAA). Os
metabólitos MAA e AA são responsáveis pelos efeitos analgésicos
da dipirona, por
inibirem a síntese de prostaglandinas. Nenhum desses metabólitos
liga-se
extensivamente às proteínas plasmáticas, sendo predominantemente
excretados
pelos rins (NASCIMENTO, 2005). Considerada um potente analgésico
e antipirético,
a dipirona é indicada para patologias como cefaleias,
neuralgias, dores pós-
operatórias, reumáticas, de fibras musculares lisas (por
exemplo, cólica renal) e de
outras origens (NASCIMENTO, 2005). Também é administrada para
tratamento dos
sintomas da dengue onde a utilização do ácido acetilsalicílico
(AAS) não é
recomendada (BRASIL, 2003a). O mecanismo de ação consiste na
inibição
irreversível da enzima COX 2. Sua ação ocorre tanto no sistema
nervoso central
quanto no sistema nervoso periférico (HARDMAN, LIMBIRD, 2001).
Apesar de exercer
grande importância na prática clínica no Brasil, o uso de
dipirona não é recomendado
em alguns países como EUA e Reino Unido por estar associada a
anemias aplásticas
e agranulocitose (BAR-OZ, et al., 2005).
1.1.2 Adifenina
A adifenina ou 2-(dietilamino) etil 2,2-difenilacetato (Tabela
1) tem como
principais propriedades farmacológicas as ações antiespasmódica
e
parassimpatolítica. Apresenta efeitos periféricos fracos
similares àqueles da atropina
-
26
associados a uma ação antiespasmódica direta e uma ação
anestésica local, sendo
administrada para o alívio de espasmos viscerais. A ação
relaxante da musculatura
lisa se deve a um mecanismo competitivo antagonista não
específico da acetilcolina
pelo receptor de atropina e sua ação na musculatura lisa
intestinal é explicada por um
efeito anestésico local, o qual interrompe os reflexos locais
regulando assim, o tônus
e a motilidade intestinais. Em doses terapêuticas, a ação no
tubo digestivo não
compromete os mecanismos secretórios do intestino (BROWN, et
al., 1980,
LISADOR).
1.1.3 Prometazina
A prometazina ou N,N, -trimetil-10H fenotiazina-10 etanamina
(Tabela
1), encontra-se no mercado sob as formas farmacêuticas de
comprimidos, drágeas,
gotas, xarope, elixir, creme e solução injetável, podendo
apresentar-se ainda na forma
de base livre ou de sal, e também associado ou não a outros
fármacos (BADRA, 1991).
Como base livre, é insolúvel em água e, devido a isso, é
utilizada geralmente como
sal, especialmente cloridrato, que se apresenta na forma de pó
cristalino branco ou
levemente amarelado, inodoro, não higroscópico e de sabor
amargo. Na forma de sal
é altamente solúvel em água, metanol, etanol e clorofórmio e
praticamente insolúvel
em acetona, éter e acetato de etila (BRASIL, 2010). Pertencente
ao grupo das
fenotiazinas, é considerado um potente anti-histamínico
utilizado no tratamento de
distúrbios alérgicos, como anti-emético e como adjuvante à
anestesia geral. A ação
anti-alérgica é apenas paliativa, pois mesmo diminuindo ou
abolindo os principais
efeitos da histamina no organismo, atuando como inibidor
competitivo dos sítios
receptores dessa substância endógena, não possui a capacidade de
inativar ou
interferir em sua síntese ou liberação. Os efeitos da histamina
são mediados por dois
tipos de receptores, denominados receptores H1 e H2. A
prometazina é um fármaco
bloqueador de receptor H1 e por possuir propriedade sedativa
promove sonolência
como efeito colateral quando empregada no tratamento sintomático
de rinite alérgica
e urticária (DeLUCIA, 2014). Quando associada a dipirona ou
outro analgésico auxilia
no controle na dor pelo efeito de sedação no pré e
pós-operatório obstétrico
(LISADOR).
-
27
Tabela 1. Propriedades dos IFAs: ação farmacológica, massa
molar, pka, log P e estrutura química.
1.1.4 Métodos analíticos farmacopeicos empregados em análises de
dipirona
sódica, cloridrato de adifenina e cloridrato de prometazina
Para o doseamento do ativo dipirona sódica monohidratada (IFA) e
nas
formas farmacêuticas solução oral e comprimido, a Farmacopeia
Brasileira 5ª edição
recomenda a titulação com iodo em meio acidificado com ácido
clorídrico a
temperaturas abaixo de 20º C utilizando-se amido como indicador
(BRASIL, 2010). A
Farmacopeia Europeia 39ª indica o mesmo procedimento para o
ativo (EUROPEAN
PHARMACOPEIA, 2017).
