-
Desenvolvimento de uma
ELISA sensvel para a deteo
de agentes clarificantes
contendo casena
em vinhos tintos e brancos
Mafalda Queiroz
Mestrado em Controlo da Qualidade - Controlo Bioqumico
Ano letivo: 2014/2015
Trabalho baseado no artigo: Deckwart M., et all, Development of
a Sensitive ELISA for the Detection of
Casein- containing Fining Agents in Red and White Wines, J.
Agric Food Chem., 2014, 62, 6803-6812
-
Objetivos
O objetivo do artigo foi desenvolver mtodos ELISA sensveis para
a deteo de casenas em vinhos brancos e tintos.
E investigar o risco de resduos de alergnios em vinhos
filtrados.
-
Introduo
As reaes alrgicas a leite de vaca ocorrem
contra a frao de casena denominada Bos d8, j
para as principais protenas de soro de leite
so a -lactoalbumina (Bos d4) e a
-lactoglobulina (Bos d5).
A alergia ao leite de vaca (CMA), e ao ovo de galinha,
so as mais comuns em crianas (1 a 7,5%) Por outro lado a CMA
em
adultos rara (0,1 a 0,5% ), mas pode ser fatal. A maioria das
crianas
superam a CMA aos 3 anos de idade tornando-se CMA
tolerante.
So aplicados na clarificao, para eliminar efeitos
indesejveis sobre as caractersticas
organolticas do vinho. atravs de uma ligao
no covalente aos compostos fenlicos.
Desde 02 de julho de 2012, a OIV, determinou que a
aplicao de agentes clarificantes tais como a
casena e os produtos derivados do leite durante o processamento
de vinho tem de ser marcado, se o
produto final contiver mais de 0,25 mg/L de protena e/ou outros
alergnios.
O mtodo recomendado pela OIV para a deteo de resduos
potencialmente alergnicos de agentes
clarificantes no vinho a ELISA com um limite de
deteo (LOD) 0.25 mg / L e um limite de
quantificao (LOQ) 0.5 mg / L.
-
As casenas so fosfoprotenas maioritariamente encontradas no
leite.
Possuem um nmero varivel de radicais fosfato ligados serina
(P-Ser).
As e as casenas possuem uma estrutura flexvel devido ao seu
elevado teor em prolina.
So suscetveis protelise.
A casena a mais hidroflica por s apresentar um radical
fosfato.
Podem ser separadas em 4 grandes grupos: , , e .
O ponto isoeltrico da casena 4.6.
Casenas
-
Clarificao A clarificao o processo que
elimina todas as impurezas em suspenso do vinho e o torna
lmpido. Existem duas tcnicas de clarificao: a colagem e a
filtrao.
Na colagem adiciona-se ao vinho um produto clarificante:
gelatina, bentonite (argila), entre outros. O produto coagula e
forma partculas que sedimentam. Estas partculas atraem e arrastam
as impurezas.
Na filtrao o vinho passa por um filtro e as partculas e
impurezas em suspenso ficam retidas no filtro.
Convm apenas referir que h um mtodo de clarificao natural
denominado btonnage. Este consiste na remoo peridica de leveduras
que se depositam no fundo do recipiente onde ocorre a fermentao,
por isso pode demorar vrios meses.
Produo
do Vinho
-
Padres e
Amostras
Padro de identificao da Casena Merck Matriz de Calibrao KalCasin
Amostras de produtos comerciais de agentes clarificantes para
estudo (12): Agrovin Begerow Enartis Erbsloh Laffort Spindal
Vason
-
Anticorpos Policlonais anti-caseinato de potssio
Anticorpos anti-coelho de cabra conjugado com HRP
ELISA Sandwich Indireta
Anticorpo policlonal anti-casena Bovina e Ovina
Anticorpos Antiovelhas conjugada com HRP.
Anticorpos
ELISA
-
Anticorpos Immunoblotting
Anticorpos anti-coelho de cabra conjugado com HRP
-
Amostras
de Vinho
Tratamento
( WW2) Vinho Branco Mueller Thurgau (vindima 2009)
( RW2) Vinho Tinto Regent (vindima 2009)
Mostos inoculados com
Saccharomyces cereviseae
fermentados a 16-18 C
Sem clarificao
Filtrao pr envasilhamento com filtro de 0.45 m
Filtrao estril
Clarificao com dose mxima permitida de Bentonite (40g
KalCasin/hL)
Clarificao com dobro da dose mxima permitida de Bentonite
(80g KalCasin/hL)
Filtrao estril pr envasilhamento
A bentonite, uma argila natural (silicato de alumnio hidratado),
largamente utilizada na indstria enolgica, que quando transformado
num gel vai possuir cargas negativas superfcie fazendo com que seja
capaz de reagir com as protenas do vinho (carregadas positivamente
ao ph do vinho.
