UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA DESENVOLVIMENTO DE UM ENSAIO DE PCR- MULTIPLEX PARA IDENTIFICAÇÃO DE ISOLADOS DE CORYNEBACTERIUM PSEUDOTUBERCULOSIS E RÁPIDA DETECÇÃO DESSA BACTÉRIA EM AMOSTRAS CLÍNICAS LUIS GUSTAVO CARVALHO PACHECO DISSERTAÇÃO DE MESTRADO Belo Horizonte – MG 2006
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DESENVOLVIMENTO DE UM ENSAIO DE PCR- MULTIPLEX PARA ...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA
DESENVOLVIMENTO DE UM ENSAIO DE PCR-
MULTIPLEX PARA IDENTIFICAÇÃO DE ISOLADOS
DE CORYNEBACTERIUM PSEUDOTUBERCULOSIS
E RÁPIDA DETECÇÃO DESSA BACTÉRIA EM
AMOSTRAS CLÍNICAS
LUIS GUSTAVO CARVALHO PACHECO
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Belo Horizonte – MG
2006
LUIS GUSTAVO CARVALHO PACHECO
DESENVOLVIMENTO DE UM ENSAIO DE PCR-
MULTIPLEX PARA IDENTIFICAÇÃO DE ISOLADOS
DE CORYNEBACTERIUM PSEUDOTUBERCULOSIS
E RÁPIDA DETECÇÃO DESSA BACTÉRIA EM
AMOSTRAS CLÍNICAS
Orientação: Dr. Vasco Azevedo
Co-orientação: Dr. Anderson Miyoshi
Universidade Federal de Minas Gerais
Instituto de Ciências Biológicas
Belo Horizonte, 2006
Dissertação apresentada como requisito parcial
para obtenção do grau de Mestre pelo programa
de Pós-Graduação em Genética, Departamento de
Biologia Geral, Instituto de Ciências Biológicas,
Universidade Federal de Minas Gerais.
Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Genética Celular e Molecular e
realizado com apoio financeiro das seguintes instituições:
� Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG)
� Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
� Financiadora de Estudos e Projetos – MCT (FINEP)
A organização desta dissertação foi baseada em: FRANÇA, J.L.; BORGES,
S.M.; VASCONCELLOS, A.C.; MAGALHÃES, M.H.A. Manual para normalização
A. pyogenes A93 00085 Hospital Universitário Ghent,
Bélgica.*
A. pyogenes HJ26 BA224.11 Hospital Universitário Ghent,
Bélgica.*
A. pyogenes-like HJ51 B Hospital Universitário Ghent,
Bélgica.*
A. pyogenes-like HJ51 Da Hospital Universitário Ghent,
Bélgica.*
Corynebacterium amycolatum HJ08
I4218 LV
Hospital Universitário Ghent,
Bélgica.*
C. bovis DL BOV23 Hospital Universitário Ghent,
Bélgica.*
C. bovis DL BOV25 Hospital Universitário Ghent,
Bélgica.*
C. pseudotuberculosis biovar equi
CIP 5297
Coleção Instituto Pasteur, França.*
C. pseudotuberculosis biovar ovis
(VD21; VD23; VD27; VD28; VD33; VD36;
VD37; VD38; VD41; VD42; VD43; VD44;
Bactérias isoladas a partir de
animais criados extensivamente e
identificadas como C.
VD45; VD46; VD48; VD50; VD52; VD53;
VD54; VD55; VD56; VD57; VD58; VD59;
VD60; VD61; VD62; VD63; VD99; 01; 05;
08; 09; 11; 12; 21; 217)
pseudotuberculosis biovar ovis
através de testes bioquímicos por
técnicos da UFBA.
C. pseudotuberculosis biovar ovis
T1
Instituto de Ciências da Saúde,
UFBA, Brasil.
C. pseudotuberculosis biovar ovis
1002
Instituto de Ciências da Saúde,
UFBA, Brasil.
C. pseudotuberculosis biovar ovis
ULCC06.334
Hospital Universitário Ghent,
Bélgica.*
C. pseudotuberculosis biovar ovis
CIP 102968T
Coleção Instituto Pasteur, França.*
C. renale CIP 6937 Coleção Instituto Pasteur, França.*
C. renale CIP 103421T Coleção Instituto Pasteur, França.*
C. ulcerans ULCA3.675,1 Hospital Universitário Ghent,
Bélgica.*
C. ulcerans HJ01 BM3796.3 Hospital Universitário Ghent,
Bélgica.*
C. ulcerans HJ02 MN 675.3 Hospital Universitário Ghent,
Bélgica.*
C. ulcerans ULCB12.735,2 Hospital Universitário Ghent,
Bélgica.*
* Bactérias gentilmente cedidas pelo Dr. Mario Vaneechoutte, Ghent University Hospital, Bélgica.
T Linhagem de referência.
3.3.2. AMOSTRAS CLÍNICAS
3.3.2.1. AMOSTRAS DE MATERIAL PURULENTO
Amostras de material purulento (n = 56) foram coletadas assepticamente de
abscessos presentes em linfonodos de ovelhas ou cabras naturalmente
portadoras de linfadenite caseosa (Carminati, 2005). As coletas foram realizadas
em duas regiões endêmicas para esta doença na região Nordeste do Brasil, por
técnicos da UFBA (Salvador – BA) e da EMBRAPA Caprinos (Sobral –CE). A
tabela 2 apresenta o detalhamento das amostras de pus utilizadas neste estudo.
3.3.2.2. AMOSTRAS DE SANGUE E SORO
Amostras de sangue e soro foram obtidas tanto de animais apresentando
sinais clínicos de linfadenite caseosa (n = 19) quanto de animais que não
apresentavam nenhum sinal da doença (n = 20) e pertenciam a rebanhos sem
histórico de infecção por C. pseudotuberculosis. Foi utilizado o sistema
Vacutainer de coleta de sangue (Becton Dickinson, Estados Unidos).