Para o cloridrato de prometazina (matéria prima) a Farmacopeia
Brasileira
5ª edição fornece dois métodos para o doseamento. Pode-se
dissolver o ativo em uma
mistura de ácido clorídrico e etanol e realizar titulação
potenciométrica com hidróxido
de sódio verificando o volume gasto entre os dois pontos de
inflexão; ou dissolver o
ativo em uma mistura de ácido acético glacial e acetato de
mercúrio e titular com ácido
perclórico utilizando cristal violeta como indicador (BRASIL,
2010), sendo esse último
método indicado também pela Farmacopeia Americana 39ª edição
(UNITED STATES
PHARMACOPEIA, 2016). A Farmacopeia Japonesa na 14ª edição indica
o
-
28
doseamento do ativo dissolvido em uma mistura de ácido acético e
anidrido acético
através de titulação potenciométrica com ácido perclórico
(JAPANESE
PHARMACOPEIA, 2001). Para a forma farmacêutica comprimido, a
Farmacopeia
Brasileira indica a técnica de espectrofotometria de absorção no
ultravioleta em meio
acidificado com ácido clorídrico (BRASIL, 2010).
Nas farmacopeias mencionadas não há descrição de metodologia
para
doseamento do cloridrato de adifenina, nem informações para a
associação em
questão.
Todas as técnicas citadas são validadas, aceitas e indicadas
nas
farmacopeias, porém quando se trata de associações
medicamentosas, as técnicas
cromatográficas são as mais indicadas, por serem mais sensíveis
e estarem
conectadas a detectores capazes de identificar compostos
diferentes numa mesma
amostra. Entre as técnicas cromatográficas, a Cromatografia
Líquida de Alta Eficiência
é a mais utilizada em indústrias e laboratórios.
1.2 Evolução das técnicas cromatográficas
A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência e a Cromatografia
Gasosa são
técnicas já consolidadas que desde a sua descrição estão em
constante inovação
tornando as análises mais eficientes e rápidas. A cromatografia
é uma técnica de
separação de componentes de uma mistura que envolve uma corrente
de fluído em
movimento, chamada fase móvel e uma fase estacionária. Á medida
que a fase móvel
transcorre a fase estacionária, os solutos são separados de
acordo com a interação
destes com as fases, eluindo primeiro os que têm maior afinidade
com a fase móvel e
em seguida, os que têm maior afinidade com a fase estacionária.
Na GC, a fase móvel
é um gás transportador, normalmente inerte, que arrasta a
amostra sobre a fase
estacionária, não participando do processo de separação.
Apresenta instrumentação
fácil de manusear, ótima capacidade analítica devido à alta
difusividade e baixa
densidade dos gases, separando diversos componentes de uma
amostra com tempo
de análise variando de minutos a pouco mais de uma hora. Sua
limitação está no tipo
de amostra a ser analisada, a qual deve ser volátil e
termicamente estável. Pode-se
realizar a derivatização do composto, porém nem sempre é viável
e as etapas de
preparação podem ser longas e complexas (COLLINS, BRAGA, BONATO,
2006).
A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência é uma das modalidades
da
Cromatografia Líquida que consiste em separar amostras que estão
distribuídas entre
https://pt.wikipedia.org/wiki/G%C3%A1shttps://pt.wikipedia.org/wiki/Inerte
-
29
as FE e FM, sendo essa última líquida. O aperfeiçoamento das FE
com a diminuição
do tamanho das partículas permitiu um aumento significativo na
eficiência da técnica
medida em número de pratos teóricos. Quanto maior o número de
pratos teóricos/cm,
maior o número de etapas de equilíbrio entre as FE e FM e,
portanto, melhor a
eficiência e separação. Seu emprego foi iniciado em meados de
1960 com intenção
de suprir as análises inviáveis pela GC (COLLINS, BRAGA, BONATO,
2006).
Em 1950, as colunas de HPLC continham o recheio de
partículas
irregulares de 100 a 200 µm com eficiência de 200 pratos/15 cm.