-
Mtodos Padro de Casenas e Agentes clarificadores
solues de 10-13 mg / 50 mL com 10 mM de soluo de carbonato sob
agitao num agitador horizontal por pelo menos de 30 min.
Eletroforese
As condies de desnaturao foram a 200 V
Com cido propanosulfnico como tampo de corrida
O gel de eletroforese NuPAGE Bis-Tris 12%
As solues de protena foram diludas 1: 2 com a amostra de LDS
tampo, que continha ditiotreitol (DDT) por reduo. Cada pista estava
carregado com 20 mL de soluo de amostra.
As Protenas
Fixao da Protenas com etanol a 30% e cido actico a 10% em gua
durante 30 min
Incubao com uma soluo contendo 0,1% tiossulfato de sdio, 30% de
etanol, e 6,8% de acetato de sdio em gua ocorreu durante 30 min.
Isto foi seguido por um passo de lavagem com gua.
soluo de nitrato de prata (0,2% de prata nitrato e de formaldedo
em gua a 0,02%) durante 20 min.
Desenvolvimento da cor carbonato de sdio a 2,5% e 0,01% de
formaldedo em gua
Paragem da reao EDTA a 1,8% em gua
Colorao
Eletroforese em
gel de
poliacrilamida
utilizando o
tampo de
Dodessilsulfato
de ltio
-
Mtodos Immunoblotting LDS-PAGE
Transferncia foi para uma membrana de nitrocelulose Atravs de um
Western Blot Semi-seco.
Membrana Seca Foi bloqueada com uma soluo de: 0,5% de
monolaurato de polietileno-sorbitano , cloreto de sdio a 0,9%, e
0,6% de tris (hidroximetil) - aminometano (Tris). Para inibir a
ligao no especfica.
Incubao da Membrana Anticorpos primrios : anti- caseinato de
potssio (1/10000) Anticorpos secundrios: Anti-coelho marcados com
HRP (1/20000) temperatura ambiente.
Colorao soluo contendo 0,06% de 3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidina
(TMB), 0,2% de sulfossuccinato dioctilsdio (DONS), etanol a 25%,
cido ctrico a 0,7%, e 1% de Na2HPO4 em gua. O marcador de peso
protena foi corado pela adio de soluo de vermelho Ponceau.
-
Mtodos
ELISA
Quantitativa
Indireta
ELISA Sandwich
Indireta
Solues Usadas
Preparados por dissoluo
12,5 mg da respetiva substncia em 50 mL de 10 mM de soluo de
carbonato sob agitao num agitador horizontal durante pelo menos 30
min.
Padres e Agentes Clarificadores
foram preparadas por diluio
ELISA Indireta tampo de carbonato (pH 9,6)
ELISA Sandwich tampo PBS-Tween 20 (pH 9,6)
Solues de Calibrao
Tampo Carbonato: 75 mM de Na2CO3 e NaHCO3 175 mM em gua
bidestilada
Tampo Tris-Tween 20: Tris 50 mM, NaCl 150 mM e 0,5% de Tween 20
em gua bidestilada
Constituio dos Tampes
Tampo PBS-Tween 20: 10 mM de NaH2PO4 H2O, Na2HPO4 70 mM, NaCl
150 mM e 0,5% de Tween 20 em gua bidestilada.
Tampo cido Ctrico: (pH 4,0) 210 mM de mono-hidrato de cido
ctrico e 300 mM de KOH em gua bidestilada.
Solues de Lavagem
Preparado de fresco
Com 5 mg de TMB, dissolvido em 125 mL de acetona e 1 mL cheio
com metanol, 19 mL de soluo tampo de cido ctrico, e 200 L de H2O2
(1%).
Substrato
2 M H2SO4 em gua bidestilada
Soluo de Paragem
-
Mtodos
ELISA
Indireta
Protocolo
200 L de amostra/poo com tampo
Foram deixadas over night a 8-9C
Placa foi lava 3xs com 300 L de soluo de bloqueio/ poo.
Os locais livres foram bloqueados com 250L/poo com soluo de
bloqueio durante 2h temperatura ambiente com agitao horizontal.
Lavagem da placa 3xs com 300L/poo de soluo de lavagem
placa de 96 poos
Incubao com 200L/poo com anticorpo primrio em PBS-Tween 20 (1:
10000) durante 1h com agitao temperatura ambiente
Lavagem 3xs da placa com 300L/poo de soluo de lavagem
Marcao com anticorpo primrio
200L / poo de anticorpo secundrio em soluo de lavagem (1: 2000)
e incubou-se durante 1 hora, agitando temperatura ambiente.
Lavagem da placa 3xs com soluo de lavagem e 3xs com tampo de
cido ctrico.