Tabela 2. Amostras de material purulento utilizadas neste estudo.
Animal* Espécie Raça Fonte Animal* Espécie Raça Fonte
100 Ovina ND UFBA 34/05 Ovina ND EMB.
SN Ovina ND UFBA 318 Caprina ND EMB.
15 Ovina ND UFBA 37/05 Ovina ND EMB.
52B Ovina ND UFBA 588 Caprina ND EMB.
108 Ovina ND UFBA 33/05 Ovina ND EMB.
154 Ovina ND UFBA 10 Caprina ND EMB.
1 (23/08) Caprina ND UFBA 351 Caprina ND EMB.
2 (23/08) Caprina ND UFBA 3673 Caprina ND EMB.
3 (23/08) Caprina ND UFBA 782 Caprina ND EMB.
4 (23/08) Caprina ND UFBA 87 Caprina Can. EMB.
5 (23/08) Caprina ND UFBA SN Caprina ND EMB.
6 (23/08) Caprina ND UFBA 94 Caprina ND EMB.
7 (23/08) Caprina ND UFBA 450 Caprina Mox. EMB.
8 (23/08) Caprina ND UFBA 197 Caprina ND EMB.
9 (23/08) Caprina ND UFBA 272 Caprina Ang. EMB.
10(23/08) Caprina ND UFBA SN Ovina ND EMB.
11(23/08) Caprina ND UFBA 371 Caprina Ang. EMB.
12(23/08) Caprina ND UFBA 3406 Caprina ND EMB.
13(23/08) Caprina ND UFBA 240 Caprina Mox. EMB.
14(23/08) Caprina ND UFBA 57 Ovina S.In. EMB.
2 (14/07) Caprina ND UFBA 01 Ovina ND EMB.
7 (14/07) Caprina ND UFBA 589 Caprina ND EMB.
382 Caprina ND EMB. 3647 Caprina ND EMB.
27/09 Caprina ND EMB. 3556 Caprina ND EMB.
412 Caprina ND EMB. 2641 Caprina ND EMB.
Lab47 Caprina ND EMB. 640 Caprina ND EMB.
35 Caprina ND EMB. 462BNB Caprina ND EMB.
0279 Caprina ND EMB. 3618 Caprina ND EMB.
EMB. = EMBRAPA Caprinos. ND = Não definida. Can. = Canindé. Mox. = Moxotó. Ang. = Anglo.
S.In. = Santa Inês.
*Número de identificação do animal na Universidade Federal da Bahia ou na EMBRAPA Caprinos.
3.4. MÉTODOS
3.4.1. ISOLAMENTO BACTERIANO E IDENTIFICAÇÃO BIOQUÍMICA
DOS ISOLADOS
Todas as amostras de pus coletadas foram submetidas a cultivo bacteriano,
como mencionado no item 3.3.1. Teste de Gram foi realizado com as colônias
obtidas que apresentaram morfologia semelhante a C. pseudotuberculosis
(colônias pequenas de coloração creme-alaranjada e opaca). Os isolados que
apresentaram coloração Gram-positiva foram submetidos a testes bioquímicos
para identificação bacteriana (testes de urease, catalase, e fermentação de
glicose) (Smibert & Krieg, 1994; Carminati, 2005). Os que apresentaram
resultados positivos nestes testes bioquímicos foram posteriormente submetidos
aos testes de hemólise sinérgica com Rhodococcus equi ATCC33701 e inibição
de beta-hemólise com Staphylococcus aureus ATCC25923 (Smibert & Krieg,
1994; Carminati, 2005). Confirmação da identificação foi realizada com a bateria
comercial de testes bioquímicos API Coryne (bioMérieux SA, França).
O isolamento e identificação de C. pseudotuberculosis foi utilizado como
padrão-ouro para avaliar a sensibilidade do teste estudado.
3.4.2. EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO BACTERIANO
3.4.2.1. EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO DE CULTURAS
BACTERIANAS
A extração de DNA genômico a partir de culturas foi realizada da mesma
forma para todas as linhagens bacterianas utilizadas neste estudo. Culturas de 20
ml foram centrifugadas a 5.000 rpm, por 10 min., a 4ºC. O sobrenadante foi
descartado e o precipitado ressuspendido em 1 ml de solução I (vide item 3.2.3).
Após vortexar, a mistura foi novamente centrifugada, desta vez a 13.000 rpm, por
10 min., a temperatura ambiente. O sobrenadante foi descartado, e foi adicionado
1 ml de solução II (vide item 3.2.3). Após ressuspender o precipitado, a amostra foi
incubada em banho-maria por 30 min. a 37ºC. Foram adicionados 30 µl de sarcosil
30%; a amostra foi homogeneizada por 15 min. e então deixada em banho-maria a
65ºC por 5 min., seguido por incubação a 4ºC por 5 min.
Para purificação do DNA extraído, foi utilizado um protocolo padrão de
fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (Sambrook e cols., 1989). Em resumo, 1 ml da
solução de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (vide item 3.2.3) foi adicionado à
amostra. Após vortexadas, as amostras foram centrifugadas a 13.000 rpm por 7
min. A fase superior da amostra foi retirada e transferida para um novo microtubo
de 2 ml. Repetiu-se o passo de purificação com fenol:clorofórmio:álcool isoamílico.
Ao final, a fase superior da amostra foi transferida para um novo microtubo, a fim
de proceder-se à precipitação do DNA genômico. Etanol absoluto foi adicionado
numa quantidade equivalente a duas vezes o volume da amostra. Acrescentou-se
solução de NaAC (3M) numa quantidade equivalente a 10% do volume da
amostra, e solução de glicogênio equivalente a 1% do volume total. O DNA foi
precipitado O.N. a -20ºC. Após centrifugação a 13.000 rpm por 10 min., o
precipitado foi lavado com etanol a 70% e o DNA ressuspendido em água mili-Q
estéril.