Em 1960, foram
incorporadas partículas peliculares rígidas de 40-50 µm
resistentes à pressão, porém
com reduzida capacidade de amostra. Em 1970, surgiram as
partículas com 10 µm,
aumentando significativamente a eficiência, entretanto por serem
irregulares
comprometiam a reprodutibilidade (MALDANER, JARDIM, 2009). Entre
as décadas
de 1980 e 1990 a eficiência alcançou 30000 pratos/15 cm com a
introdução de
partículas esféricas não porosas de 1,5 µm e 1,7 µm para as
porosas, elevando o
desempenho cromatográfico e permitindo melhores resoluções. A
combinação entre
o uso de partículas menores e sistemas com alta pressão originou
a Cromatografia
Líquida de Ultra Alta Eficiência (UHPLC - Ultra High Performance
Liquid
Chromatography) (MALDANER, JARDIM, 2009).
O aprimoramento das partículas permitiu aumentar a eficiência,
gerar picos
mais simétricos e reduzir o tempo de análise. A curva de van
Deemter, representada
pela Equação 1, avalia a eficiência do sistema cromatográfico, e
em particular, da
coluna cromatográfica, através de uma curva que relaciona a
altura equivalente a um
prato teórico (H) e a velocidade linear da fase móvel (μ):
𝐻 = 𝐴 +𝐵
µ+ 𝐶µ Equação 1
Onde o termo A representa os caminhos distintos realizados pelo
analito,
sendo menor com uso de partículas reduzidas e uniformes; o termo
B refere se ao
tempo de permanência do analito na coluna e à velocidade linear
da FM, sendo que
em velocidades maiores há diminuição na permanência do analito,
aumentando a
eficiência e o termo C relaciona a transferência de massa do
analito entre as FE e FM
(MALDANER, JARDIM, 2009).
Apesar da ampla aplicabilidade da Cromatografia Liquida é
incorreto
afirmar que a mesma substitui a Cromatografia Gasosa. Ambas são
complementares,
-
30
pois apresentam vantagens e limitações distintas, permitindo a
análise de diferentes
tipos de amostras.
Com intuito de unificar o melhor das técnicas mencionadas (GC e
HPLC) a
utilização de um fluído supercrítico como FM despertou
interesse, gerando a técnica
denominada Cromatografia com Fluído Supercrítico (Supercritical
Fluid
Chromatography, SFC). O estado supercrítico ocorre quando um
composto é
aquecido e pressurizado a condições superiores ao seu ponto
crítico, o qual determina
os limites em que as fases líquida/gasosa estão em equilíbrio.
Um novo aquecimento
eliminará essa interface, originando o estado denominado
supercrítico (NOVAKOVÁ,
et al, 2014). Os primeiros trabalhos com essa técnica utilizaram
dióxido de carbono
(CO2) como fluído supercrítico. Klesper e colaboradores, em
1962, apresentaram bons
resultados através da separação de uma mistura de porfirinas
(KLESPER, CORWIN,
TURNER, 1962), Sie e Rijnders, em 1967, avaliaram os efeitos da
pressão sobre o
coeficiente de partição, permeabilidade e eficiência na
separação em sistemas
cromatográficos (SIE, RIJNDERS, 1967a, 1967b). Em 1981, Novotny
e colaboradores
introduziram colunas capilares em equipamentos semelhantes a um
cromatógrafo a
gás. Essa inovação possibilitou o uso de gradiente de pressão,
porém a vazão
modificava com a alteração da pressão (NOVOTNY, et al, 1981,
NOVOTNY,
SPRINGTON, 1981).
Até 1982 o único constituinte da FM em SFC era o CO2 que devido
à baixa
polaridade limitava a técnica a análise de compostos apolares,
apresentando os
resultados mais satisfatórios na separação de enantiômeros. Em
1982, Gere e
colaboradores adicionaram um regulador de contrapressão em um
HPLC que
viabilizou o controle individual da pressão e da vazão da FM.
Esse fato possibilitou o
uso de modificadores orgânicos e aditivos, aumentando a
seletividade da técnica e
permitindo a análise de compostos com polaridades diferenciadas
(GERE, BOARD,
McMANIGILL, 1982). Alguns trabalhos como os de Cui e Olesik
(CUI, OLESIK, 1995)
e os de Lee e Olesik (LEE, OLESIK, 1995) evidenciaram resultados
positivos
referentes ao uso de misturas de solventes e CO2 na FM.