Marcao com anticorpo secundrio
Realizada com enzimas
Por adio de 200 L/ poo soluo de substrato (TMB)
Por oxidao catalisada da HRP-TMB, gera-se um composto azul
A reao foi parada aps 5 minutos por adio de 100L/poo soluo de
paragem, o que leva a uma mudana de cor para amarelo
A medio ocorre a 450 nm com 630 nm como comprimento de onda de
referncia.
Reao colorimtrica
Feita atravs de medio em vinho branco na diluio de 1/10 e 1/20
para vinho tinto.
Validao do Mtodo
-
Mtodos
ELISA
Sandwich
Indireta
Protocolo
200 L de anticorpo de captura/poo com tampo de revestimento
(1/20000)
Foram deixadas over night a 8-9C
Placa foi lava 3xs com 300 L/ poo de soluo de bloqueio.
Os locais livres foram bloqueados com 250L/poo com soluo de
bloqueio durante 2h temperatura ambiente com agitao horizontal.
Lavagem da placa 3xs com 300L/poo de soluo de lavagem
placa de 96 poos
Incubao com 200L/poo de amostra em estudo em PBS-Tween 20
durante 1h com agitao temperatura ambiente
Lavagem 1x da placa com 300L/poo de soluo de lavagem
Aplicao da amostra
200L / poo de anticorpo primrio em soluo de lavagem (1:
2000)
Lavagem da placa 3xs com soluo de lavagem
Marcao com anticorpo primrio
200L / poo de anticorpo secundrio em soluo de lavagem (1:
2000)
Incubao durante 1h com agitao horizontal.
Lavagem da placa 3xs com soluo de lavagem e 3xs com soluo de
cido Ctrico
Marcao com anticorpo secundrio
Realizada com enzimas
Por adio de 200 L/ poo soluo de substrato (TMB)
Por oxidao catalisada da HRP-TMB, gera-se um composto azul
A reao foi parada aps 5 minutos por adio de 100L/poo soluo de
paragem, o que leva a uma mudana de cor para amarelo
A medio ocorre a 450 nm com 630 nm como comprimento de onda de
referncia.
Reao colorimtrica
Feita atravs de medio em vinho branco e tinto na diluio de
1/10
Validao do Mtodo
-
Resultados
LDS-PAGE
Figure 2. LDS-PAGE and silver-staining of the casein fining
agents. MW, molecular weight (kDa); M, molecular weight marker;
lanes 112, fining agents 112; Std, casein standard; BSA, bovine
serum albumin (66.4 kDa); CAS, casein (1925 kDa); BLG,
-lactoglobulin (18.3 kDa); ALA, -lactalbumin (14.2 kDa).
-
Resultados
Imunoblot
Figure 3. Immunoblot of the casein fining agents. MW, molecular
weight (kDa); M, molecular weight marker; lanes 112, fining agents
112; Std, casein standard; BSA, bovine serum albumin (66.4 kDa);
CAS, casein (1925 kDa); BLG, -lactoglobulin (18.3 kDa); ALA, -
lactalbumin (14.2 kDa).
v
-
Resultados
Filtrao
Table 6. Results of the Fined Red (RW) and White (WW) Wines
Using the Developed ELISA Methods, Indirect ELISA for WW, and
Indirect Sandwich ELISA for RW, with Casein and KalCasin as
Calibration Substance (A:40g/hL KalCasin, B: 80g/hL KalCasin)
-
Concluses um mtodo sensvel e consegue detetar tanto as casenas
como outras protenas do leite em quantidades residuais.
Resultados confirmados pelas tcnicas de immunoblot e
SDS-PAGE.
uma matriz complexa e verificam-se interferncias nas
metodologias utilizadas.
As metodologias de filtrao e esterilizao mecnicas tambm eliminam
por si s as casenas presentes nos agentes de clarificao do
vinho.
-
Obrigado pela vossa ateno
-
Bibliografia Infovini, Vinho tranquilo [em linha].
Disponvel em, http://www.infovini.com/pagina.php?codNode=18100.
Consultado em 19/02/2015
Tsabouri S., Douros K., Priftis K. N., Cows Milk Allergeicity,
Endocrine, Metabolic & Immune Disorders- Drug Targets, 2014,
14, 16-26
Sgarbieri V. C., Review: Strucural and Physicochemical
Properties of Milk Proteins, Brazilian Journal of Food Tehnology,
2005, 1, 43-56.
Lisitsyn N. A., et al, Methods of Protein Immunoanalysis,
Molecular Biology, 2014, vol.48, n. 5, 624-633
Bentonites [em linha]. Disponvel em,
http://www.proenol.pt/files/products/Bentonites_FT050-08.pdf,
consultado em: 09/03/2015