3.4.2.2. EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO BACTERIANO A PARTIR DE
AMOSTRAS CLÍNICAS DE LINFADENITE CASEOSA
3.4.2.2.1. EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO BACTERIANO A PARTIR DE
AMOSTRAS DE PUS E SANGUE COM OS PROTOCOLOS CTAB-SDS E PK-ROCHE
Dois protocolos previamente descritos para extração de DNA de
Mycobacterium tuberculosis a partir de amostras clínicas de pacientes portadores
de tuberculose (Honoré-Bouakline e cols., 2003) foram utilizados para extração de
DNA de C. pseudotuberculosis a partir das amostras clínicas de linfadenite
caseosa. Aproximadamente 100 mg de pus ou o precipitado de 2 ml de uma
amostra de sangue foram ressuspendidos em 1 ml de solução II (vide item 3.2.3),
em um microtubo de 2 ml. As amostras foram incubadas em banho-maria a 37ºC
por 1 hora. 20 µl de proteinase K (20 mg/ml) foram adicionados a cada uma das
amostras, que foram incubadas em banho-maria a 56ºC por 2-3 horas. Após o
tempo de incubação, as amostras foram separadas em duas alíquotas de 500 µl.
À primeira alíquota, foram adicionados 35 µl de SDS a 10%; a amostra foi
vortexada e incubada em banho-maria a 65ºC, por 10 minutos. Foram adicionados
90 µl de CTAB-NaCl, e novamente a amostra foi incubada a 65ºC por 10 minutos.
A segunda alíquota de 500 µl foi centrifugada por 5 minutos a 13.000 rpm;
parte do sobrenadante foi retirada com uma pipeta, de forma a restarem 100 µl de
solução no final. A amostra foi então incubada por 15 minutos a 95ºC para
inativação da proteinase K.
O DNA presente em ambas alíquotas foi purificado e precipitado como
descrito no item 3.4.2.1.
3.4.2.2.2. EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO BACTERIANO A PARTIR DE
AMOSTRAS DE PUS E SANGUE COM O PROTOCOLO PK-SARCOSIL
Aproximadamente 100 mg de pus ou o precipitado de 2 ml de uma amostra
de sangue foram ressuspendidos em 1 ml de solução II (vide item 3.2.3), em um
microtubo de 2ml. As amostras foram incubadas em banho-maria a 37ºC por 1
hora. 20 µl de proteinase K (20 mg/ml) foram adicionados a cada uma das
amostras, que foram incubadas em banho-maria a 56ºC por 2-3 horas. Após o
tempo de incubação, as amostras foram separadas em duas alíquotas de 500 µl.
A cada alíquota foram acrescentados 25 µl de sarcosil 30%. As amostras foram
homogeneizadas por 15 min. e incubadas em banho-maria a 65ºC por 5 min. Após
incubação a 4ºC por 5 min., prosseguiu-se a purificação e precipitação do DNA,
como mencionado no item 3.4.2.1.
3.4.2.2.3. EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO BACTERIANO A PARTIR DE
AMOSTRAS DE PUS E SANGUE COM O KIT WIZARD® GENOMIC DNA
PURIFICATION (PROMEGA)
Aproximadamente 100 mg de pus ou o precipitado de 2 ml de uma amostra
de sangue foram ressuspendidos em 600 µl de solução II (vide item 3.2.3), em um
microtubo de 2ml. As amostras foram incubadas em banho-maria a 37ºC por 1
hora. Após centrifugação a 13.000 rpm por 2 min., o sobrenadante foi descartado
e foram acrescentados 600 µl de “Nuclei Lysis Solution”; a mistura foi
homogeneizada gentilmente com o auxílio de uma pipeta. Incubou-se em banho-
maria a 80ºC por 5 min.; as amostras foram deixadas para esfriar a temperatura
ambiente. Então, adicionou-se 3 µl de “RNase solution”; após homogeneizar,
novamente as amostras foram incubadas, desta vez a 37ºC por 30 min. Adicionou-
se 200 µl de “Protein Precipitation Solution” e seguiu-se incubação no gelo por 5
min. As misturas foram centrifugadas a 13.000 rpm por 3 min. e o sobrenadante
contendo DNA foi transferido para um novo tubo. A precipitação do DNA foi
realizada como mencionado no item 3.4.2.1.
3.4.2.2.4. EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO BACTERIANO A PARTIR DE
AMOSTRAS DE SORO COM O KIT CHARGESWITCH gDNA 1 ML SERUM
(INVITROGEN)
A extração de DNA a partir das amostras de soro foi feita de acordo com as
recomendações do fabricante do “ChargeSwitch® gDNA 1 ml Serum Kit”.
Brevemente, a 1 ml de soro foram adicionados 700 µl do tampão de lise (L19), 30
µl de proteinase K e 5 µl de RNase A. A mistura foi misturada gentilmente e
incubada à temperatura ambiente por 20 min. Então, foram adicionados 250 µl do
tampão de purificação (N7) e 30 µl da solução contendo esferas magnéticas. Após
homogeneizar, as amostras foram incubadas à temperatura ambiente por 2 min.;
posteriormente, os microtubos foram colocados na raque magnética por 3 min.
Assim que se formou o precipitado de esferas magnéticas no fundo dos tubos, os
sobrenadantes foram retirados com o auxílio de pipeta e descartados. Os tubos
foram retirados da raque magnética, e o precipitado foi ressuspendido em 1 ml de
tampão de lavagem (W12). Após voltar os tubos para a raque, os sobrenadantes
foram novamente retirados e repetiu-se a lavagem dos precipitados. A fim de eluir
o DNA ligado às esferas magnéticas, 50 µl de tampão de eluição (E5) foram
adicionados a cada amostra; incubou-se por 2 min. à temperatura ambiente e os
tubos foram recolocados na raque magnética até que todas as esferas
precipitassem. O sobrenadante contendo o DNA purificado foi transferido para um
novo microtubo.