Os bons resultados desses estudos incentivaram o aprimoramento
nos
equipamentos e nas FE possibilitando o surgimento da
Cromatografia com Fluído
Supercrítico de Ultra Alta Eficiência (UHPSFC – Ultra High
Performance Supercritical
Fluid Chromatography) que associa o potencial da UHPLC com a
SFC, permitindo
análises eficientes, rápidas e ecológicas, sendo uma alternativa
promissora em
-
31
diferentes segmentos industriais e acadêmicos. Saito (2013),
através de um
levantamento de publicações entre 1962 e 2012, evidenciou como o
aprimoramento
na instrumentação incentivou o uso da técnica. De 1962 a 1982 o
número de trabalhos
envolvendo SFC não ultrapassava os 100. A partir de 1984 houve
um crescimento
expressivo de publicações alcançando mais de 800 em 2008 (SAITO,
2013).
Entre as técnicas cromatográficas mencionadas, a HPLC e a
UHPSFC
foram as selecionadas para o desenvolvimento de métodos para
doseamento dos
IFAs dipirona, cloridrato da adifenina e cloridrato de
prometazina. A primeira por ser
uma técnica consolidada e amplamente utilizada para esse fim, e
a segunda com
intuito de demonstrar a aplicabilidade para análise destes
fármacos.
1.3. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência – HPLC
O aprimoramento ao longo dos anos possibilitou o uso do HPLC
em
diversas áreas, para análise de variados compostos. Nessa
técnica a FM exerce papel
fundamental, pois além de arrastar os compostos pela FE, também
participa do
processo de separação.
Fase móvel
A escolha da FM é importante para o sucesso da análise e alguns
critérios
devem ser atendidos. O solvente deve possuir alto grau de pureza
favorecendo a
detecção de compostos em baixas concentrações, solubilizar a
amostra sem
decompô-la, apresentar baixa viscosidade aumentando a
transferência de massas
entre as fases melhorando a eficiência, ser compatível com o
detector escolhido e não
possuir absorção no mesmo comprimento de onda do analito em
estudo (COLLINS,
BRAGA, BONATO, 2006).
A FM interage com os analitos através de ligações dipolo-dipolo,
ligação
de hidrogênio, forças de Van der Waals ou forças dielétricas.
Uma interação muito
forte diminui o fator de retenção (k) comprometendo a eficiência
da separação, pois o
analito não interage com a FE.
Uma característica importante da FM é a força cromatográfica do
solvente
que está relacionada com a polaridade da FE, pois quanto mais
similar elas forem,
mais forte será a força. Quando a FE é mais polar que a FM a
técnica é denominada
cromatografia líquida de fase normal, quando ocorre o contrário,
ou seja, a FE é
menos polar que a FM, a técnica é conhecida como cromatografia
líquida de fase
-
32
reversa. Quando há sobreposição de picos ou proximidade entre os
mesmos pode-se
alterar a seletividade da FM, substituindo o solvente por outro
de polaridade
semelhante para auxiliar a separação. Os solventes mais
utilizados em cromatografia
em fase normal são éter metil terc-butílico, clorofórmio e
cloreto de metileno. Os mais
frequentes em fase reversa são metanol, acetonitrila e
tetraidrofurano (COLLINS,
BRAGA, BONATO, 2006).
Algumas análises precisam ser executadas em pH controlado,
nessas
situações empregam-se solução tampão, onde o pH é determinado em
função do pKa
do composto a ser separado, variando normalmente ± 1 unidade.
Assim para
compostos ácidos, a solução tampão de pH menor que o pKa gera
compostos
moleculares, e em pH maiores, compostos ionizados (ânions). O
contrário acontece
com compostos básicos, se o pH for maior que o pKa formam-se
espécies
moleculares, se for menor, espécies ionizadas (cátions). A
solução tampão passa por
filtração eliminando possíveis partículas que possam entupir as
conexões. Após a
análise, deve ser realizado um eficiente processo de limpeza no
sistema
cromatográfico evitando a cristalização do componente do tampão.
Independente das
características do solvente, todos devem ser desgaseificados
antes do uso impedindo
a formação de bolhas (COLLINS, BRAGA, BONATO, 2006).
A eluição da FM pode ser isocrática ou gradiente. Na isocrática
a força
cromatográfica permanece constante durante toda a corrida, é
mais comum,
apresenta menor ruído na linha de base e é indicada em
separações simples. Na
eluição por gradiente ocorre alteração da composição da FM no
decorrer da
separação, é mais usual para misturas com compostos de
diferentes polaridades e
estruturas químicas a fim de otimizar o tempo de corrida, com
redução no fator de
retenção dos analitos (COLLINS, BRAGA, BONATO, 2006).
Fase estacionária (coluna)
A coluna é constituída por material inerte, usualmente aço
inoxidável, de
diâmetro interno uniforme e capaz de resistir às pressões em que
será usada. Sua
capacidade é determinada de acordo com o comprimento, diâmetro e
material de
recheio. Apresenta nas extremidades um disco de teflon ou metal
poroso, conhecido
como fritz, para evitar a perda do recheio ou mudanças na sua
compactação.
A sílica é o recheio mais usual por apresentar algumas vantagens
como
partículas pequenas e esféricas de diferentes diâmetros e
tamanhos de poro,
-
33
partículas porosas com grande área superficial, elevada rigidez
que permite o
emprego de altas pressões e a possibilidade de modificações na
sua superfície devido
à presença de grupos silanóis reativos (TONHI et al, 2002).
Quanto mais homogêneo
for o recheio melhor a eficiência da separação. O tamanho da
partícula controla o
processo de difusão das moléculas da amostra ao penetrar e sair
dos poros da
partícula. Quanto menor for o tamanho, menor será o tempo gasto
pelo analito,
resultando em análises mais rápidas sem comprometer a eficiência
(CEFET, 2017).
Instrumentação para HPLC
Um sistema de HPLC é constituído normalmente por reservatório,
bombas
e programadores de fase móvel, sistemas de injeção de amostra,
detector e
registrador de dados (COLLINS, BRAGA, BONATO, 2006; CEFET,
2017). Entre esses
componentes a bomba, injetor e detector devem ser destacados,
principalmente em
separações de compostos complexos que envolvem a identificação
de analitos
distintos. As bombas com programadores são responsáveis pelo
envio da FM à FE e
permitem o uso de eluição por gradiente, geralmente aplicada aos
compostos com
polaridades diferentes. O injetor introduz a amostra na coluna
através de válvulas
manuais para amostragem ou a partir de sistemas de injeção
automáticos. As válvulas
manuais são feitas de material inerte como aço inoxidável ou
PTFE
(politetrafluoretileno). Os auto injetores são operados
eletricamente ou com ar
comprimido, são precisos na injeção de volumes reduzidos e
possibilitam a
programação de várias injeções sem necessidade do analista em
tempo integral
(COLLINS, BRAGA, BONATO, 2006). O detector é responsável por
medir alguma
propriedade física ou físico-química da amostra. Quando o
efluente sai da coluna e
chega ao detector, é gerado um sinal que normalmente é
proporcional à concentração
do analito na amostra. O detector universal é normalmente
empregado, pois identifica
diferentes tipos de analitos. O detector seletivo é restrito a
uma determinada classe
de substâncias, sendo seu uso mais limitado (COLLINS, BRAGA,
BONATO, 2006).
Diversos tipos de detectores são utilizados no HPLC como
ultravioleta (UV), arranjo
de diodos (DAD), espectrometria de massas (MS - mass
spectrometry), fluorescência,
índice de refração e ELSD (detector evaporativo por espalhamento
de luz).
1.4 Cromatografia com Fluído Supercrítico de Ultra Alta
Eficiência – UHPSFC
-
34
O fluido supercrítico é considerado uma fase contínua com
propriedades
dos estados líquido e gasoso sendo obtido quando a interface que
separa esses dois
estados deixa de existir, fato que ocorre em condições
superiores ao ponto crítico
(equilíbrio), conforme demonstrado na Figura 1 (NOVAKOVÁ et al,
2014)
Figura 1: Diagrama de fases do dióxido de carbono (Adaptado
Nováková et al, 2014).
A Tabela 2 apresenta alguns compostos que podem ser utilizados
como
fluído e suas propriedades críticas (CARRILHO, TAVARES, LANÇAS,
2001).
Tabela 2. Propriedades físico-químicas de alguns compostos que
podem ser utilizados em
cromatografia com fluído supercrítico (CARRILHO, TAVARES,
LANÇAS, 2001).
Fluído Formula
molecular Temperatura crítica (°C)
Pressão crítica (atm)
Densidade crítica (dc)
Dióxido de Carbono CO2 31,3 72,9 0,47
Óxido Nitroso N2O 36,5 71,7 0,45
n-Pentano C5H12 196,6 33,3 0,23
Hexafluoreto de Enxofre
SF6 45,5 37,1 0,74
Xenônio Xe 16,6 58,4 1,10
Metanol CH3OH 240,5 78,9 0,27
Isopropanol C3H7OH 235,3 47,0 0,27
-
35
Um fluído supercrítico apresenta propriedades inerentes aos
gases,
como a elevada difusividade e baixa viscosidade, e a dos
líquidos, como alto poder
de solvatação e densidade. A baixa viscosidade (10- 3 poise) e o
elevado coeficiente
de difusão do soluto permitem vazões elevadas e análises rápidas
e eficientes. A
densidade e o poder de solvatação promovem boa solubilidade e
transferência de
analitos, favorecendo detecção de uma gama maior de compostos
(CARRILHO,
TAVARES, LANÇAS, 2001). A retenção dos compostos é complexa e
influenciada
por uma série de fatores como temperatura, pressão, FE,
propriedade do analito,
densidade e composição da FM, sendo difícil avaliar
separadamente cada um deles.