3.4.3. DOSAGEM DO DNA GENÔMICO EXTRAÍDO
A dosagem do DNA genômico extraído foi feita com o auxílio de um
espectrofotômetro, como descrito (Brigido, 2003). Basicamente, a medida de
absorbância num comprimento de onda de 260 nm foi multiplicada pelo fator de
conversão para DNA fita dupla (50) e pela diluição da amostra, para obter a
concentração em µg/ml.
3.4.4. ENSAIO DE PCR-MULTIPLEX
A tabela 3 lista os iniciadores utilizados neste estudo. A padronização do
ensaio de PCR-multiplex seguiu basicamente os passos descritos por Henegariu e
cols. (1997), sumarizados na figura 1.
As reações foram feitas para um volume final de 10 µl. A tabela 4 lista as
concentrações de reagentes utilizadas com cada uma das três polimerases
testadas.
Os iniciadores 12S-F e 12S-R (12S rDNA de caprinos e ovinos) são
incluídos nas reações com DNA extraído diretamente de amostras clínicas. O
produto de 274 pb funciona como um controle interno de amplificação não
competitivo (Hoorfar e cols., 2004), o qual permite diferenciar amostras que inibem
a reação de PCR das que são verdadeiramente negativas.
Tabela 3. Iniciadores utilizados neste estudo.
Iniciador Seqüência Gene-alvo [ ] uso Fonte
16S-F 5’-ACCGCACTTTAGTGTGTGTG-3’ 16S rDNA 2 µM
16S-R 5’-TCTCTACGCCGATCTTGTAT-3’ 16S rDNA 2 µM
Çetinkaya e cols., 2002
C2700F 5’-CGTATGAACATCGGCCAGGT-3’ rpoB 2 µM
C3130R 5’-TCCATTTCGCCGAAGCGCTG-3’ rpoB 2 µM
Khamis e cols., 2004
MPLD1 5’-ATAAGCGTAAGCAGGGAGCA-3’ pld 2 µM
MPLD2.1 5’-ATCAGCGGTGATTGTCTTCCAGG-3’ pld 2 µM
Este trabalho.a
12S-F 5’-CCAGCCACCGCGGTCATACG-3’ 12S rDNA 0,2 µM
12S-R 5’-TGAGTTTCGGGCTGTTGCCG-3’ 12S rDNA 0,2 µM
Este trabalho.b
a Iniciadores desenhados de acordo com a seqüência do gene da phospholipase D de C.
pseudotuberculosis (acesso GenBank: L16585). b Iniciadores desenhados de acordo com as seqüências do 12S rDNA de Capra hircus e Ovis aries
(acessos GenBanK: AJ490504 e AJ490503).
Figura 1. Protocolo passo-a-passo para o desenvolvimento e otimização de
PCR-multiplex. TRADUZIDO e ADAPTADO: Henegariu e cols., 1997.
Passo 1. Escolha das seqüências dos iniciadores • GC = 30-60% • 20 pb ou maior • Produtos de amplificação separáveis em gel de agarose
Passo 2. Teste/ alinhe os iniciadores • uns com os outros • BLAST para seqüências repetitivas
Passo 3. PCR singleplex: programa inicial � Amplifique todos os loci individualmente; mesmas condições � Use tampão a 1X, sem adjuvantes � Ajuste somente as condições dos ciclos
Passo 4. PCR Multiplex: mistura equimolar de iniciadores � 0,1 a 0,4 µM de cada iniciador � Use o programa de PCR do passo 3
A. Todos os produtos estão fracos a) Use tempos de extensão maiores b) Diminua tº de extensão para 62-68ºC c) Diminua tº de anelamento em pequenos passos (2ºC) d) Ajuste a conc. de Taq polimerase
B. Produtos pequenos estão fracos a) Aumente a conc. de tampão para 1,4-2X b) Diminua tº de anelamento e ou extensão c) Aumente a conc. de iniciadores para os loci fracos
C. Produtos grandes estão fracos a) Aumente o tempo de extensão b) Aumente tº de anelamento e ou extensão c) Aumente a conc. de iniciadores para os loci fracos d) Diminua a conc. de tampão para 0,7-0,8X mas mantenha MgCl2 constante a 1.5-2 mM
D. Produtos inespecíficos a) grandes: aumente conc. tampão para 1,4-2X b) pequenos: diminua conc. de tampão para 0,7-0,9X c) Aumente gradualmente a tº anelamento d) Diminua a quantidade de molde e enzima e) Aumente MgCl2 (máx. 12 mM)
Passo 5.
Quando necessário, diluições seriadas de duas vezes (1:2, 1:4, 1:8) foram
realizadas com as amostras clínicas, a fim de remover a inibição da PCR.
As reações foram preparadas em microtubos de 200 µl (PerkinElmer) e
realizadas em um termociclador (PTC-100, MJ Research Inc.), nas condições
descritas na tabela 4. Os produtos de amplificação foram visualizados em gel de
agarose a 1% corado com brometo de etídio.
Tabela 4. Reações de mPCR com diferentes polimerases.
Sistemas e Reagentes Concentração
Final
Condições dos
Ciclos
AccuPrime™ Taq DNA polymerase
Tampão 10X II 1X
Iniciadores 2 µM ou 0,2 µM a
Taq DNA polimerase 1,5 U
DNA molde 10-100ng b
H2O mili-Q q.s.p. 10 µl
P1: 95ºC por 3 min.
P2: 95ºC por 1 min.
P3: 58ºC por 40 seg
P4: 68ºC por 1 min.
e 30 seg.