A temperatura afeta a pressão de vapor, a densidade e a
solubilidade do
soluto promovendo alterações na afinidade do mesmo pela FE. À
pressão constante,
temperaturas elevadas aumentam a pressão de vapor e a
solubilidade, diminuindo a
retenção, pois há maior concentração do analito na FM do que na
FE. À temperatura
constante, o aumento da pressão promove elevação na densidade e
poder de
solvatação diminuindo a retenção. Dentre os fatores citados, a
relação
pressão/densidade é empregada para ajuste fino, pois acarreta
pequenas alterações
na retenção, principalmente em misturas com CO2 e solventes
orgânicos, devido à
baixa compressibilidade da FM (NOVÁKOVÁ et al, 2014; CARRILHO,
TAVARES,
LANÇAS, 2001).
O uso do modificador orgânico promove alteração na temperatura
e
pressão crítica, ocasionando alteração na solubilidade dos
analitos, modificação na
retenção e formato de picos e pode causar separação de fases, o
que é caracterizado
pela elevação de ruído na linha de base pela passagem da mistura
gás-líquido no
detector (BERGER, 1991). Na região denominada subcrítica, onde a
temperatura é
menor que a temperatura crítica, mas a pressão é mantida acima
daquela considera
crítica não há relatos dessa possível separação de fases, sendo
normalmente a região
mais empregada para o desenvolvimento analítico (NOVÁKOVÁ et al,
2014;
CARRILHO, TAVARES, LANÇAS, 2001).
A vazão escolhida também afeta a resolução dos analitos. Em SFC
a
pressão é controlada e a vazão varia proporcionalmente afetando
a separação de
diferentes maneiras. Pressão e vazão elevadas diminuem a
resolução, pois podem
causar queda de pressão através da coluna (CARRILHO, TAVARES,
LANÇAS, 2001).
Em 1986, Hirata e Nakata propuseram um sistema composto por 2
bombas de
pressurização, uma antes e outra depois do sistema injetor,
coluna, detector. Esse
-
36
sistema possibilitou uma programação de pressão sem aumento de
fluxo ou queda de
pressão (HIRATA, NAKATA, 1986). Atualmente esse desempenho é
alcançado pelo
regulador de contra pressão (ABPR – Automated Backpressure
Regulator).
Fase móvel e aditivos
A FM é constituída principalmente por CO2, um gás com condições
críticas
brandas (pressão 74 bar e temperatura de 31 °C), considerado
como um solvente
verde (LENARDÃO, et al, 2003) favorecendo análise de compostos
termicamente
instáveis, é atóxico, inerte, de fácil aquisição e descarte,
apresenta baixa absorção no
UV, é miscível com vários solventes orgânicos e possui custo
relativamente menor
comparado a outros compostos (ALEXANDER, HOOKET, TOMASELLA,
2012). A
polaridade do CO2 é muito baixa, próxima ao do n-hexano, sendo
utilizado puro
apenas nas separações de compostos apolares.
O aprimoramento dos equipamentos com o desenvolvimento de
bombas
binárias possibilitou o uso de outros solventes na FM em
porcentagens típicas de 1 a
40 %, com capacidade para alterar a densidade e a polaridade da
FM, aumentando a
seletividade e solubilidade de compostos polares, diminuindo a
precipitação dos
mesmos na coluna (LESSELIER, WEST, 2015). Essas alterações na FM
melhoram o
formato dos picos reduzindo interações indesejáveis que ocorrem
entre os analitos e
os grupos silanóis residuais da FE. Os silanóis residuais são
receptores de hidrogênio
e normalmente interagem mais com os analitos do que com a FM.
Porém, quando há
modificador doador de hidrogênio, como o metanol, etanol ou
2-propanol, a interação
deixa de ser com o analito e passa a ser com a FM, melhorando a
simetria do pico. A
escolha do modificador é fundamental, pois características como
constante dielétrica,
capacidade de ligações de hidrogênio, transferência de massa e
viscosidade do
solvente são modificadas, influenciando na seletividade, ordem
de eluição dos
compostos e resolução dos picos. A acetonitrila quando usada
como constituinte da
FM promove aumento na retenção e gera picos assimétricos devido
à pouca interação
com os silanóis, por não ser doadora de hidrogênio. Seu uso é
raro, porém em
algumas situações para melhorar a seletividade, pode ser
associada a um álcool
(NOVÁKOVÁ et al, 2014; BRUNELLI et al, 2008).