P5: 40 X de P2 a P4
P6: 68ºC por 7 min.
Taq DNA Polymerase, Recombinant
Tampão 10X 1X
dNTPs 2 mM
MgCl2 3 mM
Iniciadores 2 µM ou 0,2 µM a
Taq DNA polimerase 1,5 U
DNA molde 10-100ng b
H2O mili-Q q.s.p. 10 µl
P1: 95ºC por 3 min.
P2: 95ºC por 1 min.
P3: 58ºC por 40 seg
P4: 72ºC por 1 min.
e 30 seg.
P5: 40 X de P2 a P4
P6: 72ºC por 7 min.
Eppendorf® MasterMix (2.5X)
MasterMix (2.5X) 1X
DNA molde 10-100ng b
H2O mili-Q q.s.p. 10 µl
As mesmas
descritas para
AccuPrime™ Taq
DNA polymerase.
a Veja tabela 3. P = Passo. b Somente em reações utilizando DNA extraído de culturas puras.
3.4.4.1. TESTE DE SENSIBILIDADE ANALÍTICA
Para testar a sensibilidade analítica do ensaio de mPCR, DNA genômico de
C. pseudotuberculosis CIP 102968T foi extraído (vide item 3.4.2.1) e dosado em
espectrofotômetro. A concentração do DNA foi acertada para 100 ng/µl e diluições
seriadas de dez vezes foram realizadas, como segue: 10 ng/µl; 1 ng/µl; 100 pg/µl;
10 pg/µl; 1 pg/µl; 100 fg/µl; e 10 fg/µl. Reações de PCR foram feitas em triplicata
com cada uma destas concentrações de DNA, para todas as polimerases
testadas. Os produtos de amplificação foram analisados em gel de agarose 1%.
Uma das séries de reações foi corrida em gel de poliacrilamida a 6% corado
pela prata, para avaliar se haveria diferença na sensibilidade de detecção de
produtos amplificados, comparado ao gel de agarose a 1%.
3.4.4.2. TESTE DE ESPECIFICIDADE
Para testar a especificidade do ensaio de mPCR foram feitas reações
contendo 10 ng de DNA genômico de cada uma das linhagens bacterianas
taxonomicamente próximas a C. pseudotuberculosis, listadas na tabela 1. O perfil
de amplificação de cada linhagem foi analisado em gel de agarose a 1%.
3.4.4.3. TESTE DE REPRODUTIBILIDADE
A reprodutibilidade do ensaio de mPCR foi testada com 40 isolados de C.
pseudotuberculosis, previamente identificados por testes bioquímicos (Tab. 1).
3.4.4.4. CONFIRMAÇÃO DOS PRODUTOS AMPLIFICADOS
Para confirmar a especificidade dos produtos amplificados pelo ensaio de
mPCR, cada um dos três genes foi amplificado separadamente para dez isolados
de C. pseudotuberculosis; os produtos de PCR foram purificados por um protocolo
de precipitação utilizando PEG 8000 (Kusukawa e cols., 1990), e posteriormente
seqüenciados. Basicamente, o produto da reação de PCR foi transferido para um
microtubo de 500 µl. Volume igual de solução de PEG 8000 (15%) foi adicionado e
a mistura foi incubada em banho-maria a 37ºC por 15 min. Após centrifugar a
13.000 rpm por 15 min., o sobrenadante foi cuidadosamente retirado com a pipeta
e descartado. 125 µl de etanol a 80% gelado foram adicionados e centrifugou-se
novamente a 13.000 rpm por 5 min. O sobrenadante foi retirado com a pipeta.
Realizou-se mais uma lavagem com etanol 80%, e o precipitado seco foi
ressuspendido em água mili-Q.
A reação de sequenciamento dos produtos de PCR purificados foi feita
utilizando o kit DYEnamic ET Dye Terminator (Amersham Biosciences), de acordo
com as recomendações do fabricante. As seqüências foram geradas no aparelho
MegaBACE 1000 (Amersham Biosciences).
3.4.4.5. LIMITE DE DETECÇÃO EM AMOSTRAS CLÍNICAS
Para determinar o limite de detecção do ensaio de mPCR em amostras
clínicas, amostras de sangue de caprinos não-portadores de linfadenite caseosa
foram misturadas com diluições de uma cultura de 48 horas de C.
pseudotuberculosis. Essas diluições foram previamente plaqueadas em meio BHI-
ágar para determinar a quantidade de unidades formadoras de colônia (UFC) de
C. pseudotuberculosis por ml. A mistura foi processada por todo o protocolo de
extração descrito no item 3.4.2.2.2. Reações de mPCR foram feitas com os DNAs
extraídos de todas as misturas. O teste de limite de detecção foi realizado em
triplicata e o resultado expresso como uma média dos três valores.
3.4.4.6. CÁLCULO DA SENSIBILIDADE DIAGNÓSTICA
Para calcular a sensibilidade diagnóstica do ensaio de mPCR, foi obtida a
proporção entre as amostras que renderam um resultado positivo no teste e
aquelas que renderam resultados positivos no teste de referência (isolamento e
identificação bacteriana) (McAdam, 2000).
3.4.5. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Uma análise foi realizada para avaliar se há diferença na sensibilidade do
ensaio de mPCR quando aplicado em amostras de ovinos ou caprinos. Para tal,
uma tabela 2 x 2 foi construída com os resultados obtidos e aplicou-se o teste qui-
quadrado (Ayres e cols., 2000). O pacote de análises estatísticas STATISTICA
(StatSoft, Inc.) foi utilizado para calcular intervalos de confiança.
3.4.6. DETERMINAÇÃO DA EQUIVALÊNCIA GENÔMICA DE C.
pseudotuberculosis
Para determinar a equivalência em fg do genoma de 1 UFC de C.
pseudotuberculosis extraiu-se o DNA genômico de uma cultura de 10 ml cuja
densidade de células foi determinada por plaqueamento. O DNA extraído foi
dosado em espectrofotômetro e a relação “Quantidade de DNA/ Nº de UFC” foi
calculada.