Em alguns casos, o modificador é insuficiente para promover
picos
adequados, sendo necessário o uso de um aditivo. Aditivos são
compostos ácidos,
básicos ou iônicos, escolhidos de acordo com o analito a ser
analisado, que em
-
37
pequenas concentrações (tipicamente 1 %), podem melhorar a
retenção, separação
e simetria por mecanismos sugeridos como alteração da polaridade
da FE através da
ação sobre os sítios ativos, mudança na polaridade da FM
aumentando seu poder de
solvatação e alteração no nível de ionização dos compostos
levando à formação de
pares iônicos com os analitos. Para compostos ácidos normalmente
se utiliza ácido
fórmico ou ácido cítrico e para os básicos, o emprego de
dietilamina e trietilamina é
usual. Sais como acetato e formato de amônio são usados para
compostos básicos e
possuem a vantagem de serem compatíveis com a espectrometria de
massas (Mass
Spectrometry, MS). A água quando adicionada a um modificador
orgânico aumenta a
capacidade de ligações de hidrogênio, melhorando o poder de
solvatação, sendo
também compatível com a MS (NOVÁKOVÁ et al, 2014).
Alguns trabalhos evidenciam como o uso de modificador e
aditivos
impactam no perfil cromatográfico. Em 2010, Ashraf-Khorassani e
Taylor compararam
a separação de 4 nucleotídeos em uma coluna de piridina usando
etanol como
modificador e os aditivos: água (5 %) e acetato de amônio (5 mM
e 25 mM) isolados
e associados e demonstrou como os mesmos influenciam no tempo de
retenção e o
formato dos picos. Os quatro compostos foram separados em todas
as condições
testadas, com o melhor formato dos picos na condição etanol + 5
% água + 5mM
acetato de amônio (ASHRAF-KHORASSANI, TAYLOR, 2010). Em 2012,
Perrenoud e
colaboradores realizaram um estudo com 92 compostos
farmacêuticos de caráter
básico envolvendo diferentes FE e FM com e sem aditivo.
Concluíram que o uso de
metanol e aditivos básicos como hidróxido de amônio foram
necessários para eluição
dos compostos melhorando o perfil cromatográfico (PERRENOUD et
al, 2012a).
Apesar dos benefícios, o uso de aditivos deve ser criterioso,
pois alguns
podem eluir no decorrer da análise influenciando no ruído da
linha de base (BERGER,
DEYE, 1991) ou interagir fortemente com a FE necessitando de
processos de limpeza
mais demorados para sua remoção.
Fases estacionárias
A vasta faixa de polaridade dos solventes da FM permite o
emprego de
fases estacionárias de distintas seletividades, desde as mais
polares como as de
sílica, até as menos polares, como as de octadecil (C18). A
escolha adequada da FE
é essencial, pois está relacionada aos diversos tipos de
interações com o analito,
assim como a retenção dos mesmos ao longo da corrida
cromatográfica. Para garantir
-
38
maior ortogonalidade são necessários alguns tipos de FE com
diferentes seletividades
para através de um screening verificar quais as mais indicadas
(LESSELIER, WEST,
2015).
Para elucidar a classificação das propriedades químicas das FE
há um
diagrama “tipo aranha” (Spider diagram) criado a partir do
modelo de parâmetro de
solvatação ou relação de energia linear de solvatação, que
descreve as interações
soluto-solvente em termos dos parâmetros de acidez (A),
basicidade (B), polaridade
(S), refração molar em excesso (E), volume de McGowan (V) e
coeficiente de partição
gás-hexadecano (L). O diagrama apresentado na Figura 2 relaciona
o tipo de
interação existente entre o analito e a FE e são representados
pelos coeficientes e
(transferência de carga), s (dipolo-dipolo), a (ligação aceptora
de hidrogênio), v
(dispersão) e b (ligação doadora de hidrogênio) (CARRILHO,
TAVARES, LANÇAS,
2001; LESSELIER E WEST, 2015).
As colunas para SFC e UHPSFC possuem tamanho reduzido de
partícula (≤ 2 µm), possibilitam altas velocidades lineares da
FM, melhoram o tempo
de análise, a resolução e a simetria dos picos.