3.4.7. DIGESTÃO ENZIMÁTICA DOS PRODUTOS DA mPCR
Os produtos de mPCR de 4 linhagens de C. pseudotuberculosis e 4
linhagens de C. ulcerans foram utilizados, diretamente ou após precipitação, em
reações de digestão enzimática com as enzimas de restrição Cla I e Bgl I; as
reações foram feitas de acordo com as recomendações dos fabricantes. Este teste
foi realizado a fim de avaliar se seria possível identificar polimorfismos de
comprimento de fragmentos de restrição entre os isolados.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. ARTIGO
Multiplex PCR Assay for Identification of Corynebacterium
pseudotuberculosis from Pure Cultures and for Rapid Detection of this
Pathogen in Clinical Samples
Luis G. C. Pacheco, Roberta R. Pena, Thiago L. P. Castro, Fernanda A. Dorella,
Robson C. Bahia, Renato Carminati, Marcílio N. L. Frota, Sérgio C. Oliveira,
Roberto Meyer, Francisco S. F. Alves, Anderson Miyoshi, Vasco Azevedo.
Este manuscrito será submetido para publicação em forma de artigo num
periódico científico internacional de referência na área de diagnóstico molecular
microbiológico.
Multiplex PCR Assay for Identification of Corynebacterium pseudotuberculosis from
Pure Cultures and for Rapid Detection of this Pathogen in Clinical Samples
Running title: MULTIPLEX PCR FOR DETECTION OF C. PSEUDOTUBERCULOSIS
Luis G. C. Pacheco,1, 2 Roberta R. Pena,1 Thiago L. P. Castro,1 Fernanda A. Dorella,1
Robson C. Bahia,3 Renato Carminati,3 Marcílio N. L. Frota,4 Sérgio C. Oliveira,2 Roberto
Meyer,3 Francisco S. F. Alves,5 Anderson Miyoshi,1 and Vasco Azevedo1*
Departamento de Biologia Geral 1 and Departamento de Bioquímica e Imunologia
2,
Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte – MG, Brazil; Departamento de
Bio-Interação, Universidade Federal da Bahia, Salvador – BA, Brazil;3
Universidade
Estadual Vale do Acaraú, Sobral – CE, Brazil;4 and Centro Nacional de Pesquisa de
Caprinos, Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária, Sobral – CE, Brazil.5
* Corresponding author. Mailing address: Departamento de Biologia Geral, Instituto de
Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais, Av. Antônio Carlos, 6627,
4.2.5. EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO DE C. pseudotuberculosis A
PARTIR DE AMOSTRAS CLÍNICAS DE LINFADENITE CASEOSA
A detecção direta de C. pseudotuberculosis através da mPCR em amostras
clínicas de animais portadores de linfadenite caseosa representa uma
possibilidade extremamente atraente para o diagnóstico desta enfermidade, uma
vez que o método padrão de diagnóstico laboratorial (isolamento bacteriano e
identificação bioquímica de isolados) é extremamente trabalhoso e de alto custo.
Quatro protocolos diferentes foram testados para extrair DNA genômico de
C. pseudotuberculosis a partir de amostras de pus e sangue de animais
portadores de linfadenite caseosa (vide item 3.4.4.2). Foi possível extrair DNA das
amostras clínicas com três dos quatro protocolos testados, a exceção do protocolo
denominado de PK-Roche (Honoré-Bouakline e cols., 2003). No entanto, só foi
possível obter amplificação dos genes de C. pseudotuberculosis por mPCR
quando foram utilizados os DNAs extraídos com os protocolos CTAB-SDS e PK-
SARCOSIL. Em razão de ser mais prático esse último protocolo foi escolhido para
ser utilizado na continuidade dos trabalhos.
Os resultados da detecção direta de C. pseudotuberculosis em amostras
clínicas são apresentados no item 4.1.
4.2.6. LIMITE DE DETECÇÃO DA mPCR EM AMOSTRAS CLÍNICAS
Para calcular o limite de detecção da reação de mPCR em amostras
clínicas, foram realizadas misturas artificiais com sangue de caprinos, como
descrito no item 3.4.4.5. Não foi possível calcular o limite de detecção em
amostras de material purulento devido à dificuldade em se conseguir pus de
animais infectados com outro patógeno que não seja C. pseudotuberculosis. As
reações de mPCR foram realizadas com dois sistemas de amplificação diferentes:
(i) o sistema AccuPrime™ Taq DNA Polymerase, e (ii) o sistema Eppendorf®
MasterMix (2.5X) (Tab. 4). Esse último sistema possui acentuadores de PCR que,
teoricamente, são responsáveis por melhorar o rendimento da reação na presença
de inibidores tais como componentes do sangue. A Figura 7 mostra os resultados
obtidos com os dois sistemas utilizados.
Como pode ser observado na Figura 7A, foi possível detectar C.
pseudotuberculosis numa mistura artificial utilizando o sistema AccuPrime™ até
uma concentração média dessa bactéria equivalente a 4,5 X 103 UFC. Já com o
sistema Eppendorf® MasterMix, não foi possível detectar o produto amplificado
equivalente ao 16S rDNA de C. pseudotuberculosis nem na reação contendo 106
UFC dessa bactéria (Figura 7B). Porém, como já discutido no item 4.1., o limite de
detecção de 103 UFC pode estar subestimado, uma vez que C.
pseudotuberculosis tende a formar agregados em cultura, o que dificulta a
contagem de células viáveis (Jolly, 1965; Harrington e cols., 2005). Isso ajuda a
explicar a inabilidade do ensaio de mPCR para detectar esta bactéria em amostras
de sangue de animais naturalmente infectados (item 4.1). Provavelmente, C.
pseudotuberculosis é encontrada no sangue destes animais em concentrações
muito menores do que as observadas para o limite de detecção.