-
39
Figura 2: Spider diagram - Natureza das colunas cromatográficas
empregadas na UHPSFC
(adaptado Lesselier e West, 2015).
Instrumentação para UHPSFC
Um sistema de UHPSFC é constituído normalmente por
reservatório,
sistemas de bombeamento e pressurização, regulador automático de
contra pressão
(Automated Backpressure regulator - ABPR), sistema de injeção de
amostra, sistema
de convergência, detector e registrador de dados (CARRILHO,
TAVARES, LANÇAS,
2003; BERGER, 2015). Os componentes bomba, injetor, sistema de
convergência e
detector devem ser destacados. Devido ao emprego de pressões
elevadas é
necessário um maior controle no bombeamento e pressurização.
Esses sistemas
devem ser resistentes à alta pressão, responder rapidamente a
alteração da pressão
e manter o bombeamento da FM constante. O sistema de bombeamento
é binário,
uma bomba para o solvente orgânico e outra para o CO2 que possui
um resfriador
responsável por mantê-lo no estado líquido. O sistema de
convergência ¨converge¨ o
CO2 gasoso e o solvente orgânico líquido em uma só fase, a qual
percorre o sistema.
Os reguladores automáticos de contra pressão são responsáveis
por controlar a
pressão em todo o sistema cromatográfico e estão localizados
após a cela de
detecção, garantindo que a FM não chegue ruidosa (BERGER,
2015).
O equipamento de UHPSFC utilizado nesse trabalho foi fabricado
pela
-
40
empresa Waters Corporation, patenteado em 2012 como UPC2 (Ultra
Performance
Convergence Chromatography) e está representado na Figura 3. O
termo
cromatografia de convergência indica a tendência em unificar a
cromatografia gasosa
com a cromatografia liquida. O UPC2 foi lançando no mercado
junto com FE de
partículas sub 2µm, eficiente sistema de resfriamento da cabeça
das bombas de CO2
e um novo design de ABPR. Este equipamento apresenta vazão
máxima de 4 mL
min-1 quando se usa apenas CO2 na fase móvel, pressão máxima de
6000 psi, forno
para colunas de 150 mm e quatro canais disponíveis para FM. O
ABPR de dupla fase
consiste em uma fase estática que fornece uma contra pressão
fixa, e uma dinâmica,
responsável pela pressão adicional, sendo a pressão total
formada pela soma das
duas. Esse mecanismo confere maior estabilidade da pressão
quando trabalhado no
modo gradiente. Possui detector DAD que inclui uma célula de UV
de alta pressão,
mas também permite o acoplamento dos detectores ELSD e MS
(NOVÁKOVÁ et al,
2014; WATERS).
Figura 3: Equipamento UPC2 da empresa Waters
Aplicações da técnica
Na literatura se encontram diversos trabalhos empregando o uso
da técnica
de UHPSFC demonstrando a aplicabilidade da mesma (PERRENOUD et
al, 2012b; LI
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41
et al, 2013; TAGUCHI, FUKUSAKI, BAMBA, 2013; SAMIMI et al, 2014;
NOVÁKOVÁ,
CHOCHOLOUS, SOLICH, 2014; DIPAS et al, 2014; LI et al, 2015;
CAMACHO,
KASPRZYK-HORDERN, THOMAS, 2016). Perrenoud e colaboradores
avaliaram 57
compostos hidrofílicos em três técnicas diferentes, LC-RP, HILIC
(Hydrophilic
Interaction Liquid Chromatography), UHPSFC, e compararam os
resultados. O estudo
demonstrou que as técnicas são complementares e que a UHPSFC
apresenta grande
potencial para análise desse tipo de composto apresentando boa
seletividade e
retenção (PERRENOUD et al, 2012b). Li e colaboradores aplicaram
a técnica de
UHPSFC acoplada a um ELDS com emprego de coluna de tamanho de
partícula
reduzido na separação e quantificação de vários triterpenos
presentes em uma
complexa matriz vegetal de Rosa sericea (LI et al, 2013).
Taguchi e colaboradores
empregando UHPSFC-MS/MS separaram e quantificaram 25 ácidos
biliares em ratos
demonstrando que a técnica é satisfatória para separação de
compostos polares e
apolares (TAGUCHI, FUKUSAKI, BAMBA, 2013).
Em 2014 Samimi e colaboradores avaliaram através da UHPSFC
acoplada
ao ELSD a separação de 6 compostos presentes no extrato de
Ginseng empregando
os aditivos ácido trifluoracético