Figura 7. Limite de detecção da mPCR em amostras clínicas utilizando dois
sistemas de amplificação diferentes. PM: padrão de peso molecular 1 Kb Plus
DNA Ladder (Invitrogen). (A) Reações de mPCR com o sistema AccuPrime™,
utilizando DNAs extraídos das misturas artificiais de sangue de caprino com
concentrações de C. pseudotuberculosis variando de 106 até 101 UFC. (B)
Reações com o sistema Eppendorf® MasterMix, de misturas artificiais contendo C.
pseudotuberculosis variando de 106 até 103 UFC.
4.2.7. DETECÇÃO DE C. pseudotuberculosis EM AMOSTRAS DE SORO
A idéia de detectar C. pseudotuberculosis diretamente no soro de animais
infectados surgiu a partir da observação de trabalhos recentes mostrando que a
utilização dessa amostra clínica em PCR é mais viável que o uso de amostras de
sangue total (Bougnoux e cols., 1999; Elfaki e cols., 2005). Tal estratégia seria
Taq AccuPrimeTM
Eppendorf® MasterMix
A B
PM 106 105 104 103 102 101 PM 106 105 104 103
16S rDNA
rpoB 12S rDNA
pld
16S rDNA
rpoB 12S rDNA
pld
diretamente aplicável na detecção de animais com infecções sub-clínicas
aparentemente sadios ou em casos de linfadenite caseosa visceral.
DNA foi extraído de amostras de soro de animais com linfadenite caseosa
(n = 9) e de animais que não apresentavam sintomas clínicos da doença (n = 5)
(vide item 3.4.2.2.4). Esses últimos animais pertenciam a rebanhos sem relatos de
infecção por C. pseudotuberculosis. Todas as amostras foram testadas em
reações de PCR utilizando os três pares de iniciadores específicos de C.
pseudotuberculosis, separadamente.
Nenhuma amostra rendeu amplificação dos genes 16S rRNA e rpoB,
embora o controle de amplificação (12S rDNA) tenha sido detectado em todas as
reações (Figura 8). Apresentamos somente os dados com o gene 16S rRNA
(figura 8).
Por outro lado, o gene pld de C. pseudotuberculosis foi detectado em todas
as amostras utilizadas, inclusive nas provenientes de animais aparentemente não
infectados (Figura 9). Em reações multiplex os fragmentos menores podem ser
mais facilmente detectados devido à competição por reagentes ou em razão da
degradação do DNA molde (Edwards & Gibbs, 1995; Yang & Rothman, 2004).
Três hipóteses foram propostas para explicar a amplificação do gene pld
em amostras de animais aparentemente sadios: (i) ocorreu contaminação das
amostras negativas com produtos de amplificações anteriores; (ii) por ser
altamente sensível, a reação de PCR rendeu resultados falso-positivos; ou (iii) os
animais dos quais as amostras foram coletadas eram portadores de infecções
sub-clínicas.
Figura 8. Reações de PCR para amplificação do 16S rDNA de C.
pseudotuberculosis e do controle positivo de amplificação 12S rDNA, em 8
amostras de soro de animais portadores de linfadenite caseosa. PM: padrão
de peso molecular 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen). Canaletas ímpares:
amplificações utilizando os iniciadores para o gene 16S rRNA. Canaletas pares:
amplificações utilizando os iniciadores para o gene 12S rRNA.
Figura 9. Amplificação do gene pld a partir de amostras de soro. PM: padrão
de peso molecular 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen). Canaletas 1-5: reações
com amostras de soro de animais que não apresentavam sinais clínicos de
linfadenite caseosa. Canaletas 6 e 7: reações com soro de animais infectados.
500 pb
300 pb
PM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
12S rDNA (274 pb)
850 pb
PM 1 2 3 4 5 6 7
pld (203 pb)
Para testar a primeira hipótese, novas extrações de DNA foram feitas para
todas as amostras testadas, dessa vez em laboratórios diferentes. As reações de
PCR foram repetidas e novamente renderam resultados positivos. Controles
negativos de reação (sem adição de DNA molde), foram sistematicamente
realizados. Estas medidas em conjunto descartaram a possibilidade de
contaminação das reações.
Para testar as duas outras possibilidades, novas amostras estão sendo
coletadas de outros animais aparentemente saudáveis na EMBRAPA Caprinos.
Será feito um acompanhamento destes animais até o momento do abate, a fim de
detectar qualquer sinal clínico de linfadenite caseosa que possa corresponder com
um resultado positivo na reação de PCR.
4.2.8. PERFIL ELETROFORÉTICO DAS DIGESTÕES ENZIMÁTICAS
DOS PRODUTOS DA MPCR
Devido à alta similaridade genética entre C. pseudotuberculosis e C.
ulcerans (Riegel e cols., 1995; Çetinkaya e cols., 2002; Khamis e cols., 2004),
inicialmente foi avaliada a possibilidade de diferenciar estas duas bactérias
através de digestão dos produtos amplificados pela mPCR. Para tal, nestas
reações foi utilizado o iniciador MPLD2 (5’-ATCAGCGGTGATTGTCTTCC-3’) ao
invés de MPLD2.1 (Tab. 3). Este iniciador permite que o gene pld de C. ulcerans
também seja amplificado (Figura 10). As enzimas Cla I e Bgl I foram selecionadas
após análise de restrição in silico das seqüências parciais dos genes 16S rRNA,
rpoB e pld.
Figura 10. Digestão enzimática das reações de mPCR com DNAs de C.
ulcerans e C. pseudotuberculosis. PM: padrão de peso molecular GeneRuler
DNA Ladder Mix (Fermentas). (A) Digestões com a enzima Cla I. Canaletas 1-4:
linhagens de C. ulcerans. Canaletas 5-8: linhagens de C. pseudotuberculosis. (B)
Digestões com a enzima Bgl I. Canaletas 1-4: linhagens de C. ulcerans. Canaletas
5-8: linhagens de C. pseudotuberculosis. (Veja Tabela 1 para as linhagens).
Como pode ser visto na Figura 10, foi possível digerir os produtos
amplificados da mPCR sem que um passo de precipitação anterior fosse
realizado. Nenhuma das quatro linhagens de C. pseudotuberculosis rendeu
PM 1 2 3 4 5 6 7 8
1 2 3 4 5 6 7 8 PM
A
B
816 pb
203 pb
16S rDNA
rpoB
pld
16S rDNA
rpoB
pld
446 pb
275 pb 203 pb
816 pb
381 pb 446 pb
produtos de digestão com as enzimas testadas (Figura 10). O gene rpoB de todas
as linhagens de C. ulcerans avaliadas foi digerido pela enzima Cla I, gerando dois
produtos: 381 pb (Figura 10A) e 65 pb (não visível). Quando os produtos de
mPCR das mesmas linhagens foram digeridos com a enzima Bgl I, foram gerados
produtos digeridos novamente do gene rpoB, nos tamanhos de 275 pb e 171 pb
(Figura 10B). Uma das linhagens de C. ulcerans testada não foi digerida pela
enzima Bgl I, indicando a existência de polimorfismo do gene rpoB nessa espécie.
Em conjunto, estes resultados indicam que é possível detectar
polimorfismos de comprimento de fragmentos de restrição (RFLP) a partir da
digestão direta dos produtos da mPCR, e portanto esta estratégia pode ser
aplicada para avaliar variabilidade genética de isolados de C. ulcerans ou C.
pseudotuberculosis. No entanto, outras enzimas de restrição devem ser testadas
para essa última espécie. As figuras 11, 12 e 13 apresentam as enzimas de
restrição que podem ser utilizadas para avaliar possíveis polimorfismos das
regiões amplificadas pela mPCR nos genes 16S rRNA, rpoB e pld, entre isolados
de C. pseudotuberculosis. Uma coleção de isolados dessa bactéria, provenientes
de diferentes regiões do Brasil, já está sendo criada com este objetivo.
Fig. 11 (continua)
Figura 11. Mapa de restrição da região amplificada do gene 16S rRNA da C.
pseudotuberculosis. O software on-line Webcutter 2.0 (Disponível em:
http://rna.lundberg.gu.se/cutter2/) foi utilizado para gerar o mapa de restrição da
seqüência amplificada do gene 16S rRNA na linhagem CIP 102968T da C.
pseudotuberculosis biovar ovis.
Figura 12. Mapa de restrição da região amplificada do gene rpoB da C. pseudotuberculosis. O software on-line Webcutter 2.0 (Disponível em: http://rna.lundberg.gu.se/cutter2/) foi utilizado para gerar o mapa de restrição da seqüência amplificada do gene rpoB na linhagem CIP 102968T da C. pseudotuberculosis biovar ovis.
Figura 13. Mapa de restrição da região amplificada do gene pld da C.
pseudotuberculosis. O software on-line Webcutter 2.0 (Disponível em:
http://rna.lundberg.gu.se/cutter2/) foi utilizado para gerar o mapa de restrição da
seqüência amplificada do gene pld na linhagem CIP 102968T da C.
pseudotuberculosis biovar ovis.
5. CONSIDERAÇÕES FINAIS
5.1. CONCLUSÕES
Nas condições do presente estudo, é possível concluir que:
� Foi possível padronizar uma reação de PCR multiplex para amplificação
simultânea de três genes de C. pseudotuberculosis: 16S rDNA, rpoB e pld.
� O sistema de amplificação AccuPrime™ (Invitrogen) foi o mais eficiente
para utilização no formato multiplex.
� O ensaio de mPCR foi suficientemente específico para diferenciar C.
pseudotuberculosis de bactérias taxonomicamente próximas, incluindo C.
ulcerans.
� O ensaio é altamente sensível, permitindo a detecção de 10 pg de DNA
genômico de C. pseudotuberculosis por reação.
� Utilizando a reação de mPCR, foi possível confirmar a identificação de 40
isolados bacterianos.
� Foi padronizado um protocolo para extração de DNA de C.
pseudotuberculosis de amostras clínicas de animais portadores de
linfadenite caseosa.
� O ensaio de mPCR permitiu a detecção direta de C. pseudotuberculosis em
56 amostras de pus de caprinos e ovinos infectados, com alta sensibilidade
diagnóstica. Não foi possível detectar esta bactéria em amostras de
sangue.
� Através da amplificação individual do gene pld de C. pseudotuberculosis, é
possível detectar essa bactéria em amostras de soro de animais infectados.
5.2. PERSPECTIVAS
O presente trabalho abre perspectivas para:
� Empregar o ensaio de mPCR desenvolvido como ferramenta auxiliar em
estudos de prevalência de linfadenite caseosa em diferentes regiões do
Brasil.
� Avaliar a viabilidade do ensaio de mPCR na prática laboratorial, como
ferramenta para o diagnóstico da linfadenite caseosa.
� Montar uma coleção de isolados de C. pseudotuberculosis de diferentes
regiões do Brasil, para estudos posteriores de variabilidade genética.
� Montar um banco de soros de animais portadores de linfadenite
caseosa.
� Padronizar uma reação de PCR quantitativa em tempo real para
detecção do gene pld de C. pseudotuberculosis diretamente em
amostras de soro de animais infectados.
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ALVES, F.S.F. & PINHEIRO, R.R. Linfadenite caseosa – Recomendações e
medidas profiláticas. Sociedade Nacional de Agricultura, ano 100, Artigo Técnico